Đề tài Phân tích Acid Amin

MỤC LỤC Giới thiệu về acid amin 1 Thành phần và cấu tạo 1 Màu sắc, mùi vị 1 Tính tan 1 Tính quang học 1 Tính lưỡng tính 3 Thu nhận acid amin 3 Tinh sạch protein trước khi thu nhận 3 Các phương pháp thu nhận protein 6 Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký 7 Sắc ký giấy 7 Sắc ký lớp mỏng 8 Sắc ký khí 8 Một vài phương pháp cụ thể 8 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) 8 Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc ký với dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl 13 Tài liệu tham khảo 34 Giới thiệu về acid amin: Thành phần và cấu tạo: Protein là polymer của các amio acid nối với nhau bằng các liên kết cộng hoá trị là liên kết peptide. Protein có thể bị thuỷ phân tạo thành các acid amin tự do bằng nhiều phương pháp khác nhau. Người ta đã xác định protein được cấu trúc từ 20 loại acid amin khác nhau. Acid amin là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl (-COOH) và ít nhất một nhóm amino (NH2), trừ prolin chỉ có nhóm NH (thực chất là một acid imin). Trong phân tử acid amin đều có các nhóm COOH và NH2 gắn với carbon ở vị trí α. Hầu hết các acid amin thu nhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng L-α acid amin. Như vậy các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R). Màu sắc và mùi vị: Các acid amin thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như glycine, alanine, valine, serine histidine, triptophan; một số loại có vị đắng như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium glutamate). Tính tan: Các acid amin thường dễ tan trong nước, khó tan trong alcohol và ether (trừ proline và hydrogenxyproline). Chúng cũng dễ hoà tan trong acid và kiềm loãng (trừ tyrosine). Tính quang học: Các acid amin trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. Quay phải được ký hiệu bằng dấu (+), quay trái được ký hiệu bằng dấu (-). Góc quay đặc hiệu của acid amin phụ thuộc vào pH của môi trường. Tuỳ theo sự sắp xếp trong cấu trúc phân tử của các nhóm liên kết với carbon bất đối mà các acid amin có cấu trúc dạng D hay L (hình 1) gọi là đồng phân lập thể. Số đồng phân lập thể được tính theo 2n (n là số carbon bất đối) Hình 1: Đồng phân lập thể của alanine Hầu hết các acid amin khác hấp thụ tia cực tím ở bước sóng (λ) khoảng từ 220 -280 nm. Đặc biệt cùng nồng độ 10-3M, trong bước sóng khoảng 280 nm tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp 4 lần khả năng hấp thụ của tyrosine (hình 2.8) và phenylalanine là yếu nhất. Phần lớn các protein đều chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất này để định lượng protein. Hình 2: Phổ hấp thụ ánh sáng cực tím của tryptophan và tyrosine Tính lưỡng tính: Trong phân tử acid amin có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng nhường proton (H+) thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin-NH2 nên có khả năng nhận proton nên thể hiện tính base. Vì vậy acid amin có tính chất lưỡng tính. Trong môi trường acid, acid amin ở dạng cation (tích điện dương), nếu tăng dần pH acid amin lần lượt nhường proton thứ nhất chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện), và tiếp tục tăng pH acid amin sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dang anion (tích điện âm). Vì vậy đôi khi người ta coi nó như một di-acid. Thu nhận acid amin: Tinh sạch protein trước khi thu nhận acid amin: Giới thiệu: Phân tích acid amin của protein là một trong những phương pháp tốt nhất và chính xác nhất để định lượng protein. Sự cần thiết của việc thu nhận mẫu ở nồng độ cao và không bị nhiễm là một vấn đề cần giải quyết để xác định cấu tạo protein. Nhiều phương pháp hiện có để loại bỏ chất đệm, muối ra khỏi protein như phương pháp kết tủa hoặc sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) gây thất thoát protein nhiều, làm việc đánh giá nồng độ thực trở nên khó khăn. Sau đây là hai phương pháp thường dùng để thu hồi protein từ chất đệm: phương pháp lọc gel, cột vi xoáy tốc độ cao, và sự hấp thu vào màng poly vinylidene difluoride (PVDF) trong hộp chuẩn bị mẫu ProSorb. Nguyên liệu: 2.1 Thiết bị: 1. Cột vi xoáy tốc độ cao (Việc lựa chọn kích cỡ thích hợp của cột vi xoáy quan trọng cho thể tích mẫu. Mẫu thể tích càng nhỏ thì nên chọn cột nhỏ) 2. Hộp chuẩn bị mẫu ProSorb. 3. Màng vận chuyển Immobilon-PSQ. 4. Ống thủy phân mẫu (toàn bộ vật dụng thủy tinh dùng cho thủy phân nên được làm sạch kỹ và đun đến 500oC) 5. Lọ phản ứng. 2.2 Chất phản ứng: 1. Nước HPLC (luôn dùng chất phản ứng và nước có chất lượng tốt nhất) 2. Trifluoroacetic acid (TFA) 3. Methanol 4. Acid clohiric (HCl) 5. Phenol Cụ thể: 20% methanol, 0.1 N HCl 6N HCl + 0.1% phenol 0.1% TFA Phương pháp: 3.1 Chuẩn bị cột macrospin (mẫu 50-150 µL) 1. Cột macrospin cần được chuẩn bị cơ bản theo đề nghị của nhà sản xuất. Lắp cột nhẹ nhàng để thu hồi gel ở đáy cột. Hydrate hóa gel với 500 µL nước HPLC trong 15 phút ở nhiệt độ phòng (phần trăm mẫu thu hồi được tăng khi thời gian hydrate hóa tăng cột vi xoáy), sau đó ly tâm cột trong 4 phút ở 2000g để làm cân bằng cột. 2. Rửa cột 3 lần với 500 µL nước để bảo đảm sự cân bằng. 3. Thấm khô phần ngoài cột để loại ẩm và đặt nó vào một ống mới. Đối với cột macrospin, thêm 50-150 µL mẫu