Đề tài Tìm hiểu về Vibrio sp. gây bệnh trên thủy sản

(bệnh hình trụ) Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh hình sợi cá là vi khuẩn Flexibacter columnaris (Syn. Cytophaga columnaris) thuộc họ Flexibacteraceae, bộ Sphingobacteriales, lớp Sphingobacteria, ngành Bacteroideles. Vi khuẩn hình que (dạng sợi) mềm mại. Trong các mẫu mô nhiễm bệnh thấy rõ nhiều vi khuẩn dạng sợi mảnh dẻ. Trong cá mẫu mô nhiễm bệnh thấy rõ nhiều vi khuẩn chuyển động lướt nhẹ nhàng và tập hợp thành một trụ hình khối nên có tên gọi là bệnh hình trụ. Các khối trụ cũng chuyển động uốn cong. Vi khuẩn Gram âm, dạng hình que dài mảnh dẻ (dạng sợi mảnh) kích thước 0,3 – 0,5 x 3 – 8 μm. Hình 2.34: Khuẩn lạc của Flexibacter columnaris phát triển trên môi trường Cytophaga agar. Dấu hiệu nhiễm bệnh Dấu hiệu đầu tiên xuất hiện các đốm trắng trên thân, đầu, vây, mang. Các đốm lan rộng thành các vết loét, xung quanh màu đỏ, ở phần giữa màu vàng hoặc xám, da cá có thể bị lột ra vết loét lan rộng. Các mép vây biến màu sau lan dần tới gốc vây, các vây hoại tử cụt dần. Trên mang xuất hiện các vết loét, tơ mang bị phá huỷ làm cá ngạt thở. Bệnh không gây thương tích lớn trong các cơ quan nội tạng. Bệnh thường xảy ra khi cá nhốt với mật độ dày, môi trường nghèo dinh dưỡng. Hình 2.35: Cá song giống bị bệnh hoại tử cụt đuôi. Phân bố và lan truyền bệnh Cá nước ngọt đã nhiễm bệnh hình trụ: cá trình – Anguilla japonica, A. anguilla; cá – Misgurnus anguillicaudatus; cá vàng – Carassius auratus; cá chép – Cyprinus carpio; cá trắm cỏ – Ctenopharyngodon idellus; Ở Đông Nam Á bệnh đã gây ra ở cá trê vàng Clarias macrocephalus giết chết 90% cá trê giống trong ao nuôi trong vòng 24h. Ở nước ngọt, bệnh thường xuất hiện gây cá chết ở nhiệt độ 20 – 350C, dưới 150C ít khi xuất hiện bệnh. Ở Việt nam, nuôi cá lồng biển không nhiều, nhưng một số lồng nuôi cá mú (cá song) mật độ dày vào mùa xuân và mùa thu có thể xuất hiện bệnh hình sợi. Vi khuẩn dạng sợi gây bệnh ở nhiều loài động vật thuỷ sản nước ngọt và nước mặn, cá basa.... 2.3. GIỚI THIỆU VỀ Vibrio sp. GÂY BỆNH TRONG NUÔI TRỒNG THỦY HẢI SẢN 2.3.1. Tổng quan về Vibrio sp. 2.3.1.1. Đặc điểm của Vibrio sp. gây bệnh Vibrio có nguồn gốc từ “Vibrae” có nghĩa là dao động, gồm các vi khuẩn có dạng que uốn cong, có dạng dấu phẩy, có một tiên mao. Phần lớn các loài Vibrio sống hoại sinh chỉ một số ít có khả năng lây bệnh cho người. Vibrio cholerae (phẩy trùng tả) gây bệnh cho người, có khả năng sống trong nước đến 3 tuần. Một số chủng Vibrio có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc. Chúng sống trong nước ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nước lợ ven biển, vi khuẩn bám vào chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng của tôm, cua Đặc trưng của loài Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trường acid. Vibrio chứa các loại kháng nguyên O, K, H. Hình 2.36: Vi khuẩn Vibrio sp. 2.3.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng nhiễm bệnh Điều kiện môi trường xấu: Oxi hòa tan thấp, nền đáy tích tụ nhiều thức ăn thừa, tôm đã mang sẵn mầm bệnh trên các mô và bị sốc bởi các yếu tố môi trường xấu dẫn đến nhiễm bệnh, vùng đáy ao chứa nhiều chất thải độc, môi trường bị nhiễm bẩn hữu cơ, môi trường ở các vùng thâm canh năng suất cao ngày càng xấu đi. Do chất lượng nước không ổn định: pH 8: Mô bị phá hủy, gia tăng ammonia trong môi trường, độ mặn thích hợp cho tôm sú là 15 – 20%, sự thay đổi độ mặn vượt ra ngoài giới han thích ứng của tôm " gây sốc và giảm khả năng đề kháng bệnh, khí H2S, ao quá trong 2.3.2. Vibrio sp. gây bệnh trên tôm 2.3.2.1. Lịch sử phát hiện bệnh Bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiash khi bệnh xảy ra và gây chết với tỷ lệ > 50% trên đối tượng nuôi thủy sản là cua xanh (Callinectes sapidus). Đến năm 1977, Fisher đã thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus... hay tôm hùm châu Á (Panulirus homarus, P. ornatus...) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio. Kết quả này cũng được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981. Ngoài ra, Lioo và các ctv của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏ thân có liên quan đến thức ăn thối rữa. Nhưng có một số quan điểm khi nghiên cứu và phát hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm Sú ở Philippines với thức ăn tổng hợp (công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khi độc trong ao. Năm 1990, ông Hassawai cho rằng tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở Thái Lan là do phẩy khuẩn. Ở Việt Nam, có một số tác giả cho rằng nguyên nhân gây ra bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo già. Tuy nhiên theo nghiên cứu của viện nuôi trồng thuỷ sản 3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra trên tôm sú. Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectes irroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 20oC sau 24h. Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990 các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm (Đỗ Thị Hòa, 1995,1997). Những năm gần đây, nghề nuôi cá và động vật thân mềm nước mặn phát triển và bệnh Vibriosis đã trở thành bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản. Vi khuẩn thuộc giống Vibrio sống vào ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản đều gây ra một số dấu hiệu bệnh lý nhất định. Cho đến nay, một số tác giả cho rằng Vibrio là tác nhân đầu tiên gây ra các bệnh cho tôm. Ngược lại một số tác giả lại cho rằng: Vibrio chỉ là tác nhân thứ 2. Bệnh này xảy ra như là kết quả của các điều kiện khác: tôm bị bệnh truyền nhiễm hay các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt. Trong nghiên cứu bệnh động vật thuỷ sản phân lập Vibrio từ mẫu bệnh không khó nhưng xác định vai trò của chúng trong một bệnh không đơn giản và cảm nhiễm trở lại khó thành công do không tạo được các yếu tố điều kiện để bệnh bùng phát. 2.3.2.2. Phân loại Bộ: Eubacterriales Họ: Vibrionaceae Giống: Vibrio Loài: V.alginolyticus; V.parahaemolyticus; V.anguillarum; V.harveyi; V. salmonicida; V.splendidus. 