Đề tài Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì

t chưa tới. Nhóm báo cáo chúng em rất mong tiếp tục nhận được sự hướng dẫn chỉ bảo thêm của thầy Lê Văn Việt Mẫn, giúp chúng em hoàn thiện hơn nữa bài báo cáo. Cuối cùng chúng em xin được cảm ơn thầy Lê Văn Việt Mẫn, trong thời gian qua đã xây dựng cho chúng em nền tảng về công nghệ lên men, cũng như hôm nay, thầy lại hướng dẫn chúng em đi sâu hơn về từng đề tài cụ thể. Tp Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 5 năm 2008 Nhóm báo cáo I). Nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men bánh mì : Vi sinh vật : 1.Giới thiệu : Đặc điểm hình thái và cấu tạo: Saccharomyeces có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “Men đường”. Cerevisiae là từ gốc Latinh có nghĩa là “Bia”. Ngoài ra, Saccharomyces cerevisiae còn được gọi dưới những cái tên khác như: Men ale Men nảy chồi Hình 1: Nấm men Saccharomyces.cerevisea Để sản xuất men bánh mì người ta gần như chỉ sử dụng các loài Saccharomyces cerevisiae. Đó phải là các loài rất bền nhiệt, có thể sinh sản nhanh và đồng thời kéo dài được hoạt tính enzym của mình ở nhiệt độ cao. Cũng đã có nhiều nghiên cứu tìm cách sử dụng các giống Torula, Candida và Oospora để sản xuất men bánh mì, vì khác với loài Sacchoromyces cerevisiae chỉ đồng hóa được đường hexose, các giống nấm men này có thể sử dụng được cả pentose. Nhưng cho đến nay người ta vẫn chưa thành công trong việc sử dụng các giống này để sản xuất men bánh mì ở quy mô công nghiệp. Đối với các lọai bột nhão chứa nhiều đường và mỡ song lại ít nước, có thể dùng các chủng nấm men ưa thẩm thấu hoặc các con lai giữa Saccharomyces cerevisiae với các chủng hoang dại để thay thế bột nở hóa học. Men bánh mì ở các cơ sở sản xuất đang dùng thuộc giống Saccharomyces loài cerevisiae, lớp Ascomycetes, ngành nấm. Là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ từ 5-6 đến 10-14 mm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử. Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng đường glucose, galactose, saccharose, raffinose, maltose, rượu ethanol, glycerin như nguồn cacbon, sử dụng axit amin và muối amon như nguồn nitơ. Dinh dưỡng và con đường chuyển đổi vật chất trong tế bào nấm men : Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm 2 giai đoạn : Chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào Chuỗi các phản ứng hóa học, biến đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp chất liệu cho tế bào Môi trường dinh dưỡng chứa những thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau. Các chất không tích điện như đường saccharose, rượu, axit hữu cơ, amino axit xâm nhập qua màng tế bào bằng cách khuếch tán hay vận chuyển chủ đông, do sự khác nhau về nồng độ các chất này giữa tế bào và môi trường. Các chất điện tích trong dung dịch như muối KCl, Mg, Ca, và các kim loại khác có thể vào tế bào thụ động theo thang nồng độ hay vận đông ngược lại thang nồng độ (vận chuyển hoạt động). Ngoài nguồn hydrat cacbon và nguồn nitơ hoặc vô cơ hoặc hữu cơ, nấm men còn sử dụng các nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca có vai trò quan trọng trong dinh dưỡng nấm men. Riêng ion natri (Na+) có ý nghĩa quan trọng trong sự tăng trưởng tế bào nấm men. Ion Natri là thành phần duy nhất di chuyển vào tế bào bằng cả 2 cơ chế: thụ động và hoạt động và khi nó xâm nhập vào tế bào nấm men, mang theo cả saccharose, amino axit, ngay cả khi không có sự chêch lệch nồng độ các chất này giữa tế bào và môi trường. Kết quả thí nghiệm cho thấy: khi thêm NaCl vào môi trường từ 1 - 1,5%, dẫn đến quá trình tổng hợp hoạt động tăng, gia tăng hoạt tính sinh sản của nấm men và hiệu suất thành phẩm cao hơn, phẩm chất thành phẩm được cải tiến, đồng thời hạn chế sự phát triển của nấm men lạ. Bảng 1: Ảnh hưởng của NaCl lên thành phần bánh mì PHƯƠNG PHÁP NUÔI Thành phần trong tế bào Chất lượng nấm men Chất khô Độ ẩm Hoạt lực làm dậy bột Tính nhạy cảm thẩm thấu Không thêm NaCl Có thêm NaCl 34,7 40,0 65,3 60.0 60-75 45-55 5-20 0-6 Chất dinh dưỡng sau khi vào tế bào nấm men sẽ được biến đổi theo một trong hai con đường sau, tùy điều kiện môi trường và phương pháp nuôi cấy : C6H12O6 CH3-CO-COOH + 4H2 đường glucose CH3CH2OH + CO2 (1) 6H2O + 6CO2 (2) trong đó con đường (1) chủ yếu tạo cồn. Theo quan điểm năng lượng quá trình này ít kinh tế hơn vì còn nhiều năng lượng trong rượu, trong khi con đường (2) tạo ra các thành phần chủ yếu của tế bào. Từ những thành phần này khối lượng tế bào gia tăng đến một giới hạn nhất định, sau đó tế bào bắt đầu nảy chồi. Vách tế bào mềm đi, chất nguyên sinh của tế bào chui qua vách này, và bắt đầu hình thành vách cho túi sinh chất con. Chồi tăng kích thước cho đến khi tách khỏi tế bào mẹ. Tùy chủng và điều kiện nuôi quá trình này thường mất từ 1 đến 1 giờ 30 phút. Cho đến nay chưa rõ là có bao nhiêu tế bào con có thể được sinh ra từ một tế bào mẹ Đặc tính nấm men dùng trong sản xuất: Trong sản xuất nấm men bánh mì hiện nay ở Châu Âu người ta sử dụng 2 loại nấm men để làm nở bánh : Dạng nấm men nhão (paste) Dạng nấm men khô Nấm men dạng paste (còn gọi là nấm men paste) Nấm men paste là nấm men thu được sau khi ly tâm men lỏng. Nấm men paste thường có độ ẩm khoảng 70-75%. Nấm men paste thường có hoạt lực làm nở bánh kém hơn nấm men lỏng do trong quá trình ly tâm và thời gian kéo dài, nhiều tế bào nấm men bị chết. Nếu được bảo quản lạnh ở 4 - 70C, ta có thể sử dụng nấm men paste trong khoảng 10 ngày. Như vậy nếu chuyển từ nấm men lỏng sang nấm men paste ta kéo dài được thời gian sử dụng và vận chuyển. Ở nhiều nước,nhiều cơ sở sản xuất nấm men bánh mì sử dụng nấm men dạng paste. Ở Việt Nam các cơ sở sản xuất bánh mì cũng thường sử dụng nấm men dạng paste. Liều lượng sử dụng khoảng 1-5%(tính theo khối lượng men trên khối lượng dịch lên men), tùy theo chất lượng nấm men. Nấm men khô Nấm men khô được sản xuất từ nấm men dạng paste. Người ta sấy nấm men paste ở nhiệt độ < 400C hoặc sử dụng phương pháp sấy thăng hoa. Nấm men khô thường có lực nở không cao nhưng có ưu điểm rất lớn là thời gian sử dụng rất lâu và dễ dàng vận chuyển Bảng 2: Ảnh hưởng của một số chất lên sự tăng trưởng của tế bào