Đề tài Nghiên cứu xây dựng kĩ thuật nuôi trồng vi tảo làm thức ăn cho con giống động vật biển

n loại chủng N.sp với các vi tảo khác người ta dựa vào các đặc điểm đặc thù của chúng như : sự thiếu các sắc tố quang hợp chlorophyll b, c , có thành phần axít béo ecosapentaenoic acid (EPA) cao (Maruyanma et al.,1986) và sự tồn tại của các sterol đặc thù (Pattersol et al.,1994; Gladu & Pettersol, 1995). Ngoài ra người ta còn sử dụng kĩ thuật phân tử xác định chuỗi gen rARN 18s để phân biệt và thiết lập nên khoá phân loại. Chủng Nannochloropsis sp lần đầu tiên được mô tả bởi Hibbered (1981). N.sp rất khó xác định và phân biệt với các loài tảo lam dưới kính hiển vi quang học vì chúng có kích thước nhỏ bé. N.sp là những cá thể đơn bào có dạng hình hạt như hình...., kích thước từ 2-3 àm.Dưới kính hiển vi điện tử, người ta quan sát thấy những túi mỏng dẹt bên trong tế bào chất, kết nối với màng tế bào chất và màng nhân (Santos & Leedale, 1995). Ngoài ra trong tế bào chất còn có các bào quan khác như lục lạp, nhân, màng thylacoid, và các giọt lipid. II.1.2. Thành phần hoá học. Nannochloropsis là giống tảo có nhiều thành phần axit béo,đặc biệt là các axít béo không no với hàm lượng cao và cân đối.Mà các axít béo không no được xem như là chỉ tiêu hàng đầu để đánh giá giá trị dinh dưỡng của một loài vi tảo khi sử dụng chúng làm thức ăn trong chăn nuôi thuỷ sản.Hàm lượng lipid chiếm 18%, Protein chiếm 35%,hydratecacbon chiếm 7,8% trọng lượng khô (Brown,1991). Thành phần Eicosapentaeinoic acid của Nannochloropsis cao chiếm khoảng 28,8% tổng số acid béo, hàm lượng Vitamin C và Riboflavin đạt giá trị tương ứng là 8mg/g và 50àg/g trọng lượng khô(Volkman và cộng sự,1993), có đầy đủ 19 loại axit amin cần thiết cho cơ thể động vật ( Brown và cộng sự,1993) do đó chúng đã được sử dụng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Brown và cộng sự (1993) khi nghiên cứu Nannochloropsis đã thấy rằng thành phần protein thay đổi mạnh ở các pha sinh trưởng khác nhau, cao nhất ở giữa và gần cuối pha logarit,hàm lượng này giảm dần ở pha cân bằng. Tương tự như hàm lượng protein,hàm lượng lipid tổng số cũng biến đổi rất nhiều trong điều kiện dinh dưỡng bị hạn chế(Sukenik, 1986, McGinnis và cộng sự ,1991,trích theo Reintan và cộng sự ,1997).Dưới đây là bảng các thành phần hoá học của tảo Nannochloropsis sp (% khối lượng khô): STT Thành phần % trọng lượng khô 1 Khối lượng khô 18.40% 2 năng lượng từ 10ml sinh khối khô 44.4 calo 3 Protein tổng số 52.11% 4 Carbohydrate 16% 5 Lipid tổng số 27.64% 6 Vitamin C 0.85% 7 Chlorophyl a 0.89% Bảng 2: Thành phần hoá học của tảo Nannochloropsis. Thành phần các axit amin và các axít béo của tảo Nannochloropsis được thể hiện theo bảng sau: STT Thành phần axit amin(a) % Thành phần axit béo (b) % 1 Aspatic 8.4 Lauric acid 0.35 2 Glutamic 9.48 Myristic acid 3.29 3 Serin 3.31 Pentadecanoic acid 0.23 4 Histidin 0.61 Palmitic 16.57 5 Glysin 5.11 Palmitoleic acid 21.25 6 Prolin 9.2 Heptadecanoic acid 0.36 7 Alanin 1.54 Stearic acid 0.54 8 Arginin 3.57 Oleic acid 5.3 9 Tyrosin 1.06 Linoleic acid 3.4 10 Threonin 5.28 Linolenic acid 0.47 11 Valin 6.9 Octadecatetraenoic 0.47 12 Methionin 2.64 cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid 0.21 13 Phenynalanin 1.92 Arachidonic acid(AA) 3.94 14 Isoleucin 1.47 Eicosatetraenoic acid 0.21 15 Leucin 8.57 Eicosapentaenoic acid 31.42 16 Lysin 9.07 Docosahexaenoic acid 0.22 Bảng 3: Thành phần axitamin và axit béo của tảo Nannochloropsis. (a):Theo số liệu của Brown và cộng sự,1993. (b):Theo số liệu (2) Như vậy các axit amin không thay thế ở tảo Nannochloropsis sp như : Phenylalanin,methiolin,Leucin,Lizin...,những axit béo không no quan trọng như EPA,DHA,AA,có hàm lượng khá cao, và được đánh giá là cao hơn hẳn ở tảo chlorella sp và ở nấm men (Kobayashi và CS, 1995). Thành phần sắc tố quang hợp: Nannochloropsis.sp thiếu sắc tố chlorophyll b, c (Whittle and Caselton, 1975). Sắc tố quang hợp chính ở chủng N.sp là violaxanthin, vaucherxanthin, beta-caroten (Anita và Cheng, 1982; Karsol et al .,1996). Zeaxanthin và anthraxanthin là hai sắc tố phụ nhưng lại được xem là thành phần của chu trình xanthophyll ở vi tảo Nannochloropsis (L.M.Luban,personal communication). II.1.3. Sinh trưởng và phát triển. Quá trình phát triển của vi tảo Nannochloropsis được chia thành 4 pha chính gồm: pha thích nghi, pha luỹ tiến, pha cân bằng, và pha tàn lụi. Với các đặc trưng của các pha như sau: -Pha thích nghi: Dung dịch tảo có màu xanh trong. -Pha luỹ tiến: Dung dịch tảo có màu xanh đục. -Pha cân bằng: Dung dịch tảo có màu xanh đậm, có độ đục cao. -Pha tàn lụi: Dung dịch tảo nhạt màu, trở lên trong, tảo kết tụ lắng xuống đáy, có màu xanh bạc, có mùi tanh. II.1.4. ứng dựng của tảo Nannochloropsis. Khi sử dụng 100% Nannochloropsis cho ấu trùng sò huyết ở giai đoạn sống trôi nổi, có tốc độ tăng trưởng nhanh nhất, và tỷ lệ sống cao nhất. Nhưng ở giai đoạn sống đáy của sò huyết lại sử dụng hỗn hợp vi tảo Nannochloropsis (50%), Chaetoseros sp (25%) và Isochrysis sp (25%) thì sò có tốc độ tăng trưởng nhanh và tỷ lệ sống cao. Đó là do ở giai đoạn ấu trùng sò (cũng như các loại ấu trùng khác) có kích thước nhỏ chỉ 60-120 àm và chỉ có khả năng sử dụng vi tảo có kích thước nhỏ như Nanochloropsis (2-3 àm) làm thức ăn(Lê Trung Kì, Viện nghiên cứu thuỷ sản III, 2004). Vi tảo Nannochloropsis có hàm lượng lipid các axít béo không no cao, đặc biệt là các axít béo cần thiết cho sự phát triển của ấu trùng động vật biển. Lipid và các axít béo không no (polyunsaturated fatty acids) như omega-3, omega-6... là những chất thiết yếu không thể thiếu được trong cơ thể sống và chỉ được bổ sung vào cơ thể sống qua con đường thức ăn. Do đó chúng được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng con giống động vật biển. II.2. Các phương pháp nghiên cứu. II.2.1. Các phương pháp phân lập vi tảo. Việc phân lập vi tảo có thể tiến hành bằng nhiều cách như kỹ thuật dùng micropipet, kỹ thuật phun, kỹ thuật thay đổi áp suất thẩm thấu, dùng thạch nghiêng Trong điều kiện phòng thí nghiệm chủ yếu dùng phương pháp thạch nghiêng: Dùng pipet lấy khoảng 0,1-0,5ml dịch tảo rót lên bề mặt thạch đã cứng,dùng chang thuỷ tinh dàn đều lên bề mặt thạch, sau 3-5 ngày có thể thu được tập hợp các tế bào tảo đồng nhất. II.2.2. Làm