2.3.2.3. Đặc điểm chung Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6mm. Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S. Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129. Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặc biệt là nước biển và cửa sông, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối. Hầu hết các mẫu phân lập từ bệnh vỏ và viêm ruột của tôm trưởng thành đều gặp loài V.alginolyticus; V. parahaemolyticus, V.anguillarum. Hình 2.37: Khuẩn lạc của V.alginolyticus và V.parahaemolyticus 2.3.2.4. Đặc điểm dịch tễ Đặc điểm phân bố Địa lý: Bệnh Vibriosis có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn. Sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Từ mẫu bệnh phát sáng của ấu trùng và hậu ấu trùng, các tác giả đã phân lập được những loại khác nhau của giống vibrio. Như ở Philippines, C.L.pilogo, M.C.L Baticados; E.R.Crus và L.de Lapena đã phân lập được 2 loài V.harveyi và V.splendidus. Trong khi đó ở Thái Lan, người ta lại cho rằng tác nhân là V.parahaemolyticus. Ở Việt Nam, một số cán bộ của trường Đại Học Thủy Sản đã phân lập từ tôm bệnh được 2 loài vi khuẩn là V.alginolyticus và V.parahaemolyticus. Ký chủ: Hầu như các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ, mặn đều có thể bị nhiễm và chịu tác hại của bệnh Vibriosis như: các loài tôm he (Penaeus spp.) và tôm thẻ (Metapenaeus spp.), các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus spp.) và tôm hùm châu Á (Panulirus spp.), các loài cua biển như cua xanh, cua đá... Giai đoạn phát triển: bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng, ấu niên, cơ thể trưởng thành, ở đàn bố mẹ của các loài tôm, cua... Tuy vậy, tùy theo từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio có thể gây nặng ở giai đoạn này và nhẹ hơn ở giai đoạn kia. Ví dụ: Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ở nhiều giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhất là giai đoạn tiền ấu trùng Zoae và Mysis. Con đường lan truyền: Trong hệ thống nuôi thuỷ sản vi khuẩn Vibrio xâm nhập vào ao theo một số con đường: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ hoặc tôm giống, thức ăn, đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằm sẵn ở thành bể hay dưới đáy ao. Mùa vụ xuất hiện bệnh Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo loài và địa điểm nuôi. Theo nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài và Việt Nam, Vibrio sp. tìm thấy phổ biến trong nước biển và vùng ven bờ, trong bể ương ấu trùng, bể ương tảo và bể ương Artemia. Nhìn chung: Vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 – 40ppt (phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 – 30ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa nóng), phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7 – 9. Trong bể ương lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng mặt, do đó biện pháp kỹ thuật xiphong đáy có tác dụng giảm mật độ Vibrio trong bể ương. Mật độ vi khuẩn Vibrio tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới (Đỗ Thị hòa, 1997) hoặc theo con nước của thủy triều (nước cường, nước ròng). Tác hại của bệnh Bệnh do Vibrio sp. gây ra ở tôm có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính, trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể là 100%. 2.3.2.5. Dấu hiệu bệnh lý Dấu hiệu lâm sàng Tôm bị nhiễm Vibrio sp. ở trạng thái không bình thường, hôn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm có thể nổi lên mặt ao, dạt bờ hay kéo đang bơi lòng vòng. Vỏ tôm bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ. Hình 2. 38: Đuôi tôm sú bị mòn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio. Khi vi khuẩn này cảm nhiễm trên vỏ kitin và mang có thể gây ra các vết thương tổn màu nâu đen do kitin đã bị ăn mòn và viêm nhiễm. Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh nhiễm nâu. Vỏ tôm có sự biến đổi thành màu đỏ hay màu xanh. Hình 2.39: Lớp vỏ kitin của tôm mềm và có màu xanh. Ấu trùng tôm và tôm giống có sự phát sáng ở phần giáp đầu ngực, nhìn trong tối sẽ thấy thân tôm phát sáng. Sau đó sẽ kèm theo hiện tượng lắng đáy, chết hàng loạt khi nhiễm V. parahaemolyticus và V. harveyi. Hình 2.40: Hiện tượng phát sáng ở ấu trùng tôm sú. Xuất hiện các điểm đỏ ở gốc râu, ngực, ở thân hay ở các phần phụ của ấu trùng giáp xác khi nhiễm V. alginolyticus. Xuất hiện vùng mờ ở phần cơ bụng, tôm bỏ ăn và xuất hiện sắc tố nâu đen trên mặt lưng của phần bụng gây nên những khoảng tối sáng khác với tôm bình thường. Các cơ quan phần phụ chuyển màu đỏ. Dấu hiệu bệnh tích Vi khuẩn Vibrio cũng có thể nhiễm ở gan tụy, ruột và một số vùng cơ của tôm. Tuy nhiên, khi giải phẩu cơ thể tôm bệnh chúng ta không thể phát hiện được dấu hiệu bệnh tích của tôm bệnh. Sau đây là một số bệnh đặc trưng do Vibrio sp. gây ra trên tôm 2.3.2.6. Bệnh phồng đuôi Tác nhân gây bệnh Bệnh phồng đuôi ở tôm tuy không lan thành dịch bệnh lớn nhưng cũng ảnh hưởng khá lớn đến năng suất nuôi. Ao nuôi với mật độ dày có rất nhiều khả năng gặp phải bệnh này. Nguyên