Đề tài Phương pháp phân tích chuyên dùng trong công nghiệp dầu béo

điều kiện đun nóng với nước và dùng axit để chuẩn độ lượng bazơ sinh ra trong quá trình thủy phân. RCOONa + H2O RCOOH + NaOH 2NaOH + H2SO4 Na2SO4 + 2 H2O -Hoá chất cần thiết : + Cồn 95 % + Ête dầu hỏa nhiệt độ sôi 60 – 90°C + H2SO4 0,1 N + Chỉ thị mêtyl đỏ 0,2 % -Cách xác định : Cân chính xác 10 g dầu tinh luyện cho vào bình nón đã sấy khô, thêm vào 5 ml cồn 95% và 30 ml ête, lắc cho tan đều; thêm vào 5 ml nước cất đun nóng ở 80°C, lắc kỹ sẽ tạo nên hỗn hợp vẩn đục; cho vào 2 giọt chỉ thị metyl đỏ .Dùng ống nhỏ giọt vi lượng chứa dung dịch H2SO4 0,1 N và tiến hành chuẩn độ. Trong khi chuẩn độ phải giữ nhiệt độ nóng, và sau mỗi giọt axit nhỏ xuống phải lắc mạnh rồi để lắng , quan sát màu của lớp nước ở dưới, tiếp tục chuẩn độ cho đến khi dung dịch có màu đỏ nhạt . Tiến hành 1 thí nghiệm không mẫu trong điều kiện tương tự : % X – hàm lượng xà phòng của dầu V1 – số ml H2SO4 dùng chuẩn độ thí nghiệm (xác định nồng độ bằng natri ôlêat mẫu) V2 – số ml H2SO4 dùng chuẩn độ thí nghiệm không mẫu. N – nồng độ của H2SO4. W- khối lượng mẫu thử tính bằng g 0,304- mg đương lượng của natri oleat Xác định chỉ số acid Chỉ số acid : là số mg KOH cần thiết để trung hoà hết lượng axit béo tự do có trong 1g dầu mỡ. Chỉ số acid của dầu mỡ không cố định, dầu mỡ càng biến chất thì chỉ số acid càng cao. Các dầu mỡ thực phẩm chỉ số acid càng thấp càng tốt. Từ chỉ số acid (acid value -AV) có thể tính ra phần trăm acid béo tự do, thường tính theo phần trăm acid ôleic: % axit béo tự do = AV . 0,503 Nguyên tắc : dựa vào phản ứng trung hoà giữa acid béo và kiềm trong môi trường hỗn hợp gồm rượu ethylic và ether ethylic: RCOOH + KOH RCOOK + H2O Hoá chất cần thiết : + dung dịch KOH 0,1 N trong cồn 96%. + chỉ thị phênolphtalêin (C20H14O4) 1% trong cồn 96% + hỗn hợp dung môi gồm 1 thể tích ête êtylic và 3 thể tích cồn 95%. Dụng cụ & máy móc : +buret 10 ml +2 bình cầu 200ml +ống đong 50ml +nồi cách thủy Cách xác định : cân chính xác 3-5g dầu mỡ (nếu chỉ số axit thấp có thể đến 10 g ) cho vào bình cầu 200ml, thêm 50 ml dung môi hỗn hợp , lắc đều (nếu chưa hoà tan có thể đun nhẹ trên nồi cách thủy đến khi hoà tan, lắc đều, làm nguội), cho 2 giọt chỉ thị phênolphtalêin rồi chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1 N trong cồn (dùng dung dịch KOH trong cồn để tránh xảy ra sự xà phòng hóa trong trường hợp hỗn hợp chứa 20% trở lên) cho đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng tươi và màu không mất đi sau 30 giây (trường hợp chất béo có màu thẫm thì dùng chỉ thị tymolphtalein 1% trong cồn (dầu màu đỏ) chuẩn độ cho đến màu xanh hay ankaliblơ B0,75% (dầu màu thẫm) chuẩn độ cho đến màu hồng nhạt). Tính kết quả: a : số ml dung dịch KOH 0,1N chuẩn độ ở bình thí nghiệm b : số ml KOH 0,1N dùng chuẩn độ ở bình kiểm tra. c :số gam chất béo. 5.611: số mg KOH trong 1 ml KOH 0,1N. hoặc dùng công thức : Có thể biểu thị bằng độ axit, tức là số phần trăm axit béo tự do trong dầu mỡ tính theo 1 loại axit béo nào đó. Thông thường người ta tính theo axit ôleic vì nó có nhiều trong hầu hết các loại dầu . Độ axit = % axit béo tự do = AV. 0,503 Xác định chỉ số xà phòng hoá (ester value-EV) Chỉ số xà phòng hoá :là số mg KOH cần thiết để trung hoà axit béo tự do và axit béo kết hợp (trong glyxerit) khi xà phòng hóa hoàn toàn 1g dầu mỡ. Thông thường các dầu mỡ có chỉ số xà phòng hoá vào khoảng 170 – 260. Chỉ số xà phòng hóa đặc trưng cho tổng lượng axit béo có trong chất béo. Chỉ số xà phòng hoá càng cao chứng tỏ trong dầu mỡ có chứa nhiều axit béo phân tử lượng thấp và ngược lại. Nguyên tắc : tiến hành xà phòng hoá 1 lượng dầu mỡ xác định bằng một lượng dung dịch kiềm dư, sau đó chuẩn độ lượng kiềm dư bằng axit và tính ra lượng kiềm đã xà phòng hoá dầu mỡ . H2C _ COOR1 H2C _ OH HC _ COOR2 + KOH HC _ OH + R1COOK + R2COOK + R3COOK H2C _ COOR3 H2C _ OH Hóa chất cần thiết : + dung dịch KOH 0,5N trong cồn 96%. + dung dịch HCl 0,5N trong nước. + chỉ thị phênolphtalêin 1% trong cồn. Dụng cụ và máy móc : +2 bình cầu 200ml với ống làm lạnh. +ống đong 50 ml. +pipet 10m. +buret 25ml. +nồi cách thủy. Tiến hành xác định : cân chính xác khoảng 1-2g dầu mỡ trong bình cầu. Thêm 10ml KOH 0,5N và 50ml cồn. Lắp ống làm lạnh không khí(ống thủy tinh dài khoảng 1m, đường kính 3-5mm). Đun sôi cách thủy 1 giờ. Sự xà phòng hóa kết thúc khi dung dịch trong bình trở nên trong suốt. Làm nguội hỗn hợp. Thêm vài giọt phenolphtalein vào bình. Chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0,5N. Song song làm thí nghiệm kiểm tra bằng cách thay chất béo bằng nước cất. Tính kết quả : a- số ml HCl 0,5N dùng chuẩn độ ở bình kiểm tra b- số ml HCl 0,5N dùng chuẩn độ ở bình thí nghiệm c-khối lượng mẫu thử tính bằng g. 28,055 – số mg KOH trong 1 ml dung dịch KOH 0,5N Trường hợp màu dầu thẫm thì dùng chất chỉ thị như trong khi xác định chỉ số axit. Xác định chỉ số iốt (iod value-IV) Chỉ số iốt :là số gam iốt cần thiết bão hòa hết số liên kết đôi của axit béo có trong 1g dầu mỡ, nó biểu thị mức độ không no của dầu mỡ, chỉ số iốt càng cao thì mức độ không no càng lớn và ngược lại. Dựa vào chỉ số iốt người ta có thể phân dầu mỡ làm 3 loại: Dầu khô : I > 130 Dầu bán khô : 85 < I < 130 Dầu không khô : I < 85 Các dầu mỡ thực phẩm thường nằm trong phạm vi nhóm dầu không khô và bán khô (tính khô của dầu mỡ thường biểu hiện khi tiếp xúc với không khí chúng có khả năng tạo thành màng khô có tính đàn hồi, dầu mỡ chứa càng nhiều axit béo không no càng dễ hoá khô. Tính khô của dầu mỡ được ứng dụng nhiều trong kỹ nghệ sơn dầu.) Nguyên tắc : Phương pháp này dựa trên nguyên tắc iôt kết hợp với axit béo ở các vị trí nối đôi. Ở nhiệt độ thường, iôt phản ứng với các axit béo có trong thành phần của chất béo chậm, khi đun nóng thì iôt kết hợp với các nối đôi không đồng đều, không làm no được hoàn toàn các nối đôi. Các halogen khác (Cl2, Br2) phản ứng với axit béo rất mạnh, nên thay iôt bằng các hợp chất của nó với các halogen khác. C = C + I2 C_C hay C_C (Br2) I I Br Br Dùng KI để chuyển hóa Brôm dư thành iôt. 2KI + Br2 2KBr + I2 Dùng Na2S2O3 để định phân iôt dư. Hóa chất : +dung dịch Hanus (10g IBrhòa tan trong 500ml axit axetic đặc). +dung dịch KI 10%. +dung dịch Na2S2O3 0,1N. +dung dịch tinh