sạch vi tảo. Có các phương pháp như: phương pháp li tâm, phương pháp dùng tia cực tím, phương pháp sử dụng kháng sinh, phương pháp lọc. Trong đó người ta thường hay dùng phương pháp lọc. Phương pháp lọc dùng để lọc tảo sợi khỏi vi khuẩn hoặc lọc tảo có kích thước nhỏ như tảo Nannochloropsis (2-4 micromet) khỏi những tạp nhiễm có kích thước lớn. Các loại lưới lọc thường sử dụng là 10-30-100 micromet. II.2.3. Bảo quản giống tảo. Sau khi thu nhận được tảo sạch từ tự nhiên hoặc từ các tập đoàn giống khác, giống tảo cần phải được bảo quản để có thể xây dựng được một tập đoàn giống. Việc bảo quản giống bao gồm các thao tác sau: -Khử trùng: Khử trùng dụng cụ và môi trường bảo quản bằng phương pháp thích hợp. Có thể khử trùng bằng nồi áp suất hoặc bằng màng lọc để tránh làm kết tủa các muối trong môi trường nước biển đối với tảo nước mặn. -Chiếu sáng và nhiệt độ: Để duy trì và giữ giống tảo thông thường người ta chọn phương án dùng ánh sáng yếu và nhiệt độ từ 15 - 200C. -Cấy truyền: Tần số cấy truyền phụ thuộc vào điều kiện giữ giống và loài tảo. Các loài tảo đơn bào hay đa bào không chuyển động có tần số cấy chuyển thưa hơn so với các loài có roi. -Môi trường dinh dưỡng: Tuỳ từng loài tảo mà có môi trường dinh dưỡng thích hợp riêng bao gồm các thành phần là: các muối khoáng đa lượng, vi lượng, các vitamin cần thiết. II.2.4. Các phương pháp đánh giá sinh trưởng tế bào vi tảo. Có nhiều phương pháp đánh giá sinh trưởng tế bào vi tảo trong đó phương pháp cảm quan là nhanh nhất, có thể xác định khi có sự chênh lệch lớn về tốc độ sinh trưởng. Tảo lục phát triển tốt có màu xanh thẫm, độ đục cao, tảo kém phát triển nhiễm tạp có thể xanh vàng, độ đục không cao thậm chí tảo chết làm môi trường trở nên trong. Các phương pháp đánh giá sinh trưởng tế bào gồm: Phương pháp đo mật độ quang. Lấy mẫu từ các môi trường tảo cần so sánh đem đo mật độ quang. Hiện tại đang sử dụng phương pháp này là chủ yếu do thời gian nhanh, thao tác đơn giản, cho biết khả năng tăng sinh khối chứ không trực tiếp xác định được số lượng tế bào. Việc đo OD được tiến hành ở kính lọc 680nm (là bước sóng mà môi trường cần đo hấp thụ ánh sáng mạnh nhất). Môi trường đối chứng là môi trường nuôi không chứa vi tảo. Đếm tế bào. Có thể đếm trực tiếp bằng kính hiển vi hoặc bằng buồng đếm hồng cầu. Môi trường cần xác định mật độ tế bào nếu được dự đoán có mật độ tế bào rất lớn thì cần được pha loãng 101,102,103...lần rồi đem đếm. Việc xác định chính xác mật độ tế bào tảo có thể cho ta kết luận chính xác hơn về sự so sánh giữa các môi trường vi tảo nuôi ở những điều kiện khác nhau, ở các thời điểm khác nhau. * Thiết lập đường chuẩn giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Thông thường để xác định mật độ tế bào của vi sinh vật trong dung dịch lỏng, người ta phải tiến hành đếm trên buồng đếm hồng cầu nhưng biện pháp này phức tạp, thời gian lâu. Do đó người ta thực hiện đo độ đục tế bào bằng máy so màu quang điện ở bước sóng 680 nm rồi từ đường chuẩn OD-mật độ tế bào xác định được mật độ tế bào. Việc thiết lập đường chuẩn được tiến hành như sau: Chọn mẫu môi trường nuôi tảo có chất lượng tốt, có độ đồng đều cao, ít bị kết lắng, có độ sánh, đem pha loãng 1 ; 2 ; 4 ;.. lần. Đo mật độ quang ở bước sóng 680nm. Sau đó tiến hành đếm số tế bào trên buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ tế bào tảo trên 1ml môi trường nuôi ở các mẫu pha loãng tương ứng. Tiến hành như vậy với 2 mẫu tảo .Ta lập bảng tương ứng giữa mật độ quang và mật độ tế bào tảo đo được và thiết lập đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Do mật độ tế bào tỷ lệ thuận với độ đục của môi trường hay tỷ lệ với mật độ quang của mẫu đó ,do đó đường chuẩn phải có dạng đường thẳng và đi qua gốc toạ độ. Môi trường so sánh khi đo mật độ quang là môi trường pha nuôi tảo. Đường chuẩn có dạng đường thẳng: y = ax + R2 Với : a là hệ số góc. R2 là sai số khi đo. Kết quả đo thu được theo bảng sau: Mật độ quang 0.000 0.180 0.278 0.365 0.557 0.741 Mật độ tế bào(x107TB/ml) 0.000 0.281 0.450 0.623 0.897 1.178 Bảng 4: Các giá trị xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn thu được như hình dưới: OD(680nm) tế bào/ml(x107) Hình 3: đường chuẩn tương quan giữa mật độ quang và mật độ tế bào. Như vậy từ đường chuẩn trên ta có thể xác định được mật độ tế bào bằng cách xác định mật độ quang ,từ đó một cách tương đối có thể xác định mật độ tế bào bằng đường chuẩn. Phương pháp xác định trọng lượng khô. Phương pháp dùng đánh giá tăng trưởng tế bào. Phương pháp gồm các bước sau: thu mẫu, ly tâm thu sinh khối, sấy và cân trọng lượng khô. Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyl. Là một trong phương pháp hoá học để xác định nhanh tăng trưởng của vi tảo. Phương pháp gồm các bước: Tách tế bào, chiết rút chlorophyll, đo độ hấp thụ (A) ở các bước sóng 630nm, 665nm, 645nm, và tính hàm lượng chlorophyll theo công thức: Chl a = 15,6 x A665 - 2,0 x A645 - 0,8 x A630. Chl b = 25,4 x A645 - 4,4 x A665 -10,3 x A630. Chl c = 109 x A630 - 12,5 x A665 - 28,7 x A645. Tuy nhiên ở vi tảo Nannochloropsis thiếu chlorophyl b,c nên chỉ xác định được chlorophyl a. II.2.5. Phương pháp đo cường độ quang hợp. Dùng điện cực oxi như một loại tế bào điện hoá để đo tốc độ thải oxi của tảo trong quá trình quang hợp. Tốc độ thải oxi là một thông số quan trọng cho thấy hoạt tính trao đổi chất của vi tảo. Hình 4:Tốc độ tăng oxi biểu kiến theo thời gian. * Kĩ thuật xác định cường độ quang hợp như sau: -Mẫu cần đo ban đầu được đặt trong buồng tối để nồng độ oxi giảm đến mức tối thiểu. -Đậy kín, đặt mẫu cần đo vào vị trí đo, bật đèn halogen tức thời. -Đo nồng độ oxi tại thời điểm t1 bằng điện cực oxi (Ct1). -Đo nồng độ oxi tại thời điểm t2 bằng điện cực oxi (Ct2). -Đo hàm lượng chlorophyll có trong mẫu đo (m) -Tính toán cường độ quang hợp. Cường độ quang hợp tính bởi công thức: Iqh = (mg O2/mg chl.h). Trong phương pháp này để đơn giản hoá, pha loãng các mẫu cần đo sao cho có mật độ quang đo ở bước sóng 600 nm (đo hàm lượng chlorophyll) bằng nhau và bằng giá trị thống nhất là 2 (trong nghiên cứu của chúng tôi) rồi tiến hành đo cường độ quang hợp. Các mẫu đo cường độ quang hợp lúc này có m như nhau, có khoảng thời gian delta t = t2-t1 như nhau.Nồng độ oxi ban đầu thường gần bằng nhau, thấp hơn một chút so