nhân chính là do số lượng thức ăn dư thừa và vật chất khác tích tụ ở đáy ao tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển, chủ yếu là vi khuẩn thuộc giống Vibrio mà chiếm đa số là Vibrio parahaemolyticus. Hình 2.41: Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Dấu hiệu nhiễm bệnh Vi khuẩn có khả năng tạo ra loại enzyme chitinase phân hủy lớp chitin của lớp vỏ tôm. Mép đuôi trở nên đen và nhìn giống như bị đốt cháy. Có nơi phồng len hoặc sưng bên trong – chứa nhiều dịch. Những vùng đen hoặc sưng là nơi chứa nhiều vi khuẩn. Các vi khuẩn này không thể phát triển tới các nơi khác của cơ thể, nếu tôm lột vỏ trước khi vi khuẩn xâm nhập vào lớp màng trong, phần đen của đuôi sẽ bị loại khỏi qua lớp vỏ cũ. Nếu quá trình nhiễm bệnh ở dạng mãn tính, lớp mô cơ của đuôi sẽ chết và hư hỏng, lúc này trở nên màu đỏ và sưng tấy. Hình 2.42: Chân đuôi tôm sú bị phồng. 2.3.2.7. Bệnh đỏ dọc thân Tác nhân gây bệnh Nước và đáy ô nhiễm nặng, thức ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém, nhiễm vi khuẩn Vibrio mà chủ yếu là Vibrio alginolyticus. Dấu hiệu nhiễm bệnh Bệnh xảy ra làm tôm có những chấm đỏ dọc thân sau đó lan dần hết toàn thân. Ở Thái Lan tôm ấu trùng khi bị bệnh này nghiêm trọng sẽ có hiện tôm nhợt nhạt mất khả năng bơi lội sau 2 – 3 ngày tôm có thể chết. Hình 2.43: Tôm sú bị bệnh đỏ dọc thân. 2.3.2.8. Bệnh phát sáng Đặc điểm của vi khuẩn V.harveyi Nhóm Vibrio phát sáng là một phần của hệ vi sinh vật tự nhiên cư trú ở vùng ven bờ biển, được tìm thấy trên bề mặt và cà trên ruột của động vật sống ở biển. Vibrio harveyi và V. splendidus là 2 loài vi khuẩn phân lập từ các mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng bị bệnh phát sáng. Tuy nhiên Vibrio harveyi mới được xem là loài vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phát sáng trên tôm. Vibrio harveyi thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm chung của V.harveyi là vi khuẩn gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6µm, gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển. V.harveyi không có mối quan hệ cộng sinh với bất kỳ sinh vật biển nào, nó di chuyển bằng roi. Hình 2.44: Vi khuẩn Vibrio harveyi. Quan sát trong bóng tối các đĩa cấy V.harveyi trên môi trường phân lập đặc trưng thấy khuẩn lạc phát ra ánh sáng xanh nhạt. V.harveyi có khả năng kháng chịu rất nhiều loại kháng sinh thông thường như: erythromycin, penicillin, streptomycin và sulfadiazine. V.harveyi có khả năng tổng hợp enzyme catalase nên không bị tiêu diệt bởi H2O2. Bảng 2.2 : Đặc điểm sinh hóa của Vibrio harveyi. Đặc điểm Vibrio harveyi Nhuộm gram - Di động + Thử Oxydase + Phát sáng + Phát triển ở 4°C - Phát triển ở 37°C + Phát triển ở môi trường 0% NaCl - Phát triển ở môi trường 3% NaCl + Phát triển ở môi trường 7% NaCl + Mẫn cảm 0/129 (150µg) S Phát triển trên TCBS xanh Thử O/F Glucose +/+ Thủy phân Arginine - Lysine Decarbonxylase + Orinithine Decarboxylase - Sử dụng Citrate - Urease - Khử Nitrate + Indol + Sinh H2S - Methyl red + Voges – Proskauer - Dịch hóa Gelatin + Axit hóa Arabinose - Axit hóa Glucose + Axit hóa Inositol - Axit hóa Mannitol + Axit hóa Salicin - Axit hóa Sucrose - Hiện nay vẫn chưa biết rõ về cơ chế gây bệnh của V.harveyi, Liu (1997) cho rằng protease, phospholipase hoặc hemolysin có thể giữ vai trò quan trọng trong việc gây bệnh, trong đó protease cystein giữ vai trò là ngoại độc tố chính chính đối với động vật thủy sản. Montero và Austin (1999) cho rằng lipopolysaccharide có thể hình thành nên độc tố gây chết của V.harveyi dòng E2 đối với tôm. Nhìn chung hemolysin của vi khuẩn đã được coi là yếu tố quan trọng của các Vibrio gây bệnh bằng cách gây nhiễm trùng máu và tiêu chảy ở vật chủ. Phân tử tín hiệu Quorum Sensing ở Vibrio harveyi Khái niệm quorum sensing Quorum sensing là cơ chế thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào, phối hợp với sự biểu hiện gene trong tế bào vi khuẩn để đáp ứng lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng và dò tìm các phân tử dấu hiệu nhỏ, được gọi là các phân tử autoinducer (Defoirdt et al., 2004; Tu and Bassler, 2007; Tinh et al., 2007). Hệ thống quorum sensing điều khiển một số quá trình ở vi khuẩn gây bệnh như sự phát sáng, sự tiếp hợp, tạo thành khối u, sự quần tụ bầy đàn, sự hình thành bào tử, sự ăn mòn sinh học, sản xuất các chất kháng kháng sinh và quan trọng nhất là sự hình thành biofilm và các nhân tố gây độc ở vi khuẩn như các enzyme thủy phân, độc tố, siderophore và các phân tử gắn kết (Defoirdt et al, 2004; Tinh et al, 2007). Cơ chế hoạt động của hệ thống Quorum sensing Ở V. harveyi, HAI – 1 (Harveyi Autoinducer – 1) là một AHL (Acyl Homoserine Lactone) và quá trình sinh tổng hợp của HAI – 1 bị thủy phân bởi enzyme LuxM. AI – 2 (Autoinducer – 2) là một furanosyl borate diester, quá trình sinh tổng hợp của nó bị phân hủy bởi enzyme LuxS (Defoirdt et al., 2004; Tu and Bassler, 2006). Trong khi đó, quá trình sinh tổng hợp CAI – 1(Cholerae Autoinducer – 1) bị phân hủy bởi enzyme CqsA (Tu and Bassler, 2006). Mỗi phân tử dấu hiệu autoinducer được phát hiện bởi một protein kinase cảm biến histidine tự động phosphoryl hóa gắn trên màng tế bào khác nhau cho từng loại autoinducer, cụ thể là LuxN phát hiện HAI – 1, CqsS phát hiện CAI – 1, phức hợp LuxP – LuxQ phát hiện AI – 2. Tất cả 3 cảm biến này chuyển nhóm phosphate cho protein vận chuyển nhóm phosphate chứa histidine, LuxU và LuxU này sẽ chuyển nhóm phosphate cho protein điều hòa dựa vào s54, LuxO. Trong điều kiện mật độ tế bào thấp (tức là nồng độ autoinducer không