Đồ án Sản xuất xylanase bằng phương pháp lên men bề sâu

hân cỏ phản ứng theo điều khiển của sự tổng hợp xylanase bởi Bacillus circulans D1. Hoạt lực riêng xylanase cao nhất (U/mg sinh khối khô) đạt được ở 48 giờ cấy, trong môi trường với đường cô ban đầu 2.5 g/L (Bảng 5.2; hình 5.9A và B). Thành phần chính của sản phẩm thủy phân cỏ, chỉ ra bởi phép phân tích HPLC (dữ liệu không được biểu diễn) là glucose, xylose và arabinose, tương ứng, 0.9, 0.5 và 2.5 sau 10 phút thủy phân. Thông thường, sử dụng sản phẩm thủy phân đạt được với 10 phút thủy phân , sản lượng sinh khối và xylanase cao nhất (Hình 5.10A và bảng 5.2) quan sát được ở 48h cấy, trong môi trường với 3.0 g/L đường, khi khử đường cô ở mức thấp nhất (số liệu không được biểu diễn). Khi sử dụng môi trường chuẩn bị với sản phẩm thủy phân cỏ đạt được với 20 phút thủy phân, với đường cô 1.0, 1.5 hoặc 3.0 g/L, đỉnh cao nhất của sản lượng xylanase trước 24 giờ cấy (Hình 5.10B), lại xảy ra đồng thời với mức đường khử cô thấp hơn (số liệu không được biểu diễn). Trong môi trường với 3.0 g/L đường, sản lượng xylanase, ở 24 giờ, là cao hơn trong môi trường điều khiển. Tế bào sinh trưởng, trong môi trường được chuẩn bị với sản phẩm thủy phân nguồn gốc từ 20 phút thủy phân, là thấp hơn quan sát được trong môi trường chuẩn bị với sản phẩm thủy phân nguồn gốc từ 10 phút thủy phân (bảng 5.2) Hình 5.6: Khóa thời gian cho sinh khối (■), sản lượng xylanase (●), tổng số (▲) và nồng độ đường khử (▼) trong suốt quá trình lên men từ B.circulans D1 trong môi trường với xylan thương mại (môi trường kiểm soát) 41 Hình 5.7: (A) Sản lượng xylanase từ B.circulans D1 trong môi trường chất thủy phân bã mía; (B) 30 phút thủy phân. *: nồng độ đường ban đầu được đo như tổng đường khử Hình 5.8: (A) Sản lượng xylanase từ B.cirlulans D1 trong môi trường với xylan thương mại; (B) 30 phút thủy phân. 42 Hình 5.9: (A) Sản lượng xylanase từ B.cirlulans D1 trong môi trường với chất thủy phân cỏ; (B) 30 phút thủy phân. *: nồng độ đường ban đầu được đo như tổng đường khử Hình 5.10: Sản lượng xylanase từ B.circulans D1 trong môi trường xylan thương mại 43 Bảng 5.1: Nồng độ sinh khối và hoạt tính đặc hiệu trong quá trình lên men từ B. Curculans D1 trong môi trường chất thủy phân bã mía và trong môi trường xylan thương mại (môi trường kiểm soát) Bảng 5.2: Nồng độ sinh khối và hoạt tính đặc hiệu trong suốt quá trình lên men từ B.circulans D1 với chất thủy phân cỏ và trong môi trường với xylan thương mại (môi trường kiểm soát) 5.3 Việc sản xuất β-xylanase bằng vi sinh vật đột biến Thermomyces launuginosus MC 134 trên lõi ngô và ứng dụng của nó trong việc tẩy trắng sinh hóa bột giấy từ bã mía. (Kuttanpillai Santhosh Kumar, Ayyachamy Manimaran, Kugen Permaul and Suren Singh Department of Biotechnology and Food Technology, Faculty of Applied Sciences, Durban University of Technology, P.O. Box 1334, Durban, South Africa April 2009) Việc sản xuất các enzyme hemicellulase từ Thermomymes