nấm men CHẤT Nồng độ làm nấm men chậm hay ngừng phát triển (%) Nồng độ làm nấm men chết (%) Sunphurơ( SO2) Natrifluo Axit nitric Formalin Karamen Axit acetic Axit formic Axit oxalic Axit sunphuric Axit photphoric Axit clohydric Ethanol 0,0025 0,002 0,0005 0,001 0,1 0,02 0,17 0,001 0,39 0,30 0,14 12 0,004 0,09 3,0 0,34 1,3 2,0 0,72 25 2.Tiêu chuẩn chọn giống: Trong công nghiệp tuyển chọn chủng nấm men phải đảm bảo các đặc tính sau: Không sinh độc tố. Khả năng sinh sản nhanh, cho năng suất cao trong quá trình lên men. Khả năng lên men các nguồn đường glucose, fructose, maltose, saccharose. Có khả năng nở bột tốt, làm khối bột nhào nhẹ và xốp. Dễ hoà với nước. Có đặt tính sinh hoá ổn định và độ bền vững tốt (khó bị tự phân). Bền nhiệt, có thể kéo dài hoạt tính enzyme ở nhiệt độ cao. Dễ tách sinh khối và dễ bẻ gãy sau khi ép. Đặc điểm nấm men chịu được quá trình làm khô : Do chúng ta sản xuất men khô nên nấm men sử dụng cần có thêm các đặc điểm sau : Lượng Trehalose trong tế bào cao : Trehalose là nguồn chất dự trữ cho tế bào. Những nghiên cứu về vai trò của hydratcacbon cho thấy : Trehalose không những là cơ chất giàu năng lượng cho các quá trình nội bào, mà còn là tác nhân điều chỉnh áp suất nội bào, qua đó làm tăng hoạt tính sinh tổng hợp. Trehalose là disaccharide của glucose, sản sinh nhiều năng lượng khi bị phân cắt hơn so với tinh bột. Hợp chất này giúp tế bào sinh vật chịu được điều kiện thiếu nước, theo quan niệm một số nhà khoa học cho rằng do nó có thể thay thế chức năng của nước.Trehalose có ở tôm, côn trùng. Khi thiếu nước, cơ thể của những sinh vật này sẽ tự động tổng hợp trehalose từ glucose. Phân tích hóa học cho thấy lượng Trehalose trong men ép từ 2.1 - 4.9 % trong khi lượng này trong men khô có từ 7.6 - 8.1 %. Để có nấm men chứa nhiều Trehalose có thể dùng một số phương pháp sau : - Tăng áp suất thẩm thấu của môi trường - Giảm cường độ thông khí - Không cung cấp nguồn hydratcacbon 2 - 3 giờ vào giai đoạn cuối của quá trình sản xuất Lượng saccharose nội bào : cũng là một chỉ số quan trọng xác định men thích hợp để làm men khô.. Trong quá trình hô hấp hiếu khí, đường nội bào được chuyển hóa thành CO2 và H2O. Do đó có thể tính được lượng saccharose nội bào nhờ số lượng khí CO2 phóng thích ra. Thể tích CO2 tương ứng với lượng saccharose nội bào thích hợp cho men làm khô là >20ml CO2/giờ. Tính nhạy cảm thẩm thấu: thể hiện bằng sự chênh lệch về thời gian làm dậy bột của nấm men giữa bột không có NaCl và bột có 3.35 % NaCl. Sự khác nhau không quá 10 phút, được chọn là nấm men bền vững để làm khô. Khả năng tạo bào tử : những chủng thích hợp để làm nấm men khô có khả năng tạo bào tử thấp hơn < 40% Rỉ đường: Yêu cầu chất lượng rỉ đường: Hiện nay rỉ đường được xem là sản phẩm phụ của nhà máy đường thường được dùng làm cơ chất cho nhiều dạng lên men, vì giá thành rẻ và trong rỉ đường ngoài Saccharose còn có nhiều hợp chất khác như chất khoáng, hợp chất hữu cơ, vitamin có giá trị cao cho quá trình lên men. Thành phần rỉ đường của từng nhà máy, từng vùng không giống nhau, tùy thuộc vào giống mía hay củ cải đường, loại đất trồng, tình trạng bón phân, điều kiện khí hậu khi cây mọc, điều kiện xử lý sau thu hoạch. Bảng 3 : Thành phần rỉ đường từ mía và củ cải đường có chứa 75% chất khô THÀNH PHẦN Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía Đường tổng số (%) Chất hữu cơ không phải đường (%) Protein ( NÍ6.25) Kali (%) Ca(%) Mg(%) P(%) Biotin(mg/kg) Pantothenic axit (mg/kg) Inositol(mg/kg) Thiamin(mg/kg) 48-52 12-17 6-10 2-7 0,1-0,5 0,09 0.02-0,07 0,02-0,15 50-110 5000-8000 1,3 48-56 9-12 2-4 1,5-5 0,4-0,8 0,06 0,6-2 1-3 15-55 2500-6000 1,8 Trong đa số trường hợp rỉ đường củ cải chỉ cần được trung hòa bởi CaCO3 là đủ trong khi rỉ đường mía phải được làm trong bằng axit, rồi sau khi trung hòa và lọc thường còn được lọai màu bằng than. Bảng 3 cho thấy rỉ đường không bổ sung sẽ bị thiếu nitơ và photpho cần thiết cho sinh trưởng của nấm men bánh mì. Bảng 4 : Thành phần nguyên tố của nấm men và của rỉ đường củ cải 100g rỉ đường củ cải hàm lượng 50% saccaroza chứa trung bình : C N P K Mg Ca 33g 1,5-2g 0,03g 6g 0,025g 0,3g 100g men ép (27% chất khô) chứa trung bình : 12,3g 2,3g 0,28g 0,54g 0,03g 0,01g Các hợp chất chứa nitơ của rỉ đường có thể được nấm men sử dụng tới 30% - 40%. Các hợp chất này chủ yếu bao gồm betain, axit asparaginic, axit glutamic, leucin, isoleucin, tirosine và các muối nitrat. Trong số đó chỉ có betain là hầu như không được nấm men sử dụng. Để thay thế người ta dùng các nguồn nitơ vô cơ như nước amoniac (chứa 18% - 23% hàm lượng nitơ), sulfat amon (chứa 20% - 21% hàm lượng nitơ) hoặc các muối photphat amon, các muối nitrat và đôi khi cả ure. Tuy nhiên trong trường hợp này lượng biotin trong dịch lên men phải được tăng cường vì rằng enzym phân giải ure của nấm men, ure amidoliase, có thể đòi hỏi một lượng lớn biotin. Photpho có thể được bổ sung dưới dạng, một loại muối thích hợp hoặc dưới dạng axit orthophotphoric. Như đã thấy trong bảng 4, hàm lượng K của rỉ đường đủ cao để thỏa mãn nhu cầu của nấm men. Đối với canxi và các nguyên tố vết cũng như vậy (trừ kẽm), song với magie thì không, nguyên tố này cần phải được bổ sung dưới dạng muối sulfat. Biotin cũng cần được bổ sung trong trường hợp chỉ dùng rỉ đường củ cải. Cũng có thể dùng một chất của biotin là desthiobiotin để bổ sung, chất này rẻ hơn và có thể được nấm men chuyển hóa thành biotin. Trong một số trường hợp cần bổ sung một số vitamin khác, như tiamin là chất có tiềm năng kích thích khả năng làm nở bột mì của nấm men. Vì rằng ngày nay rỉ đường qua các kỹ thuật sản xuất mới hầu như không còn chứa các chất sinh trưởng cho nấm men nên việc bổ sung các chất sinh trưởng vào cơ chất lên men là cần thiết. Điểm đáng chú ý là trong rỉ đường mía có lượng biotin nhiều gấp 20 lần so với rỉ đường củ cải và đáp ứng được nhu cầu biotin của nấm men (160 - 200 mg/1 tấn rỉ đường). Ngoài những thành phần có ích cho sự tăng trưởng của nấm men, rỉ đường còn chứa nhiều chất có hại. Những chất này phần lớn hình thành trong quá trình kết tinh đường hay trong quá trình bảo quản rỉ đường, chằng hạn như : canxi (Ca), sulfurơ (SO2) dùng để làm nước mía trong lại, hydroxylmethyl furfural hình thành trong quá trình nấu, kết tinh đường. Đồng thời, nếu lượng chất khô trong rỉ đường ít hơn 75% và độ pH nhỏ hơn 7, rỉ đường rất dễ bị nhiễm vi sinh vật. Các chất dinh dưỡng bổ sung: Sulfat amon (NH4)2SO4 : là nguồn đạm cho tế bào nấm men, chứa ít nhất 21% nitơ, độ ẩm không quá 1,5%. Vì sulfat amon thường được sản xuất từ axit sulfuric có thể còn lẫn FeS và FeSO3 độc đối với tế bào nấm men. Có thể xử lí bằng cách để sulfat amon ngoài không khí đến khô, 4 giờ trước khi cho vào hệ thống lên men thì pha thành dạng dung dịch. Dung dịch amoniac : dùng để chỉnh độ pH và là nguồn đạm cho nấm men, có chứa 25% nitơ Axit photphoric : nguồn photpho, nồng độ không ít hơn 70% có thể thay thế DAP. DAP : có chứa P2O5 hơn 50,5%. MgSO4 loại kỹ thuật, dễ tan trong nước, lượng MgO < 16,3%, arcenic không hơn 0,0003% H2SO4 Hóa chất chống nhiễm : clorua canxi, NaOH (xút kỹ thuật) từ 0,5-1% để chống nhiễm thiết bị và đường ống. Nước sản xuất : Để nuôi nấm men cần loại nước mềm và mềm trung bình (10 cứng tương ứng với 10mg CaO/1 lít) có độ cứng lần lượt từ 4-80 và 8-120, nước sạch, trong, không màu, không mùi, hàm lượng các muối sau đây (không hơn mg / lít) Cl- = 0.5, SO42- = 80, As = 0.05, Pb = 0.1, Zn = 5, Cu = 3, FeO = 3, hàm lượng vi sinh vật không hơn 20 vi khuẩn E.coli/ lít Dầu phá bọt : Có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt dung dịch, áp suất khí cacbonic (CO2) làm vỡ tung bọt thoát ra ngoài. Có thể dùng axit oleic hay dầu lạc, dầu cám, dầu thầu dầu, nồng độ từ 0,005 - 0,01% so với dung dịch cần phá bọt Không khí : Lượng không khí dùng trong các cơ sở nấm men có thể chứa một số lượng vi sinh vật đáng kể (đến vài ngàn/1m3). Luồng khí này cần được qua lọc trước khi dùng để sản xuất. II). Qui trình công nghệ : 1) Quy trình tổng quát trong nuôi cấy nấm men : Hình 2 : Quy trình tổng quát nuôi cấy nấm men 2) Sơ đồ khối quy trình sản xuất sinh khối nấm men bánh mì: Nhân giống Lên men Ly tâm lắng Định hình Bảo quản nhiệt độ thường Bao gói Sấy Xử lí rỉ đường Lọc thùng quay Rỉ đường Nấm men giống Men khô Hình 3: Sơ đồ khối quy trình sản xuất nấm men bánh mì Thanh trùng môi trường Chuẩn bị môi trường 3) Thuyết minh quy trình : 3.1). Xử lý rỉ đường : Mục đích : chuẩn bị cho quá trình lên men. Xử lí rỉ đường cần loại bỏ : Các chất độc hại. Hệ keo. Các chất màu. Rỉ đường trước khi được dùng để nuôi nấm men cần được xử lý để loại bớt chất keo, chất lơ lửng (huyền phù) và một số chất có hại cho sự tăng trưởng của nấm men. Hệ keo có trong mật rỉ được hình thành bởi protein và pectin. Hệ keo thường tạo ra độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của nấm men. Nếu hệ keo không bị phá hủy sẽ gây ra hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém. Hiệu suất sinh khối thu được rất thấp. Nếu không loại bỏ hết hệ keo nói trên, sản phẩm sinh khối nấm men thu nhận được sẽ bám đầy keo này, do đó có màu vàng đậm đặc trưng của mật rỉ, không phải màu tự nhiên của nấm men. Vì vậy cần lọai bỏ các chất tạo màu trong mật rỉ trước khi làm môi trường nuôi cấy. Các biến đổi : Vật lý : + Khối lượng riêng dung dịch giảm. + Sự thay đổi màu. + Độ nhớt dung dịch giảm. Hoá học : + Hảm lượng tạp chất giảm, pH dung dịch giảm. + Các phản ứng keo tụ xảy ra. Hoá lý : Các hợp chất keo đông tụ hoặc kết tủa. Sinh học : Vi sinh vật giảm. Hoá sinh : Không có biến đổi đáng kể. Thiết bị : tháp bằng thép không rỉ (chiều cao của tháp này thường cao hơn đường kính đáy là tốt nhất) có lắp hệ thống cánh khuấy với tốc độ 30-35 vòng / phút và bộ phận lọc, gạn cặn. Loại bỏ chất keo trong rỉ đường : Có thể làm trong rỉ đường bằng 2 phương pháp : ù Phương pháp hoá học : Thường sử dụng axit sunfuric, kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ, kết tủa chất keo. Đồng thời axit sunfuric còn liên kết với muối của rỉ đường, cạnh tranh với axit hữu cơ, phân ly protein tạo ra axit hoạt động, thích hợp cho sự sinh sản của nấm men. + Pha loãng rỉ đường (0.73 m3 nước cho 1 tấn rỉ đường). Trộn đều, thêm clorua canxi, khuấy trộn và để yên. Thêm vào axit Sunfuric, khuấy tiếp tục, sau đó để lắng. Dùng bơm hút dịch trong bên trên. + Pha loãng rỉ đường như trên. Thêm 1% vôi tôi (tính theo nồng độ rỉ đường) khuấy đều, cho sôi 10 phút. Sau đó để lắng trong 7 giờ, loại bỏ lớp dày màu đen ở đáy bồn. Bơm phần trên vào bồn chứa khác, bổ sung axit đến 0.25o axit. Cũng có thể bổ sung axit sunfuric đến 1o axit vào rỉ đường không pha loãng, cho sôi 30 phút, sau đó pha loãng rỉ đường bằng nước lạnh và xử lý vôi như trên. ù Phương pháp cơ học : Dùng máy ly tâm loại chất bẩn, chất keo + Có ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học về kinh tế và thời gian + Giảm thất thoát so với phương pháp hóa học từ 2% còn 0.14%. + Trước khi ly tâm, pha loãng rỉ đường với nước. Thông số công nghệ: ù Phương pháp hoá học: + Thêm clorua canxi (0.9 kg vôi hoạt động/ 1 tấn rỉ đường) . Thời gian khuấy trộn và để yên : 60 phút + Acid sunfuric (6 lít axit Sunfuric cho 1 tấn rỉ đường. ). Thời gian khuấy 30 phút. Sau đó lắng từ 6 đến 12 giờ. ù Phương pháp cơ học: + Pha loãng rỉ đường với nước theo tỉ lệ 1,1:2,1:3,1:4 tùy thuộc thành phần muối Ca trong rỉ đường. Nếu lượng muối Ca trong rỉ đường <0.5% thì pha loãng 1:1, nếu là 0.6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4. Ngoài phương pháp cổ điển như trên, ngày nay người cũng có thể dùng màng polyme tích điện để tinh sạch rỉ đường. Bảng 5 : Xử lí rỉ đường nhiễm vi sinh vật, loại màu và các chất độc hại: Loại Phương pháp và thời gian xử lý Rỉ đường chứa vi khuẩn tạo nitric Rỉ đường có SO2 Axit bay hơi cao Độ màu cao( 2ml dung dịch Iốt 0,1 N) Canxi cao > 1% Chlotetracycline: từ 1-5g trên 1 m3 dung dịch rỉ đường pha loãng để làm trong đường, thời gian 1 giờ Clo 11g/ 110g SO2 trong 60 phút Dùng H3PO4 thay vì H2SO4 để làm trong rỉ đường Pha loãng ít nhất 20 lần Pha loãng với nước theo tỷ lệ 1/3, hạ pH đến 4,5 để 4h, ly tâm loại kết tủa 3.2).Chuẩn bị môi trường : Mục đích : Chuẩn bị cho quá trình lên men Bổ sung chất dinh dưỡng cần thiết trong rỉ đường là nguồn thức ăn cho tế bào nấm men phát triển (nguồn N, C, khoáng,..), tạo