đáng kể), 3 sensor này hoạt động như một kinase và nhóm phosphate được chuyển đến LuxO. Khi đó, phức hợp LuxO~P liên kết với s54, ức chế sự biển hiện của gene mã hóa cho sự phát sáng (gene lux), vì thế không có sự phát sáng trong điều kiện này. Ở mật độ tế bào cao (nồng độ autoinducer có thể nhận ra được), sự tương tác của sensor với các autoinducer có cùng bản chất làm cho các sensor này chuyển từ phương thức hoạt động như một kinase sang phương thức hoạt động như một phosphatase dẫn đến quá trình khử phosphoryl hóa LuxO. Khi đó, LuxO bị bất hoạt, dẫn đến sự biểu hiện của operon lux và điều khiển trực tiếp hoặc gián tiếp tất cả các gene đích của hệ thống quorum sensing. Cơ chế phân tử của sự kết nối với LuxO dẫn đến sự điều hòa của gene đích đã được xác định ở V. harveyi. Ở mật độ tế bào thấp, phức hợp LuxO~P liên kết với s54, hoạt hóa sự biển hiện của gene mã hóa cho 5 RNA điều hòa nhỏ (sRNA) được gọi là Qrr 1 – 5. sRNA làm mất tính ổn định của mRNA của luxR. Khi không có sự hiện diện của luxR, sự biểu hiện gene kiểm soát quorum sensing không xảy ra. Ở mật độ tế bào cao, quá trình dephosphoryl hóa làm bất hoạt LuxO, kết thúc quá trình sản xuất sRNA, giải thoát gene luxR khỏi sự ức chế cho phép sự điều hòa gene đích kiểm soát quorum sensing. Gần đây, sRNA được xem là một nhân tố điều hòa quan trọng hiện diện ở nhiều quá trình phát triển ở vi khuẩn và eukaryote. Ở nhiều sRNA của vi khuẩn, trong đó có V. harveyi, yêu cầu phải có sự hiện diện của Hfq, một RNA chaperone có cấu trúc và chức năng tương tự như protein Sm trong quá trình RNA splicing ở tế bào eukaryote. Hfq gắn với sRNA và phân tử mRNA đích của chúng để thực hiện quá trình bắt cặp các base và trong một số trường hợp, có thể đẩy nhanh quá trình thoái hóa phức hợp sRNA – mRNA. Phân tử tín hiệu quorum sensing quyết định các yếu tố độc lực của V. harveyi bao gồm cả khả năng gây bệnh phát sáng. Do đó, nếu kiểm soát được hoặc phân hủy được phân tử tín hiệu này có thể ức chế khả năng gây bệnh phát sáng của V. harveyi. Hình 2.45: Cơ chế hoạt động của các hệ thống Quorum sensing ở V. harveyi. Cơ chế phát sáng Cơ thể tôm phát sáng là do bị nhiễm một số loài vi khuẩn có khả năng phát sáng thuộc giống Vibrio sp. gây ra. Chúng có khả năng chuyển năng lượng hóa học thành năng lượng ánh sáng và tạo ra một thứ ánh sáng khá mạnh màu lục nhạt hay lam nhạt. Sự chuyển hóa năng lượng hóa học thành ánh sáng trong sự phát sáng sinh học là một quá trình ngược với sự quang hợp. Quá trình phát sáng gắn liền với sự có mặt của oxy và được coi là sự oxy hóa hiếu khí nhưng không dẫn đến sự tạo thành ATP mà dẫn đến sự phát sáng. Trong sự phát sáng do vi khuẩn, chất phát sáng (Luciferin) là một aldehyd chuỗi dài. Ngoài ra, tham gia vào quá trình phát sáng còn có Flavinmonoucleotid (FMN), Nicitinamid Adenin Dinucleotid (NAD), oxy và enzyme Luciferase xúc tác phản ứng xảy ra. Luciferase FMNH2 + O2 + RCHH FMN + H2O + RCOOH + ánh sáng Luciferase của vi khuẩn là một Heterodimer có trọng lượng phân tử khoảng 80.000 bao gồm hai cấu trúc dưới phân tử là a và b có trọng lượng phân tử tương ứng là 42.000 và 38.000; những cấu trúc này có chức năng riêng biệt. Trung tâm hoạt động của enzyme được định vị trên cấu trúc a. Do vi khuẩn phát sáng có nhu cầu cần ion Natri để phát triển nên sự tăng hoặc giảm nồng độ muối cũng đều ảnh hưởng đến sự phát sáng. Nếu pha loãng nước biển hơn 500/0 sẽ làm giảm sự phát sáng hoặc nếu cứ tiếp tục giảm nồng độ muối thì sẽ dẫn đến sự mất đi, không thể phục hồi khả năng phát sáng và cuối cùng làm vỡ tế bào vi khuẩn. Macleod (1961) cho rằng ảnh hưởng của NaCl đến sự phát sáng là do nó có tác dụng đến sự tạo thành enzyme Luciferase. Trong môi trường chỉ có 100/00 NaCl thì vi khuẩn phát sáng chỉ chứa ít enzyme này nhưng sau khi được chuyển sang môi trường có 300/00 NaCl thì sự tạo thành Luciferase tăng lên mạnh. Trong quá trình nuôi cấy, sự tổng hợp Luciferase tùy thuộc vào mật độ tế bào. Sự tổng hợp này bao gồm việc tạo thành và thải ra môi trường cơ chất kích thích sự hoạt động của enzyme Luciferase. Ví dụ ở vi khuẩn phát sáng V.fisheri tác nhân gây cảm ứng có cấu trúc N – (3 – oxohexanoyl) – 3 – aminodihidro – 2(3H) – furanone (N – b ketohexanoyl homoserin lactone). Kết quả nghiên cứu dịch bệnh cho thấy V.harveyi là một trong những loài vi khuẩn phát sáng được phát hiện trong suốt một năm ở hồ Galveston (O’Brien and Sizemore, 1979) và rất phong phú trong nước biển ven bờ ở sông Iloilo, đặc biệt từ tháng ba đến tháng bảy trong năm, mật độ nhóm Vibrio phát sáng trong nước biển này là 101 đến 102 CFU/ml. Cũng theo một số tác giả khi V.harveyi trong ao nuôi lên đến 102 CFU/ml thì hiện tượng chết có thể xảy ra trong vòng 48 giờ. Trái lại, một số tác giả khác thì cho rằng trên tôm giống từ ngày thứ 18 đến ngày thứ 31 của chu kỳ nuôi, mật độ vi khuẩn là 9.0x104 CFU trên mỗi mẫu gan tụy của tôm bệnh và 7x104CFU trên tôm khỏe. Điều này đã chỉ ra rằng ngưỡng 104CFU/ml trên gan tụy của tôm có thể chấp nhận được ở 30 ngày nuôi đầu, do đó không cần thiết phải sử dụng các chất kháng khuẩn, kháng sinh. Kết quả khảo sát cũng cho thấy trong suốt thời gian dịch bệnh bùng nổ, nhóm Vibrio phát sáng lên đến 90%trên tổng số vi khuẩn khu trú ở gan tụy, ở tôm khỏe tỷ lệ này chỉ chiếm 50%. Bệnh do nhóm Vibrio sp. ở tôm He được khuyến cáo như là tác nhân gây bệnh thứ cấp ảnh hưởng bỡi các tác nhân khác như: các tác nhân gây stress, ảnh hưởng môi trường và một số lượng lớn vi khuẩn có động lực hây bệnh. Nhưng nếu có một số lượng lớn vi khuẩn V.harveyi trong môi trường thì