lanuginosus SK sử dụng xylan từ yến mạch đã được kiểm tra trong suốt quá trình nuôi cấy bề sâu. Mức độ cao việc sản xuất các xylanase ngoại bào (346 ± 10 U ml− 1) được quan sát trong ngày thứ 5, tuy nhiên mức độ các enzyme phụ là thấp. T. lanuginosus SK thêm nữa được đưa ra xem xét tính liên quan đến dự phát sinh đột biến UV và N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine. Vi sinh vật đột biến T. lanuginosus MC 134 chỉ ra sự gia tăng gấp 1.5 lần trong quá trình sản xuất xylanase trên môi trường xylan yến mạch, so với chủng dại. Sản xuất xylanase thêm nữa đạt tới mức 44 độ 3299 ± 95 U ml− 1 bằng việc sử dụng lõi ngô trong điều kiện phát triển tối thích. Sự biến đổi trong khi sản xuất xylanase được theo dõi trong thùng lên men 5l. Cũng thế, hiệu suất tẩy trắng của xylanase thô được đánh giá trên bột giấy từ bã mía, và độ sáng khoảng 46.07 ± 0.05% được theo dõi bằng việc sử dụng 50IU xylanase thô trên mỗi gram bột giấy. Độ sáng này cao hơn 3.6 điểm so với những mẫu chưa được xử ly. Các đường khử (25.78 ± 0.14 mg g− 1) và những giá trị hợp chất tìm thấy từ UV hấp thụ lignin cao hơn đáng kể trong các mẫu xylanase đã được xử ly. T. lanuginosus MC 134 có tính ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp giấy và bột giấy. 5.4 Sản xuất xylanase tốt nhất bằng cách sử dụng Penicilium janthinellum NCIM 1169: một mô hình tiếp cận căn bản. (Biochemical Engineering Journal Volume 40, Issue 2, 1 june 2008, Pages 348 – 356 Mukesh Meshram, Abhijit Kulkarni, V.K. Jayaraman, B.D. Kulkarni and S.S. Lele) Xylanase là lớp quan trọng trong công nghiệp của các enzyme hydrolytic mà phân rã xylan. Sản xuất xylanase từ canh trường nấm mốc bằng lên men bề sâu và tối ưu hóa những điều kiện hoạt động cho hoạt tính tối đa là hai mục đích của đề tài này. Penicillium janthinellum NCIM 1169 với môi trường Mandels – Weber, củ cải đường như là nguồn carbon, và dịch chiết thịt bò là nguồn nitrogen được sử dụng trong thí nghiệm. Thực hiện 41 thí nghiệm để xem xét tác động đa dạng của nguồn carbon, notrogenm pH và giống vi sinh vật lên hoạt tính của xylanase. Dữ liệu này được sử dụng để xây dựng một mô hình đầu vào/ra sử dụng hồi quy tuyến tính đa. Theo nghiên cứu với 1.63% nguồn carbon, 0.16% nguồn nitrogen, pH = 4.1, giống chiếm 5.5% , hoạt tính xylanase tối đa đạt được là 28.98 ± 1.73 U/ml. 5.5 Một số tính chất của xylanase chịu nhiệt từ chủng Aspergillus niger Z1 (G. CORAL, B. ARIKAN, M.N. ÜNALDI, H. KORKMAZ GÜVENMEZ) Nhiệt độ tối ưu Để xác định nhiệt độ tối ưu của enzyme, hoạt tính được xác định tại nhiều nhiệt độ khác nhau trong khoảng 40º - 90ºC. Nhiệt độ tối thích được quan sát là khoảng 60ºC. 45 Hình 5.11: Vùng nhiệt đô tối thích của xylanase từ Aspergillus niger Z1 pH tối thích pH tối thích được xác định trong hai hệ đệm: đệm citrate-phosphate (0.1 M acid citric, 0.2 M Na2HPO4, pH 3 – 7) và đệm tris (0.08 M Tris, 0.1 M HCl, pH 7.5 – 9). Người ta thấy rằng enzyme thể hiện hoạt tíh trong vùng pH kiềm. pH