vào đỉnh, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột. 4. Ly tâm ống 4 phút ở 2000g, rửa cột với ít nhất 200 µL nước. 5. Lấy mẫu đã tinh sạch ra và r ú t chân không ở tốc độ cao đến khô trước khi thủy phân. (Khi mẫu chứa nồng độ protein hoặc peptide cao với thể tích thích hợp, không cần tinh sạch mẫu thêm, chỉ cần pha loãng mẫu với nước HPLC đến một dung dịch muối không ảnh hưởng đến quá trình phân tích.) 3.2 Cột vi xoáy (mẫu 5-25 µL) 1. Giống như đối với cột macro, rút gel khô đến đáy thùng. Làm ướt với 50 µL nước và ly tâm 3 phút, ở 1000g để cân bằng cột. Để có kết quả tốt nhất, rửa cột 3 lần với 200µL nước. Để ly tâm những cột này, đặt chúng trực tiếp vào một máy ly tâm vi mô hoặc dùng một ống ly tâm rỗng 1.7 mL. 2. Sau khi cột đã cân bằng, thấm khô để loại bỏ ẩm bám bên ngoài cột. 3. Thêm 5-25 µL mẫu vào đỉnh cột, cẩn thận đặt mẫu vào giữa cột. 4. Đặt cột vào một ống mới, xoay ống 3 phút ở 1000g. Sau khi ly tâm, mẫu đã tinh sạch ở trong ống và sẵn sàng để sử dụng. 3.3 Chuẩn bị hộp mẫu ProSorb 1. Đảm bảo rằng mẫu đựng trong dung dịch 0.1% TFA để đạt kết quả tốt nhất (Acetonitrile (ACN) với nồng độ hơn 15% cản trở mẫu dính vào PVDF, vì vậy những phần của HPLC nên pha loãng với nước cất hoặc 0,1% TFA để giảm nồng độ của ACN xuống nhỏ hơn 15%). Nếu thể tích ít hơn 100 µL, pha loãng mẫu thành 100 µL với 0.1% TFA. Nếu mẫu có chất tẩy, pha loãng để nồng độ chất tẩy thấp hơn giá trị trong bảng 1 vì chất tẩy có thể ảnh hưởng sâu sắc đến sự kết dính protein vào màng PVDF. Bảng 1 tóm tắt nồng độ của chất tẩy có thể chứa trong mẫu trước khi kết dính vào màng. Ngoài ra, nếu mẫu chứa lượng chất tẩy lớn hơn lượng tối đa trong bảng 1, có thể thêm một lượng nhỏ methanol vào mẫu trước khi cho mẫu vào hộp mẫu ProSorb) Bảng 1: Hàm lượng chất tẩy tối đa Chất tẩy Nồng độ tối đa (v/v hoặc w/v) Triton X-100 0.01 Tween-20 0.01 SDS 0.02 Octyl glucoside 0.25 Brij 35 0.02 2. Đặt thiết bị ProSorb vào một giá ống nghiệm thích hợp. 3. Làm ướt màng PVDF trong hồ nhỏ với 10 µL methanol (hộp mẫu ProSorb nên được chuẩn bị kỹ như chỉ dẫn của nhà sản xuất, dùng nước MilliQ cho mọi bước làm sạch để giảm lượng acid amin còn sót lại.) 4. Cho mẫu vào hồ nhỏ (100 đến 400 µL thể tích), để cho mẫu chảy qua màng. (Thao tác với mẫu nên cẩn thận vì protein và peptide có thể dính vào ống thủy tinh hoặc nhựa. Nếu mẫu nhỏ, có thể giảm thiểu tổn thất ở cartridge bằng cách cho 100 µL dung dịch đệm vào màng ướt trước khi cho mẫu vào. Mẫu có thể thêm trực tiếp vào dung dịch đệm.) 5. Đảm bảo rằng mẫu hồ nhỏ tiếp xúc hoàn toàn với chất hấp thụ và sự chuyển chất lỏng bắt đầu. 6. Thêm những mẫu thử thể tích nhỏ, nếu cần (đổi chất hấp thụ sau mỗi 750 µL) 7. Rửa màng với 100 µL 0.1% TFA 2 lần. 8. Lấy mẫu và làm khô màng PVDF. 3.4 Thu nhận mẫu đã thủy phân trên màng PVDF 1. Đặt màng PVDF vào đáy của ống thủy phân. 2. Thủy phân như bình thường. Sau khi acid đã được làm khô từ mẫu thủy phân, thêm 10 µg methanol. Chiết 2 lần với 50 µL dung dịch gồm 20% MeOH, 0,1N HCl và chuyển đến ống Eppendorf 0,5mL. 3. Đặt ống Eppendorf vào thùng PICOTAG và làm khô nó. 4. Pha loãng với dung dịch đệm loãng và lọc, dùng một cột vi xoáy. Mẫu đã sẵn sàng để phân tích acid amin. Thu nhận acid amin bằng thủy phân protein: Thủy phân bằng acid: Để thu nhận acid amin, phương pháp thường được dùng nhất là thủy phân bằng dung dịch HCl 6N dư ở nhiệt độ 100-120oC trong 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin dưới dạng tự do dưới dạng hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy một phần, tryptophan bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagines bị phân hủy thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+. Thủy phân bằng kiềm: Người ta còn có thể thu nhận acid amin bằng phương pháp thủy phân với dung dịch NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các acid amin nhưng đều bị racemic hóa, các acid amin cysteine, serine, threonine bị phá hủy nhưng tryptophan không bị phá hủy. Vì vậy, phương pháp thủy phân bằng kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan. Thủy phân bằng enzyme: Để thu nhận chế phẩm acid amin, ngày nay việc thủy phân bằng enzyme được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau do việc sử dụng enzyme có nhiều ưu điểm. Các enzyme thủy phân protein thành các acid amin hay các peptide có phân tử lượng thấp được gọi chung là peptidhydrogenlase. Có nhiều loại peptidhydrogenlase, chúng được phân biệt nhờ tính đặc hiệu khác nhau với liên kết peptid. Một số loại cắt đứt liên kết peptide ở đầu tận cùng của chuỗi polypeptide được gọi là exopeptidase như carboxypeptidase phân giải liên kết peptide đầu C tận cùng, aminopeptidase phân giải liên kết peptide đầu N tận cùng. Một số khác chỉ cắt đứt ở giữa chuỗi polypeptide được gọi là các endopeptidase như pepsin, tripsin… Định lượng acid amin bằng phương pháp sắc ký: Người ta có thể dùng nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, ở đây chỉ giới thiệu nguyên tắc của một số phương pháp thông dụng để phân tích acid amin. 1) Sắc ký giấy Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự phân bố giữa hai pha dung môi: dung môi cố định và dung môi di động. Dung môi cố định thường là nước giữ ở giấy sắc ký (trong điều kiện bảo hoà hơi nước, giấy có thể giữ 15-22% nước tính theo trọng lượng giấy). Dung môi di động thường là một dung môi hữu cơ bảo hoà nước di chuyển trên tờ giấy theo mao dẫn kéo theo các chất trong dung dịch. Tốc độ di chuyển của từng chất không giống nhau và mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là Rf. Trong đó: - a là khoảng cách chuyển dịch của chất phân tích - b là khoảng cách chuyển dịch của dung môi Có nhiều kiểu sắc ký giấy khác nhau, đó là sắc ký một chiều đi lên, sắc ký một chiều đi xuống, sắc ký vòng nằm ngang và sắc ký hai chiều. Loại giấy thường dùng là Whatman số 1 và Schleicher-Schull 2044 a và b, dung môi gồm các chất như 4 Butanol:1 Acetic acid: 5 Nước (dùng cho chiều thư nhất); 3 Phenol: 1 Nước (dùng cho chiều thứ hai). 