bấy giờ nó sẽ trở thành tác nhân đầu tiên gây bệnh. Dấu hiệu bệnh lý Cần phân biệt rõ sự phát triển của tôm bệnh. Nếu trong bể tôm có các đốm sáng lớn trên những con tôm chết, đó là do các tập đoàn coccobacilli tấn công vào các con tôm gây chết phát sáng, hiện tượng lâm sang này không quan trọng. Khi nước biển xử lý không tốt sẽ thường gặp hiện tượng này. Nếu phát sáng trên các con sống, đốm sáng rất nhỏ bên trong cơ của tôm thì đó là bệnh do V.harveyi và V.splendidus gây nên. Khi bị nhiễm bệnh này tôm thường có những triệu chứng khác thường như: bỏ ăn, bơi lờ đờ, thời gian lột xác kéo dài. Đặc biệc trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục ở góc bể, có thể đứng yên hoặc di động. Tôm bị nhiễm bệnh nặng thường lắng đáy, bất động và có thể chết 100%. Dấu hiệu bên ngoài: dấu hiệu để nhận biết tôm bị bệnh phát sáng là: tôm yếu lờ đờ, kém bắt mồi hoặc bỏ ăn, có màu sậm hoặc trắng đục. Màu sắc cơ thể đôi khi chuyển sang màu hồng. Tôm bơi nổi, tấp mé, phát sáng phần đầu ngực hay toàn thân, có thể nhiễm 100% đàn tôm. Tôm bệnh có thể bị đóng rong ở mang và vỏ, gan tôm bị teo lại, sẫm màu, tôm chậm lớn. Tôm có thể bị chết rải rác (10 – 20%) và có thể tăng lên nếu trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu tiên. Khi tôm nhiễm toàn thân, thì tỷ lệ chết lên đến 100%. Ấu trùng có thể chết rải rác tới hàng loạt đặc biệt ở giai đoạn tiền ấu trùng. Dấu hiệu mô học: tôm bị bệnh nặng, soi dưới kính hiển vi mẫu xoang bạch huyết và mẫu ruột thấy dày đặc những vi khuẩn di động, cơ quan chủ yếu nhiễm khuẩn là gan tụy. Tôm giống dưới 45 ngày nuôi bị nhiễm bệnh phát sáng có biểu hiện tế bào ống bên tong gan tụy bị phá hủy. Chổ lỗm giữa các tế bào hình ống bị bịt kín bởi các bạch cầu và các tế bào sợi. Tế bào biểu mô bị hoại tử và vi khuẩn tập trung từng đám trong Lumen. Quan sát ở những tôm nhỏ hơn thì thấy sự phá hủy ở các mô nhiều hơn. Điều kiện phát sinh bệnh Bệnh phát sáng trên tôm thường xảy ra trong tất cả các giai đoạn. Vibrio sp. phát sáng xâm nhập vào bể ương qua trứng tôm, tôm mẹ, thức ăn và dụng cụ sản xuất. Bệnh có thể lây nhiễm từ các trại giống, ao ương sang ao nuôi thịt. Phát triển mạnh trong những ao có hàm lượng chất hữu cơ cao, phát triển mạnh nhất ở độ mặn 30 – 35‰. Ở dưới 5‰ hầu như không thấy bệnh này xuất hiện. Bệnh có thể xuất hiện ở pH từ 7,5 – 9, bệnh có thể xuất hiện khi mất tảo đột ngột hay do môi trường biến động mạnh Các vi khuẩn gây bệnh có thể có trong nguồn nước cấp vào ao nuôi Khu vực phân bố bệnh Bệnh phổ biến nhiều nơi trên thế giới. Đặc biệt tại các trại sản xuất tôm giống. Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa sông và vùng nước lợ. Theo một số tài liệu của Philippines, Thái Lan và Indonesia, Vibrio sp. gây bệnh phát sáng cũng được tìm thấy trong nước biển vùng ven bờ, nhất là những nơi có hàm lượng chất hữu cơ cao và có nhiều xác động thực vật chết sau chu kỳ “nở hoa”. Số lượng vi khuẩn Vibrio sp. thường tăng vọt trong và sau mùa mưa, nhất là các tháng 10 – 12. Vì vậy vùng gần bờ biển cũng được xem là nguồn lây nhiễm chính.. 2.3.3. Vibrio sp. gây bệnh trên cá 2.3.3.1. Lịch sử phát hiện bệnh Vibrio anguillarum là loài vi khuẩn đầu tiên thuộc giống Vibrio được phát hiện gây bệnh trên cá và nó đã được phân lập từ cá chình nuôi ở Địa Trung Hải bởi Canestrini vào năm 1883. Và những năm tiếp sau đó, người ta cho rằng các tác nhân gây bệnh Vibriosis chính loài vi khuẩn này là nguyên nhân. Tuy nhiên, sự quan tâm ngày càng nhiều đối nghề nuôi cá trên thế giới đã giúp cho vấn đề dịch bệnh được hiểu một cách rõ ràng hơn đối với mỗi vùng nuôi, từng hệ thống nuôi và vai trò của mỗi loài vi khuẩn trong sự bùng nổ của dịch bệnh. Chẳng hạn, V. alginolyticus được xác định là tác nhân thứ cấp tham gia gây bệnh đối với cá tráp (Sparus aurata) nuôi ở Israel khi loài cá này bị thương tổn (Colorni và cộng sự, 1981). Trong khi đó, V.vulnificus là tác nhân gây bệnh cho cá chình ở Nhật bản được thông báo bởi Muroga và cộng sự năm 1979 và Bioscas vào năm 1991. Cùng với Vibrio anguillarum, V.ordalii (Schiewe et al. 1981) và V.salmonicida (Egidius et al. 1986) đã xuất hiện và là những tác nhân gây bệnh rất nguy hiểm cho cá hồi nuôi ở Thái Bình Dương và Đại Tây Dương. Qua quá trình tồn tại và phát triển, các giống loài Vibrio gây bệnh đã có sự biến đổi cấu trúc gen khác so với ban đầu, việc này đã dẫn đến hiện tượng kháng thuốc, có tác hại nghiêm trọng đối với sự phát triển của nghề nuôi thuỷ sản nói chung và nuôi cá biển nói riêng. 2.3.3.2. Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh của các loài Vibrio ở cá có điểm khác biệt so với giáp xác. Vì trong thành máu cá có các tế bào hồng cầu, đây là nguồn cung cấp ion Fe++ cho vi khuẩn Vibrio sống ký sinh trên cơ thể cá. Khi cá nuôi có sức đề kháng tốt, các yếu tố môi trường ổn định, các đại thực bào có thể tăng sinh mạnh và tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh. Trong trường hợp cá có vấn đề về sức khoẻ và điều kiện môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (nhiệt độ biến động, hàm lượng protein trong môi trường nuôi cao...), số lượng đại thực bào không đủ để tiêu diệt vi khuẩn thì vi khuẩn sẽ có cơ hội tấn công vào hệ cơ, mô và các bộ phận khác làm thương tổn và ảnh hưởng xấu đến chức năng của các cơ quan này. Vi khuẩn lấy ion Fe++ từ máu cá để hình thành enzyme protease phục vụ cho quá trình tổng hợp protein của chúng, từ đó chúng sẽ gây hoại tử mô cá, dần dần hình thành các vết loét trên cơ thể, tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân cơ hội khác xâm nhập. 