môi trường thích hợp cho nấm men phát triển Các biến đổi: Hóa học : bổ sung thêm thành phần các chất dinh dưỡng. Bảng 6:Thành phần nguyên tố của nấm men và của rỉ đường củ cải 100g rỉ đường củ cải hàm lượng 50% saccaroza chứa trung bình : C N P K Mg Ca 33g 1,5-2g 0,03g 6g 0,025g 0,3g 100g men ép (27% chất khô) chứa trung bình : 12,3g 2,3g 0,28g 0,54g 0,03g 0,01g Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat… Nguồn nitơ và phôtpho được bổ sung với tỉ lệ phù hợp (tỉ lệ P2O5/N tổng số khoảng 1/3). Trong sản xuất thường dùng superphosphate hoặc ammonphosphate làm nguồn cung cấp phôtpho. Các nguyên tố khoáng khác nói chung trong rỉ đường đã cung cấp đủ cho nấm men phát triển ngoại trừ Mg là phải bổ sung dưới dạng MgSO4. Khi sử dụng đường mía cũng cần bổ sung thêm K và các muối ammon như (NH4)2SO4, ure, NH4OH hoặc (NH4)2HPO4. Dung dịch muối khoáng cần bổ sung tăng dần trong suốt quá trình lên men thành phẩm nhưng cần phải bổ sung hết trước khi kết thúc lên men 3 - 4 giờ. Nấm men bánh mì còn cần một số vitamin để tăng sinh khối nhanh như biotin, inositol, acid pantotenic ... (thông thường rỉ đường mía có đủ biotin). Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men + Phospho : có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn. + Lưu huỳnh : tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme. + Magiê : tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men. + Sắt : tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác. + Kali : chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic. + Mangan : đóng vai trò tương tự như magiê. Bảng 7: Ảnh hưởng của một số chất hóa học lên sự tăng trưởng của tế bào nấm men CHẤT Nồng độ làm nấm men chậm hay ngừng phát triển(%) Nồng độ làm nấm men chết(%) Sunphurơ( SO2) Natrifluo Axit nitric Formalin Karamen Axit acetic Axit formic Axit oxalic Axit sunphuric Axit photphoric Axit clohydric Ethanol 0,0025 0,002 0,0005 0,001 0,1 0,02 0,17 0,001 0,39 0,30 0,14 12 0,004 0,09 3,0 0,34 1,3 2,0 0,72 25 + Hóa sinh : có thể nhiễm vi sinh vật trong quá trình này. 3.3).Thanh trùng môi trường: Phương pháp : Hiện nay phương pháp thanh trùng trong công nghệ vi sinh phổ biến là dùng hơi nước quá nhiệt do nồi hơi cung cấp. Trong lên men từng mẻ các thiết bị sau khi làm vệ sinh được khử trùng bằng hơi nóng tới 120 – 1300C, sau đó mới cho môi trường lỏng vào các nồi lên men khử trùng môi trường cùng với cả hệ thống khuấy và các đoạn đường ống, van tiếp cận. Việc gia nhiệt cao có thể dẫn đến sự phá huỷ các thành phần dinh dưỡng mẫn cảm với nhiệt và caramen hoá các nguồn đường cũng như xảy ra các phản ứng melanoid giữa đường với aminoacidhoặc các vitamin bị phá hỏng. Những thành phần mẫn cảm với nhiệt có khi phải khử trùng riêng, sau đó mới trộn lẫn hoặc khử trùng theo phương pháp khác như lọc qua phin vô trùng. Ngoài cách khử trùng theo phương pháp hơi nước gián đoạn này, người ta còn dùng phương pháp khửtrùng bằng hơi liên tục bằng cách cho môi trường chảy qua thiết bị khử trùng chuyên dùng ở nhiệt độ 1400C trong vài phút. Ở đây ta sử dụng phương pháp thanh trùng bản mỏng Mục đích : chuẩn bị cho quá trình nhân giống và lên men Biến đổi : -Vật lý : nhiệt độ tăng -Sinh học : tiêu diệt vi sinh vật nhiễm Thông số công nghệ : -Nhiệt độ : 60-750C -Thời gian :10 phút Thiết bị : thanh trùng bảng mỏng Hình 4 : Thiết bị thanh trùng bản mỏng 3.4).Nhân giống : Phương pháp : Cũng giống như trong phòng thí nghiệm và qui mô pilot, muốn thực hiện một quá trình lên men ở qui mô công nghiệp phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào với tuổi sinh lí đang ở thời kỳ hoạt động mạnh nhất để cấy vào môi trường lên men. Nhân giống ở đây có thể phải qua 2 - 3 bước, ta thường gọi là nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3 v.v... tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất. Việc nhân giống thường diễn ra bằng cách nuôi chìm. Các điều kiện nuôi được lựa chọn sao cho chỉ xảy ra sự sinh trưởng chứ không xảy ra sự tạo thành sản phẩm. Khi sử dụng nấm sinh bào tử và xạ khuẩn, trước khi nuôi chìm, người ta thực hiện nhân bào tử trên môi trường đặc như môi trường cám, bột ngô... Nhân giống cấp 1 được tiến hành trên máy lắc với nhiệt độ và thời gian tuỳ thuộc vào nồi nhân giống (tương tự nồi lên men) có sục khí và ổn nhiệt. Tỷ lệ nhân giống từ ống nghiệm vào bình tam giác có thể chỉ một vòng que cấy hoặc cả dịch huyền phù của một ống giống. Từ nhân giống cấp 1 sang cấp 2 (hoặc từ cấp 2 sang cấp 3) tỉ lệ giống thường là 1- 10% thể tích dịch lên men hoặc là cao hơn, từ dịch nhân giống cuối cùng vào nồi lên men khoảng 0,5-10% Thành phần môi trường nhân giống và môi trường lên men gần giống nhau. Thông thường thì hàm lượng carbon ở môi trường nhân giống thấp hơn môi trường lên men, nhưng các thành phần khác thì giàu hơn, đặc biệt là các chất sinh trưởng để phục vụ cho sinh sản và phát triển của giống vi sinh vật. Chế độ nuôi đặc biệt là nhiệt độ giữa nhân giống và lên men cũng khác nhau (nếu cùng chế độ nhiệt độ thì không cần phải quan tâm lắm). Nhưng nếu nhiệt độ lên men thấp (như lên men bia) thì cần phải nhân giống với nhiệt độ giảm dần để khi vào lên men, giống không bị choáng sốc. Chế độ sục khí ở các công đoạn này cũng khác nhau, thường thì trong thời gian nhân giống nhu cầu về ôxy cao như trong pha sinh trưởng của lên men hoặc cao hơn. Nói chung một chủng vi sinh vật nhân giống để đưa vào lên men đảm bảo các yêu cầu công nghệ như sau: - Dịch giống không được tạp nhiễm, đặc biệt là thực khuẩn thể (Bacteriophage). - Các tế bào đảm bảo ở độ tuổi sinh lí ở thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạt tính cao nhất, thường là nữa sau của pha chỉ số. - Các thông số kĩ thuật như OD, pH, màu sắc, mùi vị... đúng như quy định của từng dây chuyền công nghệ. Mục đích : - Chuẩn bị cho quá trình lên men - Khai thác Các giai đoạn trong phòng thí nghiệm, thường dùng môi trường tổng hợp như nước mạch nha, nước cà chua cà rốt, dịch tự phân của nấm men, đường glucose,maltose làm nguồn cacbon và nito, vitamin cho nấm men. Giai đoạn sản xuất men mẹ trong phân xưởng giống sạch tuy không vô trùng triệt để nhưng nguyên liệu, nước đều được hoặc khử trùng ở 100oC trong 60 phút,hoặc được xử lí ở hypocloric. Các biến đổi : sự tăng sinh khối nấm men. Thông số công nghệ : Giai đoạn nhân giống thường tiến hành trong điều kiện vô trùng, hệ thống nuôi men kín,nguyên liệu được khử trùng hoặc triệt để trong nồi hấp áp suất ở 100oC trong 60 phút Bảng 8 : Các bước nhân giống 3.5).Lên men: Mục đích : khai thác Các yếu tố ảnh hưởng : Môi trường lên men không khác nhiều so với môi trường nuôi cấy trong quá trình nhân giống. Tuy nhiên, thành phần môi trường phải tuyệt đối ổn định để chất lượng nấm men đồng đều ở tất cả các mẻ nuôi trong suốt quá trình sản xuất và môi trường nuôi cấy phải vô trùng a. Lượng đường trong môi trường lên men : Lượng đường trong môi trường khoảng 4-5% , không nên nhiều hơn và cũng không nên ít hơn. Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gấy ức chế ngược đến quá trình tạo sinh khối. Nếu lượng đường quá nhỏ sẽ không đủ nguồn cacbon cần thiết cho sự tạo thành sinh khối. Nồng độ đường là nhân tố cơ bản quy định sự sinh trưởng và tốc độ lên men của nấm men. Sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae trong một môi trường chứa glucoza được thông khí cần được xem như một sự sinh trưởng kép (diauxi) trên glucose-etanol. Glucose trước hết được chuyển hóa thành etanol trong pha sinh trưởng logarit thứ nhất trong đó tế bào có tốc độ sinh trưởng cao (độ dài thế hệ là 1,7 giờ). Pha sinh trưởng thứ hai bắt đầu khi đường trong môi trường gần như bị tiêu thụ hết. Pha này được tách bịêt với pha đầu bằng một thời kỳ quá độ, một pha lag khá rõ. Tốc độ sinh trưởng của tế bào trong pha thứ hai (độ dài thế hệ 5-8 giờ) thấp hơn trong pha lên men và thể hịên trên một đường cong sinh trưởng ít dốc hơn. Ngược lại, tốc độ sinh trưởng trong pha hô hấp phụ thuộc rõ rệt vào mức độ thông khí. Trong sản xuất công nghiệp men bánh mì người ta đã quan sát thấy một độ dài thế hệ là 3-4 giờ khi rượu được tạo thành nhiều và 5-6 giờ trong môi trường không có rượu. Trong nuôi cấy tĩnh cường độ thông khí chỉ gây hiệu quả nhỏ hoặc không gây hiệu quả gì lên giai đoạn lên men hoặc lên vị trí của pha lag quá độ. Hình 5 : Độ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của nấm men Trong pha sinh trưởng logarit đầu tiên, chu trình TCA họat động chỉ để tạo ra bộ khung cacbon cho các mục đích sinh tổng hợp. Hoạt tính của các enzym thuộc chu trình oxi hóa là thấp, họat tính này sẽ tăng lên trong pha thứ hai của sinh trưởng diauxi vì rằng sự tạo thành các enzym của trao đổi chất oxi hóa đã tăng lên trong pha lag trung gian. Nếu nồng độ glucose vượt quá một mức độ nhất định (khỏang 250-300mg/L) thì các enzym này sẽ hòan tòan không được tạo thành hoặc chỉ được tạo thành ở mức độ rất thấp. Oxi kiểm sóat sự trao đổi glucose trong hiệu ứng Pasteur và vì rằng ở đây glucose kiểm sóat sự trao đổi chất oxi hóa nên hiện tượng được gọi là “hiệu ứng Pasteur ngược” hay “hiệu ứng glucose” và thậm chí “hiệu ứng Crabtree” (theo tên người báo cáo dầu tiên). Do cơ chế của hiện tượng ngày càng được hiểu rõ hơn nên thuật ngữ “kiềm chế dị hóa” ngày càng được dùng nhiều hơn. Có thể tránh hiện tượng kiềm chế dị hóa bằng cách nuôi nấm men theo phương thức sao cho nồng độ đường được duy trì ở một mức độ rất thấp như là trong một hệ thống nuôi cấy liên tục. Nấm men chứa các enzym họat động cho trao đổi chất oxi hóa sẽ chuyển trao đổi chất của nó từ oxi hóa sang lên men khi nồng độ đường vượt quá một giới hạn nhất định. Song điều này không thể chỉ được mô tả theo nghĩa tổng hợp enzym, tức là theo cùng cơ chế với sự kiềm chế dị hóa. Ngòai khả năng ức chế sự tạo thành các enzym oxi hóa (kiềm chế dị hóa), glucose cũng có khả năng (theo một cách nào đó còn chưa biết rõ) kiềm chế họat tính của các enzym này . b. Oxy Việc cung cấp oxy cho quá trình tạo sinh khối rất cần thiết. Oxy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men Saccharimyces cerevisiae. Vi sinh vật nhất là nấm men không thể sử dụng oxy ở dạng hòa không tan trong môi trường lỏng. Do đó, quá trình nuôi cấy nấm men thu nhận sinh khối bắt buộc phải được cung cấp oxy liên tục Khi số vòng quay của cánh khuấy và tốc độ thổi khí tăng thì độ hòa tan của oxy vào dung dịch môi trường sẽ tăng theo. Đồng thời làm tăng sự xáo trộn môi trường, thúc đẩy quá trình trao đổi chất và sinh sản tăng nhanh. Tuy nhiên, việc tăng tốc độ khuấy và tốc độ thổi khí chỉ đạt đến một giới hạn nhất định. Nếu tốc độ của hai yếu tố này quá cao sẽ làm tăng nhanh hiện tượng tự phân của tế bào và bọt sẽ tạo ra nhiều. Độ hòa tan của oxy bị chi phối bởi nhiệt độ của môi trường. Khi nhiệt độ của môi trường tăng thì độ hòa tan của oxy sẽ giảm. Nhiệt độ thấp thường làm tăng tốc độ hòa tan của oxy. Nếu trong quá trình lên men, nhiệt độ môi trường tăng nhanh (do quá trình hô hấp của vi sinh vật) thì ngay lập tức phải thổi khí mạnh để làm giảm nhiệt của môi trường. Nếu không làm hạ nhiệt, độ hòa tan của oxy sẽ giảm và năng suất sinh khối sẽ giảm. Trong trường hợp phải dùng những chất hoạt động bề mặt, chất phá bọt hay một số chất chống nhiễm trùng cũng làm giảm độ hòa tan của oxy. Sự tổng hợp xitocrom ở Saccharomyces cerevisiae phụ thuộc vào oxi. Ở nồng độ oxi hòa tan 0,05 µM/L hoặc thấp hơn, các xitocrom a-a3, b và c-c1 sẽ vắng mặt trong hệ thống các xitocrom.Vì vậy lượng oxi cung cấp có ý nghĩa đặc biệt. Tuy nhiên, nấm men bánh mì là lọai vi sinh vật có khả năng sinh trưởng cả khi vắng mặt lẫn khi có mặt oxi. Khi sinh trưởng trong điều kiện có mặt oxi, men bánh mì cần biotin, trong khi nhu cầu về inozitol và axit pantothenic thay đổi tùy chủng. Việc bổ sung các vitamin khác như tiamin, mặc dù có thể có ích song không tuyệt đối cần thiết. Ngòai các nhu cầu này, nấm men khi sinh trưởng trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt còn cần các thành phần khác như các axit béo chưa bão hòa và ecgosterol và một số chủng còn cần cả axit nicotinic. Thiếu các thành phần này trong môi trường, sinh trưởng chỉ diễn ra trong một vài thế hệ và sau đó dừng lại hòan tòan. Nguyên nhân của việc nấm men đòi hỏi mạnh mẽ trong điều kiện kị khí là vì sự sinh tổng hợp các axit béo chưa bão hòa và các sterol bao gồm một số bước enzym cần