với nồng độ oxi trong nước( 5,1- 5,8 mg/l) như vậy chỉ cần dựa vào nồng độ oxi đo được sau thời gian t(khoảng 5 phút) Ct là có thể so sánh được cường độ quang hợp của các mẫu thí nghiệm. Đem các mẫu đó nuôi trong cùng điều kiện ,môi trường để so sánh khả năng sinh trưởng của chúng. II.3. Dụng cụ, thiết bị, môi trường, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu. II.3.1. Dụng cụ, thiết bị. * Các dụng cụ: ống đong, cốc đong, pipet, đầu côn, nhiệt kế thuỷ ngân. * Các thiết bị nuôi vi tảo trong thí nghiệm đều là các thiết bị bằng thuỷ tinh hoặc bình nhựa trong suốt để ánh sáng có thể chiếu xuyên qua dễ dàng.Các thiết bị bao gồm: -Thiết bị bảo quản giống : ống nghiệm 50ml, 100ml, đĩa petri. -Thiết bị nhân giống sơ cấp: bình tam giác 150 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml. -Thiết bị nhân giống lớn: thẩu2l, bình 5l, bình 25l hoặc lớn hơn nữa là thùng 50l. -Bể xi măng nuôi sinh khối 300 lit. Các thiết bị này đều có thể nhập nội hoặc tự đặt mua. * Thiết bị khử trùng khô. Dựa trên nguyên tắc khử trùng bằng không khí nóng, nhiệt độ từ 165-1800C trong 2 giờ. * Thiết bị khử trùng ướt. Thiết bị hoạt động trên nguyên tắc tiêu diệt vi sinh vật và bào tử ở nhiệt độ cao của hơi bão hoà. Đối với môi trường cần khử trùng ở 0,08-0,1at trong vòng 30 phút. * Máy khử trùng Ozon. * Buồng cấy vô trùng. * Máy lắc. Hiệu Gerharadt.Tốc độ 120 nhịp/phút. * Hệ thống sục khí. Hệ thống bao gồm: bình chứa CO2, máy nén khí, hệ thống ống dẫn, hệ thống lọc khí, thiết bị khử trùng bằng đèn cực tím. Sử dụng máy nén hiệu RESUN có nhiều loại khác nhau,có công suất thay đổi từ 35W hoặc lớn hơn,tạo áp suất P=0.03Mpa,năng suất 60lít/phút.Thiết bị nhập ngoại của Trung Quốc. * Bơm chìm. Hiệu Lifetech AP 1300,công suất 8,5W.Có thể dùng loại công suất lớn hơn đến AP 3500 (25W).Thiết bị nhập từ Trung Quốc. * Kính hiển vi quang học. Nhãn hiệu: Laboval-4.Với các độ phóng đại:3,2-10-40-100 lần. Nguyên tắc hoạt động: dựa trên nguyên tắc về sự tạo ảnh qua hai thấu kính . * Buồng đếm hồng cầu: Bukne,do Liên Xô cũ sản xuất. * Thiết bị đo oxy hoá khử. Nhãn hiệu:IMS-DOT 01.Nhập nội,do Viện Công Nghệ Vật Liệu thiết kế và sản xuất. Nguyên tắc: đo điện trên thế điện kế căn cứ vào sự sai khác điện thế giữa hai điện cực: điện cực cần đo và điện cực so sánh Ag/Pb. * Thiết bị so màu quang điên. Nhãn hiệu Pharmacia Biotech. Nguyên tắc hoạt động: Dựa trên sai khác giữa khả năng hấp thụ (hay phát xạ) ánh sáng của môi trường nuôi tảo và môi trường so sánh thông qua tế bào quang điện. * Cân điện tử. Nhãn hiệu Mettler toledo. Max 210g Sai số e =1mg. Min 10g d =0,1mg. II.3.2. Môi trường, hoá chất sử dụng trong thí nghiệm. * Môi trường sử dụng trong phân lập và bảo quản giống vi tảo là môi trường Walne - aga. Cách pha môi trường Walne như sau: - Pha môi trường A:(Pha trong 1lít nước cất) NaNO3: 100g. Na2EDTA,NaH2PO4: 20g. H3BO3: 33,6g. MnCl2.4H2O: 0,4g. FeCl3: 0,8g. 1ml dung dịch B. - Pha môi trường B:(pha trong 100ml nước cất,đun nóng ,hoà tan) ZnCl2: 2,1g. CoCl2: 2,0g. (NH4)6Mo7O24.4H2O: 0.9g. CuSO4: 2,0g. Dùng 1ml môi trường A pha cho 1lít môi trường nuôi. Các loại hoá chất chủ yếu nhập ngoại từ Trung Quốc. * Môi trường trong nhân giống sơ cấp là môi trường Walne cải tiến, có bổ sung vitamin các loại: Vitamin B1, B12, H. * Môi trường trong nhân giống thứ cấp và thử nghiệm nuôi sinh khối là môi trường phân bón :phân đạm, phân lân,nhập nội, hoá chất ure, axit citric nhập ngoại từ Trung Quốc. chương iii kết qủa và bàn luận. III.1. Nghiên cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm. III.1.1. Phân lập lại và bảo quản giống. Vì đối tượng nghiên cứu do nhà cấp giống cung cấp dưới dạng chủng sản xuất nên chúng tôi phải tiến hành phân lập lại để thu được giống thuần chủng phục vụ cho nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng môi trường Walne - aga (aga-aga 4g/lit) phân lập lại và bảo quản vi tảo. * Phân lập lại: Chúng tôi sử dụng phương pháp cấy chuyển trên môi trường thạch đĩa. Dịch chứa vi tảo được trải đều trên bế mặt môi trường thạch đĩa sau đó đem bảo quản nơi thoáng mát, sạch sẽ, sử dụng ánh sáng đèn neon (2 bóng 40W). Đảm bảo điều kiện vi hiếu khí. Sau 25 ngày thu được kết quả vi tảo phát triển tốt trên môi trường thạch đĩa. * Bảo quản: Sau khi vi tảo trên môi trường thạch đĩa đã phát triển tốt (20 - 30 ngày), các phần tảo phát triển tốt mọc lan ra tách biệt khỏi các tạp nhiễm được cấy chuyển sang môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống thuần khiết và tạo nguồn giống cho nhân giống sơ cấp. Giống trong môi trường thạch nghiêng được bảo quản giống như điều kiện bảo quản giống trên môi trường thạch đĩa. Kết quả bảo quản giống trong môi trường thạch nghiêng sau 25 - 30 ngày như hình 4. iii.1.2. Nhân giống sơ cấp. Sau khi thu được giống vi tảo thuần chủng trong môi trường thạch nghiêng, chúng tôi tiến hành nhân giống sơ cấp trong các bình tam giác theo thứ tự lần lượt từ ống nghiệm sang bình tam giác 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml. Sử dụng môi trường Walne. Nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm, môi trường và dụng cụ được khử trùng ướt trong điều kiện 0,1 at trong 30 phút. Nhiệt độ nuôi cấy 200C -250C, ánh sáng 3000 - 4000 lux, điều kiện hiếu khí lỏng lắc. Kết quả nhân giống sơ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm sau 8-10 ngày thu được như hình 6. Hình 5 :bảo quản vi tảo trong môi trường thạch nghiêng. Hình 6: Nhân giống sơ cấp và thứ cấp trong phòng thí nghiệm. III.1.3 Nhân giống thứ cấp. Giống sạch từ nhân giống sơ cấp được nhân giống thứ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Sử dụng môi trường Walne, nuôi trong bình thuỷ tinh 2 lít, chế độ khử trùng nhiệt. Điều kiện nhiệt độ 20-250C, ánh sáng 5000 - 6000 lux, sục khí vô trùng. Kết quả nhân giống thứ cấp trong điều kiện phòng thí nghiệm như hình 6. Sau 7 ngày thu được OD = 5,36 tương đương 9,5 triệu tế bào/ml. III.