2.3.3.3. Đặc điểm dịch tễ Đặc điểm phân bố Địa lý: Vi khuẩn Vibrio gây bệnh trên cá biển có sự phân bố rất rộng ở các vùng nước lợ, mặn trên khắp thế giới, từ châu Âu, châu Á, châu Mỹ hay ở các lục địa. Chúng luôn luôn tồn tại trong môi trường nước và có thể gây bệnh cho cá khi gặp điều kiện thuận lợi. Ký chủ: Có thể bắt gặp nhiều loài Vibrio gây bệnh cho cá như: cá chình, cá tráp, cá hồi, cá bơn... Giai đoạn phát triển: bệnh có thể được bắt gặp ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá nhưng bệnh do vi khuẩn này thường gây thiệt hại lớn ở giai đoạn cá hương, cá giống. đối với cá trưởng thành Vibrio chỉ gây ra một số thương tổn trên da và làm giảm giá trị thương phẩm của cá. Mùa vụ xuất hiện Bệnh do vi khuẩn Vibrio xuất hiện quanh năm nhưng thường bùng phát vào mùa có nhiệt độ cao và ở vùng nước có độ mặn cao khi cá bị stress, tuy vậy bệnh này vẫn có thể xảy ra ở khu vực cửa sông hay đối với một số loài cá nước ngọt. Tác hại Mặc dù vi khuẩn có thể cảm nhiễm ở các cơ quan bộ phận khác nhau nhưng thường chúng tấn công mạnh tim và hệ cơ của cá. Vì vi khuẩn có khả năng tấn công mạnh vào hệ cơ nên tác hại của chúng rất nghiêm trọng và khó chữa trị triệt để, vi khuẩn có thể gây nên bệnh mãn tính ở cá trưởng thành. Nếu bệnh xảy ra cấp tính thì hậu quả thiệt hại rất nặng nề. Đối với ấu trùng cá hay cá ở giai đoạn cá hương, cá giống khi nhiễm bệnh nặng tỷ lệ chết có thể lên đến 50%. Đối với cá lớn hơn thì tỷ lệ thiệt hại thấp hơn nhưng cá sẽ giảm ăn, ngừng ăn hoặc không lớn nữa và khi thu hoạch có thể quan sát thấy những vết thương hoại tử ở trên da và cơ của cá. 2.3.3.4. Dấu hiệu bệnh lý Dấu hiệu lâm sàng Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng lưng và trên các vết thương tổn; da, vây có thể sưng lên và bị lở loét. Cơ nổi hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục. Dấu hiệu bệnh tích Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan nhanh, hoá lỏng và lá lách sẽ có màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên. Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen. 2.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH Vibrio sp. 2.4.1. Phát hiện vi khuẩn Vibrio sp. bằng phương pháp nuôi cấy 2.4.1.1. Nguyên tắc Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh peptone kiềm, phân lập trên môi trường phân lập đặc trưng. Quan sát chọn những khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa cấy. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên nhược điểm của nó là mất thời gian để thực hiện. 2.4.1.2. Cách thực hiện Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2 – 3 con tôm (cá) trong ao nuôi có dấu hiệu nhiễm khuẩn. Lấy máu tôm (cá): mỗi con 0,1ml, sau đó nhỏ lên các đĩa chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên một đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hóa của Vibrio sp. như khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng Citrate như nguồn carbon duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gar của glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hóa; khả năng phân giải gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hóa; khả năng sử dụng các acid amin. Hình 2.46: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio sp. trên môi trường TCBS. 2.4.2. Phương pháp miễn dịch học – ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V.harveyi trên tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng Vibrio sp Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt. Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa. Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra. Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể có thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra.Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Có những phương pháp ELISA như sau: 2.4.2.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn. Thêm dung dịch protein không tương tác (non – interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blocking" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng nguyên còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme). Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). Hình 2.47: ELISA gián tiếp. Sandwich ELISA Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn kháng thể. Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định. Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán. Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp ở bước 5). Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện. Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể. Hình 2.48: Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng kháng thể (2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên. Kháng nguyên (nếu có) sẽ gắn với kháng thể; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với Kháng nguyên; (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại kháng nguyên. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hóa trị của kháng nguyên này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của kháng nguyên và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (không chứa kháng nguyên trong mẫu), phức hợp kháng nguyên – enzyme có thể gắn lên các kháng thể sơ cấp và sau đó thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các giếng kiểm tra, các phân tử kháng nguyên tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ kháng nguyên càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt. Thí nghiệm này nhanh, dễ dàng thực hiện. Hình 2.49: ELISA cạnh tranh. 2.4.