bột 1%. +clorofom. Dụng cụ, máy móc : +pipet 10ml. +2 bình cầu dung tích 200-300ml có nút nhám. +2 cốc nhỏ đường kính 1-2 cm. Tiến hành: Cân vào lọ nhỏ 0,2g dầu hoặc 4g bơ hoặc mỡ. Chuyển sang bình cầu dung tích 200-300ml có nút nhám. Bình kiểm tra thay chất béo bằng 0,2ml nước cất. Cho thêm 10ml clorofom vào mỗi bình, lắc nhẹ để hòa tan hết chất béo. Cho thêm 15ml dung dịch Hanus, đậy kín bình ngay bằng nút nhám. Lắc cẩn thận bình. Để yên chỗ tối 15 phút (dầu có nhiều axit béo không no thì dđể lâu hơn). Thêm 15ml dung dịch KI 10%, 50ml nước cất. Chuẩn độ iôt giải phóng ra bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến màu vàng rơm. Thêm 1ml dung dịch hồ tinh bột 1%, 3ml clorofom. Chuẩn độ tiếp cho đến khi dung dịch bị mất màu hoàn toàn. Cho thêm clorofom vào để giải phóng iôt bị hấp thụ trên chất béo (khi chuẩn độ phải lắc mạnh) đồng thời làm thí nghiệm kiểm tra. Tính kết quả: a-số ml dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình kiểm tra. b- số ml dung dịch Na2S2O3 dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm. c-lượng chất béo (g). f-hệ số điều chỉnh nồng độ Na2S2O3 100-hệ số qui chuẩn cho 100g chất béo. 0,01269-số g iôt tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,1N. Xác đinh chỉ số peroxyt (PoV) Chỉ số peoxyt là số gam iôt được giải phóng ra khi dung dịch KI tác dụng với 100g chất béo nhờ tác dụng của peroxyt có trong chất béo. PoV là chỉ số chất lượng đặc trưng cho mức độ ôi hóa bằng oxi hóa. Nguyên lý: Ở môi trường axit, peoxyt giải phóng iôt từ muối kali iođua, ở nhiệt độ nóng hoặc lạnh. Chuẩn độ iôt được giải phóng ra thể tự do bằng một dung dịch natri tiosunfat. H H ç ç R1_C_C_R2 + KI +2CH3COOH R1_CH_CH_R2 + 2CH3COOK + H2O + I2 ç ç \ / O_O O 2 Na2S2O3 + I2 2NaI + Na2S4O6 Thuốc thử: +Dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay). +Chỉ thị hồ tinh bột 1%. +Dung dịch Na2S2O3 O,01N (pha trước khi dùng từ dung dịch Na2S2O3 0.1N bằng nước cất đun sôi để nguội không chứa CO2). Cách xác định: Lấy 2 bình nón dung tích 250ml. Cho vào bình 1 (bình thí nghiệm) 2g dầu, bình 2 (bình kiểm tra) 2ml nước cất. Cho thêm vào mỗi bình 10ml dung dịch hỗn hợp axit axetic và clorofom (tỉ lệ 2:1), 1ml dung dịch KI mới pha (hoặc một ít tinh thể KI), đậy nút. Lắc hỗn hợp cẩn thận và đặt vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm 25ml nước cất. Cho thêm 0,5ml dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ iôt tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N cho đến khi mất màu xanh. Tính kết quả : a-số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình thí nghiệm. b-số ml dung dịch Na2S2O3 0,01N dùng để chuẩn độ ở bình kiểm tra. c-khối lượng chất béo. 0,01269-số gam iôt tương ứng với 1ml dung dịch Na2S2O3 0,01N. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG QUÁT PHÂN TÍCH LIPID Phương pháp để xác định tổng lipid trong thực phẩm: Chất béo tổng được biểu diễn là số gram chất béo trên 100 gram một khẩu phần nhỏ thực phẩm hay trên một muỗng xúp. Những số liệu này thì được xác định bằng cách thủy phân mẫu và phân tích những acid béo riêng lẻ (xem bên dưới). Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định chất béo tổng được chấp nhận bởi các cơ quan có thẩm quyền ở hầu hết các nước (Bảng 5.2). Các phương pháp cũ dùng dung môi để trích ly và đo tổng khối lượng bã lipid còn lại. Ưu điểm của phương pháp này là có thể đồng thời trích ly nhiều mẫu trong cùng một trụ chiết. Để xác định chất béo tổng, ethyl ether (diethyl ether) là những dung môi được lựa chọn vì nó không phân cực và trích ly được hầu hết các chất béo không phân cực: triacylglycerol, sterol, tocopherol,…; trong khí đó lại trích ly kém hiệu quả những chất béo phân cực: glycolipid và phospholipid… Nguyên tắc của định lượng lipid tổng bằng phương pháp Soxhlet: dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được sấy khô, nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi … tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất phần trích ly gọi là lipid tổng hay dầu thô. Một số phương pháp khác được phát triển, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn để trích ly và xác định chất béo tổng. So với phương pháp trích ly bằng dung môi, trong hầu hết trường hợp, số liệu ở cả hai phương pháp thì gần giống như nhau. Phương pháp quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân cũng được phát triển để định lượng chất béo tổng của một số thực phẩm. Ngoài ra, phương pháp quang phổ cận hồng ngoại cũng được sử dụng như là một phương pháp không phá vỡ cấu trúc để định lượng chất béo tổng. Cả hai phương pháp này được dùng để xác định chính xác hàm lượng vì vậy đòi hỏi dụng cụ và thiết bị phải được đo đạc và chuẩn bị chính xác. Phương pháp để trích ly lipid tổng trong thực phẩm: Quá trình trích ly lipid tổng trong thực phẩm khá đơn giản. Tuy nhiên, do sự đa dạng của các cấu trúc sinh học, thực phẩm và lipid, đạt được sự trích ly chính xác là một việc khá khó khăn. Phương pháp trích ly được mô tả ở trên (dùng dung môi hữu cơ và CO2 siêu tới hạn) tỏ ra hữu hiệu trong việc trích ly triacylglycerol và những lipid không phân cực khác từ thực phẩm có hàm ẩm thấp. Để trích ly lipid tổng (phân cực và không phân cưc), những dung môi phân cực được sử dụng làm chất trích ly (Bảng 5.3). Phương pháp để trích ly lipid tổng phổ biến nhất là phương pháp Folch (Bảng 5.3). Lipid được trích ly từ mẫu (1g) với 20ml chloroform-methanol (2:1 theo thể tích). Sau khi trích ly, 1/5 thế tích nước hay dung dịch muối (0.29%) được thêm vào, hỗn hợp được khuấy và cân bằng. Sau khi cân bằng, hai pha sẽ hình thành, lớp ở đáy bao gồm chloroform-methanol-nước, 86:14:1, và gần như tất cả lipid. Lớp ở trên bao gồm những dung môi giống như vậy theo tỉ lệ 3:48:47 và chứa hầu hết những chất không phải là lipid. Phương pháp này thể hiện tốt nhất nếu tỉ lệ cuối cùng của 3 dung môi, chloroform-methanol-nước, là 8:4:3. Phương pháp Bligh và Dyer được phát triển để trích ly lipid tổng từ cá nhưng nó được tận dụng để trích ly lipid từ mô của nhiều động, thực vật. Phương pháp này được tiến hành bằng cách lấy mô và mô được trích ly theo tỉ lệ 1:2:0.8, chloroform-methanol-nước nội sinh. Sau khi trích ly hỗn hợp một pha, một phần chloroform và nước (0.08% KCl) được