2) Sắc ký lớp mỏng Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên lý thuyết của sắc ký giấy, nghĩa là cũng dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha: chất hấp phụ được tráng rộng trên một phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là dung môi thích hợp. Dung môi di chuyển làm dịch chuyển các chất trong mẫu thử. Các chất hấp phụ thường dùng là silicagel, alumin oxyt, sephadex ,v.v...được kết hợp với thạch cao (gypse) để dán vào phiến kính 3) Sắc ký khí Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng tính chất khó bay hơi của các acid amin nên có thể sử dụng chương trình nhiệt để chuyển chúng thành các dẫn xuất (thường là N-acetyl-amin). Cho tác dụng acid amin với cồn amylic và HBr khan, sau đó cho tác dụng hỗn hợp này với anhydrid acetic. Cột thường dùng là loại Chromosorb W (60-80 mesh) có một lớp polyetylenglycol 1% (carbowax 1564 hoặc 6000). Chương trình nhiệt giữa 125o C và 155oC, tốc độ chảy 60-240 mL/phút. Một vài phương pháp cụ thể Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp sau phản ứng tạo dẫn xuất với 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide (thuốc thử Marfey) Giới thiệu Việc tạo dẫn xuất của acid amin kèm theo việc phân tích sắc ký lỏng cao áp có đảo pha (RP-HPLC) được xem là phương pháp thích hợp nhất để phân tích acid amin. Các bước tạo dẫn xuất không chỉ cần thiết cho sự tương tác với pha không phân cực và ổn định, mà còn cần cho việc đo quang. Thuốc thử Marfey 1-fluoro-2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide hoặc (S)-2-[(5-fluoro-2,4-dinitrophenyl)-amino]propanamide được sử dụng để tách và xác định cấu hình acid amin. Thuốc thử phản ứng hóa học với nhóm amino của đối hình acid amin để tạo ra dẫn xuất ổn định mà có thể tách bằng phương pháp RP-HPLC (hình 1). Dinitronphenyl alanine amid hấp thu mạnh bước sóng 340 nm (ε = 30000 M-1 cm-1), điều này cho phép đầu dò xác định được ở phạm vi subnmol. Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey cũng được dùng để định lượng 19 L-acid amin thường gặp. Ưu điểm của thuốc thử Marfey là: Có khả năng tạo sắc phổ trên bất kỳ thiết bị phân tích HPLC nào mà không cần phải tăng nhiệt độ cột phản ứng. Những dung môi không tinh khiết khác khó dò được bước sóng 340 nm. Phát hiện cả sự có mặt của proline khi chạy cột sắc ký đơn. Tạo dẫn xuất acid amin ổn định. Kỹ thuật đo đơn giản này đem lại cho những nhà phân tích acid amin một phương pháp hiệu quả và rẻ tiền. Việc tạo dẫn xuất với thuốc thử Marfey còn có những ứng dụng trong các lĩnh vực hóa sinh, trong đó có việc xác định cơ chất và sản phẩm trong những phản ứng enzyme của acid amin. Hình 3: Thuốc thử Marfey (I) và L,L-dẫn xuất từ L-acid amin và thuốc thử (II) Nguyên liệu-Thiết bị: Thủy phân protein Ống nghiệm bằng thủy tinh chịu nhiệt kích thước 25-50 x 5 mm Ống nghiệm thủy tinh có nắp khoen siết chặt Dung dịch HCl 6N Phản ứng thu nhận dẫn xuất dd acid amin chuẩn Bộ kit thử L-acid amin chuẩn LAA21 Thuốc thử Marfey. Lưu ý: thuốc thử Marfey là dẫn xuất của 1-fluoro-2,4-trinitrobenzene, chất nghi ngờ là có khả năng gây ung thư nên cần thận trọng khi sử dụng. HPLC grade triethylamine, methanol, acetone và dimethyl sulfoxide (DMSO) Phân tích sắc ký: Hệ thống vận chuyển dung môi: bất kỳ thiết bị phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp nào cũng có thể sử dụng để thu nhận dẫn xuất của acid amin. Cột sắc ký: cột silicat C8 chuyển đổi pha, ví dụ như: LiChrospher 100 RP 8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), Aquapore RP 300 (220 x 4.6 mm; 7 μm from Perkin-Elmer), Nucleosil 100-C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel), or Vydac C8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from The Separations group). Đầu dò UV/vis kèm theo ô chứa chất lỏng dài 0.5-1 cm, thể tích 3-5 µL. Dẫn xuất của acid amin được phát hiện ở 340 nm. Tổng hợp peak: các phần mềm máy tính được dùng để tổng hợp và định lượng peak của acid amin Dung môi: phải được chuẩn bị với HPLC grade và phải được loại khí Dung môi A: 13 mM trifluoroacetic acid (TFA) cùng với 4% (v/v) tetrahydrofuran trong nước. Dung môi B: Acetonitrile (50% v/v) trong dung môi A. Phương pháp: Thủy phân protein: Lấy vào lọ thủy tinh nhỏ 50-500 pmol mẫu protein hoặc 20 μL dung dịch acid amin chuẩn chứa 2.5 μmol/mL mỗi 17 acid amin, sau đó làm khô dưới áp suất nhẹ trong thiết bị cô đặc SpeedVac. Đặt những lọ thủy tinh mẫu trên vào lọ thủy tinh có nút