có sự tham gia của oxi phân tử. Sự sinh tổng hợp axit nicotinic diễn ra qua tritophan, kinurenin và axit quinolinic, và oxi phân tử cần cho cả ba bước. Các lipid không phải là nhân tố không thể thiếu khi môi trường chứa oxi. Có nghĩa là môi trường chứa oxi có thể không có lipid. Thay cho việc nói rằng nhu cầu về các nhân tố sinh trưởng tăng lên trong điều kiện sinh trưởng kị khí chúng ta cũng có thể nói rằng các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng của nấm men bao gồm cả oxi phân tử. Theo phương trình sinh trưởng đã nêu ở trên, nhu cầu về oxi nằm vào khoảng 5,5 mg oxi/ chất khô nấm men được tạo thành. Con số này tương đương với nhu cầu về magie, vì vậy oxi không thể đơn giản chỉ là một nguyên tố vết. Quan hệ của nấm men đối với oxi là một quan hệ phức tạp, điều này được thể hiện qua nhiều “hiệu ứng” kiểm soát sự trao đổi oxi ở nấm men. Ngòai “hiệu ứng Pasteur”, còn có “hiệu ứng Pasteur ngược” (đồng nghĩa với “hiệu ứng Crabtree”, “hiệu ứng glucose” hay “sự kiềm chế dị hóa”) và “hiệu ứng Pasteur âm”. Một điều đáng ngạc nhiên là mặc dầu môi trường sinh trưởng của nấm men có thể được thông khí mạnh song sản lượng vẫn thấp và hầu hết đường cơ chất bị lên men thành etanol. Hiện tượng này được mô tả vào năm 1934, được biết khá rộng rãi vào những năm 1950, song những nhà sản xuất men bánh mì đã đề ra các phương pháp nuôi cấy thích hợp (phương pháp bổ sung định kỳ) để khắc phục hiệu ứng có hại này, thu được sản lượng cao về men bánh mì và loại bỏ được sự tạo thành etanol. Nghiên cứu ảnh hưởng của oxy hòa tan đến sự phát triển của saccharomyces cerevisiea cho thấy: năng suất tạo thành sinh khối tăng dần khi tăng hàm lượng oxy hòa tan. Năng suất sinh khối nấm men đạt cao nhất khi lượng oxy hòa tan tăng từ 0.5 – 1 milimol / L / phút. Khi lượng oxy hòa tan tăng đến 4 milimol/l/phút, sinh khối giảm. Nếu tăng lượng oxy lên nữa, sinh khối sẽ giảm nhanh. Điều đó cho thấy sự tăng oxy hòa tan không phải tỷ lệ thuận với sự tăng sinh khối. Nhu cầu cung cấp oxy cho quá trình phát triển của nấm men không phải lúc nào cũng giống nhau. Do đó, ta phải thay đổi mức độ cung cấp oxy theo đúng nhu cầu thực của nấm men. Không khí trước khi đưa vào thiết bị lên men, phải được làm sạch khỏi vi sinh và các tạp chất. Các biến đổi: + Vật lý : nhiệt độ tăng. + Hoá học : hàm lượng chất khô trong dịch lên men giảm, hàm lượng oxy hoà tan giảm + Sinh học : tế bào nấm men phát triển + Hoá sinh : enzym tham gia phản ứng sinh tổng hợp tế bào Thông số công nghệ : Nấm men phát triển tốt ở pH 4,5 - 5,5. pH = 4 : tốc độ tích lũy sinh khối giảm pH = 3,5 hay pH = 3 sẽ làm sự sinh sản của nấm men bị dừng lại. Mức độ hấp thu chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzym tham gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào độ pH, pH ngoài 4,5-5,5 làm chất lượng nấm men giảm đi. Trong công nghiệp sản xuất men bánh mì thường lên men ở pH 4,2 - 4,5 để hạn chế vi khuẩn tạp nhiễm Duy trì pH = 4.5 - 5.5 bằng cách dùng ammoniac với liều lượng thích hợp vừa có tác dụng chỉnh pH vừa cung cấp nguồn đạm cho nấm men Nhiệt độ thích hợp cho nấm men thích hợp sinh sản là 29-31oC. Trên 43oC và dưới 28oC sự sinh sản của nấm men bị chậm hay ngừng lại. Nếu lên men ở nhiệt độ cao 35-400C thì bột nhào rất chóng chua vì khoảng nhiệt độ này thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn lên men acid lactic Thực tế ở nước ta trong mùa nắng nhiệt độ trong quá trính sản xuất có thể lên 31-34oC, làm cho sự tăng trưởng của nấm men chậm lại. Nếu hệ thống nuôi men kín, có hệ thống nước để điều hòa thì tốt,nếu không, khi theo dõi có sự dao động nhiệt trong quá trình sản xuất có thể xử lí bằng axit sorbic, hay chlortetracycline, hydrochlorid ... như đã trình bày để hạn chế sự phát triển sinh vật gây nhiễm Nuôi trong khỏang thời gian từ 8 – 16 giờ. Tối đa là 16 giờ. Nồng độ đường có thể lên đến 5 – 6 %. Hiện nay, để gia tăng hiệu suất và chất lượng men thành phẩm các nước phát triển chủ yếu khai theo những hướng dưới đây : Nuôi nấm men trong môi trường có nồng độ chất khô cao, trong đó rỉ đường có nồng đô chất khô 75 % được pha loãng từ 7-14 lần, gia tăng hiệu suất đến 140 %, chi phí cho 1 tấn nấm men giảm 50 %, chi phí năng lượng thong khí giảm 35 %. Men thành phẩm thu được có nồng độ chất khô cao, nhất là trehalose, làm tăng độ bền vững của men trong quá trình bảo quản. Giảm sự tạo thành ethanol bằng cách sục khí men mẹ trong môi trường chỉ có nguồn đạm, khoáng, sau đó 1 giờ mới bổ sung rỉ đường Số lượng nitơ hấp thụ được trong môi trường : cứ mỗi giờ lấy 10 ml dịch men (không lọc) pha với 90 ml nước cất và nhỏ từ từ dung dịch NaOH 0.1N vào, trong sự hiên diện của phenolphthalein đến khi có màu hồng nhạt. Kế đó thêm vào bình phản ứng 5 ml dung dịch formalin trung tính và chuẩn độ lần 2 với NaOH 0.1N như trên. Đến khi có màu hồng nhạt, thể tích ml NaOH dung trong lân 2 gọi là số N-formol. Giá trị tương đối này xác định số lượng ammonium và nitơ amin trong môi trường. Lúc bổ sung nitơ đầu quá trình nuôi, chỉ số N-formol là 1-1.5, trong giai đoạn nấm men tăng trưởng mạnh số N-formol giảm xuống đến 0.4-0.5, tuy nhiên không cần thiết bổ sung nguồn Nitơ vào môi trường.Vào cuối quá trình tăng trưởng số N-formol giảm đến 0.2 - 0.3 và trong quá trình lắng, chuẩn bị ly tâm số N-formol là 0.15-0.2 Thiết bị : Thiết bị nuôi nấm men vừa có dung tích thích hợp, vừa thuận lợi cho việc nạp môi trường, phá bọt cũng như thu nhận sản phẩm. Thiết bị phải được lắp đặt hợp lý hệ thống thổi khí, hệ thống bọt cũng như thu nhận sản phẩm. Thiết bị phải được lắp đặt hợp lý hệ thống thổi khí, hệ thống cánh khuấy và tấm cản dòng chuyển động của môi trường để làm tăng quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Hình 6 : Thiết bị lên men Quá trình sinh trưởng và phát triển : - Sự sinh trưởng : Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều. - Sự phát triển : Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia thành hai cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển. Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa. Các giai đoạn phát triển tế bào nấm men trong lên men tĩnh có 5 giai đoạn : Giai đọan thích nghi : nấm men cần có thời gian thích nghi với điều kiện mới. Ở giai đọan này việc tạo thành axit amin, các peptid và axit nucleic xảy ra nhanh các quá trình khác. Thời gian này có thể dài, có thể ngắn tùy thuộc vào loài nấm men. Giai đoạn này thường từ 0.5 – 1 giờ. Giai đoạn này chỉ cần cung cấp lượng ko khí khỏang 50m3 / giờ / 1m3 môi trường là đủ. Giai đoạn logarit : nấm men tiến hành các quá trình trao đổi chất rất mạnh, khối lượng nấm men trong các thiết bị tăng rõ rệt. Việc tổng hợp enzym được xúc tiến nhanh. Hàm lượng RNA được tổng hợp nhiều nhất. Giai đoạn này thường kéo dài từ 7 – 14 giờ và cũng là giai đoạn nấm men cần nhiều oxy nhất, do đó lượng oxy cung cấp phải gấp đôi giai đoạn đầu tiên, khỏang 80 – 100m3 / giờ / m3 môi trường. Giai đoạn chậm dần : tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều Giai đọan kế tiếp là giai đoạn ổn định : giai đoạn này có nhiều thay đổi quan trọng. Lượng tế bào mới sinh gần bằng lượng tế bào chết. Các quá trình trao đổi chất giảm mạnh, do đó nhu cầu oxy cần không nhiều. Giai đoạn này kéo dài từ 1 – 2 giờ và ta phải giảm lượng không khí cung cấp vào môi trường. Lượng không khí cung cấp cho giai đoạn này từ 20 – 50 m3 / giờ / 1m3 môi trường. Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số lượng tế bào nấm men giảm dần Trong sản xuất nấm men bánh mì, người ta thường kết thúc quá trình nuôi nấm men ở cuối giai đoạn hai bởi vì lúc này số lượng tế bào nấm men sống là lớn nhất, hoạt lực enzym cao nên không thể đợi đến giai đoạn ổn định mới thu nhận sinh khối, làm như vậy nấm men thu được sẽ chứa rất nhìêu tế bào già. Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như : + Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch. + Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào… Sự tích lũy nấm men trong 1 lít dịch men : hằng giờ lấy mẫu dịch men, xác định nồng độ tế bào nấm men sơ bộ, bằng cách đo lượng chất khô trong dịch men với đường kế Balling.Vì chỉ số Balling bị ảnh hưởng do lượng nấm men trong dung dịch 42.56 g nấm men / 1 lít dung dịch : 1oBalling. Do đó, từ sự khác nhau về chỉ số Balling trước và sau khi ly tâm loại tế bào, có thể tính được lượng tế bào nấm men sau mỗi giờ và tính được hiệu suất sinh khối gần đúng theo công thức: 42.56 x tổng số lít x hiệu số chỉ số Balling = kg nấm men 100 3.6).Quá trình men lắng Mục đích : chuẩn bị cho quá trình ly tâm tách rửa Các biến đổi : + Vật lý : nhiệt độ giảm + Hóa học : hàm lượng không khí giảm, không còn chất dinh dưỡng trong môi trường, xảy ra các phản ứng trao đổi chất. + Hóa lý : dung dịch tách pha, từ dạng huyền phù nấm men trong dịch lên men các tế bào nấm men tách ra lắng xuống + Hóa sinh : enzym xúc tác các phản ứng trao đổi chất thay vì các quá trình hoạt động sinh tổng hợp Thông số công nghệ : + Giảm nhiệt độ đến 27oC + Giảm lượng không khí 40-60% so với giai đoạn nuôi chính + Thời gian lắng từ 1.5 -2 giờ Thiết bị : quá trình men lắng xảy ra trong thiết bị lên men 3.7).Ly tâm tách rửa men : Mục đích công nghệ : Khai thác và hoàn thiện Dùng bơm bơm dịch men vào máy ly tâm để loại môi trường còn lại Các biến đổi : + Thay đổi thành phần tạp chất bám trên men Thông số công nghệ : + Nhiệt độ nước rửa : 20C + Thời gian không quá 2 giờ. + Tốc độ quay : 1000 rpm. Thiết bị : máy ly tâm Hình 7 : Máy ly tâm 3.8). Lọc : Mục đích : + Khai thác + Chuẩn bị cho quá trình định hình Biến đổi : +Vật lí : khối lượng riêng tăng, nhiệt độ tăng +Sinh học : có thể nhiễm vi sinh vật Thông số công nghệ : độ ẩm sau quá trình này đạt 40% Thiết bị : máy lọc thùng quay.Người ta cũng có thể tráng một lớp bột khoai mì ở thành trong thiết bị, tác dụng của nó là để giữ lại và thu hồi sinh khối tốt hơn. Hình 8: Máy lọc thùng quay 3.9). Định hình : Mục đích : chuẩn bị cho quá trình sấy Các biến đổi : + Vật lí : thay đổi hình dạng:dạng sợi dài, nhiệt độ tăng + Hóa lí : nước bay hơi + Sinh học : có thể nhiễm vi sinh vật Thiết bị : phễu có gắn dĩa đồng trục kích thước khoảng 0.3 cm ở đầu ra. 3.10). Sấy : Mục đích : + Chuẩn bị +Bảo quản Các biến đổi : +Vật lí : khối lượng riêng giảm do nước bay hơi, nhiệt độ tăng, độ ẩm giảm +Hóa lí : nước chuyển sang trạng thái hơi Thông số công nghệ : + Độ ẩm : 7,5 - 8% (nhiều nhà nghiên cứu cho rằng nếu sấy độ ẩm dưới 6% thì protid của tế bào nấm men bị biến tính, enzym của nấm men bị mất hoạt tính). Độ ẩm nấm men khô không quá 11-12%. + Nhiệt độ : 320C + Thời gian : 30 – 34 h Thiết bị: sấy thăng hoa Sấy thăng hoa là phương pháp sấy bằng cách hạ thấp nhiệt độ sản phẩm sấy xuống dưới điểm đông lạnh (dưới -100C) và được đặt trong bình chân không có áp suất gần với áp suất chân không tuyệt đối, khi đó nước thoát ra khỏi sản phẩm sấy ở trạng thái rắn, tức là thăng hoa ẩm. Mô hình hệ thống thiết bị sấy thăng hoa gồm 5 bộ phận : bình thăng hoa, bình ngưng của máy lạnh, máy nén của máy lạnh, bình ngưng-đóng băng, bơm chân không. Quá trình sấy thăng hoa gồm 3 giai đoạn : giai đoạn đông lạnh, giai đoạn thăng hoa và giai đoạn sấy ẩm dư. Sấy thăng hoa có ưu điểm giảm thời gian sấy xuống 3 lần, không ảnh hưởng lớn đến giá trị dinh dưỡng và mùi vị sản phẩm, tuy nhiên chi phí năng lượng riêng cao hơn các phương pháp khác khoảng 50-60% Hình 9: Sơ đồ thiết bị sấy thăng hoa hoạt động tuần hoàn Thiết bị này gồm phòng sấy hình trụ kín (nồi thăng hoa) 1, ở trong có giàn ống rỗng 2, vật liệu sấy cho vào đây. Nồi thăng hoa làm việc một cách tuần hoàn như một phòng lạnh. Ở chế độ làm lạnh, bơm 5 đẩy tác nhân lạnh ở bên trong ống rỗng 2. Sự làm lạnh của chất tải nhiệt được tiến hành trong bộ trao đổi nhiệt 3 có đính ruột xoắn, chất làm nguội đi qua đó và vào thiết bị làm lạnh 4. Khi nồi thăng hoa làm việc ở chế độ của máy sấy, chất tải nhiệt được đun nóng trong bộ trao đổi nhiệt 7 và đẩy vào các ống rỗng nhờ bơm 6. Sự ngưng tụ hơi được tạo ra khi sấy trong nồi thăng hoa được tiến hành trong nồi ngưng tụ chống thăng hoa 10. Nó là một bộ trao đổi nhiệt, hỗn hợp hơi - không khí từ nồi thăng hoa vào không gian giữa các ống của bộ trao đổi nhiệt. Chất làm nguội (amoniac, freon) qua các ống 11 của nồi chống thăng hoa vào thiết bị làm lạnh 9. Thường để làm lạnh bề mặt thăng hoa và ngưng tụ, người ta sử dụng máy nén 2 hoặc 3 cấp có khả năng đảm bảo lạnh bề mặt đến -400C, - 600C. Các khí chưa ngưng tụ được tách ra khỏi nồi chống thăng hoa bằng bơm chân không 8. Hơi ngưng tụ được làm lạnh ở dạng lớp đá trên bề mặt các ống lạnh của nồi chống thăng hoa. Vì trong quá trình làm việc của nồi chống thăng hoa, các ống 11 bị phủ bởi một lớp đá đáng kể, nên cần làm tan băng một cách chu kỳ. Để thực hiện điều đó, đẩy nước nóng từ bộ đun 7 vào các ống 11. 