thêm vào và khuấy trộn, và sau khi cân bằng, lipid được lấy trong pha ít hơn. Bởi vì một vài mô thực vật chứa những enzyme phân giải lipid hoạt động, sự giảm sút lipid có thể giải quyết bằng cách ngâm mô thực vật trong isopropanol nóng trước khi trích ly bằng chloroform methanol.Gần đây, sự đa dạng của phương pháp này được phát triển, dùng để trích ly lượng mẫu lá lớn để phân tích lipid bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Bởi vì sự quan tâm về sức khoẻ, làm việc với chloroform, phương pháp được phát triển để sử dụng những dung môi ít độc hại hơn như hexane-isopropanol. Phương pháp để phân tách và phân tích định lượng lipid: Phân tách lipid bắt buộc khi chuẩn bị mẫu cho phân tích chất béo. Nó cũng cung cấp thông tin định lượng về thành phần cấu tạo của các lipid khác nhau. Một vài phương pháp đơn giản được phát triển để tách lipid từ lipid tổng, sử dụng sắc kí cột (áp suất thấp). Christie mô tả phương pháp để tách những lipid không phân cực (hydrocarbons, cholesterol esters, triacylglycerols, cholesterol, diacylglycerols và monoacylglycerols) từ lipid trích ly bằng cách sử dụng cột silicic acid và tách rửa bằng dung môi haxane và diethyl ether từ 0 – 100% (bảng 5.4). Bảng bao gồm những chất béo tự do và hydroxyl và được phân tách bằng sắc kí cột áp suất thấp (LC), trích ly pha rắn (SE), sắc kí lớp mỏng (TLC) và sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Những phương pháp tương tự để phân tách chất béo phân cực và không phân cực có thể sử dụng chất hấp phụ như là Florisil hay DEAE cellulose. CE, cholesterol esters FS, free sterol PG, phosphatidylglycerol Ch, cholesterol HC, hydrocarbons PL, phospholipids CSE, cinnamic acid steryl esters MAG, monoacylglycerols SE, sterol esters DAG, diacylglycerols MGDG, monogalactosyldiacylglycerol SG, sterol glycosides DGDG, digalactosyldiacylglycerol PE, phosphatidylethanolamine TAG, triacylglycerols FAMEs, fatty acid methyl esters PC, phosphatidylcholine FFA, free fatty acids PI, phosphatidylinositol Sắc kí lớp mỏng là một kỹ thuật phổ biến để tách các lipid khác nhau. Hiện nay, hầu hết các nhà phân tích sử dụng dĩa TLC được mạ lót vì sự thuận tiện và để tái sử dụng dễ dàng. Mặc dù, trong tương lai, HPLC sẽ thay thế TLC, vài ưu điểm quan trọng của TLC bao gồm: thiết bị đơn giản và rẻ tiền; thuốc thử dạng phun được lựa chọn cung cấp thông tin về cấu trúc rất chính xác. Phương pháp TLC thường dùng để tách những lipid phân cực và không phân cực được nêu ra ở bảng 5.4. Mặc dù hầu hết các nhà phân tích sử dụng TLC một chiều nhưng đôi khi cũng cần thiết để sử dụng TLC hai chiều ( với hỗn hợp dung môi khác nhau cho mỗi chiều) để việc tách lipid hiệu quả hơn. Tuy nhiên, ở một vài trường hợp, chúng ta cũng có thể tách cả lipid phân cực và không phân cực ở cùng một chiều bằng cách sử dụng hai bước kế nhau trong cùng một hướng, với hỗn hợp hai dung môi khác nhau. Phương pháp HPLC :dùng tia UV (bước sóng từ 205 – 210 nm) có thể phát hiện những chất béo chưa bão hoà một cách hiệu quả. Tuy nhiên, định lượng bằng đầu dò UV thì rất khó khăn vì tín hiệu đáp lại của đầu dò thì tỉ lệ với tổng số liên kết đôi carbon-carbon trong lipid. Tương tự, đầu dò UV không thể phát hiện ra những chất béo bão hòa. Trong những năm giữa thập niên 80 của thế kỉ XX, hai loại khác nhau của “máy dò khối lượng” được phát minh, máy dò ion hóa ngọn lửa (FID) và máy dò ánh sáng tán xạ có khả năng làm bay hơi (ELSD). FID thì chỉ được sử dụng trong khoảng thời gian ngắn, các nhà sản xuất hiện tại đang tiếp tục hoàn thiện ELSDs và chúng đã trở thành một công cụ rất hữu hiệu trong việc phân tích lipid. Một vài phương pháp HPLC_ELSD đã phát triển để phân tích định lượng lipid không phân cực (hình 5.3) và lipid phân cực (hình 5.4). Mặc dù sắc kí khí (GC) thì không được sử dụng nhiều để phân tích các loại lipid, một vài phương pháp GC được phát triển để tách những lipid không phân cực (bảng 5.5). Hầu hết các phương pháp này sử dụng nhiệt độ rất cao, và một vài phương pháp đòi hỏi phải trimethyl hóa mẫu để giảm điểm sôi của lipid. Vì hầu hết những phương pháp này thực hiện ở nhiệt độ rất cao, việc tiến hành phải cẩn thận để chắc chắn rằng lipid không bị giảm trong suốt quá trình phân tích. Phương pháp để thủy phân lipid mạch thẳng và phân tích định lượng acid béo và sterol: Những chất béo phức tạp thường được phân tích bằng cách thủy phân liên kết ester với acid béo, và sau đó định lượng chúng với GC. Việc thủy phân được tiến hành trong môi trường kiềm nhẹ (0.5 – 1.5 KOH trong methanol). Sau khi thủy phân, hỗn hợp được acid hóa để tạo thành acid béo. Sau đó chúng được trích ly (được tách từ glycerol, muối, và những chất không lipid khác) bằng cách thêm hexane hay sử dụng những phương pháp trích ly lipid khác (ví dụ như trích ly theo phương pháp Bligh và Dyer). Phương pháp GC để phân tích chất béo thường bắt buộc phải chuyển acid béo tự do thành FAMEs. Nhiều phương pháp GC để phân tích FAMEs được trình bày trong bảng 5.5. Hỗn hợp đơn giản của FAMEs sẽ được tách trên cột không phân cực. Hỗn hợp FAMEs chứa hỗn hợp đa dạng những acid béo (bao gồm hỗn hợp FAMEs mạch ngắn, mạch rất dài hay chưa bão hòa) đòi hỏi phải sử dụng cột phân cực (ví dụ như CP-Sil 88, BPX 70, SP-2340) để tách tốt nhất. Một vài cột GC phân cực cũng có thể tách đồng phân cis và trans. Phương pháp HPLC được phát triển thêm để tách (sử dụng dectetor UV) và phân tích định lượng (sử dụng dectector ELSD) acid béo tự do và FAMEs, nhưng hầu hết nhà phân tích thì nhận định rằng phương pháp GC thì tối ưu hơn. Ngươc lại, phân tích FAMEs của acid béo hydrosy và epoxy thì phương pháp HPLC tỏ ra tốt hơn. Cholesterol và sterol thực vật có thể định lượng bằng GC. Sterol esters được thủy phân trong điều kiện kiềm nhẹ (giống như thủy phân ester của acid béo ở trên), trong khi sterol glycosides phải được thủy phân trong điều kiện acid (4 – 6 M HCl trong methanol) để giải phóng sterol tự do. Những sterol tự do sẽ được trích ly. Chúng có thể định lượng bằng GC (bảng 5.5). Một vài nhà phân tích không dùng phương pháp GC mà những sterol tự do sẽ được acetyl hóa hay TMS để hạ nhiệt độ cột sử dụng. Vì vậy sự phân hủy sterol sẽ được giảm đến mức tối đa trong suốt quá trình phân tích sắc kí. Phương pháp để phân tích định