Định lượng mafenid acetat trong dung dịch mafenid acetat 5% bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 5 ĐỊNH LƢỢNG MAFENID ACETAT TRONG DUNG DỊCH MAFENID ACETAT 5% BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Lê Thị Thu Hằng*; Nguyễn Như Lâm*; Vũ Ngọc Thắng** TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng mafenid acetat trong dung dịch mafenid acetat 5%. Đối tượng và phương pháp: thẩm định phương pháp định lượng mafenid acetat trong dung dịch mafenid acetat 5% (chế phẩm được điều chế từ nguồn nguyên liệu sản xuất trong nước) với các tiêu chí: tính tương thích của hệ thống, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện theo hướng dẫn của USP và ICH. Kết quả: điều kiện sắc ký gồm: cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm); pha động là hỗn hợp dung dịch đệm phosphat pH 2,5-acetonitril (90:10); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector UV-VIS 267 nm. Phương pháp xây dựng được có độ đúng (% tìm lại) từ 98,32 - 99,58% và độ lặp lại cao (RSD% = 0,35%). Khoảng tuyến tính 0,05 - 2,0 mg/ml với hệ số tương quan r = 0,9999. Giới hạn phát hiện (LOD) 0,1076 µg/ml và giới hạn định lượng (LOQ) 0,3227 µg/ml. Kết luận: đã xây dựng được phương pháp phù hợp để định lượng mafenid acetat trong dung dịch mafenid acetat 5%. * Từ khóa: Dung dịch mafenid acetat; Thẩm định phương pháp; HPLC. Quantitative of Mafenid Acetate in 5% Mafenid Acetate Solution by High Performance Liquid Chromatography Summary Objectives: To establish the HPLC method for the quantitative of mafenide acetate in 5% mafenide acetate solution. Subjects and methods: Validating some parameters of the established method used to quantify 5% mafenide acetate solution (the products are prepared by domestic materials) including system suitability, specificity, linear range, precision, accuracy, the limit of detection, the limit of quantitation. Results: Chromatographic conditions of the method: Phenomenex C18 (150 x 4.6 mm, 5 µm) column, phosphate buffer solution pH 2.5-acetonitrile (90:10) as mobile phase, monitored at 267 nm. The established method has high accuracy (average recovery ratio from 98.50 to 99.58%) and the high precision (RSD% = 0.35%). Linear range is 0.05 - 2.0 mg/mL with r = 0.9999; the limit of detection was 0.1076 µg/mL, the lower limit of quantitation was 0.3227 µg/mL. Conclusion: A suitable HPLC method for quantifying mafenide acetate in 5% mafenide acetate solution was validated. * Keywords: Mafenide acetate solution; Validation; HPLC. * Bệnh viện Bỏng Quốc gia ** Viện Kiểm nghiệm, Nghiên cứu Dược và Trang thiết bị Y tế Quân đội Người phản hồi (Corresponding): Lê Thị Thu Hằng (lehangvb@gmail.com) Ngày nhận bài: 07/08/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 23/11/2017 T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 6 ĐẶT VẤN ĐỀ Mafenid acetat là một sulfonamid có hoạt tính kháng khuẩn rộng trên các chủng vi khuẩn, đặc biệt là trực khuẩn mủ xanh [6]. Thuốc đã và đang được sử dụng có hiệu quả tại các trung tâm bỏng trên thế giới dưới dạng dung dịch hoặc dạng kem để điều trị nhiễm khuẩn tại chỗ do trực khuẩn mủ xanh và vi khuẩn đa kháng thuốc khác [1, 2, 5]. Hiện nay, chúng ta chưa sản xuất được sản phẩm này mà phải nhập khẩu với giá rất cao. Trên cơ sở đó, Viện Bỏng Quốc gia đã phối hợp với Trường Đại học Dược Hà Nội nghiên cứu tổng hợp thành công nguyên liệu mafenid acetat đạt tiêu chuẩn Dược Điển Mỹ USP 38, đồng thời Khoa Dược, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác đã điều chế được dung dịch mafenid acetat 5%. Hiện tại, trong các Dược điển tham khảo chưa có chuyên luận cho dung dịch mafenid acetat. Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng dung dịch mafenid acetat để điều trị bỏng rất lớn. Vì vậy, cần phải xây dựng phương pháp định lượng thành phần hoạt chất trong chế phẩm dung dịch mafenid acetat phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện có để phục vụ công tác xây dựng tiêu chuẩn chế phẩm nhằm kiểm soát tốt chất lượng và hiệu quả của chế phẩm. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu. - Chế phẩm nghiên cứu: dung dịch mafenid acetat 5% được điều chế tại Khoa Dược, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác ngày 06/03/2017, số lô: M1. - Chất chuẩn: mafenid acetat (Hội đồng Dược điển Mỹ, số lô GOL 536, hàm lượng nguyên trạng 99,4%). - Hóa chất, dung môi: kali dihydrophosphat, natri hexansulfonat, axít phosphoric (Merk) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA); acetonitril (Merck) đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC. - Thiết bị, dụng cụ: hệ thống phân tích HPLC Shimadzu 10 AVP với detector UV; cân phân tích Mettler Toledo độ chính xác 0,1 mg (Thụy Sỹ); bộ lọc hút chân không Pall (Mỹ) Các thiết bị được hiệu chuẩn, kiểm định định kỳ theo quy định. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Điều kiện sắc ký: qua tham khảo tài liệu [4] và thực nghiệm, lựa chọn điều kiện sắc ký gồm: - Cột Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm). - Detector UV: 267 nm. - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Thể tích tiêm: 20 µl. - Dung dịch đệm pH 2,5: hòa tan 6,8 g kali dihydrophosphat và 1,0 g natri hexansulfonat trong 1.000 ml nước, điều chỉnh pH về 2,5 bằng axít phosphoric. * Pha động: hỗn hợp dung dịch đệm pH 2,5:acetonitril (90:10), lọc qua màng 0,45 µm, siêu âm đuổi khí. T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 7 * Phương pháp chuẩn bị mẫu: - Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 100 mg mafenid acetat chuẩn vào bình định mức 20 ml, thêm khoảng 15 ml pha động, lắc để hòa tan; bổ sung pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch có nồng độ mafenid acetat khoảng 5 mg/ml. - Dung dịch thử: pha loãng một lượng chế phẩm mafenid acetat 5% với pha động để được dung dịch có nồng độ mafenid acetat khoảng 0,5 mg/ml, lọc qua màng 0,45 μm. * Thẩm định phương pháp phân tích: Theo hướng dẫn của USP và ICH với các tiêu chí: tính tương thích hệ thống; tính đặc hiệu; độ tuyến tính; độ đúng và độ lặp lại; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [3, 4]. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Tính tƣơng thích của hệ thống. Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với pha động được dung dịch chuẩn mafenid acetat có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml. Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch này vào hệ thống sắc ký. Bảng 1: Tính tương thích của hệ thống sắc ký. TT Thời gian lƣu (phút) Diện tích píc (µAU.s) Số đĩa lý thuyết Hệ số bất đối xứng 1 3,448 1756257 2324 1,43 2 3,453 1764536 2346 1,45 3 3,457 1773225 2307 1,44 4 3,460 1762404 2355 1,44 5 3,445 1783756 2389 1,43 6 3,432 1779267 2400 1,42 TB 3,449 1769908 2354 1,44 SD 0,01 10600,74 36,04 0,01 RSD (%) 0,29 0,60 1,53 0,73 Độ lặp lại của diện tích píc và thời gian lưu tốt (RSD% đều < 2%), số đĩa lý thuyết và hệ số bất đối xứng phù hợp. Như vậy, thiết bị và điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích mẫu nghiên cứu. T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 8 2. Tính đặc hiệu. Tiêm lần lượt mẫu trắng (pha động), dung dịch chuẩn, dung dịch thử và mẫu thử thêm chuẩn vào hệ thống theo các điều kiện trên, thu được kết quả như sau: Minutes 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 m c A U 0.00 0.02 0.04 ( M a f e n i d e a c e t a t ) a) Sắc ký đồ mẫu trắng Minutes 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 m c A U 0.00 0.05 0.10 0.15 M a f e n i d e a c e t a t 3 . 4 4 8 b) Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Minutes 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 m c A U 0.00 0.05 0.10 0.15 M a f e n i d e a c e t a t 3 . 4 6 3 c) Sắc ký đồ dung dịch thử Minutes 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 m c A U 0.0 0.1 0.2 0.3 M a f e n i d e a c e t a t 3 . 3 9 5 d) Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn Hình 1: Sắc ký đồ các mẫu: mẫu trắng (a); dung dịch chuẩn (b); dung dịch thử (c) và mẫu thử thêm chuẩn (d). Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung dịch thử và mẫu thử thêm chuẩn xuất hiện píc tương ứng với vị trí của mafenid acetat như trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn. Các píc này cân đối và riêng biệt. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng tại vị trí tương ứng với mafenid acetat không thấy xuất hiện píc. Như vậy, phương pháp phân tích mafenid acetat xây dựng đảm bảo có tính đặc hiệu cao. 3. Độ tuyến tính. Chuẩn bị các dung dịch có nồng độ mafenid acetat 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 và 2,0 mg/ml. Tiêm lần lượt các dung dịch trên vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc đồ, vẽ đường hồi quy tuyến tính về sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ. T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 9 Bảng 2: Phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc vào nồng độ mafenid acetat. Nồng độ (mg/ml) 0,05 0,1 0,25 0,5 0,75 1,0 2,0 Diện tích píc (µAU.s) 140632 352340 866759 1704847 2543670 3387260 6663168 Đường chuẩn y = ax + b y = 3334162x + 22117; r = 0,9999 Hình 2: Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích píc vào nồng độ mafenid acetat. Trong khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc vào nồng độ mafenid acetat theo phương trình y = 3334162x + 22117 với hệ số tương quan r = 0,9999. Kết quả này là cơ sở để lựa chọn nồng độ định lượng các hợp chất nghiên cứu tương ứng. 4. Độ đúng. Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách thêm chuẩn với các mẫu được chuẩn bị như sau: thêm chính xác một lượng mafenid acetat chuẩn ở 3 nồng độ khoảng 0,25; 0,5 và 0,75 mg/ml vào dung dịch ban đầu có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml. Tính nồng độ tìm lại dựa vào đường chuẩn. Độ đúng là tỷ lệ % giữa nồng độ tìm lại và nồng độ thêm vào. Tiến hành lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ. Bảng 3: Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp. Nồng độ thêm vào (mg/ml) Nồng độ tìm lại (mg/ml) % tìm lại Trung bình tìm lại (%) SD RSD (%) 0,2499 0,2481 99,27 98,50 1,18 1,19 0,2481 0,2411 97,15 0,2515 0,2492 99,08 0,4999 0,5042 100,87 99,58 1,19 1,20 0,4963 0,4931 99,36 0,5030 0,4955 98,51 0,7498 0,7515 100,23 99,32 0,82 0,82 0,7444 0,7375 99,06 0,7545 0,7444 98,66 Phương pháp có độ đúng cao, % tìm lại trung bình từ 98,32 - 99,58%. T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 10 5. Độ lặp lại. Tiến hành định lượng lặp lại 6 lần của cùng một mẫu thử. Bảng 4: Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp. TT Diện tích píc (µAU.s) Nồng độ (%) % so với nhãn 1 1652995 4,83 96,63 2 1670254 4,88 97,64 3 1665467 4,87 97,36 4 1661413 4,86 97,12 5 1660503 4,85 97,07 6 1660455 4,85 97,06 Trung bình 4,86 97,14 RSD (%) 0,35 0,35 Phương pháp định lượng có độ lặp lại cao với RSD = 0,35%. 6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ). LOD của phương pháp được xác định bằng cách tính từ độ lệch chuẩn của mẫu trắng và hệ số góc của phương trình hồi quy; LOQ được xác định bằng 3 lần LOD. Bảng 5: Kết quả xác định LOD và LOQ. TT Tín hiệu mẫu trắng (µAU.s) 1 465 2 493 3 499 4 270 5 303 6 295 SD 108,69 LOD (µg/ml) 0,1076 LOQ (µg/ml) 0,3227 Phương pháp có LOD và LOQ lần lượt là 0,1076 và 0,3227 µg/ml, thấp hơn nhiều so với điểm cuối cùng của đường tuyến tính đã khảo sát (50 µg/ml). 7. Kết quả định lƣợng mafenid acetat trong dung dịch chế phẩm. Tiến hành định lượng mafenid acetat trong chế phẩm dung dịch mafenid acetat 5% (sản xuất tại Khoa Dược, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác gồm 3 lô thuốc M1, M2, M3). Bảng 6: Kết quả định lượng dung dịch mafenid acetat 5%. Hàm lƣợng (%) mafenid acetate so với nhãn (n = 5) X ± SD Dung dịch 5% Lô M1 99,51 ± 0,54 99,30 ± 0,633 Lô M2 99,61 ± 0,35 Lô M3 99,79 ± 0,61 Hàm lượng mafenid acetat trung bình của cả 3 lô chế phẩm nồng độ 5% đạt 99,30% so với lượng ghi trên nhãn. KẾT LUẬN Đã xây dựng được phương pháp định lượng mafenid acetat bằng HPLC. Phương pháp đã được thẩm định đầy đủ trên các tiêu chí. Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy, phương pháp có tính đặc hiệu cao. Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,05 - 2,0 mg/ml, có sự phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc và nồng độ mafenid acetat với hệ số tương quan r = 0,9999. Phương pháp xây dựng được có độ đúng (98 - 99,58%) và độ lặp lại (RSD% = 0,35%) cao. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp thấp hơn nhiều so với điểm T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2017 11 cuối của đường tuyến tính. Phương pháp được áp dụng để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của dung dịch mafenid acetat 5%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Afshari A, Nguyen L, Kahn S.A, Summitt B. 2.5% mafenide acetate: A cost-effective alternative to the 5% solution for burn wounds. Journal of Burn Care & Research, 2016, Vol 38, No 1, pp.e38-e47. 2. Ibrahim A, Fagan S, Keaney T et al. A simple cost-saving measure: 2.5% mafenide acetate solution. Journal of Burn Care &Research, 2014, Vol 35, No 4, pp.349-353. 3. ICH guidelines. Q2 (R1) validation of analytical procedures: text and methodology. 1996. 4. United State Pharmacopeia 38. NF33. 2015, p.4168. 5. Paulson D, Eastman T, Bottini P.B. Activity of mafenide acetate 5% solution against nosocomial pathogens. Plasty. 2004, Vol 3, No 7, 6. Japoni A et al. Pseudomonas aeruginosa: Burn infection, treatment and antibacterial resistance. Iranian Red Crescent Medical Journal. 2009, Vol 11, No 3, pp.244-253.