tối thích của enzyme là khoảng 7.5 Hình 5.12: Vùng pH tối thích của Aspergillus niger Z1 Tính bền nhiệt Tính bền nhiệt của enzyme được nghiên cứu bằng cách gia nhiệt enzyme tại những nhiệt độ khác nhau (40ºC - 100ºC) trong khoảng 15 phút. Enzyme được giữ bền vững tới 46 100ºC, với 49,2% hoạt tính ban đầu được giữ lại sau quá trình xử ly nhiệt tại 100ºC trong 15 phút. Hình 5.13: Tính bền nhiệt của xylanase từ Aspergillus niger Z1 47 6. Phụ lục 6.1 Giới thiệu về xylanase 6.1.1 Chức năng, diễn đạt và đa thành phần Xylanase (endo-β-1,4-xylanase, EC 3.2.1.8) tách xylan thành những oligosaccharide nhỏ hơn. Chúng là những enzyme chìa khóa cho sự phân rã xylan và khác biệt trong những đặc trưng của chúng đối với polyme xylan. Nhiều chỗ tách chỉ ở những vùng không thay thế được trong khi những cái khác có sự đòi hỏi đối với những chuỗi mạch bên trong vùng lân cận của những liên kết được tách (Coughlan và Hazlewood, 1993). Hầu như các xylanase cũng đều hoạt động trên các xylooligomer của mức độ polyme hóa nhiều hơn 2, chỉ ra sự gia tăng ái lực đối với các xylooligomer cho sự gia tăng chiều dài. Các xylanase là các enzyme loại endo mà thủy phân các liên kết bên trong xylan và hoạt động bởi cơ chế tấn công ngẫu nhiên mà tạo ra hỗn hợp các xylooligosaccharide từ polyme. Tuy nhiên, tính chất của các xylanase Aeromonas mà sản xuất chỉ duy nhất một loại oligosaccharide như một sản phẩm phản ứng từ xylan, đề xướng một cách thay đổi của sự thủy phân: một cơ chế kiểu bên ngoài từ một đầu tận cùng của polyme (Kubata và cộng sự, 1995) tương tự như cách thức tiến hành của phản ứng của enzyme cellulose ngoại trong việc phân rã cellulose (Lynd và cộng sự, 2002). Tuy nhiên, vì loại cơ chế này đầu tiên đòi hỏi sự tháo xoắn các chuỗi mạch bên của xylan, sự xảy ra của các enzyme xylanase ngoại đối với sự phân rã xylan dường như không thích hợp. Vì xylan là một polyme lớn mà không thể xâm nhập vào các tế bào, các enzyme xylanase phải được cách biệt trong môi trường ngoại bào để vươn tới và thủy phân nó. Nói chung, các enzyme xylanase được kích thích trong hệ vi sinh vật trong suốt giai đoạn phát triển của nó trên cơ chất chứa xylan. Các oligosaccharide hòa tan nhỏ được phóng thích từ xylan bởi phản ứng ở các mức độ thấp của các enzyme được sản xuất một cách cơ bản được vận chuyển trong các tế bào nơi mà chúng gây ra những biểu hiện enzyme xylanase (Kulkarmi và cộng sự, 1999). Trong nấm Cryptococcus albidus, xylobiose được xem như tác nhân tự nhiên hoặc tiền chất trực tiếp của các hợp chất mà làm thể hiện đặc tính của xylanase (Biely, 1985). Sự điều chỉnh việc tổng hợp xylanase thường được kết hợp với đặc tính của cellulase, như trong trường hợp của Aspergillus trong đó nhiều protein điều chỉnh bao gồm sự hoạt hóa sao chép XlnR và chất ức chế dị hóa carbon CreA đã được nhận dạng và xác định đặc điểm (de Vries and Visser, 2001). Mặc dù hầu hết các xylanase đều là các enzyme ngoại bào, thường được tách bởi con đường