luợng loại phân tử của những lớp lipid khác nhau: Một vài phương pháp HPLC pha đảo (bảng 5.6) được phát triển để phân tách những loại phân tử của triacylglycerols. Trước khi bơm mẫu vào hệ thống HPLC, triacylglycerol tinh khiết (TAGs) phải được chuẩn bị bằng phương pháp phân tích lớp lipid TLC hay HPLC. Nếu hỗn hợp lipid rất phức tạp (ví dụ như dầu cá), TAGs được phân tách trước thành nhiều phần bằng sắc kí ion Ag và những phần nhỏ đó được bơm vào hệ thống HPLC để tạo thành những sắc phổ loại phân tử đơn giản hơn. Một vài phương pháp dùng để tách những loại phân tử của những lớp phospholipids khác nhau. Sau khi tinh sạch những lớp phospholipid riêng rẽ (ví dụ như phosphatidylcholine), những phân tử này được tách với HPLC pha đảo. Những phương pháp này cũng được áp dụng để phân tách những loại phân tử của những lớp lipid khác như sterol esters, galactolipids thực vật và sterol glycosides thực vật. IV.PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ACID BÉO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ 1.Nguyên tắc của phương pháp phân tích Khaùi nieäm: Saéc kyù laø phöông phaùp phaân tích caùc caáu töû coù trong hoãn hôïp döïa vaøo khaû naêng haáp phuï hay phaân boá khaùc nhau cuûa caùc caáu töû giöõa 2 pha: pha ñoäng vaø pha tónh. Saéc kyù khí (Gas Chromatography – GC) laø moät boä phaän cuûa kyõ thuaät phaân tích saéc kyù neân nguyeân taéc cuûa noù cuõng töông töï nhö caùc phöông phaùp phaân tích saéc kyù khaùc nhöng coù moät soá ñieåm khaùc bieät sau: Maãu phaân tích ôû traïng thaùi khí. Pha ñoäng: chaát khí hoaëc ôû daïng hôi. Pha tónh: coù theå goàm 2 loaïi: Pha tónh laø maøng moûng chaát loûng treân beà maët chaát haáp phuï raén: saéc kyù phaân boá hay coøn goïi laø saéc kyù khí – loûng. Pha tónh laø chaát haáp phuï raén: saéc kyù haáp phuï. Hieän nay saéc kyù khí söû duïng pha tónh laø chaát loûng ñöôïc aùp duïng nhieàu trong phaân tích thöïc phaåm. Ñeå phaân tích thaønh phaàn acid beùo thöôøng duøng phöông phaùp saéc kí khí. Hoãn hôïp acid beùo ñöôïc taïo thaønh daãn xuaát methylester tröôùc khi ñöa vaøo phaân tích vì methylester coù nhieät ñoä hoaù hôi thaáp hôn raát nhieàu so vôùi acid beùo töï do. Cuõng coù theå chuyeån acid beùo thaønh etylester nhöng nhieät ñoä hoaù hôi seõ cao hôn. Phaûn öùng chuyeån ester hoaù cuûa glycerid coù theå ñöôïc xuùc taùc baèng acid hay kieàm trong khi phaûn öùng ester hoaù chæ coù theå xuùc taùc baèng acid 2.Thiết bị-Phương tiện: Hệ thống sắc ký khí Cấu tạo của thiết bị: Boä phaän cung caáp khí mang (pha ñoäng): Boä phaän cung caáp khí mang laøm nhieäm vuï cung caáp khí mang cho heä thoáng. Boä phaän tieâm maãu Boä phaän tieâm maãu duøng ñeå ñöa maãu caàn phaân tích vaøo coät saéc kí. Hình: Boä phaän tieâm maãu coù chia doøng Coät saéc kyù :coät saéc kí laø nôi xaûy ra qua trình taùch caùc caáu töû trong hoãn hôïp. Trong kỹ thuật phân tích sắc ký, người ta sử dụng 2 loại cột: Coät nhoài: Laøm baèng kim loaïi. Thöôøng coù ñöôøng kính coät lôùn nhöng chieàu daøi ngaén (0,15 – 0,6mm * 3 – 20ft). Chaát nhoài coät coù theå laø phaân cöïc hoaëc khoâng phaân cöïc. Pha tónh thöôøng ñöôïc gaén treân beà maët trong cuûa oáng nhôø moät phaûn öùng hoùa hoïc. Tính chaát cuûa pha tónh seõ quyeát ñònh tôùi thöù töï phaân tích cuûa caùc acid beùo. Coät mao quaûn: Laø moät oáng silic nung chaûy boïc ngoaøi baèng moät phim polimid chòu nhieät ñeán 370 – 400oC, hoaëc baèng moät lôùp nhoâm chòu nhieät ñeán 480oC. Khoâng coù chaát raén mang. Thaønh coät ñöôïc cheá taïo sao cho pha tónh coù theå traùng moät lôùp moûng ngay treân thaønh coät. Coù daïng hình xoaén. Ñöôøng kính nhoû nhöng chieàu daøi lôùn (0,1 – 0,4mm * 25 – 500ft) Hieän nay, ngöôøi ta hay söû duïng coät mao quaûn thay cho coät nhoài. Boä phaän loø: Boä phaän loø coù chöùc naêng ñieàu nhieät cho caùc boä phaän sau trong heä thoáng saéc kí khí: Boä phaän bôm maãu. Coät saéc kí. Detector. Detector: Coù raát nhieàu loaïi detector ñöôïc söû duïng trong phaân tích saéc kí khí. Tuøy vaøo ñoái töôïng phaân tích maø ta choïn loaïi detector söû duïng cho phuø hôïp. Maùy ghi: Maùy ghi laø nôi nhaän tín hieäu töø ñaàu doø, xöû lyù soá lieäu chuyeån thaønh daïng ñoà thò. Treân ñoà thò coù peak, moãi peak ñöôïc xaùc ñònh baèng thôøi gian löu. 3.Tiến hành thí nghiệm: Chuaån bò metylester baèng xuùc taùc keát hôïp: Nguyeân lyù: Triglycerid ñöôïc chuyeån ester hoaù vôùi metanol trong moâi tröôøng CH3ONa. Acid beùo töï do coøn laïi sau phaûn öùng ñöôïc metylester hoaù baèng moâi tröôøng acid. Saûn phaåm metylester cuûa acid beùo ñöôïc trích ly ra khoûi hoãn hôïp baèng hexan. Duïng cuï, hoaù chaát: Hexan. Dung dòch metanolat natri: Caân 7,5 mg phenolphtalein vaø 1,15 mg Na, hoaø tan vaøo 30 ml methanol vaø 20 ml benzen. Xuaát hieän dung dòch metanolat Natri maøu hoàng coù noàng ñoä 1 mol/l. Dung dòch metanolic HCl: Cho vaøo bình hai coå 30 ml H2SO4 ñaäm ñaëc. Laép pheãu trích ly coù chöùa 15 ml HCl ñaäm ñaëc vaøo moät coå bình qua nuùt cao su. Ñaàu kia cuûa bình ñöôïc daãn vaøo dung dòch 60ml metanol. Töø töø nhoû HCl vaøo H2SO4 ñaäm ñaëc seõ giaûi phoùng ra khí HCl ñöôïc haáp thuï vaøo metanol. Dung dòch thu ñöôïc coù noàng ñoä khoaûng 10%. Phöông phaùp taïo metylester: Caân chính 20,5 mg lipid, cho vaøo trong oáng nghieäm. Sau ñoù cho vaøo 1 ml hexan vaøo 0,15 ml dung dòch metanolat natri, laéc thaät kyõ trong khoaûng 1 phuùt roài ñeå yeân ôû nhieät ñoä thöôøng trong 30 phuùt. Tieáp theo, cho vaøo 1,5 ml metanolic HCl, laéc thaät kyõ roài ñeå cho phaûn öùng xaûy ra trong 45 phuùt. Sau ñoù ly taâm trong oáng nghieäm 3000 voøng/phuùt. Dung dòch trong oáng nghieäm seõ bò taùch laøm ba pha. Duøng pipet töï ñoäng huùt laáy pha treân cuøng coù chöùa metylester cuûa acid beùo ñem phaân tích treân maùy saéc kí. Chuaån bò metylester baèng xuùc taùc acid: Nguyeân lyù: Triglicerid vaø acid beùo töï do ñöôïc chuyeån ester hoaù (hoaëc ester hoaù) vôùi metanol trong moâi tröôøng HCl. Saûn phaåm metylester cuûa acid beùo ñöôïc trích ly ra khoûi hoãn hôïp baèng hexan. Duïng cuï, hoaù chaát: Hexan Dung dòch metanolic HCl: Cho vaøo bình 2 coå 30 ml H2SO4 ñaäm ñaëc. Laép pheãu trích ly coù chöùa 15 ml HCl ñaäm ñaëc vaøo moät coå bình qua nuùt cao su. Ñaàu kia cuûa bình ñöôïc daãn vaøo 60 ml metanol. Töø töø nhoû