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường. III.1.4.1. Xác định phương pháp khử trùng phù hợp với điều kiện nuôi vi tảo trong thí nghiệm cũng như khi ứng dụng vào sản xuất. Đối với việc bảo quản giống và nhân giống nhỏ thì việc khử trùng bằng phương pháp khử trùng ướt (0,1 at) là cần thiết để đảm bảo độ vô trùng cao. Tuy nhiên trong nhân giống lớn cũng như khi ứng dụng vào sản xuất, việc khử trùng môi trường nuôi bằng phương pháp nhiệt có những hạn chế của nó. Việc khử trùng dụng cụ nuôi nhân giống lớn bằng nước zaven 10%, cồn cũng tỏ ra không hiệu quả, đó là do: Giá thành cao. Thao tác khó khăn. Thời gian lâu. Việc khử trùng nhiệt có thể làm tủa một số muối khoáng có trong nước biển và muối khoáng bổ sung vào môi trường nuôi, làm thay đổi thành phần của môi trường nuôi ,ảnh hưởng tới sự phát triển của vi tảo. Đặc biệt khi đưa ra sản xuất với việc khử trùng môi trường cho 1 mẻ từ nửa khối tới vài khối thì việc khử trùng nhiệt và việc khử trùng dụng cụ là không kinh tế . Hiện nay có một phương pháp khử trùng khá là hiệu quả cả về mặt kinh tế lẫn thao tác mà đang được sử dụng đó là phương pháp khử trùng bằng Ozon. Tuy nhiên việc khử trùng bằng chất oxi hoá mạnh là ozon có thể tiêu diệt được vi sinh vật cùng bào tử của chúng nhưng cũng có thể làm oxi hoá các chất cần thiết cho sinh trưởng và phát triển của vi tảo. Do đó cần phải đánh giá sự phát triển của vi tảo trong môi trường và dụng cụ khử trùng bằng phương pháp ozon. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu như sau : Ba mẫu tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhiệt độ 20-280C ,sử dụng môi trường cơ bản Walne làm môi trường nuôi vi tảo, ánh sáng đèn Neon (4 đèn) , nuôi trong bình thuỷ tinh 2 lít, có sục khí vô trùng. Chỉ khác nhau về chế độ khử trùng như sau: Mẫu 1 : (Mẫu đối chứng ĐC ) Dụng cụ được khử trùng bằng cồn 90 độ, môi trường được khử trùng bằng đun sôi trong 30 phút. Mẫu 2 : Dụng cụ cùng môi trường nuôi được khử trùng bằng ozon. Môi trường gốc được bổ sung sau khi tiến hành khử trùng (OZON1). Mẫu 3 : Dụng cụ cùng môi trường nuôi được khử trùng bằng ozon. Môi trường gốc được bổ sung trước khi tiến hành khử trùng (OZON2) Bổ sung lượng giống như nhau, cùng 1 nguồn giống. Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh khả năng phát triển của vi tảo. Kết quả đo OD tại các thời điểm khác nhau đối với các các mẫu thí nghiệm về điều kiện khử trùng như sau: ngày 0 1 2 3 4 ĐC 0,128 0,144 0,18 0,244 0,32 OZON1 0,135 0,149 0,187 0,26 0,344 OZON2 0,147 0,16 0,188 0,235 0,3 5 6 7 8 9 10 0,382 0,477 0,527 0,521 0,495 0,468 0,412 0,492 0,546 0,541 0,526 0,486 0,36 0,401 0,389 0,36 0,335 Bảng 5 :OD của các mẫu thí nghiệm về điều kiện khử trùng. Từ các giá trị OD đo được ta xây dựng được các đường cong sinh trưởng như hinh 7. * Bàn luận: Mẫu1 đạt được mật độ tối đa là cao nhất (OD=0,532 tương đương 9,46 triệu tế bào/ml) mẫu 2 đạt tối đa là 0,531 Cũng tương đương với mẫu 1 nhừng thời gian đạt tối đa chậm hơn.Còn ở mẫu 3 ,vi tảo phat triển hoàn toàn kém hơn so với ở hai mẫu kia,mật độ tối đa chỉ đạt 0,452 tương đương 7.47 triệu tế bào/ml, thời gian đạt cực đại xớm hơn và pha cân bằng ngắn hơn. Như vậy ta có thể sử dụng phương pháp khử trùng ozon để thay thế phương pháp khử trùng nhiệt thông thường cho nhân giống thứ cấp và nuôi thu sinh khối.Nhưng môi trường gốc cần bổ sung vào môi trường nước biển sau khi khử trùng. Vì có thể khi khử trùng bằng chất oxi hoá mạnh là ozon thì có thể làm nhiều thành phần bị thay đổi thậm chí tạo ra các chất ức chế sự phát triển của vi tảo. III.1.4.2. Cải tiến môi trường Walne. Chúng tôi làm thí nghiệm bổ sung vitamin vào môi trường walne với lượng vitamin theo công thức của môi trường tảo nước mặn Guillard với cách pha vitamin gốc như sau: Dung dịch C : Vitamin B1 : 100mg/l. Vitamin B12 : 0,5 mg/l. Vitamin H : 0,5 mg/l. Thí nghiệm tiến hành với hai mẫu như sau: Mẫu 1: Mẫu đối chứng (sử dụng môi trường Walne). Mẫu 2: Walne + Vitamin (1ml/l môi trường C). Nuôi trong bình tam giác 500 ml, chế độ khử trùng ướt (0,1 at), điều kiện ánh sáng đèn neon 3000-4000lux), nhiệt độ phòng 20-250C, nuôi cấy lắc. Sử dụng phương pháp mật độ quang để so sánh sự sịnh trưởng của vi tảo. Sau 10 ngày đo thu được kết quả như bảng sau: ngày 0 1 2 3 4 Walne 0,176 0,183 0,2 0,244 0,32 Walne+VTM 0,158 0,18 0,22 0,286 0,384 5 6 7 8 9 10 0,37 0,402 0,48 0,502 0,498 0,479 0,425 0,486 0,538 0,534 0,522 0,499 Bảng 6 : Giá trị OD của các mẫu thí nghiệm môi trường Walne cải tiến. Từ bảng giá trị mật độ quang xây dựng đường cong sinh trưởng của hai mẫu thí nghiệm moi trường Walne và môI trường Walne cảI tiến như hình 8. * Bàn luận: Từ đồ thị hình 9 ta nhận thấy trong môi trường Walne cải tiến, vi tảo phát triển nhanh và đạt mật độ tối đa xớm hơn. Mật độ tối đa đạt được sau 7 ngày là OD = 0.538 tương đương với mật độ tế bào 9,57 triệu tế bào / ml. Trong khi mẫu đối chứng sử dụng môI trường Walne đạt mật độ tối đa chậm hơn sau 8 ngày, OD = 0.502 tương đương mật độ tế bào là : 8.9 triệu tế bào/ml. Như vậy vi tảo Nannochloropsis sp có nhu cầu về vitamin các loại B1, B12, H và việc bổ sung vitamin vào môi trường nuôi sẽ làm tăng khả năng sinh trưởng và mật độ cực đại của vi tảo. Do đó chúng tôi lựa chọn môi trường Walne cải tiến làm môi trường nuôi cấy và bảo quản vi tảo trong phòng thí nghiệm. Thời gian cấy chuyển là 6 ngày (cuối pha logarit). III.1.4.3. Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối. Trong thực tế sản xuất , nước biển có thể có nồng độ muối khác nhau tuỳ thuộc vào vị trí từng vùng và từng mùa. Có 3 loại nước biển chính đó là: nước lợ(16‰ - 25‰), nước mặn (25‰ - 30‰), nước quá mặn (30‰ - 35‰). Do đó việc nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối tới sự phát triển của vi tảo là hết sức cần thiết. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành thí nghiệm với ba mẫu như sau: Mẫu 1:Nước biển có nồng độ muối 16‰ (đường 16). Mẫu 2:Nước biển có nồng độ muối 25‰ (đường 25). Mẫu 3:nước biển có nồng độ muối 30‰ (đường 30). Thí nghiệm được tiến hành trong bình thuỷ tinh 2 lít, chế độ khử trùng ozon, bổ sung môi trường gốc sau khử trùng, điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm: t0 20-280C, ánh sáng đèn neon 40W(4 bóng ,6000lux), sục khí vô trùng, lượng giống bổ sung ban đầu như nhau.Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để tiến hành so sánh các mẫu thí nghiệm thu được giá trị như bảng sau: Ngày đo 0 1 2 3 4 16‰ 0,157 0,162 0,196 0,25 0,318 25‰ 0,16 0,179 0,237 0,295 0,388 30‰ 0,164 0,18 0,22 0,277 0,353 5 6 7 8 9 10 0,364 0,386 0,37 0,345 0,486 0,532 0,538 0,529 0,514 0,485 0,44 0,489 0,525 0,511 0,489 0,462 Bảng 7 : Mật độ quang của các mẫu thí nghiệm về nồng độ muối. Từ bảng số liệu trên, xây dựng các đường cong sinh trưởng như hình 9. * Bàn luận: Từ đường cong động học về sự phát triển của vi tảo trong các môi trường có nồng độ muối khác nhau ta nhận thấy đường cong 16‰ thấp hơn các đường cong khác như vậy khả năng sinh trưởng và phát triển của vi tảo trong môi trường này là kém hơn các môi trường khác và ở đây có sự khác biệt rõ rệt, đạt mật độ quang cực đại là 0.386 tương đương mật độ tế bào là 6.86 triệu TB/ml. Mật độ quang của mẫu 25‰ đạt giá trị cực đại sau 7 ngày là 0,538 tương đương với mật độ tế bào là 9,57 triệu tế bào/ml. Mật độ quang cực đại của 30‰ đạt được chậm hơn, sau 8 ngày và đạt được là 0.525 tương đương với mật độ 9,34 triệu TB/ml. Như vậy để đạt được sự sinh trưởng và phát triển tốt và mật độ tế bào cực đại thì chủng vi tảo Nannochloropsis sp cần phải được nuôi trong điều kiện nước biển có nồng độ muối trong dải từ 25 - 30‰. Trường hợp nuôi trong môi trường nước biển có nồng độ muối là 16‰, vi tảo vẫn sinh trưởng và phát triển nhưng bị hạn chế. III.1.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi bằng nước biển nhân tạo và bán nhân tạo tới sự phát triển của vi tảo. Trong thực tế để nuôi con giống động vật biển trong khu vực nước có nồng độ muối thấp thì việc nuôi đối tượng vi tảo Nannochloropsis sp là bất lợi về mặt nồng độ muối nên không thể tối đa về mặt mật độ tế bào.Việc pha thêm muối vào nước biển có nồng độ muối thấp làm tăng nồng độ muối trong nước biển có thể thay thế nước biển thông thường hay không. Nếu điều này xảy ra thì sẽ co giải pháp cho vấn đề nuôi vi tảo Nannochloropsis sp ở các vùng biển có nồng độ muối thay đổi mà vẫn đạt được mật độ tế bào mong muốn. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu có cùng điều kiện nuôi : điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm,chế độ nuôi cấy lắc, ánh sáng 3000 - 4000 lux, nhiệt độ 20 - 280C, sử dụng môi trường Walne cải tiến. Thí nghiệm tiến hành trong các bình thuỷ tinh 2 lít, điều kiện khử ozon, bổ sung lượng giống như nhau, môi trương nước biển : Mẫu 1: Sử dụng môi trường nước biển 25‰ nồng độ muối (mẫu đối chứng). Mẫu 2: Nước biển 16‰ nồng độ muối pha thêm muối ăn để đạt 25‰ (môi trường nước biển bán nhân tạo). Mẫu 3: Nước biển 16‰ nồng độ muối. Mẫu 4: Môi trường nước muối 25 ‰. Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo trong các mẫu thí nghiệm. Kết quả đo mật độ quang thu được như bảng sau: Mẫu TN 0 1 2 3 4 25‰ 0,141 0,18 0,209 0,269 0,346 16‰+m 0,134 0,176 0,203 0,25 0,314 16‰ 0,145 0,162 0,196 0,239 0,287 m 0,136 0,142 0,166 0,181 0,209 5 6 7 8 9 10 0,412 0,485 0,54 0,538 0,511 0,489 0,392 0,466 0,516 0,522 0,493 0,47 0,325 0,397 0,415 0,421 0,385 0,356 0,249 0,285 0,292 0,289 0,278 0,242 Bảng 8 : Giá trị mật độ quang của các mẫu thí nghiệm về ảnh hưởng của môi trường nước biển. Từ số liệu này ta xây dựng được đường cong sinh trưởng như hình 10. * Nhận xét: Trong mẫu thí nghiệm 16 ‰ + m vi tảo phát triển khá tốt, đường cong sinh trưởng của mẫu này khá gần với đường cong sinh trưởng của mẫu đối chứng và phát triển tốt hơn hẳn mẫu 16‰. Mật độ quang cực đại đạt sau 7 ngày là 0,522 tương đương với mật độ tế bào là: 9,3 triệu tế bào/ml. Trong khi mẫu thí nghiêm 4 (100% nước muối) vi tảo phát triển chậm, Đạt được mật độ cực đại thấp, Chỉ đạt ODmax = 0,292 tương đương với mật độ tế bào là 5.2 triệu tế bào/ml. * Bàn luận: -Như vậy trong nước biển có chứa những thành phần hoá học cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo mà không thể thay thế được bằng môi trường nhân tạo. -Có thể tăng nồng độ muối trong môi trường nước biển lợ bằng pha thêm muối vào để tạo điều kiện phù hợp hơn cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo.Giải quyết được vấn đề nuôI vi tảo ở những vùng có nồng độ muối thấp. III.1.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng. Đối tượng nghiên cứu là vi sinh vật quang dưỡng nên việc tổng hợp các chất hữu chủ yếu là nhờ quá trình quang hợp. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhu cầu về ánh sáng của vi tảo. Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm ở 4 dải cường độ ánh sáng khác nhau là: 2000 lux , 4000 lux , 6000 lux , 8000 lux . Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm,sử dụng môi trường Walne cải tiến làm môi trường nuôi. Điều kiện nhiệt độ 20-280C,bổ sung cùng nguồn giống, lượng giống bổ sung như nhau, nuôi trong bình thuỷ tinh 2 lít,sục khí vô trùng, môi trường và thiết bị được khử trùng bằng ozon, môi trường gốc bổ sung vào sau khử trùng. Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh giữa các mẫu thí nghiệm. Kết quả đo mật độ quang thu được như sau: Ngày 0 1 2 3 4 2000lux 0,178 0,193 0,211 0,257 0,308 4000lux 0,195 0,21 0,247 0,286 0,362 6000lux 0,182 0,201 0,238 0,307 0,389 8000lux 0,169 0,184 0,251 0,324 0,416 5 6 7 8 9 10 0,395 0,43 0,432 0,414 0,4 0,373 0,449 0,473 0,48 0,478 0,454 0,42 0,464 0,509 0,513 0,498 0,486 0,456 0,505 0,549 0,568 0,547 0,529 0,503 Bảng 9 : Giá trị mật độ quang các mẫu thí nghiệm điều kiện ánh sáng. Qua đó ta xây dựng đường cong động học của các mẫu thí nghiệm theo hình 11. * Nhận xét: cường độ chiếu sáng càng tăng thì càng tăng khả năng sinh trưởng của vi tảo nhưng đến mức độ náo đó thì ánh sáng tăng nhiều nhưng sự tăng khả năng sinh trưởng của vi tảo lại ít đi. Đó là khi ánh sáng sắp đạt đến mức bão hoà. ở cường độ ánh sáng 15 - 20 VA, vi tảo phat triển mạnh mẽ nhaat và đạt mật độ cực đại là OD = 5,57 sau 7 ngày,tương đương với 9,9 triệu tế bào/ml. * Bàn luận: Như vậy nên nuôi vi tảo trong điều kiện ánh sáng thích hợp là từ 7000-8000 lux.Trong điều kiện ánh sáng yếu hơn,vi tảo vẫn phát triển nhưng kém hơn nhiều. III.1.4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ. Do điều kiện khí hậu miền bắc nước ta khá là phức tạp, không ổn định ,nhiệt đổi thay đổi nhiều giữa mùa đông và mùa hè. Nhiệt độ mùa hè có thể lên 38-390C nhưng lại có thể giảm xuống 7-80C vào mùa đông, mà vi sinh vật chỉ có thể thích nghi trong một dải nhiệt độ nhất định nào đó, ngoài dải nhiệt độ đó ra ,vi sinh vật có thể bị ức chế hoặc bị tiêu diệt. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của vi tảo. Chúng tôi tiến hành 3 mẫu thí nghiệm tương ứng với 3 dải nhiệt độ đó là:15-180C, 25-320C, 350C. Còn các điều kiện khác đều bố trí giống nhau. Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm: ánh sáng đèn neon (4 chiếc), môi trường Walne cải tiến, thiết bị nuôi bằng bình thuỷ tinh 2 lít, dụng cụ cùng môi trường được khử trùng ozon, môi trường gốc được bổ sung vào sau khử trùng . Bổ sung một lượng giống như nhau. Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh sự phát triển .Kết quả sau 6 ngày mẫu thí nghiệm ở nhiệt độ 15-180C đạt giá trị OD là 0,35 tương đương 6.2 triệu tế bào/ml ,mẫu thí nghiệm ở nhiệt độ 33-380 sau 2 ngày thì lụi. Mẫu thí nghiệm ở dải nhiệt độ 22-300C vi tảo phát triển bình thường đạt mật độ quang tối đa là 0,552 sau 7 ngày tương đương đương với 9,8 triệu tế bào/ml. * Bàn luận : Như vậy ở điều kiện nhiệt độ cao hay thấp đều ảnh hưởng bất lợi đến sinh trưởng của vi tảo. Vi tảo chỉ phát triển tốt trong dải nhiệt độ từ 20-300C. Do đó trong điều kiện nuôI sinh khối ngoài trời cần phảI có biện pháp giảI quyết vấn đề khi nhiệt lên quá cao(>350c) và khi nhiệt độ xuống thấp (< 160C). III.1.4.7. Nghiên cứu đánh giá hoạt tính quang hợp vi tảo. Thí nghiệm tiến hành với 3 mẫu như sau : -Mẫu 1 : Ct1 = 6,9. -Mẫu 2 : Ct2 = 8,2. -Mẫu 3 : Ct3 = 9,3. Sử dụng 3 mẫu này làm giống cho 3 mẫu nuôi tương ứng có bổ sung cùng 1 môi trường nuôi sao cho mật độ trong các mẫu là như nhau, sử dụng môI trường Walne cảI tiến, chế độ khử trùng Ozon, bổ sung môI trường gốc sau khử trùng. Điều kiện nuôi ánh sáng 5000-6000 lux, nhiệt độ 20-300C, nuôI trong bình thuỷ tinh 2 lít, có sục khí vô trùng. Kết quả thu được như sau: ở mẫu Ct1=6,9 vi tảo lụi sau 3 ngày, ở mẫu Ct2 = 8,2 ,khả năng sinh trưởng vi tảo thấp hơn nhiều so với mẫu có Ct3=9,3. Mật độ tối đa đạt được ở mẫu 2 là OD = 4,45 trong khi ở mẫu 3 là OD = 5,6 sau 7 ngày. * Thảo luận: Như vậy cường độ quang hợp của vi tảo càng cao thì khả năng sinh trưởng của vi tảo càng mạnh. Tốt nhất nên kiểm tra khả năng quang hợp vi tảo trước khi nhân giống và loại bỏ các mẫu tảo nào có cường độ quang hợp thấp Ct 9 thì tiến hành nhân giống tiếp tục. III.2. Nghiên cứu trong điều kiện tự nhiên. III.2.1.Tìm kiếm môi trường phân bón thích hợp nuôi sinh khối vi tảo. III.2.1.1. Sử dụng phân bón N,P làm nguồn thức ăn nuôi sinh khối vi tảo Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nuôi vi tảo bằng nguồn thức ăn rẻ tiền dễ kiếm đó là nguồn phân đạm((NH4)2SO4) và phân lân(CaHPO4) dựa trên cơ sở nhu cầu về Nitơ và phospho của vi tảo trong công thức môi trường cơ bản Walne kết hợp với những nghiên cứu của các tác giả về đối tượng tảo lục ,chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu như sau: Mẫu 1: Mẫu đối chứng, dùng môi trường cơ bản là môi trường Walne cải tiến. Mẫu 2: Sử dụng đạm((NH4)2SO4) : 0,1g/l. Sử dụng lân(CaHPO4) : 0,01g/l. (Theo (1) môi trường phân bón dùng cho tảo lục nói chung,trong đó có sử dụng cho cả vi tảo Nannochloropsis). Mẫu 3: Sử dụng nguồn phân bón giống mẫu 1, kết hợp bổ sung vi lượng của vi tảo. Mẫu 4:Sử dụng nguồn phân bón với vi lượng giống mẫu 2 kết hợp với axit citric (C6H8O7) :0,015 g/l, FeCl3 :14g/l. Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện tự nhiên,nhiệt độ thay đôi trong dải rộng hơn từ 18-300C,ánh sáng cũng thay đổi trong dai rộng từ a => b lux,thời gian chiếu sáng 10-12 giờ/ngày,thí nghiệm tiến hành trong các bình thuỷ tinh 2 lít,khử trùng thiết bị và môi trường băng ozon,bổ sung môi trường sau khử trùng,sục khí vô trùng và bổ sung lượng giống ban đầu như nhau. Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh sự phát triển của vi tảo trong các mẫu. Kết quả đo thu được như sau: Ngày 0 1 2 3 4 Mẫu 1 0,197 0,226 0,253 0,291 0,387 Mẫu 2 0,188 0,198 0,221 0,26 0,288 Mẫu 3 0,182 0,206 0,254 0,286 0,356 Mẫu 4 0,191 0,232 0,268 0,3 0,383 5 6 7 8 9 10 0,469 0,534 0,548 0,522 0,499 0,48 0,357 0,372 0,34 0,296 0,411 0,456 0,478 0,465 0,398 0,321 0,44 0,499 0,529 0,505 0,458 0,42 Bảng 10 : Giá trị OD các mẫu vi tảo trong thí nghiệm phân bón. Từ số liệu này xây dựng được đường cong sinh trưởng như hình 12. * Nhận xét: - Các mẫu thí nghiệm bổ sung môi trường phân bón N, P có sự phát triển kém hơn so với mẫu đối chứng sử dụng môi trường Walne cải tiến. Kém nhất là mẫu 2 chỉ bổ sung N, P vào môi trường. -Mẫu 4 ( có bổ sung vi lượng, sắt và axit citric) vi tảo có sự phát triển mạnh gần bằng đối chứng. Đạt mật độ cực đại sau 7 ngày là 0,529 tương đương với 9,4 triệu tế bào/ml. * Thảo luận: -Như vậy trong môi trường phân bón N, P ,vi tảo vẫn có nhu cầu về vi lượng, về sắt và axit citric làm nguồn C hữu cơ. -Có thể sử dụng môi trường trong mẫu thí nghiệm 3 để tiếp tục cải tiến nâng cao khả năng sinh trưởng và mật độ vi tảo . Hình 7: đường cong sinh trưởng của các mẫu thí nghiệm về phương pháp khử trùng. Hình 8: Đường cong sinh trưởng của các mẫu trong thí nghiệm môi trường Walne cải tiến. Hình 9: Đường cong sinh trưởng của các mẫu thí nghiệm về nồng độ muối. Hình 10: Đường cong sinh trưởng của vi tảo trong môi trường nước biển thường và môi trường nước biển bán nhân tạo. Hình 11: Đường cong sinh trưởng các mẫu vi tảo trong thí nghiệm điều kiện ánh sáng. Hình 12: Đường cong sinh trưởng các mẫu thí nghiệm về môi trường phân bón. Hình 13: Đường cong sinh trưởng các mẫu thí nghiệm bổ sung ure. Hình 14: Đường cong sinh trưởng các mẫu tảo trong thí nghiệm bổ sung axit amin vào môi trường phân bón. III.2.1.2. Bổ sung ure vào môi trường phân bón. Theo tài liệu nghiên cứu (2) các nhà nghiên cứu đã sử dụng ure trong nuôi tảo lục Nannochloropsis oculata với lượng 5-10 mg/l. Dựa vào kết quả nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu như sau: Mẫu 1: Mẫu đối chứng,sử dụng môi trường N,P+ axit citric + Fe3+ Mẫu 2: Môi trường N,P+ axit citric + Fe3+ + ure(5mg/l). Mẫu 3: Môi trường N,P+ axit citric + Fe3+ + ure(10mg/l). Mẫu 4: Môi trường N,P+ axit citric + Fe3+ + ure(15mg/l). Bốn mẫu thí nghiệm tiến hành trong điều kiện ngoài trời ,trong bình thuỷ tinh 2 lít,môi trường cùng thiết bị nuôi được khử trùng ozon,bổ sung một lượng giống như nhau,điều kiện ánh sáng 5000-7000 lux,nhiệt độ từ 200C-320C,có sục khí vô trùng.Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh sự phát triển của các mẫu vi tảo. Kết qủa đo thu được như sau: Ngày 0 1 2 3 4 ĐC(PB) 0,191 0,232 0,268 0,3 0,383 URE(5mg) 0,179 0,225 0,31 0,446 0,521 URE(10mg) 0,184 0,248 0,39 0,543 0,667 URE(15mg) 0,175 0,232 0,378 0,55 0,704 5 6 7 8 9 10 0,44 0,499 0,529 0,505 0,458 0,42 0,59 0,669 0,665 0,602 0,586 0,54 0,705 0,747 0,769 0,769 0,722 0,654 0,74 0,768 0,8 0,8 0,751 0,706 Bảng 11 : Giá trị mật độ quang các mẫu thí nghiệm về bổ sung ure vào môi trường phân bón N,P. Từ số liệu này ,xây dựng được đường cong sinh trưởng như hình 13. * Nhận xét: - Các mẫu có bổ sung ure phát triển mạnh hơn hẳn mẫu đối chứng. -Phát triển tốt nhất là mẫu bổ sung ure 10 mg /l, đạt mật độ cực đại sau 7 ngày là OD = 0,783 tương đương 13,9 triệu tế bào/ml. Mẫu 4 bổ sung lượng ure cao hơn nhưng phát triển chỉ ở mức ngang bawnfg ,thậm trí kém hơn mẫu 3. * Bàn luận: -Như vậy vi tảo Nannochloropsis sp có khả năng sử dụng ure như nguồn Nitơ. -Nên bổ sung ure vào môi trường nuôi ở mức 10mg/l III.2.1.3. Bổ sung môi trường giàu axit amin vào môi trường phân bón. Một số vi tảo cũng có nhu cầu về axit amin. Ví dụ: Trong công thức môi trường nuôi tảo của Provasoli,L; McLaughlin, J. J. A; Droop,M.R, 1957 sử dụng cho hai đối tượng tảo lục Chlorella sp và Platimonas sp có sử dụng axit amin. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng dịch chiết D giàu axit amin (hỗn hợp nhiều loại axit amin khác nhau) với 4 mẫu thí nghiệm như sau: Mẫu 1: Mẫu đối chứng, sử dụng môi trường phân bón. Mẫu 2: Sử dụng môi trường phân bón với môi trường D:0,1%(1ml/l). Mẫu 3: Sử dụng môi trường phân bón với môi trường D:0,3%(3ml/l). Mẫu 4: Sử dụng môi trường phân bón với môi trường D:0,5%(5ml/l). Thí nghiệm tiến hành trong điều kiện tự nhiên, trong bình 2 lít, chế độ khử trùng ozon, bổ sung môi trường sau khử trùng, nhiệt độ từ 20-300C, ánh sáng 7000-8000 lux, có sục khí vô trùng. Sử dụng phương pháp đo mật độ quang để so sánh sự phát triển của vi tảo ở các mẫu ta thu được bảng giá trị sau: Ngày 0 1 2 3 4 Đối chứng 0,188 0,269 0,48 0,617 0,695 D(0,1%) 0,191 0,272 0,457 0,668 0,751 D(0,3%) 0,195 0,32 0,558 0,755 0,88 D(0,5%) 0,182 0,399 0,628 0,856 0,941 5 6 7 8 9 10 0,737 0,747 0,763 0,717 0,676 0,647 0,816 0,84 0,821 0,81 0,74 0,699 0,943 0,932 0,91 0,883 0,843 0,804 1,036 1.043 1,019 0,99 0,95 0,909 Bảng 12 : Giá trị OD của các mẫu thí nghiệm bổ sung axít amin vào môi trường phân bón. Từ số liệu trên ta xây dựng được đường cong sinh trưởng như hình 14. * Nhận xét: -Thời gian đạt mật độ cực đại ở các mẫu có bổ sung axit amin là 6 ngày, sớm hơn ở mẫu đối chứng là 1 ngày. -Mẫu 4 (bổ sung 5% dung dịch D), vi tảo phát triển mạnh mẽ nhất, hầu như triệt tiêu pha thích nghi mà phát triển ngay thành pha logarit. Mật độ cực đại đạt được là OD = 1,043 tương đương 18,55 triệu tế bào/ml. * Thảo luận: Như vậy vi tảo Nannochloropsis sp có nhu cầu về axit amin như là nguồn Ni tơ hữu cơ cần thiết cho sự sinh trưởng của chúng. Để nuôi thu sinh khối, có thể bổ sung nguồn giàu axít amin rẻ tiền để nâng cao khả năng sinh trưởng và mật độ tế bào. Nhưng lưu ý là việc bổ sung axit amin vào môi trường có thể thúc đẩy các tạp nhiễm phát triển mạnh mẽ ,thậm trí có thể lấn át sự phát triển của vi tảo. III.2.2. Nhân giống thứ cấp và thử nghiệm nuôI sinh khối trong điều kiện tự nhiên Điều kiện tự nhiên có những đặc điểm khác với điều kiện phòng thí nghiệm là: Tận dụng nguồn năng lượng ánh sáng mặt trời (nhưng chỉ vào ban ngày). Khó khống chế được các điều kiện như ánh sáng, nhiệt độ,dễ bị nhiễm tạp trong điều kiện tự nhiên. Chúng tôi tiến hành nhân giống sơ cấp và thử nghiệm nuôi thu sinh khối trong điều kiện tự nhiên, sử dụng môi trường phân bón, chế độ khử trùng ozon, bổ sung môi trường sau khử trùng. Thời điểm tiến hành thí nghiệm vào khoảng tháng 3-đầu tháng 4 thời tiết không thuận lợi: mưa nhiều, ánh sáng yếu, nhiệt độ thay đổi nhiều từ 18 - 300C vào ban ngày. Để tăng cường khuấy trộn trong các chúng tôi tiến hành sục khí, kết hợp bơm khuấy đảo bằng bơm chìm Lifetech AP 1500,và AP 2500. * Nhân giống thứ cấp. Chúng tôi tiến hành nhân giống sơ cấp trong cacs bính thuỷ tinh 2 lit, 30 lít, bể kính 50lít và thu được kết quả như hình sau: Hình 15: Nhân giống sơ cấp trong điều điều kiên tự nhiên. Hình 16: Nhân giống thứ cấp trong điều kiện tự nhiên. * Thử nghiệm nuôi thu sinh khối trong điều kiện tự nhiên. Chúng tôi tiến hành thử nghiệm nuôi thu sinh khối trong điều kiện tự nhiên, trong bể có thể tích 300ml. Bể có dạng hình chữ nhật 2x0,5x0,2 m x m x m có bố trí một đường gờ ở giữa dọc theo bể để tạo kênh dẫn,sử dụng một bơm chìm lifetech AP 3500 để bơm nước tuần hoàn trong kênh của bể. Tiến hành nuôi vi tảo vào trong bể với tỉ lệ giống là 20 % - 25% ,sử dụng phương pháp khử trùng ozon ,bổ sung môi trường phân bón vào sau khử trùng. Kết quả thu được như hình sau: Hình 17: Thử nghiệm nuôi thu sinh khối trong điều kiện tự nhiên. III.3. triển khai áp dụng thực tiễn. Sau khi đã thử nghiệm và xây dựng được quy trình sản vi tảo trong điều kiện thí nghiệm, chúng tôi tiến hành triển khai áp dụng vào thực tiễn tại một cơ sở nuôi trồng thuỷ sản tại xã Giao Xuân, Huyện Giao Thuỷ tỉnh Nam Định. * Thuận lợi: -Thời điểm triển khai vào cuối tháng tư, thời tiết thuận lợi, mát mẻ, nhiệt độ ổn định từ 25-300C, ánh sáng mạnh và ổn định. -Điều kiện nước biển dồi dào,được lọc sạch (dùng nuôi con giống) -Các thiết bị sẵn có : Các bình thuỷ tinh 70 lít phục vụ cho nhân giống thứ cấp, các bể xi măng 1/2 khối hình chảo, dùng nuôi thu sinh khối. * Khó Khăn: -Trong điều kiện môi trường khí hậu biển dễ nẩy sinh vấn đề tạp nhiễm những động vật phù du ăn tảo, các loài tảo lạ đặc trưng ch vùng mà không bắt gặp ở điều kiện phòng thí nghiệm. -Trong điều thực tiễn các thiết bị để đảm bảo điều kiện vô trùng rất khó khăn,hầu như không có,chỉ sử dụng thiết bị khử trùng ozon công suất 2mg/h. -Khó điều chỉnh các điều kiện môi trường nuôi như ánh sáng nhiệt độ, thời tiết thay đổi đột ngột,mưa kéo dài... khi nuôi thu sinh khối lớn trong điều kiện ngoài trời. -ở miền Bắc nước ta việc nuôi thu sinh khối vi tảo trong điều kiện ngoài trời chỉ thuận lợi vào mùa hè, thời tiết ấm, ánh sáng nhiều mà khó có thể tiến hành vào mùa đông. -Chủng tảo nannochloropsis sp cũng như các chủng tảo khác nói chung khá nhậy cảm với sự tác động của các yếu tố gây hại, sự thay đổi của điều kiện môi trường nên dễ bị kết lắng và tàn lụi khi gặp điều kiện bất lợi. -Nồng độ muôi thay đổi