khoen chặt chứa 200 μL dung dịch HCl 6N. Sục khí argon vào những lọ trên trong 5-15 phút rồi đậy nắp kín và không cho không khí lọt vào. Ủ những lọ thủy tinh ở 110oC trong 24 giờ hoặc 150oC trong 2 giờ trong tủ ấm khô. Chờ một thời gian cho quá trình thủy phân xảy ra xong, lấy những lọ thủy tinh khỏi tủ ấm, làm nguội về nhiệt độ phòng và mở nắp từ từ. Lấy lọ thủy tinh nhỏ ở trong ra, lau khô bề mặt ngoài bằng giấy mềm rồi làm khô ở áp suất nhỏ. Phản ứng thu nhận dẫn xuất: Thêm 50 μL hỗn hợp theo tỉ lệ triethylamine : methanol : nước = 1 : 1 : 2 vào lọ đã làm khô rồi trộn vortex thật đều, sau đó đem làm khô. Chuẩn bị dung dịch thuốc thử cho phản ứng tạo dẫn xuất (18.4mM) bằng cách cho 5 mg thuốc thử Marfey vào 1 mL dung dịch acetone. Cho hỗn hợp acid amin đã làm khô hoặc mẫu protein đã thủy phân vào 100 μL triethylamine 25% v/v, rồi thêm vào 100 μL dung dịch thuốc thử Marfey và trộn vortex thật đều. Ủ lọ thủy tinh đó ở 40oC trong 60 phút trong điều kiện khuấy trộn nhẹ và tránh ánh sáng để phản ứng tạo dẫn xuất xảy ra. Sau khi ủ, thêm vào hỗn hợp 20 μL dung dịch HCl 2N. Khi này phản ứng kết thúc. Làm khô hỗn hợp dưới áp suất nhỏ. Bảo quản hỗn hợp ở -20oC trong bóng tối cho đến khi sử dụng. Thêm vào mẫu đã làm khô 1mL dung dịch dimethyl sulfoxide (DMSO) 50% v/v. Phân tích sắc ký: Thêm dung môi A và dung môi B vào hệ thống phân tích sắc ký lỏng cao áp theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cân bằng cột chạy sắc ký và đầu dò với 90% dung môi A và 10% dung môi B. Đem mẫu đi phân tích ở nhiệt độ phòng; nếu cần có thể pha loãng với dung môi A bằng cách thêm vào cột 20 μL (50-1000 pmol). Rửa giải cột với hàm lượng dung môi A và B như bảng 2. Việc phân tích dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide của 18 L-acid amin thường gặp và acid cysteic thu được kết quả trong 120 phút (hình 4). Bảng 2: Chương trình HPLC cho sự phân giải dẫn xuất acid amin với thuốc thử Marfey. Thời gian (phút) % Dung môi A % Dung môi B 0 90 10 15 90 10 15,1 90 10 115 50 50 165 0 100 170 0 100 Xác định những yếu tố ảnh hưởng đối với mỗi acid amin từ khu vực đỉnh của biểu đồ sắc phổ ở những hàm lượng 100, 250, 500 và 1000 pmol. Khi quá trình phân tích sắc ký kết thúc, rửa cột và bơm vào methanol đã loại khí 20% v/v để bảo quản. Trước khi sử dụng lại, làm sạch với 100% methanol. Hình 4: Sự tách dẫn xuất 2,4-dinitrophenyl-5-L-alanine amid của L-acid amin bằng phương pháp HPLC. Thuốc thử Marfey tạo dẫn xuất từ lượng 20 μL hỗn hợp acid amin chuẩn. Thiết bị: cột LiChrospher 100 RP 8 (250 x 4.6 mm; 5 μm from Macherey-Nagel); mẫu chứa 100 pmol dẫn xuất của 18 L-acid amin; dung môi A chứa 13mM acid trifluoroacetic cùng tetrahydrofuran 4% v/v trong nước; dung môi B chứa acetonitrile 50% v/v trong dung môi A; tốc độ chảy 1mL/phút; đầu dò bước sóng 340 nm; cột rửa giải với lượng dung môi B trong dung môi A phù hợp. Dẫn xuất acid amin được biểu thị bằng những chữ cái, ví dụ acid cysteic được ký hiệu là CYA, còn cysteine là Cs. FFDA đặc trưng cho đỉnh của thuốc thử; đỉnh không có ký hiệu tượng trưng cho thuốc thử phụ có liên quan, như được chỉ trong quá trình chạy sắc phổ riêng lẻ trong thuốc thử riêng. Chú ý: Để phân tích acid amin khi acid này đóng vai trò là cơ chất hay sản phẩm trong phản ứng enzyme, việc tách protein từ acid nucleic là cần thiết. Thêm dung dịch acid perchloric 4M vào dịch cô đặc cuối cùng nồng độ 1M và ủ trên đá trong ít nhất 15 phút. Khi thêm cùng một thể tích dung dịch KOH 2M ở trạng thái lạnh, acid perchloric chuyển thành muối KClO4. Sau khi ly tâm 15 phút ở 4oC, ta thu chất nổi trên bề mặt, đem làm khô rồi sử dụng cho quá trình tạo dẫn xuất. Việc tách hoàn toàn dung dịch HCl ra khỏi hỗn hợp là rất quan trọng cho phản ứng giữa các acid amin và thuốc thử Marfey. Tỉ lệ giữa thuốc thử Marfey và tổng lượng acid amin không nên vượt quá tỉ lệ 3:1 Trong suốt quá trình thu nhận dẫn xuất, màu của hỗn hợp phản ứng chuyển từ vàng sang cam rồi đỏ. Trong quá trình acid hóa, màu của hỗn hợp chuyển sang vàng. Hỗn hợp acid amin sẽ giữ được tính chất ổn định trong hơn 1 tháng khi bảo quản ở -20oC trong bóng tối. Trong dung dịch DMSO 50% v/v, dẫn xuất thu được sẽ ổn định trong 72 giờ ở -4oC và hơn 6 tuần nếu bảo quản ở -20oC. Để quá trình đạt hiệu suất cao nên sử dụng thiết bị phun HPLC tự động. Cột phản ứng silicat C8 từ những nhà sản xuất khác nhau sẽ cho kết quả của 19 dẫn xuất acid amin, tuy nhiên, khu vực dốc gradient của dung môi B nên tương tự cho mỗi cột. Nếu tính thêm acid S-carboxymethyl-L-cysteine và tryptophan thì 2 acid này tách riêng biệt trong sắc phổ riêng lẻ. Việc xác định mỗi đỉnh trên biểu đồ sắc phổ được thiết lập bằng việc thêm lượng dư acid amin gấp 3 lần. Ô thuốc thử nên được chạy theo từng mẻ với thuốc thử Marfey để xác định peak liên quan. Thuốc thử dư sẽ gây cản trở cho việc tách riêng peak của arginine và glycine. Lysine và tyrosine được tách riêng như những dẫn xuất không thể thay thế. Xác định hàm lượng acid amin trong thực phẩm bằng phương pháp đảo pha trong phân tích sắc kí với chất dẫn xuất mới butylthiocarbamyl và benzylthiocarbamyl Giới thiệu: Phân tích acid amin với phương pháp phân tích sắc ký lỏng đảo pha và chiếu UV thường được sử dụng đối với những dụng cụ có độ nhạy cao và nhanh hơn nhiều so với phương pháp phân tích acid amin bằng phương pháp trao đổi ion chuyên dụng. Dẫn xuất acid amin phenylthiocarbanyl (PTC) được sử dụng trong phân tích acid amin bằng phương pháp RP HPLC. Đây là phương pháp tốt nhất cho phân tích những dẫn xuất acid amin bậc 2 proline và hydroxy proline. Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là đòi hỏi 1 hệ thống hút chân không và tốn thời gian để loại những sản phẩm phụ được sinh ra trong quá trình và loại thuốc thử dư để tránh nhiễu đối với đỉnh phân tích. Mặc dù có những tiến bộ trong việc tìm thuốc thử cho thu nhận dẫn xuất vì những dẫn xuất vẫn còn khuyết điểm, các nhà khoa học vẫn cần thuốc thử với những đặc điểm: đơn giản, nhạy, ổn định, có khả năng vay hơi cho phương pháp phân tích acid amin với RP HPLC và đầu dò UV. Dẫn xuất sử dụng trong phương pháp phân tích này rất đa dạng, ngoài phương pháp PTC còn có OPA (dansyl, dabsyl, 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPTC)). Với những dẫn xuất OPA, những sản phẩm acid amin bậc 2 proline, hydro proline không thể phát hiện bởi vì OPA không phản ứng với acid amin bậc 2 khi có mặt những tác nhân oxi hóa. Hơn nữa, dẫn xuất Dansyl được hình trong bóng tối và không bền khi thời gian phản ứng kéo dài, dưới tác dụng của dung môi, ánh sáng và bị nhiễu bởi những đỉnh song vì những sản phẩm phụ trong suốt quá trình dẫn xuất hóa. Dẫn xuất dansyl, theo báo cáo thấy rằng nó liên kết với những hợp chất hóa học để tiêu diệt vi khuẩn rất chặt chẽ. Nhược điểm của dẫn xuất này là sự vượt mức hàm lượng ure, muối photphat, NH4NO3 sẽ thay đổi pH đệm của phản ứng và gây cản trở cho quá trình. Dẫn xuất hóa với 4- nitro phenyl thiocarbonyl (NPITC) tạo nên sự ổn định của dẫn xuất NPITC – 1 chất rất phù hợp cho phân tích RP-HPLC và đầu dò UV ở 254- 340 nm. Nhược điểm của NPITC là sự là sự vượt mức thuốc thử không dễ bị loại bỏ dưới áp lực chân không. Trong trường hợp này người ta thường dùng dung môi là toluene để trích ly nó. 1 thuốc thử dễ bay hơi hơn trong phương pháp này là BITC, nó là dẫn xuất của 22 acid amin tiêu chuẩn. BTC_acid amin được phân tích bằng RP-HPLC và đầu dò UV phát hiện ở bước song 250nm. Thuốc thử này cũng rất phù hợp trong phân tích acid amin trong thực phẩm. Ưu điểm của BITC: dễ bay hơi, do đó giảm thời gian phân tích (vì những sản phẩm phụ và thuốc thử dư dễ loại bỏ); khả năng tách dẫn xuất với cystine, cystein, PTC không có khả năng này, những dẫn xuất acid amin bậc 2, proline, hydroxyproline cũng được dò thấy với độ nhạy cảm rất cao. Nhưng asparagines và serine thì không thấy rõ và khả năng bền của dẫn xuất BTC ở nhiệt độ phòng chỉ khoảng 8h. BZTC có dạng tương tự BTC (ngoại trừ NPITC) được thu nhận dẫn xuất từ 22 acid amin đối với BZTC thành công và những dẫn xuất này được tách ra hoàn toàn trong pha đảo của cột Nova. Thuốc thử BZITC kém bay hơi hơn so với BITC nhưng khả năng bay hơi tương tự PITC. Ưu điểm của dẫn xuất BZTC là đạt hiệu quả cao hơn trong phương pháp đảo pha so với dẫn xuất PTC trong cùng điều kiện thí nghiệm. Nguyên liệu-Thiết bị: Thiết bị: Máy hút chân không Hệ thống phân phối dung môi Spectra-Physics 8800 cùng với hệ thống bài khí và ổn định dung môi Đầu dò bước song UV Spectra 200 Nova Pak C18 Thiết bị đun nóng dạng cột Eppendorf CH-30 Thuốc thử: BITC, BZITC, PITC (bảo quản ở 0-5oC) Bolvine serum albumin (BSA), acid amin chuẩn, norleucine. Acid amin chuẩn bảo quản ở nhiệt độ phòng còn BSA được giữ ở 2-8oC. HPLC – grade acetonitrile, CH3OH, tetra hydrofuran (giữ ở nhiệt độ phòng) Những thuốc thử khác Mẫu thực phẩm Dung dịch chuẩn: Dung dịch acid amin chuẩn: Trộn hỗn hợp acid amin chuẩn, ngoại trừ glutamine, cystine, cysteine, được chuẩn bị ở nồng độ 2.5 µmol/mL trong dd HCl 0.01M. Dung dịch chuẩn của glutamine và cysteine được chuẩn bị với nước. Chuẩn bị dung dịch đệm: gồm hỗn hợp acetonitrile-methanol-triethylamine với tỉ lệ 10:5:2 chứa L-norleucine (nồng độ 2.5 µmol/mL) với vai trò như chất chuẩn bên trong, được bảo quản ở 0-5oC và phải chuẩn bị lại sau khoảng thời gian rất ngắn. Phương pháp: Quá trình thủy phân BSA và mẫu thực phẩm: Cho BSA (4mg) và bột đậu nành đã nghiền hoặc mẫu trứng đã đồng hóa (0,2g) lần lượt vào ống nghiệm 5ml và 25ml với nắp vặn có lỗ và màng ngăn. Thêm 0,5ml và 15ml HCl 6M chứa 0,1% phenol vào ống nghiệm 5ml và 25ml, theo thứ tự. Sau khi vặn nắp chặt, đâm 2 kim tiêm bằng thép không rỉ qua màng ngăn. Nối 1 kim ngập trong dung dịch với nitơ khô cung cấp, kim còn lại nối vào bơm chân không. Rút chân không bằng bơm chân không trong 5 phút, đồng thời sục khí nitơ vào. Tháo kim nối với bơm chân không trước khi tháo kim nối với nitơ. Cẩn thận tháo nắp có lỗ, thay bằng nắp không có lỗ vì những lỗ nhỏ có thể tạo thành khi áp suất cao. Thủy phân ở 145oC trong 4 giờ. Làm khô bã BSA với nitơ ở 50oC, hòa tan với 5ml HCl 0,01M. Mẫu đã sẵn sàng cho quá trình tạo dẫn xuất. Lọc bã đậu nành và trứng, sấy với thiết bị sấy thùng quay. Hòa tan và điều chỉnh tới 50ml HCl 0.01M. Dùng sắc ký trao đổi cation để làm sạch dung dịch thủy phân đậu nành và trứng. Cho 5ml dung dịch thủy phân đi qua cột trao đổi cation 100 x 13 mm (Dowex 5 x 8) với vận tốc 6 giọt/phút để giữ lại acid amin ở nhựa trao đổi