HCl vaøo H2SO4 ñaäm ñaëc seõ giaûi phoùng ra khí HCl ñöôïc haáp thu vaøo metanol. Dung dòch thu ñöôïc coù noàng ñoä khoaûng 10%. Phöông phaùp taïo metylester: Caân 20 mg lipid, cho vaøo trong oáng nghieäm. Sau ñoù cho vaøo 1 ml CH2Cl2 vaø 2 ml metanolic HCl, ñaäy naép oáng nghieäm, laéc thaät kyõ ñeå cho phaûn öùng xaûy ra ôû 500C trong 3 giôø. Sau ñoù cho vaøo oáng nghieäm 1 ml nöôùc caát vaø trích ly metylester taïo thaønh baèng 2 ml hexan. Chuaån bò metylester baèng loø vi soùng: Nguyeân lyù: Vi soùng coù khaû naêng ñaåy nhanh phaûn öùng metylester. Duïng cuï, hoaù chaát: Hexan Dung dòch metaolic HCl Phöông phaùp taïo metylester: Caân 19,8 mg lipid, cho vaøo oáng nghieäm (20*150 mm). sau ñoù cho vaøo 0,5 ml metaolic HCl, ñaäy naép laéc thaät kyõ roài ñeå cho phaûn öùng xaûy ra trong loø vi soùng trong 1 phuùt. Sau phaûn öùng laøm nguoäi oáng nghieäm trong loø vi soùng. Sau ñoù cho vaøo oáng nghieäm 0,5 ml nöôùc caát vaø trích ly metylester taïo thaønh baèng 1 ml hexan. Dung dòch thu ñöôïc ñem phaân tích treân maùy saéc kí. Phaân tích maãu treân maùy: Acid beùo sau khi ñöôïc methyl ester hoùa seõ ñöôïc bôm tröïc tieáp vaøo maùy saéc kyù khí. Söû duïng kim 10µl ñeå bôm maãu vaøo maùy. Löôïng maãu bôm vaøo khoaûng 2 µl. Trình töï phaân tích maãu treân maùy: Khôûi ñoäng maùy. Cho pha ñoäng chaïy. Caøi ñaët chöông trình chaïy saéc kí. Bôm maãu. Tieán haønh chaïy saéc kí. Phaân tích vaø xöû lyù soá lieäu thu ñöôïc. Chöông trình chaïy saéc kí: Coät mao quaûn DB-5 (ID = 0,25nm, l=30m), laø loaïi coät phaân cöïc yeáu. Pha tónh : 100% dimetylpolysiloxane. Pha ñoäng : khí N2. Detector: FID. Tröôùc khi bôm maãu vaøo maùy, thieát laäp ñieàu kieän phaân tích cho maùy: Cheá ñoä bôm maãu : coù chia doøng vôùi split ratio = 1/25. Nhieät ñoä injector : 250oC. Nhieät ñoä detector : 250oC. Löu löôïng H2: 40ml/phuùt. H2 ñöôïc taïo thaønh nhôø maùy taïo H2. Löu löôïng khoâng khí: 400ml/phuùt. Nhieät ñoä coät: 180oC trong 2 phuùt, taêng 2,5oC/phuùt tôùi 205oC, taêng 3,5oC/phuùt tôùi 230oC, döøng 2 phuùt, taêng 5oC/phuùt tôùi 275oC. Cheá ñoä nhieät ñoä quyeát ñònh thôøi gian phaân tích maãu (khoaûng 30 phuùt). Cheá ñoä nhieät ñoä cuûa coät coù theå thay ñoåi nhaèm laøm giaûm nhöõng ñoaïn khoâng xuaát hieän peak treân saéc kyù ñoà, giaûm thôøi gian phaân tích. Trong quaù trình phaân tích phaûi ñaûm baûo vaän toác truyeàn thaúng cuûa khí trong coät laø khoâng ñoåi ñeå peak nhoïn vaø ñoái xöùng. AÙp suaát ñaàu vaøo cuûa khí mang :14psi. 4.Xử lý kết quả thí nghiệm: Thaønh phaàn acid beùo trong daàu ñaäu naønh tinh luyeän (Theo taøi lieäu tham khaûo) Acid beùo Haøm löôïng, % (Tính treân toång löôïng acid beùo) < C14 Caùc acid beùo no coù ñoä daøi maïch cacbon nhoû hôn C14 £ 0,1% 14:0 Acid myristic £ 0,2% 16:0 Acid palmitic 9% ¸ 13% 16:1 Acid palmitoleic £ 0,3% 18:0 Acid stearic 3,0% ¸ 5,0% 18:1 Acid oleic 17,0% ¸ 30,0% 18:2 Acid linoleic 48,0% ¸ 58,0% 18:3 Acid linolenic 5,0% ¸ 11,0% 20:0 Acid arachidic £ 1,0% 20:1 Acid eicosenoic £ 1,0% 22:0 Acid behenic £ 1,0% Töø ñaây ta coù baûng toùm taét sau: Maïch C Haøm löôïng, % < C14 £ 0,1% C14 £ 0,2% C16 9% ¸ 13,3% C18 83,4% ¸ 91% C20 £ 2% C22 £ 1% Nhö chuùng ta ñaõ bieát, khaû naêng taùch cuûa caùc caáu töû trong saéc kí khí phuï thuoäc vaøo: Khaû naêng töông taùc cuûa chuùng vôùi pha tónh vaø pha ñoäng: Neáu coät saéc kí söû duïng laø loaïi coù tính phaân cöïc, thì caáu töû naøo caøng phaân cöïc seõ töông taùc vôùi pha tónh caøng maïnh, caáu töû ñoù seõ bò giöõ laïi laâu hôn trong coät. Ngöôïc laïi neáu coät saéc kí söû duïng laø loaïi coù tính khoâng phaân cöïc, thì caáu töû naøo caøng ít phaân cöïc seõ töông taùc vôùi pha tónh caøng maïnh, caáu töû ñoù seõ bò giöõ laïi laâu hôn trong coät. Nhieät ñoä Do chuùng ta xaây döïng chöông trình nhieät ñoä töø thaáp ñeán cao neân khaû naêng taùch cuûa caùc caáu töû trong hoãn hôïp coøn phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä bay hôi cuûa caáu töû. Caáu töû naøo coù nhieät ñoä bay hôi thaáp hôn seõ bay hôi tröôùc vaø theo pha ñoäng ra ngoaøi tröôùc. Maët khaùc, chuùng ta laïi bieát raèng: Caùc acid beùo coù cuøng soá C, acid beùo naøo coù caøng nhieàu noái ñoâi hôn seõ caøng phaân cöïc. Caùc acid beùo khoâng coù cuøng soá C, acid naøo coù soá C nhoû hôn seõ coù nhieät ñoä bay hôi nhoû hôn, seõ ñi ra tröôùc theo pha ñoäng. Nhö vaäy, döïa vaøo soá C vaø soá noái ñoâi cuûa caùc acid beùo, ñoä phaân cöïc cuûa coät saéc kí, ta cuõng coù theå döï ñoaùn ñöôïc thöù töï cuûa caùc acid beùo treân saéc kí ñoà. Neáu chæ döïa vaøo saéc kí ñoà thu ñöôïc maø khoâng coù saéc kí ñoà cuûa chaát chuaån, ta khoâng theå ñònh tính vaø ñònh löôïng ñöôïc caùc acid beùo no coù trong daàu ñaäu naønh. Tuy nhieân ta vaãn coù theå suy ñoaùn ñöôïc vò trí caùc peak treân saéc kí ñoà laø öùng vôùi caùc acid beùo naøo döïa vaøo baûng thaønh phaàn acid beùo coù saün cuûa daàu ñaäu naønh nhö ñaõ neâu ôû treân. Coät saéc kí chuùng ta söû duïng laø loaïi coät coù tính phaân cöïc yeáu, naèm giöõa loaïi coät khoâng phaân cöïc vaø phaân cöïc neân chuùng ta raát khoù döï ñoaùn heát keát quaû thu ñöôïc maø chæ döï ñoaùn ñöôïc moät phaàn. Chuùng ta tieán haønh döï ñoaùn nhö sau: Vì dieän tích peak cuûa moät caáu töû treân saéc kí ñoà cuõng phaàn naøo theå hieän haøm löôïng cuûa caáu töû ñoù trong hoãn hôïp. Ta xem toång dieän tích peak laø 100% khoái löôïng cuûa hoãn hôïp, töø ñoù ta suy ra ñöôïc phaàn traêm caùc caáu töû coù trong hoãn hôïp. Theo baûng “Thaønh phaàn acid beùo trong daàu ñaäu naønh tinh luyeän” ôû treân, ta thaáy raèng trong daàu ñaäu naønh tinh luyeän, haøm löôïng cuûa C18 laø cao nhaát, keá ñeán laø C16. Cho neân nhoùm coù peak cao nhaát seõ öùng vôùi nhoùm C18, coøn peak cao keá tieáp laø peak öùng vôùi C16. C16 seõ ra tröôùc C18 do coù phaân töû löôïng nhoû hôn. Ngoaøi ra coøn coù caùc peak cuûa caùc acid beùo khaùc vaø caùc peak taïp vôùi haøm löôïng nhoû. Nhaän xeùt keát quaû thí nghieäm Nhaän xeùt keát quaû (so saùnh vôùi keát quaû cuûa baûng “Thaønh phaàn acid beùo trong daàu ñaäu naønh tinh luyeän”): Ñoái vôùi C18: keát quaû tính toaùn gaàn ñuùng vôùi soá lieäu trong baûng. Ñoái vôùi C16: keát quaû tính toaùn ñuùng vôùi soá lieäu trong baûng. Tuy nhieân ta cuõng thaáy raèng vieäc döï ñoaùn nhö vaäy ñoøi hoûi phaûi coù soá lieäu trong thöïc teá, vì vaäy noù chæ mang tính kieåm tra. Muoán ñònh löôïng vaø ñònh tính chính xaùc nhaát thieát phaûi coù chuaån cuûa caùc acid beùo. IV.ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ SINH HỌC CỦA LIPID – DHA: Cách xác định giá trị sinh học của lipid: Ta xác định giá trị sinh học của lipid bằng cách xác định thành phần acid béo không no, không thay thế trong thành phần thực phẩm có chứa lipid. Quan trọng nhất là xác định DHA. Nguyên liệu Trích ly bằng dung môi chiết lỏng siêu tới hạn tổng chất chiết Chiết phân đọan lipid Phân đoạn lipid Phân tích trực tiếp TLC-FID FAB-MS HPLC- MS HPLC Phân tích và phân tách bằng dung môi CC SF TLC Chú thích TLC (Thin-Layer Chromatography) sắc kí lớp mỏng FID (Flame Ionization Detection) sắc kí khí đầu dò ion hoá ngọn lửa FAB (Fast Atom Bombardment) : bắn phá nguyên tử MS (Mass Spectrometry) : khối phổ HPLC ( High-Perfomance Liquid Chromatograph) sắc kí lỏng cao áp CC (Column Chromatograph) : sắc kí cột SF (Solvent Fractional) : trích ly phân đoạn LIPID Ít phân cực Rất phâncực DUNG MÔI Hydrocacbons Wax ester Aldehydes Triacylglycerol Fatty alconhols Fatty acids Sterol Dyacylglycerols Monoacylglycerol Phospholipids Hexane Cyclohexan Dyethyleter Chloroform Acetone Acetonitrile Etanol metanol Giới thiệu về acid docosahexaenoic (DHA): Acid docosahexaenoic (DHA) là một acid béo bất bão hòa đa thuộc nhóm Ω-3. DHA chứa 22 nguyên tử carbon và 6 nối đôi, có công thức tổng quát là : CH3(CH2-CH=CH)6(CH2)2COOH Trọng lượng phân tử của DHA là 328,6 và điểm nóng chảy là -440C. DHA còn được kí hiệu là 22:6n-3 và trong tự nhiên có dạng acid cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic. 2 3 Phương pháp ly trích, cô lập và tinh sạch DHA: Phương pháp tách phân đoạn bằng li tâm phân tử (molecular centrifugal) Acid béo của dầu cá mòi (10% DHA) được phân chia thành những phân đoạn bằng ly tâm phân tử cho đến khi được những phân đoạn chứa 5, 11, 20, 21 và 30%. Phân đoạn cuối cùng được khuấy với urê trong MeOH ở 450C, làm lạnh trong 18 giờ ở 160C, lọc, nước lọc cho tiếp xúc với nhiều urê hơn, làm lạnh ở 130C qua đêm, lọc, nước lọc được cô đặc và tái xử lý với urê. Nước lọc cuối cùng được rót vào nước, dung dịch nước này được trích ly với ether, , làm khan dung dịch eter với Na2SO4 và dung môi được loại bỏ. Sản phẩm bây giờ chứa 88% DHA, và được làm tinh khiết hơn bằng cách chuyển thành methyl ester, đi qua silica gel, giải li bằng dung môi ether dầu hỏa, và loại bỏ những tạp chất còn dư bởi sự chưng cất phân tử. Phương pháp CO2 siêu tới hạn (supercritical carbon dioxide) lCO2 siêu tới hạn (SC-CO2) là một chất thích hợp để trích ly các chất không phân cực (triacylglycerol). Hiệu quả trong việc sử dụng SC-CO2 và hỗn hợp ethanol để trích ly và phân đoạn các phospholipid từ trứng cá hồi đã được khảo sát. Sự trích ly được thực hiện ở nhiệt độ 330C và áp suất thấp 17,7MPa để tránh sự oxide hóa các acid béo bất bão hòa đa. Các phospholipid đươc trích ly hiệu quả với 10, 15 hay 20% ethanol trong SC-CO2. Lượng phospholipid được trích ly tăng cùng với sự bổ sung ethanol (với hỗn hợp 20% ethanol, có 80% các phospholipid được thu nhận). Phương pháp trích bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) Các acid béo được trích ly bằng cách sử dụng “máy trích CO2 lỏng siêu tới hạn” (Supercritical Fluid CO2 Extraction Machine). 3 mức áp suất khác nhau (200, 240 và 280 bar), 3 mức nhiệt độ khác nhau (35, 40 và 450C) và 5 khoảng thời gian khác nhau (60, 120, 180, 240 và 300 phút) được chọn. Điều kiện lý tưởng nhất cho sự trích ly acid béo bất bão hòa đa được xác định là áp suất 280 bar ở nhiệt độ 400C và 300 phút. Phương pháp sắc ký cột CC (Column Chromatography) Các acid béo bất bão hòa (C ≥ 16) và những dẫn xuất của chúng được tách bởi sắc ký cột sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc CO2 lỏng như là pha động và oxit nhôm đã xử lý với kiềm như là pha tĩnh. Phosphate kim loại cũng được sử dụng như là tác nhân tách chiết các acid béo bất bão hòa và các chất tương đồng của chúng. Các tác nhân tách chiết bao gồm các muối phosphoric acid với Ag (và các kim loại khác). Hỗn hợp chứa ethyl eicosapentaenoate và ethyl docosahexaenoate được: Đưa lên sắc ký cột silica gel phủ Ag phosphate Cột được giải li với hỗn hợp n-hexane và n-hexane-isopropanol để thu nhận lượng ester. Phương pháp sắc ký cột ion bạc cũng được dùng để thay thế cho việc trích pha rắn để tách các acid béo methyl ester. Cột trích pha rắn loại Bond Elut SCX (0.5g propylbenzene sulphonic acid) được cân bằng bởi 5ml NaOH 1M, 10ml nước, 5ml HCl 4M, nước cho đến khi đạt pH trung tính và tiếp tục với acetonitrile-nước (10:1). Cột được bọc lại trong cuộn nhôm để tránh ánh sáng.Cột được chuyển sang dạng ion bạc bằng cách cho ngấm kiệt từ từ 1ml dung dịch AgNO3 (40mg AgNO3 trong 1ml acetonitrile-nước 10:1). Sau đó cột được giải ly lần lượt với 5ml acetonitrile, 5ml acetone và 10ml dichloromethane, 0,1ml dichlorome0thane chứa không quá 1mg acid béo methyl ester. Các (hệ) dung môi dùng để giải ly có độ phân cực tăng dần (từ dichloromethane đến acetone-acetonitrile) theo số liên kết đôi của acid béo (từ acid béo bão hòa đến acid béo 6 nối đôi). Sự giải ly tiến hành ở áp suất khí quyển (vận tốc dòng chảy 0,5ml/phút). Phương pháp bạc nitrate (silver nitrate method) DHA và các dẫn xuất của nó được cô lập từ hỗn hợp các acid béo bất bão hòa đa từ nguồn tự nhiên bằng phương pháp bạc nitrate. Phương pháp bao gồm sự tính toán lượng bạc nitrate cần để tạo phức với các acid bất bão hòa đa dựa trên số mol nối đôi có trong acid béo bất bão hòa. DHA được tách chiết và tinh sạch từ dầu cá ngừ bằng phương pháp tách chiết nhiệt độ thấp kết hợp với phương pháp kết tinh sắc ký cột Ag+/silica gel hoặc phương pháp riêng lẻ với sắc kí cột Ag+/silica gel. Dung môi giải ly cột là hỗn hợp của aceton (hoặc diethyl ether)-hexane. Một phương pháp khác được sử dụng để tinh sạch hỗn hợp các acid béo methyl ester từ dầu cá hoặc dầu thực vật là phương pháp sắc ký lớp mỏng ion bạc. Các bản mỏng silica gel được nhúng trong 1 phút vào dung dịch bạc nitrate 4% trong methanol-nước (9:1). Sau đó bản mỏng được sấy khô 2 phút dưới ánh sáng mờ trong tủ sấy thông gió và tiếp tục trong 20 phút ở 1000C. Chúng