Đồ án Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi hoa mười giờ ( Portulaca grandiflora. ) qua trung gian mô sẹo

nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó. Các mô và các cơ quan khác nhau của một thực vật có thể được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo như: rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn,… Vai trò của tuổi cơ quan thực vật trong sự tạo mô sẹo Tuổi của những mảnh mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo mô sẹo. Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo. Ngược lại, cây non hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin. Vai trò của ánh sáng trong quá trình tạo mô sẹo Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo. Trong đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt đối với mẫu cấy là lá. Ví dụ: Các trường hợp tạo mô sẹo trong tối như: Lá khoai tây, Lá Vitis rupestris,… Các trường hợp tạo mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng như: Lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum, mô củ khoai tây,… Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong thu nhận mô sẹo Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo. Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra: sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào. Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo. Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại và nồng độ thay đổi khác nhau tùy thuộc vào vật liệu nuôi cấy. Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin. Ví dụ: Sự tạo mô sẹo từ lá Solanum melongena xảy ra trên môi trường có bổ sung nhiều loại auxin khác nhau như: NAA; 2,4 – D; 2,4,5 – T ở các nồng độ thay đổi từ 0.1 – 10 mg/l. Tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0,5 mg/l và BAP 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo. Lá của Solanum tuberosum L. cần có sự phối hợp giữa 2,4 – D 3,0 mg/l; NAA 1,0 mg/l và Kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mô sẹo. Vai trò của auxin trong tăng trưởng của mô sẹo: mô sẹo sau khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì mô sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nếu chuyển sang môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo xảy ra rất chậm. Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ của auxin. Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong phát sinh hình thái mô sẹo: hình thái của mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Qua các thí nghiệm ghi nhận được nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi. Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện của BAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và thường không có khả năng sinh phôi. Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc. 2.2.3. Tạo mô sẹo từ lá song tử diệp Trong quá trình tạo mô sẹo từ lá song tử diệp, mô sẹo xuất hiện trước hết là ở vị trí vết cắt, kế đến xuất hiện ở vùng đáy lá, vùng giữa của lá, hay dọc theo hệ thống mạch. Mô sẹo ít được tạo ra ở vị trí ngọn lá mà thường ở đó chỉ có sự phân hóa rễ, sự phân hóa rễ cũng xảy ra ở vị trí cuống lá để ngăn chặn sự lão suy của lá. 2.2.4. Môi trường nuôi cấy mô sẹo Sự đáp ứng của những mẫu cấy, việc cung cấp tất cả các nguyên tố khác ở mức độ tối thích phụ thuộc phần lớn vào nồng độ auxin và cytokinin. Sự đáp ứng của mẫu phụ thuộc vào cả hai lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh và ngoại sinh. Auxin thường được sử dụng để khởi đầu và duy trì mô sẹo gồm IAA (10-10 ÷ 10-5M) và NAA (10-10 ÷ 10-5M). Một vài mô không thể tạo được mô sẹo khi chỉ có tác dụng của auxin mà đòi hỏi cả sự có mặt của cytokinin. Để duy trì mô sẹo đòi hỏi cần phải có sự hiện diện của các amino acid khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Các amino acid thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là glycine, arginine hoặc hỗn hợp các amino acid như trong casein hydrolysate. Mô sẹo thường tăng trưởng trong môi trường đặc còn môi trường lỏng thì đôi khi cũng được sử dụng. Trước đây, người ta đã làm nhiều thí nghiệm tạo mô sẹo trên môi trường đặc có agar, gelatine hoặc silicagen. Hiện tại có những dạng xác định của acrylamide gel được dùng để làm đặc môi trường. Agar là chất làm đặc môi trường thông dụng nhất và được sử dụng với nồng độ 8 ÷ 10 g/l. Một thuận tiện khi sử dụng agar để làm đặc môi trường là khi cho vào trong nước thì nó trở thành dạng gel, sẽ lỏng ra ở 100oC và đặc lại ở 45oC. Đặc điểm này giúp cho môi trường agar ổn định trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy mẫu. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất hiện diện trong môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi enzyme. Nuôi cấy trên môi trường đặc đôi khi cũng có những bất lợi, do đó người ta cũng sử dụng môi trường lỏng để nuôi cấy. Ví dụ như khi nuôi trên môi trường đặc thì chỉ có một phần của mô sẹo tiếp xúc với môi trường nuôi cấy do đó sự tăng trưởng của mô sẹo sẽ không đều do gradient các khoáng chất, sự trao đổi khí và sự tiết ra các sản phẩm có độc tính ra môi trường từ mô sẹo. Đồng thời sự phân phối ánh sáng lên toàn bộ khối mô sẹo không đều sẽ làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của mô sẹo. Sự tăng trưởng của mô sẹo sẽ bị giới hạn ở mặt tiếp xúc với môi trường. Cuối cùng, mô sẹo tăng trưởng trên môi trường đặc khi được chuyển qua môi trường lỏng thì không thể tránh khỏi sự xáo trộn bên trong mô. Bên cạnh những hạn chế này thì việc tạo mô sẹo trên môi trường đặc vẫn là phương pháp được lựa chọn để duy trì việc tạo mô sẹo. Việc nuôi cấy mô sẹo ổn định trong môi trường lỏng không lắc có những thuận lợi là những hợp chất cản tiết ra từ mẫu cấy sẽ phân tán trong môi trường chứ không cố định quanh mẫu như trong môi trường đặc. Phương pháp nuôi cấy tăng trưởng này dành riêng cho sự nuôi dưỡng khoáng. Mô sẹo được đặt trên một tờ giấy lọc trong một đĩa petri trên bề mặt môi trường. Giấy lọc sẽ hút môi trường cung cấp cho mô đồng thời cũng giúp mô tiếp xúc tốt với không khí. 2.2.5. Cấy chuyển mô sẹo Mô sẹo thường được chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới theo từng giai đoạn. Sự tăng trưởng của mẫu cấy sẽ làm tích tụ các sản phẩm thải, cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và môi trường bị khô nước. Mẫu được nuôi ở 25oC thì nên được cấy chuyển sau mỗi 4 – 6 tuần. Hầu hết mô sẹo nuôi cấy đều đòi hỏi phải được phân cắt thường xuyên và đặt các mặt cắt úp trên môi trường mới trừ khi mô sẹo đang ở giai đoạn đầu của sự tăng trưởng. Các mẫu mô sẹo tươi tốt không được cắt ra quá nhỏ, nếu không thì nó không thể sống được khi được chuyển sang môi trường mới. Nếu như cứ nuôi mãi mà không tách ra và cấy chuyền thì mô sẹo sẽ bị hoại tử và chết. Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trưởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi. Đây là những mô chắc và dễ tái sinh hơn mô không sinh phôi. 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa mười giờ 2.3.1. Các đặc điểm của cây hoa mười giờ Cây hoa mười giờ có nguồn gốc Nam Mỹ, nhưng được trồng rộng rãi trong các khu vực ôn đới. Tại Việt Nam hoa mười giờ được trồng trong vườn hay làm cảnh. Đây là loài cây thích hợp với những chỗ đất ráo nước và nhiều nắng. Hoa mười giờ thuộc họ rau sam là một họ trong thực vật có hoa, bên cạnh hoa mười giờ thì còn có 500 loài khác thuộc họ rau sam đều là những cây thân thảo hay cây bụi nhỏ. Theo tạp chí Birds & Blooms, ngày 1 tháng 6 năm 2006 thì "nó được đưa vào các khu vườn của châu Âu khoảng 300 năm trước và nhanh chóng thu được sự phổ biến vì các tính chất y học của nó. Cây mười giờ có khả năng chữa một số bệnh trong y học như: bệnh co thắt cơ, làm dịu vết bỏng do thuốc súng, làm mất tiếng nghiến răng, bệnh viêm họng, bệnh chàm, ghẻ, mụn nhọt,… Trong họ rau sam còn có cây rau sam trông nó gần giống với cây hoa mười giờ, cũng là loài cây dễ mọc và có rất nhiều tác dụng trong y học như làm lành vết thương, chống lão hóa, tác dụng diệt khuẩn, giúp làm gia tăng sự co bóp của tử cung, có tác dụng diệt giun móc, giun kim, điều trị bệnh goute, phòng ngừa bệnh tim mạch, trị mụn trứng cá,…; các tác dụng đó đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên một số động vật như chuột, chó, thỏ và cũng đã thử nghiệm trên một số bệnh nhân. Mặc dù chỉ là những loài cây thân thảo rất phổ biến và dễ trồng nhưng chúng có rất nhiều tác dụng tốt đối với con người mà nhiều loài cây khác không có. Một số bài thuốc thông thường chữa bệnh bằng hoa mười giờ: Đau họng: nghiền cây và chiết dịch, lấy một lượng nhỏ dùng ngậm. Chàm, đinh nhọt: nghiền cây tươi đắp ngoài. Một số bài thuốc thông thường chữa bệnh bằng rau sam: Trừ giun kim: rau sam tươi 50g, rửa sạch, thêm ít muối, giã nát, vắt lấy nước, uống liên tiếp 3 – 5 ngày, có thể thêm ít đường cho dễ uống. Tẩy giun móc: rau sam tươi 300g giã vắt lấy nước nấu lên thêm ít muối hoặc đường, ngày uống 2 lần khi đói, uống trong 3 ngày. Trị mụn trứng cá: rau sam tươi khoảng 30 – 50g, rửa sạch, giã nhỏ lấy nước cốt để riêng, bã để riêng, rửa mặt sạch và lau khô, dùng bông y tế thấm nước cốt rau sam bôi lên mặt mụn, bôi nhiều lần trong ngày, cứ khô là bôi tiếp, vào buổi trưa hoặc tối có thể đắp xác và nước cốt rau sam lên mặt như thế không những các nốt mụn sẽ lặn dần mà còn đem lại cảm giác dễ chịu. Hình 2.1. Hoa mười giờ 2.3.1.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Caryophyllales Họ: Portulacaceae Chi: Portulaca Loài: P. grandiflora 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái Hoa mười giờ hay còn được gọi là rau sam hoa lớn, nó được gọi là mười giờ vì hoa của nó thường chỉ nở từ khoảng 8 – 10 giờ sáng trong ngày. Là loại cây thân thảo, có những đặc điểm hình thái như sau: Thân: mọng nước, nhỏ, có nhiều nhánh và lớn nhanh, thân cao khoảng 10 – 15 cm. Thân có màu hồng nhạt. Lá: hình trụ, hơi dẹt, dài 1.5 – 2.0 cm, lá có màu xanh nhạt Hoa: có nhiều màu sắc sặc sỡ như đỏ, cam, hồng, trắng hay vàng. Hoa to, thường mọc ở đỉnh, có đường kính từ 3 – 4 cm. 2.3.2. Một số nghiên cứu đã được tiến hành Năm 2006, một nhóm sinh viên của Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh (nhóm sinh viên gồm Nguyễn Sĩ Tuấn, Du Ngọc Yến, Hà Bảo Ngọc, Hứa Mỹ Ngọc và Nguyễn Thanh Mai) đã nghiên cứu thành công nuôi cấy mô cây mười giờ và cho ra hoa trong ống nghiệm, đã có thể cho cây tượng nụ và ra hoa trong khoảng thời gian 1 tháng nuôi cấy và hoa có thể tươi 2 ngày kể từ khi nụ hé nở. Năm 2000, Trung tâm nghiên cứu Bhabha Atomic, Mumbai 400 085, Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu dùng GA3 thay đổi màu sắc và kích thước hoa mười giờ, màu hoa được thay đổi từ đỏ sang trắng hoàn toàn hoặc nửa trắng nửa đỏ tùy vào lượng GA3 bổ sung, kích thước hoa tăng từ 20 – 40%. Hình 2.2. Các loại hoa mười giờ Chương 3: Vật liệu và phương pháp Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2009 tại phòng thí nghiệm thực vật trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính được sử dụng trong nghiên cứu là cây hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) được bán ở các nhà vườn. Nguồn mẫu được sử dụng là đốt thân hoa mười giờ được chọn để cấy tạo nguồn mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Đốt thân hoa mười giờ được chọn phải to, khỏe, tươi, thân có màu hồng nhạt. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, kệ đặt bình, đèn neon,… Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, chai nước biển 500ml, đĩa thủy tinh, đèn cồn, đũa thủy tinh. Các loại môi trường nuôi cấy Môi trường sử dụng là môi trường muối khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962), có bổ sung thêm đường sucrose (30g/l), agar (10g/l) và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tùy theo mục đích của từng thí nghiệm mà môi trường có thể bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau. Môi trường sau khi được bổ sung đầy đủ các chất cần thiết thì được điều chỉnh về pH = 5.7 ± 0.05 (bằng KOH 1N và HCl 1N) trước khi hấp khử trùng bằng autoclave ở 1atm, 121oC trong 30 phút. Điều kiện nuôi cấy ở phòng nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày Cường độ chiếu sáng: 2500 lux Nhiệt độ: 25oC Khử trùng mẫu Mẫu thân sau khi được cắt ra thì cắt bỏ hết lá, cắt thành từng đoạn khoảng 3cm rồi khử trùng theo các bước sau: Khử trùng sơ bộ Mẫu đốt thân được cho vào một cái cốc đặt dưới vòi nước chảy khoảng 30 phút để loại bỏ bớt sự nhiễm bẩn bề mặt. Rửa kỹ từng đốt thân trong nước rửa chén sunlight pha loãng. Rửa sạch lại bằng nước máy khoảng 3 – 4 lần rồi đưa vào tủ cấy. Khử trùng mẫu trong tủ cấy Chuyển mẫu đốt thân từ cốc sang một erlen đã được hấp khử trùng. Cho dung dịch Javel (NaOCl) 7% có bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween 20 vào erlen rồi lắc khử trùng mẫu đốt thân trong các khoảng thời gian khác nhau. Rửa sạch mẫu lại bằng nước cất vô trùng khoảng 3 – 4 lần. Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung thêm Tween 20 Mục đích thí nghiệm Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy đốt thân để tìm ra thời gian khử trùng cho tỉ lệ nhiễm và chết thấp nhất để mẫu cấy vẫn có khả năng tăng trưởng và phát triển để có nguồn mẫu thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành thí nghiệm Mẫu sau khi thu nhận được khử trùng sơ bộ và đưa vào tủ cấy, tiến hành khử trùng bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung Tween 20 với các khoảng thời gian lần lượt như trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung thêm Tween 20 Nghiệm thức Nồng độ Natri hypochlorit (%) Thời gian (phút) 1 7 5 2 7 7 3 7 10 4 7 15 Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ nhiễm của mẫu cấy ứng với các khoảng thời gian khử trùng khác nhau. Ghi nhận kết quả và chọn thời gian khử trùng có tỉ lệ mẫu cấy nhiễm ít nhất đồng thời tỉ lệ mẫu sống sót phải cao để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo. Tiến hành thí nghiệm Mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ sau khi khử trùng, cắt bỏ hai đầu của đốt thân có màu trắng đục do tác động của chất khử trùng và cắt đốt khoảng 0.5cm để nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 10 g/l agar và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật như trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Kinetine (mg/l) A0 - - - A1 0.1 0.1 - A2 0.25 0.25 - A3 0.5 0.5 - A4 0.1 - 0.1 A5 0.25 - 0.25 A6 0.5 - 0.5 Sau 4 tuần, ghi nhận sự phát sinh mô sẹo của mẫu cấy. Đánh giá hình thái của mô sẹo ở từng nồng độ khác nhau. Cân để xác định trọng lượng mô sẹo ở từng mẫu. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát màu sắc, hình dạng, đặc điểm, trọng lượng của mô sẹo phát sinh sau 4 tuần theo dõi. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ các dòng mô sẹo khác nhau. Mục đích thí nghiệm Đánh giá khả năng tái sinh chồi từ hai dòng mô sẹo khác nhau trên cùng một môi trường. Tiến hành thí nghiệm Các dòng mô sẹo thu được ở thí nghiệm 2 được cấy chuyển vào môi trường bổ sung IBA và BA hoặc Kinetin nhưng với tỉ lệ cytokinin cao hơn (tỉ lệ auxin:cytokinin = 1:5) để đánh giá khả năng tái sinh chồi từ các dòng mô sẹo khác nhau. Bảng 3.3. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Kinetine (mg/l) Auxin/cytokinin B0 - - - - B1 0.1 0.5 - 1:5 B2 0.1 - 0.5 1:5 Sau 4 tuần, ghi nhận hình thái mô sẹo, khả năng tái sinh chồi ở hai dòng mô sẹo khác nhau. Chọn dòng mô sẹo có khả năng tái sinh chồi tốt nhất để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát khả năng tái sinh chồi, đếm số lượng chồi, đo chiều cao chồi, hình thái chồi. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Mục đích thí nghiệm Đánh giá khả năng tái sinh chồi của dòng mô sẹo từ thí nghiệm trên khi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất kích thích tăng trưởng IBA và BA ở các nồng độ khác nhau. Tiến hành thí nghiệm Từ thí nghiệm 3, chọn dòng mô sẹo có khả năng tái sinh chồi tốt nhất và nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau như trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Môi trường khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo ở các nồng độ khác nhau Ký hiệu IBA (mg/l) BA (mg/l) Auxin/cytokinin C1 0.1 0.25 1:2.5 C2 0.1 0.5 1:5 C3 0.1 0.75 1:7.5 C4 0.1 1.0 1:10 C5 0.25 0.5 1:2 C6 0.25 0.75 1:3 C7 0.25 1.0 1:4 C8 0.25 1.25 1:5 Sau 4 tuần, ghi nhận khả năng tái sinh chồi của mô sẹo trên môi trường có bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau, tiến hành đếm số lượng chồi thu được và đo chiều cao chồi. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát khả năng tái sinh chồi, đặc điểm chồi, số lượng chồi thu được, đo chiều cao chồi. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các số liệu sau khi được đo đạc, tính toán ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được phân tích, xử lý thống kê bằng chương trình MS – EXCEL biểu diễn dưới dạng trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn và xử lý bằng chương trình Statgraphics. Chương 4: Kết quả - Thảo luận 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu đốt thân hoa mười giờ bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung thêm Tween 20 Mẫu đốt thân hoa mười giờ sau khi được khử trùng sơ bộ bên ngoài dưới vòi nước chảy và nước rửa chén sunlight pha loãng sẽ được đưa vào tủ cấy để tiến hành khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung vài giọt Tween 20 với các khoảng thời gian khác nhau. Mẫu đốt thân sau khi khử trùng sẽ được cắt bỏ hai đầu của đốt thân có màu trắng đục do tác dụng của chất khử trùng, sau đó cắt từng đoạn ngắn khoảng 0.5cm và cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA. Tỉ lệ mẫu nhiễm được ghi nhận sau 1 tuần nuôi cấy và trình bày trong bảng 4.1 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu sống (%) 5 7 10 15 10.4c (*) 4.2b 0a 0a 0a 35.4b 43.75c 68.75d 89.6a 60.4b 56.25b 31.25c Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Từ bảng kết quả cho thấy thời gian khử trùng ở 5 phút thì tỉ lệ mẫu bị nhiễm cao (10,4%) so với các khoảng thời gian khác nhưng mẫu không bị chết. Ở thời gian 10 và 15 phút thì tỉ lệ mẫu chết lại cao (tương ứng là 43,75% và 68,75%), ở 15 phút mẫu chết khá nhiều vì để mẫu lâu trong dung dịch Javel 7% thì mẫu cấy bị tổn thương và dẫn đến chết mẫu cấy sau đó. Do đó thời gian khử trùng tốt nhất đối với mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ là 5 phút với Javel 7% có bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween 20. Khi tiến hành nuôi cấy mô thực vật thì vấn đề quan trọng nhất là phải tạo được nguồn mẫu ban đầu đảm bảo vô trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy đốt thân hoa mười giờ đảm bảo vô trùng và vẫn có khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho các thí nghiệm tiếp theo. Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng trong quá trình nuôi cấy như từ mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin rất thích hợp cho các loài nấm và vi khuẩn phát triển, tốc độ phát triển của nấm và vi khuẩn rất nhanh so với tế bào thực vật nên rất dễ nhiễm nấm hay vi khuẩn và tốc độ lan truyền rất nhanh gây ảnh hưởng lớn đến mẫu hoặc thường gây chết mẫu. Nếu nhiễm vi khuẩn thì sẽ thấy trên bề mặt lớp môi trường có một lớp màng mỏng có màu trắng đục, màu vàng, hồng, cam,… Những loại vi khuẩn thường gặp ở mô thực vật là: Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Xanthomonas,… Nếu nhiễm nấm thì thường thấy một lớp dày trên bề mặt lớp môi trường có màu xanh, nâu, xám, trắng, đen,… Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mô và môi trường cấy thì đây là nhiễm do mô cấy. Nếu sự nhiễm đi từ một điểm bất kỳ nào đó trong môi trường thì nguồn nhiễm có thể do không khí hoặc sự khử trùng môi trường không tốt hoặc do nhiễm từ không khí xung quanh. (Dương Công Kiên, 2002). Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử trùng bằng nhiệt độ cao mà mẫu phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó, mẫu cấy phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng như: Hypoclorite calcium Ca(OCl)2, Hypochlorite sodium NaOCl, Clorur thủy ngân HgCl2, H2O2,… Ở đây sử dụng dung dịch Javel 7% (Hypochlorite sodium). Các chất khử trùng phải ức chế hoặc phá hủy sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hiệu lực của các chất khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy và có độc tính thấp đối với mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì ta có thể thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật do vậy bề mặt tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Cơ chế tác động của chất khử trùng là: phá hủy lớp màng phospholipid, phân hủy lipid và acid béo, hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật; gây oxy hóa ức chế không thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo Tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2 và 4.3 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh mô sẹo Môi trường Trọng lượng mô sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l BA 0.4752b (*) 0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l BA 1.0160b 0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 1.6637a Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Bảng 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với Kinetine lên sự phát sinh mô sẹo Môi trường Trọng lượng mô sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l Kinetine 0.0953b (*) 0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l Kinetine 0.0963b 0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine 0.1608a Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Các mẫu cấy trong môi trường MS không bổ sung chất kích thích tăng trưởng thì mẫu cấy chỉ kéo dài ra sau đó đen dần và chết. Các loại auxin và cytokinin khác nhau có tương tác khác nhau. Do đó, ảnh hưởng của chúng lên mẫu cấy cũng khác nhau. Trong môi trường MS có bổ sung thêm IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine dù ở nồng độ nào thì vẫn hình thành mô sẹo nhưng loại cytokinin khác nhau thì cho loại mô sẹo khác nhau. Nếu là IBA kết hợp với BA thì hình thành loại mô sẹo đặc, có màu trắng vàng và nâu nhạt, xốp bông, mô sẹo phát triển nhanh. Còn IBA kết hợp với Kinetine thì hình thành loại mô sẹo cứng, có màu nâu đen, ít hoặc ko xốp, mô sẹo phát triển chậm. Điều này cũng được chứng minh bởi Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi. Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần, cũng như nồng độ của auxin (Bonner và Galston, 1959; De Garcia và Martnez, 1995; Grant và Fuller, 1968). Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Ceriani và cộng sự, 1992). Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo (Ahloowalia, 1991; Komamin và cộng sự, 1992; Liu và cộng sự, 1993; Zimmerman, 1993). Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987). Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo (Torres, 1989). Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Đối với cây hoa mười giờ cũng là cây thuộc nhóm song tử diệp nên môi trường nuôi cấy có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là rất cần thiết cho cây để tạo mô sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu trên tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0.5 mg/l và BA 1.0 mg/l để có thể tạo mô sẹo ; lá của Solanum tuberosum L. cần có sự phối hợp giữa 2,4-D 3.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và kinetine 0.2 mg/l cho sự tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Có một số công trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey,1977 trên mô rễ cây đậu nành, ghi nhận có sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu môi trường chỉ có auxin thì hàm lượng DNA được ghi nhận là không thay đổi. Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau một thời gian nuôi cấy, nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hoàng Anh, 2000). Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy (Pal, Banerjee và Dhar, 1985). Do vậy, việc chọn lựa ở cơ quan để tiến hành cấy vô mẫu ban đầu là rất quan trọng, ở thí nghiệm này mẫu cấy được chọn là những đốt thân còn non ở cây tươi, khỏe, kết quả thu được sau khi vô mẫu là mô sẹo để tiến hành thí nghiệm 3. 3 2 1 Hình 4.1. Mô sẹo ở môi trường có bổ sung IBA kết hợp với BA [1]: Môi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA [2]: Môi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l BA [3]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA 3 2 1 Hình 4.2. Mô sẹo ở môi trường có bổ sung IBA kết hợp với Kinetine [1]: Môi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l Kinetine [2]: Môi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l Kinetine [3]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l Kinetine Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000). Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa). Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987). Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin để cho ra mô sẹo. Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Hunault, 1979). Khi đặt trong môi trường, các mẫu cấy sẽ phồng ra, dày lên do sự hấp thu nước, dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Có rất nhiều mô và cơ quan thực vật có thể được sử dụng để làm vật liệu tạo mô sẹo như: thân, lá, phát hoa, cuống lá, rễ,… (Street, 1969) ; ở thí nghiệm này sử dụng mẫu cấy là đốt thân hoa mười giờ, khi cấy vào môi trường đã bổ sung auxin và cytokinin thì mẫu cấy phồng ra và chỗ phồng đó to dần tạo thành mô sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Ochatt và Caso (1986) người ta có thể tạo được mô sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó. Mô sẹo phát sinh từ gân và cuống còn sót lại trên lá sớm hơn từ phần phiến lá gần như đồng thời với sự phát sinh mô sẹo từ thân và cuống. Điều này có thể hiểu là do gân có kiểu phân chia giống như thân và cuống (Bùi Trang Việt, 2000), mà thân, cuống (với mô vỏ) có xu hướng tạo mô sẹo hơn mô lá (Dương Công Kiên, 2003). Chọn mẫu cấy là đốt thân vì mẫu đốt thân non, có xu hướng tạo mô sẹo hơn mô lá, mô lá hoa mười giờ quá nhỏ nên khó tạo mô sẹo. Cây non (nguyên vẹn hay được cắt đoạn)hay mảnh thân non của cây trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh được áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000). Nhờ vậy trong thân non ‘Sorbone’ có thể tồn tại một lượng auxin nội sinh khá cao nên khi môi trường không chứa bất kì chất điều hòa nào, các mẫu cấy vẫn có thể tạo mô sẹo và lên chồi. Sự phát triển của mô sẹo có thể chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào và phân hóa. Ở giai đoạn phân chia, tế bào mô cấy trở về dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hóa. Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mô sẹo khác nhau và có thể hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phôi. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất kích thích tăng trưởng ở nồng độ nào cũng đều cảm ứng tạo mô sẹo, nên sử dụng môi trường nuôi cấy là 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.1 mg/l BA hoặc 0.1 mg/l Kinetine vì ở môi trường này vẫn hình thành mô sẹo mà lại tiết kiệm được lượng chất kích thích điều hòa tăng trưởng thực vật. Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần một đơn vị sẽ thu được sinh tạo mô sẹo. Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao sẽ kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1 sẽ kích thích tạo mô sẹo, từ những mô sẹo này sau đó hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp sẽ kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C xác định sự tạo cơ quan, tỉ lệ cao tạo chồi, tỉ lệ thấp tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959). 