ion. Rửa cột nhiều lần với 20ml nước. Tách rửa acid amin trên cột trao đổi cation với 40ml dung dịch ammonia 4M, tốc độ 6 giọt/phút. Làm khô dung dịch đã tách rửa trong thiết bị sấy thùng quay ở 50oC, hòa tan bằng dung dịch HCl 0,01M và điều chỉnh thể tích đến 50ml. Mẫu đã sẵn sàng cho quá trình tạo dẫn xuất. Quá trình tạo dẫn xuất: Cho 20µl hỗn hợp dung dịch acid amin chuẩn, 50µl dung dịch cystine chuẩn, và mẫu thủy phân (BSA; 100µl, đậu nành; 500µl, trứng; 500µl) vào từng lọ nhỏ hình nón 2ml với 1 nắp đậy vặn có lỗ và một màng ngăn. Làm khô dung dịch hoàn toàn với khí nitơ ở 50oC Thêm vào một lượng thích hợp acetonitrile vào mỗi lọ và làm khô lần nữa. Hòa tan bã trong 50µl dung dịch đệm. Thêm vào 3ml BITC, BZITC, PITC vào mỗi dung dịch hòa tan trên để tạo dẫn xuất BITC, BZITC, PTC. Sau khi vặn nắp chặt, quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện ở 40oC trong 30 phút để tạo dẫn xuất BTC và PTC, ở 50oC trong 30 phút để tạo dẫn xuất BZTC. Sau khi tạo dẫn xuất, dùng 2 kim tiêm bằng thép không rỉ đâm xuyên qua màng ngăn vào lọ. Nối một kim với nitơ cung cấp và 1 kim với bơm chân không. Sục nitơ vào lọ, đồng thời rút chân không để hoàn thành quá trình làm khô ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút đối với dẫn xuất BTC và khoảng 40 phút đối với dẫn xuất BZTC và PTC. Thêm 100µl acetonitrile vào lọ và làm khô dung dịch trong 5 phút với dẫn xuất BTC và 30 phút với dẫn xuất BZTC và PTC. Hòa tan bã của dẫn xuất BTC trong 1ml ammonium acetate 0,02M. Hòa tan bã của dẫn xuất BZTC và PTC trong 1ml Na2HPO4 chứa 5% methanol và 1,5% tetrahydrofuran (pH 6,8, điều chỉnh với acid phosphoric.) Lọc dung dịch bằng màng membrane 0,25µm. Cho lần lượt từng 10µl dung dịch vào HPLC. Phép sắc ký: Hệ thống HPLC Spectra-Physics 8800 hệ thống 3 dung dịch Detector Detector bước sóng cực tím phổ 200 có thể lập trình Bước sóng 240 nm cho dẫn xuất BTC để phát hiện 246 nm cho dẫn xuất BZTC 254 nm cho dẫn xuất PTC Cột Nova-Pak C18 (300 x 3,9 id, 4µm dimethyloctadecylsilyl silica vô định hình, nước). Nhiệt độ cho mọi cột dẫn xuất là 40oC với cột gia nhiệt Eppendorf CH-30. Dung môi Cho dẫn xuất BTC: Dung dịch A: ammonium acetate 0,05M (pH 6,7, điều chỉnh với acid phosphoric.) Dung dịch B: dung dịch natri phosphate 0,02M dibase chứa 5% methanol và 1.5% tetrahydrofuran-acetonitrile (50:50). Dung dịch C: acetonitrile : nước = 70:30 Tỉ lệ dung môi: A B C Tốc độ chảy 0.0 phút 100% 0% 0% 1ml/phút 5.0 phút 85 15 0 1ml/phút 14.0 phút 70 20 10 1ml/phút 20.0 phút 60 20 20 1ml/phút 25.0 phút 30 20 50 1ml/phút 30.0 phút 10 20 70 1ml/phút Cho dẫn xuất BZTC và PTC: Dung môi A: Na2HPO4 0,02M chứa 5% methanol và 1.5% tetrahydrofuran (pH 6,8, chỉnh với acid phosphoric.) Dung môi B: dung môi A và acetonitrile (50:50) Dung môi C: acetonitrile và nước (70:30) Tỉ lệ dung môi A B C Tốc độ chảy 0.0 phút 100% 0% 0% 1,2ml/phút 15.0 phút 76 20 4 1,2ml/phút 20.0 phút 70 20 10 1,2ml/phút 30.0 phút 50 30 20 1,2ml/phút 40.0 phút 30 35 35 1,2ml/phút Sau đó thực hiện một bước rửa trong 20 phút với dung môi C để bảo vệ cột không bị hỏng. Cả 2 loại tỉ lệ dung môi trên đều thích hợp cho mẫu dẫn xuất acid amin và dẫn xuất acid amin chuẩn. Độ nhạy của các dẫn xuất BTC, BZTC VÀ PTC: Độ nhạy của các chất dẫn xuất BTC, BZTC và PTC có thể phát hiện ở 0.05 aufs, đây là mức giới hạn cho ranh giới bền vững với lượng nhỏ nhất. Cũng có thể xác định mối quan hệ tuyến tính bằng phép phân tích định lượng. Độ bền của các dẫn xuất BTC và BZTC: Sự biến thiên của các đỉnh trong vùng phản ứng của các chất dẫn xuất BTC và BZTC với nhiệt độ phòng trong thời gian lưu trữ có thể xác định được độ bền của các chất dẫn xuất BTC và BZTC. Phép phân tích thống kê: Để xác định được khả năng tái sản xuất, tất cả các thí nghiệm đều phải được lập lại từ 3 lần trở lên. Độ lệch tương đối tiêu chuẩn ( RSDs) trên kết quả phân tử gam tương đối (RMR) có thể được tính toán để so sánh về độ chính xác của các chất dẫn xuất .Sự tuyến tính của các đồ thị định cỡ trong các dãy thích hợp cũng có thể được phát hiện bởi sự định rõ các yếu tố thống kê quan trọng của hệ số tương quan (γ) của đồ thị định cỡ. Khả năng tái sản xuất và sự chính xác trên BSA và các mẫu thực phẩm cũng có thể được so sánh với phương pháp dùng phép ghi sắc trao đổi ion và các dữ liệu từ những tài liệu khác Chú ý: Nếu sử dụng một bơm chân không mà không dùng nước, phải lắp đặt thiết bị để hấp thu những chất phản ứng còn dư thừa bay hơi và những sản phẩm phụ sinh ra trong suốt quá trình chuyển hóa bởi vì bơm chân không sẽ trở nên vô dụng khi có mặt các vật chất bay hơi. Những chất phản ứng này dường như rất bền trong nhiều năm nếu không bị mở ra , nhưng khi nắp của chúng được mở ra nhiều lần ,những chất phản ứng này chỉ được sử dụng trong 6 lần cho dù chúng được bảo quản ở -20ºC. Tất cả các chất phản ứng này đều rất độc và có hại. Những dung dịch chuẩn của glutamine và cysteine thường được chuẩn bị với nước bởi vì trong quá trình lưu trữ kéo dài các acid amin này trong dung dịch HCl, sẽ xảy ra sự biến đổi thành pyroglutamic acid và cystine theo thứ tự lần lượt như trên. Đối với chất dẫn xuất BZTC dành cho tiêu chuẩn bên trong của mẫu, L-norleucine không nên sử dụng. Khi cung cấp khí nitơ khô, phải kết nối ống để hấp thu tất cả các hơi ẩm như được chỉ ra trong hình 2. Ống chứa muối Na2SO4 khan phải được thay đổi định kỳ từ 1 đến 2 lần. Khi nắp có 1 lỗ trở thành nắp không còn lỗ, thì bạn phải cẩn thận vì vách ngăn không thể tháo ra được. Phải thật cẩn thận, không để mẫu, dung dịch rửa và dung dịch tách rửa rơi vào bề mặt chất dẻo dung để trao đổi cation trong cột. Tốc độ của các giọt dung dịch rửa trong suốt quá trình rửa không quan trọng. Khi phân tích với sắc ký trao đổi ion và phương pháp chuyển hóa ninhydrin, phải làm khô dung dịch mẫu trong các máy bay hơi quay. Hòa tan lại lần nữa trong chất đệm citrate Na 0.2 M (pH = 2.2) và đưa vào máy phân tích mino acid tự động.