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của enzyme polymerase. Hiện nay có thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio sp. trong vài giờ mà không mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho Vibrio sp. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó, ta cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó. Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong vòng 30 giây – 1phút, thường là ở 940C. Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30° – 70°C khoảng 40 giây – 1 phút. Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thưòng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu. Hình 2.50: Các giai đoạn trong phản ứng PCR. 2.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÒNG NGỪA VÀ ĐIỀU TRỊ 2.5.1. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp 2.5.1.1. Cải tạo và vệ sinh môi trường nuôi Cải tạo ao trước khi ương nuôi: tháo cạn, vét bùn (rửa đáy ao), phơi khô (hoặc rửa chua) và khử trùng ao nuôi với mục đích là: Diệt địch hại và sinh vật là vật nuôi trung gian sinh vật cạnh tranh thức ăn của tôm, cá, như các loài cá dữ, cá tạp, giáp xác, côn trùng, nòng nọc, sinh vật đáy.. Diệt sinh vật gây bệnh cho tôm, như các giống loài vi sinh vật: Vi khuẩn, nấm và các loài ký sinh trùng. Cải tạo chất đáy làm tăng các muối dinh dưỡng, giảm chất độc tích tụ ở đáy ao. Đắp lại lỗ rò rỉ, tránh thất thoát nước trong ao, xoá bỏ nơi ẩn nấp của sinh vật hại tôm. Vệ sinh môi trường ao nuôi trong quá trình nuôi: vệ sinh môi trường nuôi bằng phương pháp cơ học, hóa học, sinh học. Vệ sinh môi trường nuôi bằng phương pháp cơ học: trong quá trình nuôi thương phẩm thức ăn thừa và phân đã gây ô nhiễm môi trường nuôi, đặc biệt là thời gian cuối chu kỳ nuôi. Những sản phẩm khí độc như: H2S, NH3 ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của tôm nuôi. Biện pháp dùng hệ thống máy quạt nước để tăng cường hàm lượng oxy hoà tan trong ao, đặc biệt là tầng đáy, tạo điều kiện cho vi sinh vật hiếu khí phát triển sẽ làm giảm thiểu lượng khí độc trong ao. Sục khí mạnh cũng sẽ làm các khí độc thoát ra khỏi ao, đồng thời gom các chất thải trong ao vào một nơi nhất định, giúp rút các các chất thải ra khỏi ao nuôi tốt hơn. Vệ sinh bằng phương pháp hóa học: vệ sinh môi trường nước nuôi tôm thường xuyên bằng vôi bột (vôi nung để hả) tuỳ theo pH của nước ao. Vôi có tác dụng cung cấp Ca2+ cho ao, ổn định pH, khử trùng làm sạch nước ao. Nếu pH 8,0 dùng bột đá vôi (CaCO3) hoặc vôi đen – CaMg(CO3)2 để bón là 1kg/100m3. Đối với ao nuôi thâm canh có thể dùng vôi đen – Dolomite (Ca và Mg), chú ý chất lượng vôi đen và nguồn gốc. Trong quá trình nuôi tôm nên thường xuyên bón vôi 2 – 4 lần/tháng với liều lượng 1 – 2kg/100m3 nước(100 – 200kg/ha với độ sâu 1m). Dùng một số hoá dược có tính oxy hoá mạnh phun vào ao: thuốc tím (KMnO4) nồng độ 2 – 5g/m3 hoặc Benzalkonium Chloride (BKC) nồng độ từ 0,1 – 0,5 g/m3 để tham gia vào quá trình oxy hoá các khí độc (H2S, NH3) thành các vật chất đơn giản không độc. Vệ sinh bằng phương pháp sinh học: khi nuôi qui mô lớn có thể dùng một số chế phẩm sinh học để cải thiện môi trường nuôi tôm. Tác dụng của chế phẩm sinh học: cải thiện chất lượng nước, ổn định pH, cân bằng hệ sinh thái trong ao; loại các chất thải chứa nitrogen trong ao nuôi, những chất thải này gây độc cho động vật thủy sản,sau đó chúng được chuyển hóa thành sinh khối làm thức ăn cho các động vật thủy sản; giảm bớt bùn ở đáy ao; giảm các vi khuẩn gây bệnh như: Vibrio sp, Aeromonas sp và các loại virus gây bệnh khác; hạn chế sử dụng hóa chất và kháng sinh. 2.5.1.2. Tiêu diệt nguồn gốc gây bệnh Khử trùng cơ thể con giống trước khi thả nuôi: ao đã được tẩy dọn sạch sẽ và khử trùng đáy ao, nước mới tháo vào ao cũng đã lọc kỹ nhưng con giống có thể mang mầm bệnh vào ao hồ. Do vậy nguồn con giống thả vào thuỷ vực cần tiến hành kiểm dịch, nếu có sinh vật gây bệnh ký sinh trên cơ thể tôm thì tuỳ theo kết quả kiểm tra mà chọn thuốc trị bệnh cho thích hợp. Khử trùng thức ăn: Thức ăn là động vật tươi nên rửa sạch, tốt nhất là nấu chín. Phân hữu cơ cần ủ với 1% vôi sau đó mới sử dụng. Xung quanh nơi cho ăn, thức ăn thừa thối rữa gây nhiễm bẩn, tạo điều kiện cho sinh vật gây bệnh phát triển. Do đó thức ăn thừa phải vớt bỏ hoặc làm sạch và khử trùng địa điểm cho ăn. Làm sạch nơi cá (tôm) đến ăn có thể dùng thuốc nào hay số lượng nhiều ít còn tuỳ thuộc vào chất nước, độ sâu, nhiệt độ nước, diện tích nơi cho ăn và tình hình phát sinh bệnh. Khử trùng dụng cụ: sinh vật gây bệnh có thể theo dụng cụ lây lan bệnh từ ao bể bị bệnh sang ao, bể tôm khỏe. Vì vậy dụng cụ của nghề nuôi nên dùng riêng biệt từng ao, bể. Nếu thiếu thì sau đó khi sử dụng xong phải có biện pháp khử trùng mới đem dùng cho ao, bể khác. Dụng cụ đánh bắt dụng cụ bằng gỗ, quần áo khi lội ao phải dùng dung dịch Ca(OCl)2 200ppm để ngâm ít nhất 1 giờ và rửa sạch mới dùng. 2.5.1.3. Tăng cường sức đề kháng bệnh Nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào những cơ thể có phát sinh ra bệnh hay không còn tuỳ thuộc vào yếu tố môi trường và bản thân cơ thể vật nuôi. Nếu vật nuôi có sức đề kháng tốt có khả năng chống đỡ lại yếu tố gây bệnh nên không mắc bệnh hoặc bệnh nhẹ. Ngược lại khả năng chống đỡ yếu, dễ dàng nhiễm bệnh. Do đó một trong những khâu quan trọng để phòng bệnh cho vật nuôi phải tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi. Cho ăn theo phương pháp “4 định”: Định chất lượng thức ăn: Thức ăn dùng cho ăn phải tươi, sạch sẽ không bị mốc, ôi thối, không có mầm bệnh và độc tố. Thành phần dinh dưỡng thích hợp đối với yêu cầu phát