được giữ trong 1 hộp được đậy kín ở trong tối. Dung môi giải ly có thể là hexane-diethyl ether (9:1) để tách các acid béo bão hòa, acid béo có 1 nối đôi và acid béo có 2 nối đôi, hoặc là toluen-ethyl acetate (9:1) để tách tất cả các loại acid béo theo độ bất bão hòa. Tỷ lệ dung môi có thể thay đổi 1 ít theo điều kiện thí nghiệm (loại bản mỏng, độ ẩm, nhiệt độ, hình dạng của bình giải ly …) để nâng cao hiệu quả của việc phân tách. Việc thêm 1% acid acetic theo thể tích vào pha động cho phép các vết acid béo đạt độ phân giải tốt. Bảng mỏng được sấy trong tủ sấy thông gió, nhúng vào dung dịch nước đã bão hòa sodium thiosulphate trong 1 phút và rửa dưới dòng nước chảy trong 1 phút. Sau đó tiếp tục sấy khô và phun xịt với primuline để phát hiện các vết acid béo phát huỳnh quang dưới đèn UV. Phương pháp nhận danh DHA: Phương pháp sắc ký khí (gas chromatography – GC), sắc ký khí ghép khối phổ (gaschromatography/mass spectrometry – GC/MS) và sắc ký khí mao dẫn (capillary gas chromatography). Các acid béo tự do và acid béo trong triglyceride trong dầu cá biển sâu được biến đổi thành acid béo methyl ester bằng cách sử dụng tetramethylammonium hydroxide methanoal (N(CH3)4OH-CH3OH). Sau đó, các acid béo methyl ester này được phân tích bằng GC và GC/MS. Kỹ thuật sắc ký khí mao dẫn được áp dụng trong việc định danh các acid béo bão hòa chuỗi dài và acid béo bất bão hòa trong lòng đỏ trứng và gan gà. Mẫu trước tiên được làm đồng nhất và trích ly bằng cách sử dụng chloroform-methanol (CHCl3-MeOH) hay methylene chloride-methanol (CH2Cl2-MeOH) 2:1, những acid béo trong chất trích được methyl hóa với KOH-MeOH. Acid béo methyl ester được phân tích bằng sắc ký khí mao dẫn. Các Ω-3 LC PUFAs có hoạt tính sinh học dễ bị oxde hóa như EPA, DPA (docosapentaenoic acid, 22:5n-3) và DHA có thể được xác định bởi phương pháp này. Phương pháp ái lực pha rắn với ion bạc và sắc ký lớp mỏng có chỉnh đổi (affinity solidphasepurification with argentous ions and modified thin layer chromatography) Đây là phương pháp đơn giản để nhận danh DHA trong sữa bò. Phương pháp bao gồm ba bước : (1) sự methyl hóa DHA một lần trong sữa bò mà không cần phải loại béo trước (2) sự cô đặc methyl ester bằng sắc ký cột silica gel có chỉnh đổi với AgNO3 (3) sự phát hiện DHA methyl ester bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao-tập trung vết (spot focusing-high performance thin layer chromatography). DHA được methyl hóa trực tiếp trong sữa bò và được cô đặc một cách có chọn lọc nhờ vào ái lực của nó với các ion bạc. Phương pháp này không cần sự trích ly lipid tốn hao lượng lớn dung môi hữu cơ và không cần hệ thống sắc ký khí. Phương pháp phổ hồng ngoại chuyển dạng Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy – FT-IR) Những co giãn của nối =C-H alkene của các acid béo bất bão hòa trong dầu sẽ hấp thu ở bước sóng 3010cm-1 với những cướng độ khác nhau. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này : nguồn sáng phát ra một chùm bức xạ đến gương cầu lõm, tại gương cầu lõm sẽ cho chùm tia phản xạ song song đập vào gương phẳng. Ánh sáng phản xạ từ gương phẳng sẽ đi vào giao thoa kế michelson rồi đi qua mẫu đến detector. Tín hiệu quang sau đó sẽ được biến đổi thành tín hiệu điện, qua bộ khuếch đại rồi và bộ máy tính lắp ghép với máy phổ. Máy tính sẽ xử lý tín hiệu và in ra phổ. Sự đo bằng FT-IR trên thực tế có thể dự đoán được thành phần của mỗi loại PUFA trong mẫu dầu được kiểm tra. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography – HPLC) hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp (high pressure liquid chromatography) Phương pháp HPLC thuộc loại sắc ký cột có pha động là chất lỏng. Khác với các loại sắc ký lỏng khác, hiệu quả phân tích của HPLC rất cao là do vật liệu nhồi cột có kích thước hạt rất bé (5-10 μm) và độ đồng nhất cao cùng với việc sử dụng nhiều đầu dò khác nhau. HPLC tỏ ra ưu việt hơn so với sắc ký khí khi phân tích thành phần của dầu cá do dầu cá không cần phải methyl ester hóa trước khi phân tích. Dầu cá khi phân tích sẽ được hòa tan vào dung môi thích hợp và được phân tích ở nhiệt độ phòng. Trong sắc ký phân bố, thông thường người ta sử dụng pha tĩnh phân cực hơn so với pha động và gọi là sắc ký thuận (normal phase). Nhưng trong kỹ thuật HPLC ngược lại người ta thường dùng pha tĩnh kém phân cực hơn và gọi đó là sắc ký pha đảo (inversed phase) (RP-HPLC). Dung môi sử dụng ở phương pháp này là dung môi phân cực, thường ít độc hại, rẻ tiền và không gây ô nhiễm môi trường (thường dùng nước có bổ sung methanol, ethanol hoặc acetonitrile). Sử dụng phương pháp tủa urê (urea complexation) để loại bỏ các acid béo bão hòa Theo những nghiên cứu gần đây, mỡ cá có vai trò rất quan trọng đối với con người bởi vì nó có chứa nhiều PUFA (polyunsaturated fatty acid – acid béo bất bão hòa đa), đặc biệt là DHA và EPA (acid eiscosapentaenoic). Tuy nhiên, lượng DHA và EPA này (đặc biệt là DHA) chiếm tỷ lệ rất thấp trong mỡ cá. Do đó đã có nhiều nghiên cứu về cách làm giàu PUFA trong mỡ cá để đưa vào sử dụng. Các PUFA có thể được làm giàu lên bằng nhiều phương pháp khác nhau như tạo tinh thể ở nhiệt độ thấp, tủa urê, lọc phân tử, tạo kết tủa với ion bạc hoặc bằng cách sử dụng lipase. Tuy nhiên, phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất để thu nhận những PUFA được làm giàu dưới dạng những acid béo tự do từ mỡ cá là phương pháp tủa urê. Đây là một phương pháp sử dụng urê để tạo tủa với các acid béo bão hòa, loại bỏ bớt các acid này ra khỏi hỗn hợp acid acid béo ban đầu. Phương pháp này dựa trên hiện tượng urê sẽ tạo thành tinh thể (kết tủa) ở nhiệt độ thấp và các acid béo bão hòa sẽ liên kết với những tinh thể urê. Bằng cách loại bỏ những kết tủa này có thể loại bỏ được những acid béo bão hòa trong hỗn hợp. Phương pháp này đã được áp dụng trên dầu gan cá tuyết và kết quả thu được là rất khả quan, hàm lượng DHA và EPA trong hỗn hợp tăng lên đến 60-85% . Cách tiến hành Mỡ cá đem đi thủy giải để thu được những acid béo tự do. Acid béo tự do thu được sau đó sẽ được trộn lẫn với urê (10%, w/v) trong ethanol 95%. Hỗn hợp này được đun nóng kết hợp với khuấy kĩ ở 60 – 700C đến khi thành một dung dịch đồng nhất. Tỷ lệ của urê với lượng acid béo tự do theo nghiên cứu tốt nhất là 