theo mùa trong năm từ 22 - 30‰. * Hướng khắc phục: -Do vi tảo Nannochloropsis sp có kích thước nhỏ hơn nhiều các tạp nhiễm, các động vật phù du và các loài tảo hoang dại, nên có thể sử dụng phương pháp lọc để làm sạch vi tảo trước khi tiến hành nhân giống. Sử dụng các lưới lọc sẵn có trong nuôi trồng thuỷ sản, kích thước lỗ lọc là 30micromet. Nhưng phải đảm bảo khử trùng kĩ môi trường, dụng cụ, bình nuôi. -Các bể nuôi phải được bố trí nơi thoáng mát sạch sẽ có mái che di động bằng ninon (che mưa) + lưới đen chắn sáng (giảm bớt ánh sáng và tránh nhiệt độ tăng quá cao). Đồng thời các bể được bố trí nổi trên mặt đất, có tiếp xúc với cac máng dẫn nước để khi nhiệt độ tăng cao có thể bơm nước vào làm hạ nhiệt xuống. -Chỉ có thể tiến hành nuôi vi tảo vào mùa nắng ấm, nhiều ánh sáng, còn vào mùa đông nhiệt độ xuống thấp chỉ nuôi trong nhà ở mức bảo quản. Vì mùa sinh sản của động vật biển chủ yếu vào tháng 3 đến tháng tám, nhu cầu về tảo lúc này là lớn nhưng có thể cung ứng được. -Để tăng cường khả năng chống chiu của vi tảo, chúng tôi tiến hành nhân giống ban đầu với mật độ giống cao, bổ sung 40-50% giống, thậm trí 60%. Kiểm tra hoạt tính quang hợp băng thiết bị đo DO trước khi tiến hành nhân ra. Mẫu nào không đạt chất lượng cần được loại bỏ. * Tiến hành : Giống được kiểm tra sự tạp nhiễm và lọc qua lưới lọc 30 micromet trước khi nhân. Toàn bộ sử dụng môi trường phân bón. Môi trường nước biển, thiết bị, dụng cụ được khử trùng kĩ bằng ozon, bổ sung phân bón, hoá chất vào sau khử trùng. Dùng bơm Lifetech AP 3500 để khuấy trộn. Điều kiện ánh sáng ngoài trời, nhiệt độ 25-320C,nếu nhiệt độ lên cao hơn thì phải chắn bớt ánh nắng. * Kết quả : Công việc triển khai đã đạt được những thành công bước đầu. Đã khắc phục được những hạn chế ban đầu và nhân giống ra được nhiều bình thuỷ tinh 70 lit, chuẩn bị cho nhân nuôi thu sinh khối trong các bể 1/2 khối. Như vậy việc triển khai áp dụng thực tiễn rất khả thi. Chương 4 KếT LUậN và kiến nghị * Kết luận. Có thể sử dụng môi trường Walne cải tiến (Bổ sung 3 loại Vitamin B1, B12, H) làm môi trường cơ bản cho bảo quản,nhân giống vi tảo Nannochloropsis sp trong điều kiện phòng thí nghiệm. Có thể sử dụng phương pháp khử trùng bằng Ozon để thay thế cho các phương pháp khử trùng thông thường để khử trùng môi trường cùng dụng cụ trong nhân giống sơ cấp và nuôi thu sinh khối vi tảo. Chủng vi tảo Nannochloropsis có thể sinh trưởng phát triển tốt trong môi trường nước biển có nồng độ muối thay đổi trong dải từ 22-30‰, tốt nhất là 25‰. Có thể pha thêm muối vào môi trường nước lợ để pha môi trường nước biển bán nhân tạo làm tăng năng suất trong sản xuất sinh khối vi tảo. Vi tảo Nannochloropsis sp có khả năng sử dụng ure và có nhu cầu về ure làm nguồn bổ sung Nitơ.Trong nuôi thu sinh khối ngoài trời có thể sử dụng môi trường phân bón đạm (100mg/l), lân10 (mg/l), kết hợp thành phần vi lượng , (sắt14mg/l) , axit citric (15mg/l), ure (10mg/l), vitamin các loại B1, B12, H để nuôi vi tảo đạt mật độ cực đại cao và tăng trưởng nhanh. Vi tảo Nannochloropsis sp có khả năng sử dụng axit amin và có nhu cầu về axit amin làm nguồn bổ sung Nitơ hữu cơ. Có thể nâng cao mật độ, giảm thời gian đạt cực đại bằng cách bổ sung vào môi trường giàu axit amin. * kiến nghị. Mặc dù đề tài đã thu được những kết quả khả quan là đã nhân giống và nuôi thu sinh khối quy mô phòng thí nghiệm có hiệu quả, hiện đang được triển khai trong thực tế ở một số đơn vị nuôi giống thuỷ sản.Tuy nhiên việc nghiên cứu đề tài xây dựng quy trình sản xuất vi tảo làm thức ăn cho con giống động vật biển còn có một số điểm hạn chế như sau: Việc nghiên cứu được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm. Nên việc nghiên cứu triển khai vào thực tế từng vùng sẽ còn gặp nhiều khó khăn tuỳ thuộc vào điều kiện của vùng đó, do đó khi áp dụng cho từng vùng khác nhau cần phai co sự nghiên cứu khảo sát điều kiện của vùng đó để việc triển khai đạt được kết quả mong muốn. Quá trình sản xuất vi tảo còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu thời tiết trong khi điều kiện khí hậu thời tiết miền bắc nước ta không ổn định thường thay đổi theo từng mùa trong năm nên cần tiếp tục nghiên cứu tăng cường tính ổn định trong kĩ thuật nuôi vi tảo. Do có những điểm hạn chế trên nên tôi kiến nghị cần tiếp tục vừa tiến hành triển khai nuôi thu sinh khối vi tảo vừa tiến hành nghiên cứu tối ưu hoá môi trường nuôi, tăng cường ổn định kĩ thuật nuôi để có thể đảm bảo cung cấp thức ăn tươi sống vi tảo cho con giống hải sản đặc biệt vào mùa sinh sản của các loài hải sản. Chương 5 Tài liệu tham khảo. PGS,PTS Đặng Đình Kim ,(1998) ”Công nghệ sinh học vi tảo" , Nhà xuất bản Nông Nghiệp,Trang.... Nguyễn Thị Xuân Thu,Nguyễn Thị Bích Ngọc,Nguyễn Thị Hương, "Tảo đơn bào- cơ sở thức ăn của động vật thuỷ sản" . Nguyễn Thị Hương,Nguyễn Trọng Nho,"ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái lên sự phát triển của quần thể tảo Chaetoceros calcitrans", Trong tập"Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1984-2004),2004,Trung tâm nghiên cứu thuỷ sản III - Nha Trang ,Trang 405-423,Trang 424-446. Tuyển tập hội thảo toàn quốc về NC & ƯD KHCN trong nuôi trồng thuỷ sản,2004. Trang 607-610. Phạm Thị Lam Hồng,1999. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ mặn ,ánh sáng và tỷ lệ thu hoạch lên một số đặc điểm sinh học, thành phần sinh hoá của hai loài vi tảo Nannochlorosis oculata (Drop) Hibber và Chaetoceros muerelli Lemmerman, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Luận văn thạc sĩ. Trường đại học thuỷ sản Nha trang. Brown. M, 1991. The amino acid and sugar composition of 16 species of microalgae used in mariculture. J. Exp. Mar. Biol. Ecol.’ CSIRO.Australia Vol.145. pp. 79 – 99. Brown. R. M, et al (1993).” The gross and amino acids comporitions and semicontinuous cultures of Isochrysis sp, Pavlovacutheri and Nannochloropsis oculata” ,Journal of applied Phycology, 285 - 296 . Eirick O.Duer, Augustin Molnar, and YernonSato(1998). ” Cultured microalgae as aquaculture feeds.” Mini –revicu. J. Mar. Biotech :65-70. Markovits. A., Conjeros.R.,Lopez.L. and Lutz.M.1992.Evaluation of microalga Nannochloropsis sp as a potential dietary supplement: Chemical,nutitional and short term toxicological evaluation.Nutrition Research.12.1273-1284.