( LKB 4150 alpha , cột trao đổi cation Ultrapac 11) Do tác động đồng thời của acetonitrile bốc hơi ,phần còn lại của nước sẽ được làm khô hoàn toàn . Các phản ứng hóa học của các chất dẫn xuất BTC và BZTC diễn ra như sau: Quang phổ UV của hỗn hợp acid amin BTC và BITC, sự hợp lại của 2 chất phản ứng được chỉ ra trong hình 5. λmaxcủa acid amin BTC vào khoảng 234 nm, nhưng bước sóng có tác dụng mạnh nhất vào khoảng 250 nm, nó có thể tránh được sự hấp thu phổ của các tạp chất và chất điện phân, ammonium acetate trong dung môi (16) Phổ UV của hỗn hợp acid amin BZTC và hỗn hợp acid amin TC khi hoà tan trong dung dịch NaH2PO4 0.02 M được chỉ ra trong hình 6. Những bước sóng cho khả năng hấp thu mạnh nhất là 220 nm và 238 nm trong dẫn xuất BZTC; 215 nm và 270 nm trong dẫn xuất PTC.Nhưng bước sóng có tác dụng mạnh nhất là 246 nm trong dẫn xuất BZTC và 254 nm trong dẫn xuất PTC, để tránh được sự nhiễu của phổ hấp thu các tạp chất, chất điện phân và có thể thấy được một ranh giới bền vững. Sắc phổ acid amin chuẩn của các chất dẫn xuất BTC và BZTC khi so sánh với chất dẫn xuất PTC được tách riêng trong cột Nova Pak C18 được chỉ rõ trong hình 7.Tất cả 22 acid amin chuẩn được chuyển hóa với các chất dẫn xuất BTC, BZTC và PTC và được phân giải trong cột lưu trữ C18. Trong những chất dẫn xuất BTC, asparagines và serine đều hoàn toàn không tách được nhưng BTC- cysteine và cystine thì được tách rửa từng cái một mặc dù đỉnh của nó được chuyển thành đỉnh cuối. trong những chất dẫn xuất PTC , đỉnh của cysteine và cystine xuất hiện ở cùng vị trí ,từ đó có thể cho rằng cysteine có thể được chyển hoàn toàn thành cystine trong suốt quá trình chuyển hóa bởi vì sự thật là cysteine có thể bị oxy hóa (20) .Những tư liệu khác cũng cho rằng cysteine và cystine được tách rửa ở cùng vị trí (2,4,7) Hình 5: Phổ UV (trục x là nm) của hỗn hợp BTC acid amin và thuốc thử BITC. Độ hấp thu của dung môi ở 250nm = 0 Hình 6: Phổ tia UV của hỗn hợp acid amin BZTC và acid amin PTC. Dung dịch NaH2PO4 0.05 M. Sự hấp thu của dung dịch ở 254 nm = 0. Hình 7 : Sắc phổ của các chất dẫn xuất protein acid amin chuẩn khi phân tích trên cột Nova – pak ( 30 cm x 3.9 mm) C18 .I.S. = norleucine .Lượng thêm vào là 0.625 nmol . : acid amin BTC : acid amin BZTC : acid amin PTC Cyt: Cystine, Cys: Cysteine Hình 8: Đồ thị sự hấp thu của chất dẫn xuất BZTC-cysteine ở 238 nm chỉ ra mức hấp thu cao nhất của phân mol BZITC trong dung dịch chuyển hóa cho phản ứng giữa benzylisothiocyanate và cysteine. Không giống như những chất dẫn xuất BTC và PTC, trong chất dẫn xuất BZTC, tất cả 22 acid amin chuẩn đều gần như được tách riêng hoàn toàn. Và cũng như thế, trong chất dẫn xuất BZTC và BTC, các đỉnh của cysteine và cystine được tách riêng rõ rệt. Không giống như trong các chất dẫn xuất PTC, trong các chất dẫn xuất BZTC và BTC, phân nửa gốc –SH của cysteine sẽ được chuyển hóa thành chất dẫn xuất thiocyanate nhờ BZITC và BITC. Để 1 mol cysteine phản ứng với 2 mol BZITC, thì sự hấp thu của chất dẫn xuất BZTC trong phân mol BZITC trong dung dịch chuyển hóa giữa BZITC và cysteine phải được xác định (hình 8). Bước sóng xác định là 238 nm, ở bước sóng này sẽ hình thành sự hấp thu cực đại cho ch61t dẫn xuất BZTC. Sự hấp thu cực đại xuất hiện ở 0.667 phân mol, nghĩa là tỉ số mol của phản ứng giữa cysteine và BZITC là 1 : 2. Do đó, chúng ta có thể rút ra kết luận là nhóm –SH, cũng như nhóm amin của cysteine bị chuyển hóa .Bởi vì sự thật là một nửa nhóm – SH của cysteine dễ dàng chuyển hóa thành chất dẫn xuất thiocyanate với 2 – nitro -5-thiocyanobezoic acid (21). BZTC và BTC-cysteine nên được tách rửa cuối cùng do chuỗi không phân cực dài của nhóm –SH. Sắc phổ của chất dẫn xuất acid amin BTC, BZTC và PTC khi thủy phân đậu nành được chỉ ra trong hình 9. Trong chất dẫn xuất BTC và PTC, chúng ta có thể phát hiện ra các dạng giống nhau của 16 acid amin, nhưng trong chất dẫn xuất BZTC, cysteine và cystine thêm vào 16 acid amin trên có thể bị phát hiện ra. Chúng tôi cho rằng độ nhạy của chất dẫn xuất BZTC cao hơn BTC và PTC. Sắc phổ của chất dẫn xuất acid amin BTC và PTC khi thủy phân toàn bộ quả trứng được chỉ ra trong hình 10. Do không may mắn, chúng tôi không phát hiện được chất dẫn xuất BZTC trong quả trứng thủy phân. Thật đáng tiếc vì chúng tôi không thể so sánh 2 chất dẫn xuất BTC và PTC. Các dạng giống nhau của 17 acid amin trong chất dẫn xuất BTC và PTC đều được phát hiện. Như sắc phổ được chỉ ra trong các mẫu thực phẩm (hình 9 và 10), cho rằng mốt vài lại chất nhiễm chứa trong