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ các dòng mô sẹo khác nhau Mục đích thí nghiệm xem xét khả năng tái sinh chồi từ các dòng mô sẹo thu được ở thí nghiệm 2 từ đó tìm ra được dòng mô sẹo có khả năng cảm ứng lượng chồi nhiều phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Hình thái mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Qua số thí nghiệm, ghi nhận nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái của mô sẹo thay đổi (Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Ở thí nghiệm 3 lượng auxin giữ nguyên còn lượng cytokinin tăng (auxin/cytokinin = 1:5) thì có sự tạo chồi từ mô sẹo. Những mô sẹo sau khi thành lập sẽ phát sinh chồi do tác động của cytokinin ngoại sinh. Vì vậy, tổng số chồi tạo ra là kết quả của cả hai quá trình phát sinh trực tiếp và gián tiếp. Tuy nhiên, sự hình thành chồi từ mô sẹo không kéo dài do hoạt tính của cytokinin giảm theo thời gian. Do đó, đến một thời điểm nào đó, mặc dù mô sẹo còn nhưng chồi không phát sinh. Lượng auxin nội sinh lúc này sẽ có tác dụng lên quá trình tạo rễ là chủ yếu. Sự dừng phát sinh chồi từ mô sẹo sẽ sớm hơn cũng như số lượng và chiều dài rễ tạo ra sẽ lớn hơn khi sử dụng cytokinin hoạt tính thấp hơn. Khả năng tái sinh chồi của 2 dòng mô sẹo được ghi nhận và trình bày trong bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh chồi từ hai dạng mô sẹo khác nhau Nghiệm thức Môi trường Số chồi trung bình Chiều cao chồi TB (cm) 1 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 12a(*) 1.24b 2 0.1 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine 9b 1.34a Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Tuy nhiên, xét về mặt hình thái thì các chồi trong môi trường có chất điều hòa khác nhau cũng rất khác nhau.Trên môi trường có bổ sung IBA và BA, mô sẹo tái sinh chồi, chồi khỏe, có thân màu hồng nhạt, ở ngọn chồi có màu trắng, chồi ra lá tươi, có màu xanh; trên môi trường có bổ sung IBA và Kinetin, mô sẹo cũng có khả năng tái sinh chồi nhưng chồi yếu, có màu hồng nhạt, đầu chồi bị đen và chồi chết dần từ ngọn xuống (Hình 4.3). Cytokinin thuận lợi cho sự phân nhánh của các chồi non của cây thân thảo. Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro. Nhóm cytokinin đẩy nhanh sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi. Các chồi đang tăng trưởng được kích thích mạnh mẽ bởi nồng độ cytokinin. Từ nhiều nghiên cứu, người ta rút ra kết luận vai trò của cytokinin trong nuôi cấy chồi: tăng sinh chồi bên, tạo chồi bất định, cản sự tạo rễ (nồng độ cytokinin cao từ 0.5 – 10 mg/l thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ, đồng thời cũng cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin). Cytokinin là một nhóm hormon thực vật đặc biệt đóng vai trò chính trong chu trình tế bào và ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển. Srinivasan và Mullin phát biểu rằng các cytokinin ngoại sinh hoạt hóa các cytokinin nội sinh đang đi lên trong mạch mộc. Sự thiếu hụt cytokinin ở thực vật sẽ làm xuất hiện các chồi bị lùn, đồng thời các đỉnh sinh trưởng nhỏ lại, ti thể và lạp thể kéo dài ra, sự tạo tế bào mới chỉ còn khoảng 3 – 4% so với bình thường. Ngoài ra, các đỉnh sinh trưởng rễ của các cây này phình to, phát triển nhanh hơn và có nhiều rễ nhánh hơn. Tất cả các hiện tượng trên cho thấy rằng cytokinin là một yếu tố rất quan trọng ở thực vật giúp điều hòa hoạt động và kiểm soát sự phát sinh hình thái của đỉnh sinh trưởng. Qua thí nghiệm điều khiển sự hình thành cơ quan từ đốt thân của cây thuốc lá, Skoog thấy rằng hoạt động của cytokinin có ảnh hưởng đáng kể đến ribonucleic acid (RNA), ông cho rằng cytokinin điều hòa sự hình thành cơ quan thông qua việc ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp các yếu tố sinh trưởng khác như: thiamin, auxin, ngoài ra cytokinin còn đóng vai trò như các chất điều hòa sự sinh tổng hợp protein. Qua đó thấy được một hiện tượng rất phổ biến trong sinh vât, đó là sự xuất hiện của yếu tố này làm thay đổi ngưỡng của yếu tố khác. Ảnh hưởng của cytokinin trên mô, cơ quan nuôi cấy phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài thực vật được nuôi cấy và mẫu cấy thu từ mô còn non hay mô đã trưởng thành. BA kích thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea, trong khi kinetine không có ảnh hưởng gì cả, kinetine chỉ kích thích sự tạo chồi bên trong quá trình nuôi cấy chồi Prunus và để tăng sinh chồi cần sử dụng đến BA. Qua các kết quả trên cho thấy được vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái thực vật là rất đáng kể và rất khác nhau giữa các loài. Không chỉ có thể tái sinh chồi thông qua mô sẹo mà còn có thể tái sinh chồi trực tiếp từ các cơ quan như: lá, thân, cuống lá, chồi ngủ, đế hoa, lát mỏng tế bào,… Những chồi phát sinh từ những mô trưởng thành không liên quan đến mô phân sinh ngọn gọi là chồi bất định. Về cơ bản, mọi cơ quan thực vật đều có khả năng tái sinh các mô phân sinh ngọn chồi bởi sự sinh cơ quan trực tiếp hay gián tiếp. Ở các cây hạt kín, nguồn gốc của chồi có thể là tế bào biểu bì, mô hàng rào, mô khuyết hay mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi phân hoá để tạo mới chồi thì mọi tế bào đã phân hoá đều phải được tái hoạt động. Sự tái hoạt động trong quá trình phát sinh cơ quan cần phải được cảm ứng bằng cách: gỡ hiệu ứng cản tương quan trên cây nguyên, như cắt chồi ngọn để gỡ ưu tính ngọn; hoặc dùng môi trường thích hợp cho mô cấy mô in vitro. Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cs., 2003). Kết quả này đã được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003). 2 1 Hình 4.3. Chồi được tái sinh từ 2 dòng mô sẹo trên 2 môi trường khác nhau [1]: Môi trường có bổ sung IBA và BA [2]: Môi trường có bổ sung IBA và Kinetine Trong sự khởi đầu và điều hoà sự tăng trưởng của cơ quan, chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò quan trọng. Khi nuôi cấy trên môi trường có cytokinin và auxin thì sự phát triển chồi được kích thích. Cần có một sự cân bằng về nồng độ của từng loại hormone trong từng loại mô, ở từng vị trí chuyên biệt. Khi tỷ lệ cytokinin/auxin (C/A) cao thì kích thích tạo chồi; ngược lại tỷ lệ C/A thấp thì kích thích tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000) và dựa vào thí nghiệm 2 nên ở thí nghiệm 3 cấy mẫu trên môi trường sử dụng 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.5 mg/l BA hoặc 0.5 mg/l Kinetine. Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao: kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1: kích thích tạo mô sẹo, từ những mô sẹo này sau đó hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp: kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C sẽ xác định sự tạo cơ quan: tỉ lệ cao: tạo chồi, tỉ lệ thấp: tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959). Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965), cây cải ốc biển (horse radish) (Wurm, 1960; Sastri, 1963), cây mao địa hoàng (foxglove) (Dolfus và Nicolas-Prat, 1969), Atropa belladonna (Zenkteler, 1971) và cây bông cải (Margara, 1969). Ngoài ra, sự tái sinh chồi còn phụ thuộc vào hiện tượng ưu thế ngọn và sự hình thành các mô phân sinh bên để hình thành các chồi bên mới dọc theo trục của chồi chính. Ưu thế ngọn là một hiện tượng do chồi đỉnh ức chế sự phát triển của các chồi bên nằm bên dưới. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng đến tăng trưởng và phát triển của chồi, cũng như sự ức chế mối tương quan giữa chồi đỉnh và chồi bên nằm dưới chồi đỉnh. Trong các loại chất điều hoà tăng trưởng, thì auxin và cytokinin được sử dụng để điều hoà hiện tượng ưu tính ngọn. Theo mô hình giải thích cổ điển thì: auxin được tổng hợp tại ngọn, sau đó di chuyển trong libe (hữu cực) và trong tế bào (vô cực) đến cơ quan cuối cùng là rễ. Auxin điều hoà một cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các cơ chế khác bao gồm hoạt hoá các chất điều hoà thứ cấp, điều hoà tỷ lệ A/C. Khi gia tăng hàm lượng cytokinin trong mô thì hiện tượng ưu tính ngọn bị phá vỡ sự bật chồi được kích thích bởi cytokinin; trái ngược với tác động của auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Áp dụng vào thí nghiệm này cũng sử dụng auxin (IBA) và cytokinin (BA hoặc Kinetine). BA là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật. Các loại cytokinin khác (kinetine, 2i – P, PBA và zeatin) cũng có thể được sử dụng nhưng ít hơn BA (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Kết quả thí nghiệm 3 cho thấy khi kết hợp IBA và BA thì cho số chồi nhiều, còn sự kết hợp của IBA và Kinetine thì cho số chồi ít nhưng chồi kéo dài thân. Để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo là cần số chồi để tiến hành tiếp nên tiếp tục khảo sát ở dải nồng độ khác nhau của IBA và BA để đưa ra được nồng độ thích hợp nhất cho số chồi nhiều nhất. Hầu hết những bằng chứng về nhu cầu cytokinin đặc biệt đều được thực hiện trong nuôi cấy chồi của nhiều loài thực vật khác nhau. Cytokinin sẽ hoạt hoá sự phân chia tế bào bằng cách kích thích sự tổng hợp mạnh mẽ acid nucleic, protein và các chất cần thiết cho quá trình phân chia tế bào với điều kiện có auxin kết hợp. Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein, nhưng cytokinin cản sự kéo dài tế bào. Ở giai đoạn gia tăng kích thước tế bào thì auxin có vai trò quan trọng, kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn. BA kích thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea (Vieitez, 1980) trong khi kinetine không có ảnh hưởng gì. Zeatin có khuynh hướng kích thích sự tăng trưởng của chồi chính và chỉ làm tăng nhẹ sự nảy các chồi bên. Tương tự, 2-iP và kinetine chỉ kích thích sự tạo chồi bên trong quá trình nuôi cấy chồi Prunus; và để tăng sinh chồi cần phải sử dụng đến BA (Martinelli, 1985). Ở thí nghiệm này sự kết hợp của IBA và BA cho ra chồi tốt hơn khi kết hợp giữa IBA và Kinetine. Quan sát hình thái và số lượng chồi cho thấy ở môi trường có bổ sung IBA và BA cho số lượng chồi nhiều và chồi tươi tốt, còn ở môi trường có bổ sung IBA và Kinetine chồi cao hơn nhưng số lượng chồi ít hơn và chồi có xu hướng chết. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu tiếp trên môi trường có bổ sung IBA và BA để tái sinh chồi ở nhiều nồng độ khác nhau để chọn ra nồng độ cho tỉ lệ chồi cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Vôùi muïc ñích taïo choài baát ñònh thì söï keát hôïp cuûa auxin vaø cytokinin cho keát quaû toát hôn khi söû duïng moät mình cytokinin (Vuõ Vaên Vuï, 1999). Ở thí nghiệm này sử dụng kết hợp IBA và BA với nồng độ khác nhau để tái sinh chồi từ mô sẹo nhằm thu được lượng chồi nhiều phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cộng sự, 2003), kết quả này được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr (sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003). Kết quả sau 4 tuần nghiên cứu khả năng bật chồi của mô sẹo ở môi trường bổ sung chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA ở nhiều nồng độ khác nhau được trình bày trong bảng bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh chồi Môi trường Số chồi trung bình C1 3.33b (*) C2 20.67ab C3 18b C4 22.33ab C5 20.0b C6 49.33a C7 24.33ab C8 22.67ab Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05. Trong hầu hết các trường hợp, sự hình thành chồi, rễ từ mô của những cây còn non dễ hơn là từ những cây trưởng thành. Tuổi mô ảnh hưởng đến cả số lượng chồi hình thành cũng như kích thước của chồi hay cây con. Mô trẻ cho thấy là nguồn mẫu tốt nhất cho vài nghiên cứu. Giai đoạn sinh lý của cây mẹ ảnh hưởng đến sự hình thành chồi trên mô nuôi cấy. Các chất điều hòa kích thích sự hình thành chồi đáng kể và một sự tương tác giữa khả năng tái sinh, tuổi mô và nồng độ chất điều hòa tăng trưởng tối ưu. Sự tạo chồi và rễ từ mô sẹo đòi hỏi cần phải có sự điều chỉnh lại nồng độ auxin và cytokinin cảm ứng ban đầu. Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn cytokinin hoặc khi chỉ xử lý với auxin thì rễ sẽ được hình thành. Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh sẽ là chất cản. Người ta cho rằng auxin cảm ứng sự tạo rễ là do nó cảm ứng sự tổng hợp polyamine (Friedman và cộng sự, 1985). Bởi vậy tỉ lệ giữa auxin và cytokinin ở thí nghiệm 2 và 3 có sự khác biệt rõ ràng để có thể tạo mô sẹo hay tạo chồi hay rễ từ mẫu cấy. 4 3 2 1 8 7 6 5 Hình 4.4. Chồi tái sinh trên các môi trường bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau [1]: Môi trường C1 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.25 mg/l BA [2]: Môi trường C2 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA [3]: Môi trường C3bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.75 mg/l BA [4]: Môi trường C4 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 1.0 mg/l BA [5]: Môi trường C5 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA [6]: Môi trường C6 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.75 mg/l BA [7]: Môi trường C7 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 1.0 mg/l BA [8]: Môi trường C8 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 1.25 mg/l BA Quan sát hình thái và số liệu cho thấy, khi cố định lượng IBA, thay đổi lượng BA tăng thì số chồi tăng đến một mức nhất định thì số chồi lại giảm dần, khi số chồi tăng lên thì chiều cao chồi lại giảm vì số chồi quá nhiều chồi ko thể kéo dài thân ra được. Điều này được chứng minh bởi Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2006), để kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây lá rộng, người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn II. Cách này có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy sau khoảng 4 – 6 tuần. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài. Để kích thích tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Ở môi trường có bổ sung 0.25 mg/l IBA kết hợp với 0.75 mg/l BA cho số lượng chồi cao nhất nhưng chiều cao chồi rất thấp vì số lượng chồi quá nhiều. Từ đó cho thấy chỉ có thể chọn một trong hai yếu tố là số lượng chồi hoặc chiều cao chồi, nếu muốn thu được số lượng chồi nhiều thì không thể có chồi kéo dài thân. Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn hoặc khi xử lý auxin thì rễ sẽ được hình thành. Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh là chất cản. Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Khi được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy chồi thì những hợp chất này phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi non và kích thích sự hoạt động của các chồi bên. Khi không có cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì kì giữa của chu trình tế bào sẽ bị kéo dài vì vậy người ta cho rằng cytokinin cần thiết trong sự điều hòa sinh tổng hợp protein tế bào trong sự tăng trưởng và phát triển của tế bào. Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như mô thực vật nuôi cấy in vitro. Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin. Trong thí nghiệm, việc kết hợp hai loại chất điều hòa là cytokinin và auxin cũng cho kết quả làm tăng số lượng chồi hình thành. Đặc biệt là sự kết hợp của IBA và BA cho lượng chồi hình thành khá cao. Sau khi có được số lượng chồi nhiều, chúng tôi tiến hành tách cụm chồi lớn ra thành từng cụm nhỏ và cấy chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất kích thích tăng trưởng để chồi có thể kéo dài thân và ra rễ thành cây con. Từ đây có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo như cấy chuyển sang môi trường kích thích tượng nụ và ra hoa trong ống nghiệm hoặc tiến hành giai đoạn đưa cây con ra vườn trồng. Hình 4.5. Cây con hoàn chỉnh có chồi và rễ Chương 5. Kết luận – Đề nghị 5.1. Kết luận Nhân giống in vitro hoa mười giờ là một công cụ giúp ích cho việc nghiên cứu đặc điểm sinh lý của cây, quy trình ra hoa của cây khác với những loài cây khác như thế nào và tại sao trong nuôi cấy in vitro hoa có thể tồn tại cả ngày với điều kiện hoàn toàn khác ngoài tự nhiên. Qua quá trình làm thí nghiệm tôi rút ra được một số kết luận sau: Công việc tạo nguồn mẫu vô trùng rất khó khăn vì nó ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Dung dịch Javel 7% sử dụng trong thời gian 5 phút là điều kiện thích hợp nhất để tạo được nguồn mẫu vô trùng. Chỉ cần lượng auxin và cytokinin thấp bổ sung vào môi trường MS là có thể cho mẫu hoa mười giờ cảm ứng tạo được mô sẹo. Với tỉ lệ cytokinin cao thì lại cho ra chồi từ mẫu mô sẹo cấy được. Với mỗi nồng độ chất kích thích tăng trưởng IBA và BA thì cho ra số lượng chồi và kích thước chồi khác nhau. Dựa vào môi trường tạo chồi này để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo như nhân chồi, ra rễ, kéo dài thân, cho ra hoa trong ống nghiệm đem lại giá trị kinh tế cao. 5.2. Đề nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm và thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm có hạn nên tôi xin đưa ra một số đề nghị để nghiên cứu này được hoàn thiện hơn. Nghiên cứu thêm các loại hóa chất khử trùng khác khi đưa mẫu từ bên ngoài vào. Nghiên cứu thêm mẫu cấy là lá với loại cây mười giờ có lá lớn. Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng khác lên khả năng tái sinh mô sẹo Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng khác lên khả năng tái sinh chồi. Nghiên cứu các giai đoạn tiếp theo như nhân chồi, cho cây ra rễ. Nghiên cứu cho cây tượng nụ và ra hoa trong ống nghiệm. Đưa cây in vitro ra vườn ươm, theo dõi sinh trưởng của cây hoa mười giờ trong giai đoạn vườn ươm đến khi đạt tiêu chuẩn đem trồng để xem cây in vitro có dễ trồng như cây ngoài tự nhiên không.