1 : 15 theo số mol. Dung dịch này sau đó được cho vào tủ đông -50C trong 22 giờ. Loại bỏ kết tủa tạo thành bằng phương pháp lọc. Nước lọc sau đó được pha loãng với một lượng nước cất và được acid hóa bởi acid H2SO4 6M sao cho pH= 2-3. Thêm vào dung dịch nước lọc một lượng hexan (hoặc ether dầu hỏa) và lắc kỹ. Dung dịch nước lọc sau đó sẽ tách làm hai lớp : lớp nước chứa urê nằm phía dưới và lớp hexan (ether dầu hỏa) chứa acid béo nằm phía trên. Thu lấy lớp hexan (ether dầu hỏa), làm khan nước, đem cô quay đuổi dung môi thu được acid béo tự do chứa chủ yếu là các acid béo bất bão hòa. Phương pháp sắc ký ghép khối phổ (gas chromatograph / mass spectrometry – GC/MS) Nguyên tắc hoạt động: Vào những năm đầu của thập kỷ 70, kỹ thuật liên hợp giữa hệ thống sắc ký khí và phổ khối lượng được ra đời. Trong trường hợp này các cấu tử sau khi tách khỏi cột sắc ký sẽ lần lượt được đưa vào buồng ion hóa của máy khối phổ. Tại đó chúng được phân mảnh và tách theo khối lượng nhờ một từ trường rồi đi vào bộ nhân quang để chuyển hóa thành tín hiệu điện ứng với mỗi peak trên sắc ký đồ mà ta sẽ nhận được một khối phổ riêng biệt và hoàn chỉnh. Sơ đồ thiết bị GC/MS: 4 So sánh giữa phương pháp sắc ký và phương pháp khối phổ thấy có những đặc tính chung sau : Mẫu được nghiên cứu trong trạng thái khí. Cả hai phương pháp đều có độ nhạy cao. Tốc độ phân tích của cả hai phương pháp tương tự nhau. Sự khác biệt duy nhất giữa hai phương pháp này là trong cột sắc ký luôn tồn tại một áp suất lớn hơn áp suất môi trường, trong khi đó buồng ion của máy khối phổ lại hoạt động ở một chân không cao (khoảng 10-6mmHg). Để có thể ghép nối giữa cột sắc ký và buồng ion, giữa hai thiết bị này có một bộ phận dùng để táchkhí mang (thường là helium) trước khi vào buồng ion hóa. Nhờ đó mà độ chân không của nguồn ion không bịảnh hưởng. Toàn bộ hệ thống GC/MS được nối với máy tính để điều khiển tự động, xử lý số liệu, lưu trữ và ghi phổ. Phổ MS ghi được sẽ được so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thư viện máy tính, nhờ đó mà xácđịnh được các chất có trong mẫu. Thư viện phổ cần phải có nhiều phổ chuẩn để tăng độ chính xác cho sựdò tìm và so sánh. Những ưu điểm của phương pháp GC/MS : Lượng mẫu cần phân tích nhỏ. Nghiên cứu được các hợp chất không bền. Tiến hành tốt việc tách và nhận biết đồng thời hỗn hợp nhiều cấu tử. Nhược điểm của phương pháp này là không phân tách được các chất có trọng lượng phân tử cao, có nhiệt độ bay hơi cao. Vì acid béo khó bay hơi nên thường phải được ester hóa để trở thành dạng methyl hoặc ethyl ester là dạng dễ bay hơi để có thể phân tích bằng sắc ký khí ghép khối phổ. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC) Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatogaphy), là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng, trong đó pha động là chất lỏng được cho đi ngang qua một lớp chất hấp thu trơ (ví dụ như : silica gel hoặc oxid alumin) chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng nên được phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Trong phần tích lipid, loại bản mỏng được sử dụng là bản nhôm tráng silica gel có trộn thêm chất phát huỳnh quang (Merck) Muốn thực hiện việc sắc ký, người ta cho mẫu cần phân tích (có thể chứa nhiều hợp chất khác nhau) hòa tan vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất này thành một vết nhỏ gọn lên tấm lớp mỏng nói trên, vết chấm ở vị trí cách cạnh đáy 1 – 1,5cm. Sấy nhẹ để đuổi bay đi phần dung môi hòa tan mẫu, như thế mẫu chất chỉ còn là dạng bột khô ở trên tấm lớp mỏng. Đặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng đứng vào trong một bình có chứa sẵn dung môi phù hợp (chiều dày của lớp dung môi trong bình không quá 1cm). Trước khi đặt bản vào bình, bình được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc có tẩm ướt dung môi dùng để giải ly. Dung môi sẽ bị lực mao quản hút di chuyển lên cao trong tấm bảng, quá trình như thế sẽ phân chia hỗn hợp mẫu chất ban đầu thành những vết riêng biệt . Khi dung môi lên gần hết tấm bảng (còn cách khoảng 0,5cm), lấy bảng ra khỏi bình và sấy khô bảng. Các vết mẫu sẽ được xác định bằng phương pháp vật lý (nhìn trực tiếp bằng mắt thường, soi tấm bảng bằng đèn phát huỳnh quang…) hoặc bằng phương pháp hóa học (phun xịt lên tấm bảng bởi một loại dung dịch thuốc thử phù hợp). Ở đây, chúng tôi đã sử dụng phương pháp hóa học với thuốc thử là dung dịch H2SO4 đậm đặc để xác định vết mẫu. Bản mỏng sau đó được lưu trữ trong bao plastic hoặc chụp hình và scan lại cho việc nghiên cứu về sau. Một hợp chất tinh khiết sau khi sắc ký lớp mỏng sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ dung môi xác định, bởi bảng sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Rf được tính theo công thức sau : Rf = (khoảng đường di chuyển của hợp chất)/ (khoảng đường di chuyển của dung môi) Giá trị Rf không bao giờ > 1 và thay đổi tùy theo : loại chất hấp thu dùng để tráng bảng mỏng, bảng mỏng tráng sẵn dù của cùng một hãng sản xuất cũng khác nhau từ lô này đến lô kia, hoạt độ của bảng lúc sử dụng, việc tồn trữ bảng , độ dày của bảng, thành phần của dung môi giải ly (chỉ cần thay đổi một ít cũng làm ảnh hưởng kết quả), độ bão hòa của dung môi trong bình giải ly của 2 lần giải ly khác nhau cũng khác nhau, kỹ thuật giải ly (dung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết quả khác nhau). Dung môi giải ly phù hợp là dung môi có thể là cho hỗn hợp các chất ban đầu tách thành nhiều vết khác nhau, các vết này sắc nét, rõ ràng và có vị trí nằm trong khoảng từ 1/3 đến 2/3 chiều dài bản sắc ký (các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 đến 0,7) Sắc ký lớp mỏng có các ưu điểm sau : Mẫu để phân tích chỉ cần một lượng rất ít. Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. Việc triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết kết quả mẫu cần phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng. Sau quá trình giải ly, dung môi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bảng mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hoặc hóa học để phát hiện sự hiện diện chất nên không phải lo đến vấn đề hậu sắc ký như ở sắc ký lỏng cao áp (HPLC). TÀI LIỆU THAM KHẢO Methods of analysis Food Components and Adititives