đó đã gây ra các bóng mờ chồng lên các đỉnh. Hiện tượng này đã chỉ ra rằng BITC, BZITC và PITC là những chất phản ứng rất tốt có sự chọn lọc cao hơn với acid amin. Hình 9: Sắc phổ của acid amin trong thủy phân đậu nành. A: chất dẫn xuất BTC B: chất dẫn xuất BZTC C: chất dẫn xuất PTC Hình 10: Phổ sắc ký của acid amin trong sản phẩm thủy phân trứng. (A) dẫn xuất BTC (B) dẫn xuất PTC 20. Sắc ký phổ trên giấy thu được từ dẫn xuất BTC, BZTC và PTC của BSA hydrosate được thể hiện ở hình 11. Mặt khác, ở bột đậu nành dẫn xuất BTC và PTC phát hiện được 17 acid amin, còn với BZTC phát hiện được 18 acid amin với sự xuất hiện của cystine. Hình 11: Phổ sắc ký của acid amin của dịch thủy phân albumin trong huyết thanh bò. (A) dẫn xuất BTC, (B) dẫn xuất BZTC, (C) dẫn xuất PTC 21. Độ nhạy của các dẫn xuất BTC, BZTC và PTC vào khoảng 39pmol ở 0.005 AUSF (hình 12). Ở mức thấp hơn 39pmol, nhiều loại acid amin của các dẫn xuất trên không được phát hịên và không đươc thể hiện trên đừơng kẻ trên biểu đồ phân tích định lượng. Hình 12: Phổ sắc ký của dẫn xuất acid amin chuẩn, cho thấy độ nhạy. Lượng thêm vào là 3,9 pmol, 0,05 AUFS. (A) BTC acid amin, (B) BZTC acid amin, (C) PTC acid amin. 22.Có một báo cáo cho rằng độ nhạy ở 1pmol trong máy dò ở 0.005AUFS (tỉ lệ tín hiện so với nhiễu là 5:1). Nhưng ở điều kiện này, những đòi hỏi về môi trường, dung môi, thiết bị và thuốc thử rất khó khăn đồng thời đường ranh giới cũng dễ xê dịch nên việc ứng dụng phương pháp phân tich này vào thực tiễn là không thể. 23.Trạng thái ổn định của các dẫn xuất BTC và BZTC được thể hiện ở hình 13 và 14. Hình 13: Độ bền của BTC acid amin ở nhiệt độ phòng Hình 14: Độ bền của dẫn xuất BZTC của hydroxyproline. Mỗi điểm là giá trị trung bình của 3 phép đo. 24.Ở dẫn xuất BTC, khi bảo quản đến 2h thì vùng đỉnh tăng lên ở hầu hết các dẫn xuất, điều này cho thấy phản ứng vẫn tiếp tục diễn ra ở nhiệt độ phòng. Sau 8h bảo quản, cystein giảm nhiều nhất (17.3%), sự mất những chất khac vào khoảng 0_6.9%., glutamic acid, asparagine+serine, glutamine, threonine, tyrosine, proline, lysine, và tryptophan bị mất ít hơn 5% sau 14h.(16) 25.Ở BZTC, sau 120h bảo quản, vùng đỉnh bị giảm gần 5% nhưng threonine, alanine, cystein và serine giảm còn 18.9, 13.7, 15.1 và 15.6% sau 4h. pH lcó ảnh hưởng rất lớn. Với PTC, pH tối thích là 7.5, sự tổn thất PTC ở pH này là từ 0_10% sau 10h bảo wản ở nhiệt độ phòng.(7) 26. BZTC tốt hơn PTC và BTC, ngoại trừ đối với threonine, alanine, cystein và serine. 27. Sự liên quan giữa BTC, BZTC và PTC được thể hiện ở bảng 3 Bảng 3: 28. Đối với BTC, giá trị RMR quyết định bởi methionine, RSDs trên RMR phải nhỏ hơn 5% trừ cystein (5.24%). Còn với BZTC và PTC, giá trị RMR được quyết định bởi norleucine. 29. Ở BZTC, các giá trị R.S.D của mọi dẫn xuất trừ cystein là 7.22% thì còn lại đều nhỏ hơn 5%. Tuy nhiên dẫn xuất PTC của glutamine, prolamine, cystine và cystein, lysine thì RSDs có thể đạt đến 10%. Ở PTC, thúôc thử PITC phải được bảo quản dưới -20 với khí trơ vớ hệ thống chân không để tránh hư hỏng và loại bỏ những sản phẩm phụ có thể ảnh hưởng đến đỉnh chính và cũng để củng cố sự tái sản xuất. 30.BTC và BZTC thì tương đối dễ dàng hơn PTC. 31.Biểu đồ định lượng BTC cho thấy những đường rõ nét ở 0.5_2.5nmol. Hệ số tương quan trong biểu đồ xác định, thấp nhất là đối vói cystein là 0.926, có thể dùng làm chuẩn. 32.Biểu đồ định lượng của ácc dẫn xuất BZTC cũng cho những đừong rõ nét trong khoảng 0.125_5nmol.Hệ số tương quan kappa cũng rất lớn (p<0.001) và có thể lên dến 0.99, ngoại trừ cysteine(0.952) và glutamine(0.976) 33. Đồi với dẫn xuất PTC, cystine+cysteine cho giá trị kappa tấhp nhất (0.967) nhưng có thể dùng làm hệ số chuẩn để phân tích. Tuy nhiên, có một nghiên cứu cho rắng các dường kẻ của cystine quá ít nên không thể sử dụng làm chẩun để phân tích.(22) 34.Thành phần cấu tạo acid amin trong bột đâu nành quyết định bởi các dẫn xuất BTC, BZTC và PTCso với sắc kí trao đổi ion được thể hiện ở bảng 4 Bảng 4 35. Đối với các dẫn xuất BTC so với sắc kí trao đổi ion thì hầu hết các acid amin cho thấy có độ lệch không quá 5% trừ histidine (13%) và isoleucine(9%). Nhưng với BZTC và PTC thì hàu hết các amiono acid cho độ lệch lớn hơn 5%.Khả năng tái tổng hợp của BTC và BZTCthì hơn hẳn PTC. 36. Bảng 5 thể hiện thành phần tạo của các acid amin trong trứng quýet định bởi BTC và PTC so với sắc kí trao đổi ion. Khả nang tái tổng hợp của BTC vẫn cao hơn. Bảng 5 37.Bảng 6 cho thấy thành phần cấu tạo của các acid amin của BSA được tính toán lại trên cơ sở của 583chất còn lại với giả thiết rằng 2 trp bị phá huỷ hoàn toàn và cysteine về căn bản cũng bị phá hủy trong quá trình thủy phân. 38.Kết quả phân tích cho thấy BSA có 17 cầu nối disulfide (cystine) và 1 cysteine tự do. Lựơng chất còn lại của BZTC_cystine và BZTC_cysteine là 12.5 và 12.4. Lượng của hai chất này bị mất đi trong quá trình thủy phânvới HCl 6M mà không có sự biến đổi các acid amin này. Do đó cysteine và cytine có thể gây ra những sai dố nhất định mặc dù bổ sung cho những chất khác như pyridylethyl_cysteine hay cystecic acid trước khi định lượng. Bảng 6: Tài liệu tham khảo: Catherine Cooper, Nicolle Packer, Kate Williams, “Amino acid protocols”, Humana Press, 253 pages.