triển cơ thể trong các giai đoạn. Định số lượng thức ăn: dựa vào trọng lượng cơ thể để tính lượng thức ăn, thường sau khi cho ăn sau 2 giờ kiểm tra nếu ăn hết là lượng vừa phải. Nếu ăn thừa nên giảm bớt lần sau, nếu thiếu thì tăng lần sau (chú ý đối với tôm khi lột xác thì ăn ít. Định vị trí để cho ăn: Khi cho ăn phải rải đều khắp ao (đối với cá thì cho ăn một nơi cố định để tập cho cá có thói quen đến ăn tập trung tại một điểm nhất định), trừ vùng tập trung nhiều cặn bã (như ở giữa đáy ao khi nuôi thâm). Định thời gian cho ăn: những tháng đầu nuôi hàng ngày cho ăn 2 lần, những tháng cuối chu kỳ nuôi có thể cho ăn 4-5lần/ngày. Ví dụ nuôi tôm thâm canh, mật độ dày tháng thứ 3-4 cho ăn 5 lần/ngày. Khi nuôi có thể dùng phân hữu cơ bón xuống thuỷ vực bổ sung chất dinh dưỡng để cho sinh vật phù du phát triển cung cấp nguồn thức ăn tự nhiên. 2.5.2. Điều trị Khi tôm (cá) bị nhiễm bệnh có thể sử dụng các loại thuốc kháng sinh như Furacin, Oxytetracylin, trộn vào thức ăn cho ăn liên tục 5 -7 ngày. Dùng một số kháng sinh trị bệnh cho ấu trùng tôm: Oxytetracyline + Bacitracin (tỷ lệ 1:1) nồng độ 1-3 ppm. Erytromycin + Rifamycin (tỷ lệ 5:3) nồng độ 1-2 ppm. Erytromycin + Bacitracin (tỷ lệ 1:1) nồng độ 1-3 ppm. Thuốc phun trực tiếp trong bể sau 12 giờ thay nước, xử lý 3 ngày liên tục. CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua kết quả tìm hiểu về Vibrio sp. gây bệnh trên thủy sản cho thấy nhóm vi khuẩn này có thể lây nhiễm trên tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thủy sản và đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy sản trên thế giới và tại Việt Nam. V.parahaemolyticus là vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phồng đuôi cho tôm, tuy không lan truyền thành dịch bệnh lớn nhưng cũng ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng tôm nuôi. V.alginolyticus gây bệnh đỏ dọc thân trên tôm, bệnh nhiễm khuẩn trên cá tráp. V.harveyi là vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phát sáng trên tôm, nếu ao bị nhiễm V.harveyi nặng có thể làm tôm chết hoàn toàn. V.vulnificus là tác nhân gây bệnh cho cá chình ở Nhật bản. V.anguillarum, V.ordalii, V.salmonicida là những tác nhân gây bệnh cho cá hồi nuôi ở Thái Bình Dương và Đại Tây Dương. Có những phương pháp thông dụng để xác định vi khuẩn Vibrio sp. như là phương pháp nuôi cấy trên môi trường đặc trưng, phương pháp ELISA dựa theo nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, phương pháp PCR dựa vào việc phát hiện đoạn DNA đặc hiệu của vi khuẩn Vibrio sp. và có thể đưa đến những biện pháp phòng ngừa, điều trị thích hợp. KIẾN NGHỊ Cần tiến hành thử nghiệm gây cảm nhiễm các chủng vi khuẩn Vibrio sp. trên động vật trong nhiều điều kiện khác nhau, đặc biệt là các điều kiện gần với sản xuất thực tế ở các vùng. Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn Vibrio sp. khác nhau để tổng hợp, đưa ra các phương pháp xác định chính xác và biện pháp phòng ngừa thích hợp cho bệnh ở động vật thủy sản. Nghiên cứu phát triển và ứng dụng chế phẩm vi sinh vào trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao chất luợng sản phẩm thủy sản, bảo đảm an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và khắt khe của xã hội. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước Bùi Quang Tề, (1994). Kết quả khảo sát bệnh Penaeus monodon Baculovirus (MBV) của tôm sú nuôi ở các tỉnh phía Nam. Báo cáo khoa học Viện Nghiên Cứu Thủy Sản I. Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, (1994). Những bệnh thường gặp ở tôm cá đồng bằng sông Cửu Long và biện pháp phòng trị bệnh. NXB Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. Bùi Quang Tề, (1996). Bệnh tôm cá và giải pháp phòng trị.Tạp chí thuỷ sản số 4/1996. Bùi Quang Tề, (1997). Tình hình bệnh tôm cá trong thời gian qua và biện pháp phòng trị bệnh.Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y - Hội thú y Việt nam, tập IV, số 2/1997. Đỗ Thị Hoà, (1996). Nghiên cứu một số bệnh chủ yếu trên tôm sú (Penaeus monodon) nuôi ở khu vực Nam Trung Bộ. Luận văn P.TS. khoa học nông nghiệp. Đỗ thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Hà Ký và ctv, (1995). Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh tôm cá. Tổng kết đề tài cấp nhà nước mã số KN – 04 – 12, năm 1991 – 1995. Nguyễn Văn Thành và ctv, (1974). Kết quả nghiên cứu bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ. Tuyển tập các công trình nghiên cứu Đại học Thuỷ sản. Trần Linh Thước, (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục. Trần Thị Thanh Tâm, (2003). Nghiên cứu bệnh đốm trắng trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi công nghiệp. Báo cáo khoa học của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, năm 2001 – 2003. Tài liệu tiếng Anh Claude E. Boyd, (1996). Water Quality in Ponds for Aquculture. Copyright by Claude E. Boyd Ph.D. Auburn University. Auburn Alabana 36849 USA. Printed 1996 by Shrimp Mart (Thai) Co. Ltd. 40-41 Chaiyakul Soi. 1, Hatyai, Songkhla Thailand. Chanratchakool et all, (1994.) Health Management in shirmp ponds.Published by Aquatic Animal Health Research Institute Department of Fisheries Kasrtsart University Campus. Jatujak. Bangkok. Thailand. H.W.Ferguson, J F Turnbull, A Shinn, K Thompson, T T Dung and M Crumlish, (2001). Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong Delta, Vietnam. Journal of fish diseases 2001. Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete, (2004). The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana. Ghent University, Belgium. Tài liệu web