3.11).Bao gói : Mục đích : + Bảo quản + Hoàn thiện Biến đổi : không có gì đáng kể III). Sản phẩm: 1.Chỉ tiêu chất lượng men thành phẩm: Chỉ tiêu vật lí: Tế bào nấm men có kích thước lớn, đều, có khả năng phát triển mạnh và chịu được nhiệt độ cao. Có màu vàng sẫm, bên ngoài không có chấm đen, không có mùi mốc và có mùi lạ khác, có cấu tạo chắc, dễ bẻ, không dính tay. Chỉ tiêu hóa sinh: Có hoạt lực enzyme zymase < 45 phút (giá trị này được xác định khi cho nấm men (2.5% w/v) lên men 20ml dung dịch đường 5 % (w/ v) giải phóng ra 10 ml CO2 Hoạt lực mantose < 70 phút ( giá trị này biểu thị thời gian cần thiết để giải phóng 10ml CO2 khi lên men 20ml dung dịch 5% (w/v) mantose với hàm lượng nấm men 2.5% (w/ v). Chỉ số này dùng để đánh giá khả năng lên men đường mantose của nấm men Lực nở bột < 45 phút giá trị này biểu thị thời gian cần thiết làm nở 280g bột với 160 ml dung dịch NaCl 2.5% và lượng nấm men là 5g trong khuôn hình bình hành có kích thước xác định : Diện tích đáy : 12.6x8.5 cm Diện tích trên : 14.3x 9.2 cm Chiều cao : 8.5 cm Độ bền của nâm men lớn hơn 72 giờ (xác định thời gian làm nở bột của nấm men lúc ban đầu và sau một thời gian bảo quản nhất định). Nếu độ bền của nấm men cao thì sau 72 giờ bảo quản ở nhiệt độ 0-40C thời gian làm nở bánh không được tăng quá 5 phút Chỉ tiêu hóa học theo bảng sau : Bảng 9: Thành phần hóa học của nấm men Các chất Thành phần (% chất khô) Cacbon CaO Nitro Hydro P2O5 K2O SO3 MgO Fe2O3 SiO 49,8 12,4 6,7 3,54 2,34 0,04 0,42 0,38 0,035 0,09 2.Lợi ích của việc sử dụng nấm men khô : Dễ bảo quản Đảm bảo đặc tính sinh sản và lên men của nấm men Chất lượng men ổn định Đáp ứng đủ số lượng men khi cần thiết trong nhân giống cũng như trong lên men Tăng tính chủ động và linh hoạt trong sản xuất Bỏ bớt một số giai đoạn trong lên men, giảm được nhân công và tiền của Tăng khả năng quản lý việc nhân giống từ nhiều nguồn khác nhau Dễ vận chuyển và có nguyên liệu thường xuyên Hình 10 : Hình dạng sản phẩm 3.Sản phẩm saf-instant của tập đoàn Lesaffre: Sơ lược: Men khô sử dụng liền Khả năng lên men so với men tươi : một phần men khô tương ứng 3 – 4 phần men tươi Sử dụng đơn giản như men tươi : chỉ việc khuấy trộn Ngoài đặc tính có khả năng lên men cao, loại men này có những thuận lợi của một sản phẩm được tách nước là : dễ bảo quản, tuổi thọ sử dụng cao, bền Sản phẩm được làm ra từ công nghệ tiên tiến gần đây nhất Kích thước mỗi hạt : dài 1.5 mm, đường kính 0.5 mm Có mùi đặc trưng Đặc tính phân tích Thành phần : +Saccharomyces cerevisiae > 98.5% +Chất tạo nhũ: sorbitan monostearate(E491) <1.5 +Không chứa các chất hóa học khác Tính chất hóa lí : + Chất khô (DM) : 94.5 – 96.5 % +Protein (nitrogen x 6.25) / DM : 40 – 52 % + P2O5 / DM : 2 – 3 % + Lipid tổng / DM : 5 – 8 % + Khoáng / DM : 4 – 7 % + Năng lượng (Kcal) : khoảng 300 – 400/100g men Đặc tính vi sinh: + Coliforms : <1000 cfu/g men khô + Escherichia coli : < 10 cfu/g men khô + Salmonella : abs trong 25g men khô + Staphylococcus aureus : <10 cfu / g men khô + Bảo quản : nhiệt độ nhỏ hơn 270C, hạn sử dụng trong 2 năm Hình 11:Các sản phẩm men khô của tập đoàn Lesaffre 5).Cải tiến chât lượng và thu hồi sản phẩm trong quá trình sản xuất men : Một số phương pháp cải tiến quá trình và chất lượng thành phẩm men ép : Nuôi nấm men trong môi trường có nồng độ chất khô cao, trong đó rỉ đường có nồng độ chất khô 75 % được pha loãng từ 7-14 lần, gia tăng hiệu suất đến 140 %, chi phí cho 1 tấn nấm men giảm 50 %, chi phí năng lượng thông khí giảm 35 %. Men thành phẩm thu được có nồng độ chất khô cao, nhất là trehalose, làm tăng độ bền vững của men trong quá trình bảo quản Triển khai nuôi nầm men liên tục trong sản xuất hiện đại. Phương pháp này về lí thuyết có nhiều ưu điểm hơn phương pháp tuần hoàn. Giảm sự tạo thành ethanol bằng cách sục khí men mẹ trong môi trường chỉ có nguồn đạm, khoáng, sau đó 1 giờ mới bổ sung rỉ đường Cải tiến chất lượng men mẹ bằng phương pháp lai, gây đột biến Sử dụng chất thải của quá trình sản xuất : Dung dịch đã thu nấm men để nuôi nấm men trở lại : sau khi ly tâm thu men mẹ, phân dịch môi trường còn lại có thể được dùng trở lại để nuôi nấm men, mà không cần phải thanh trùng, và 1m3 dịch này có khoảng 39 kg rỉ đường. Phần dịch còn lại sau khi ly tâm thu lấy men thành phẩm chứa khoảng 25 kg rỉ đường, cần được khử trùng trước khi dùng lại số rỉ đường này Thu hồi khí CO2 : Nguồn protein cho gia súc và phân kali: ở Pháp, các cơ sở sản xuất men bánh mì đã dùng nước thải sau khi ly tâm lấy men và nước rửa men cho bốc hơi để cô lại và bổ sung thêm MgSO4, thu hồi 2 sản phẩm là sunphat kali dạng tinh thể và dịch cô đặc giàu protein làm thức ăn gia súc IV). Thành tựu công nghệ : Việc thu hồi nấm men dư thừa tại các nhà máy bia, bằng công nghệ enzym và công nghệ chế biến tiến tiến, đã sản xuất được bột nấm men giàu protein, các đặc điểm nổi bật : có hàm lượng protein cao từ 46,27% đến 56,67%, có đầy đủ các axít amin thay thế và không thay thế với tỷ lệ lớn, các vitamin và các nguyên tố vi lượng như Mg, Ca, Fe, P2O5, Na. Sản phẩm có hình thức hấp dẫn, màu vàng sáng, thơm, đảm bảo các tiêu chuẩn về vệ sinh, an toàn thực phẩm. Công nghệ đã loại bỏ được hòan tòan vị đắng của hoa houplon khói sinh khối nấm men bia. Tài liệu tham khảo (1) Lê Ngọc Tú và các tác giả khác, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học kĩ thuật Hà Nội. (2) Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật học công nghiệp,NXB Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh (3) Nguyễn Đức Lượng, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại Học Quốc Gia Tp, Hồ Chí Minh (4) Lào Thị Ngà, Kĩ thuật sản xuất nấm men bánh mì và một số loại nấm ăn, NXB Tp Hồ Chí Minh