Sec-dependent, các xylanase nằm giữa thành tế bào và màng plasmit được mô tả trong một số vi khuẩn có trong dạ cỏ của động vật và trong Cellvibrio mixtus (Fontes và cộng sự, 2000). Các xylanase nằm giữa thành tế bào và màng plasmit này có thể liên quan trong việc phá vỡ các xylooligosaccharide lớn và được bảo vệ tại vị trí này khỏi protease ngoại bào. Gần đây, một xylanase tế bào chất mà có thể đại diện cho một loại enzyme mới liên quan tới sự phân giải xylan mà đã được biết rõ đặc điểm từ Paenibacillus barcinonensis (Gallardo và cộng sự, 2003). Nhìn chung với ba enzyme xylanase khác nhau được đặc điểm hóa từ Bacillus và Aeromonas, enzyme P. barcinonensis thiếu peptide đánh dấu cho vùng vận chuyển bên ngoài tế bào chất. Bốn enzyme này cấu thành một nhóm xylanase thần khiết cao mà những vai trò có mục đích của chúng là thủy phân các oligosaccharide ngắn mà kết quả thu được từ sự thủy phân xylan ngoại bào khi chúng được vận chuyển vào bên trong tế bào. Nhiều hệ vi sinh vật phân rã xylan sản xuất nhiều dạng xylanase với sự khác biệt nhưng trùng lắp những đặc trưng (Wong và Saddler, 1988). Điều này đang được minh chứng cho những chất dùng sản xuất xylanase quan trọng như Aspergillus, Trichoderma, Streptomeces và Bacillus trong số những cái khác (Beg và cộng sự, 2001; Sunna và Antranikian, 1997). Nhiều dạng khác nhau của các xylanase có thể phát sinh từ quá trình sản xuất hậu phiên mã khác nhau của cùng sản phẩm gene (Ruiz-Arribas và cộng sự, 1995), mặc 48 dù rất thường có rất nhiều xylanase – gene mã hóa đang được phân lập từ chủng vi sinh được xác định, ít nhất bốn đoạn gene xylanase được phân lập từ Fibrobacter succinogenes (Jun và cộng sự, 2003) và sáu đoạn gene xylanase đang được xác định đặc điểm trong Cellvibrio japonicus (trước đây là Pseudomonas cellulosa) (Emami và cộng sự, 2002). Sản phẩm một hệ thống đa enzyme của xylanase, trong đó mỗi enzyme có một chức năng đặc biệt, đại diện cho một khuynh hướng gặt hái sự thủy phân xylan hiệu quả. Cellulosomes được kích thích các phức đa enzyme, được tìm thấy trong các vi khuẩn kỵ khí mà làm trung gian gắn kết giữa các tế bào và thành phần cellulose để tăng cường hiệu quả của sự thủy phân cellulose và hemicellulose (Bayer và cộng sự, 2004). Chúng chứa lượng lớn các enzyme, chủ yếu trong đó là cellulase, gắn kết với nhau thông qua những tác động qua lại giữa các cặp dockerine và cohesin giới hạn vị trí trong các enzyme và trong một giàn protein không xúc tác. Các xylanase cũng được tìm thấy trong các enzyme thành phần của các cellulosome đã được biết đến nhiều nhất. Sự thủy phân xylan có thễ thiết yếu trong việc tạo ra cellulose sẵn có cho sự thủy phân enzyme, bởi vì cellulose đặt ra trạng thái gần với xylan trong gain bào thành tế bào. Bằng phép loại suy, khóa xylanosome đang được dự tính những tập hợp protein ngoại bào chủ yếu bao gồm các xylanase có trong nhiều vi khuẩn, mặc dù chúng không có những tính chất tốt như cellulosome (Beg và cộng sự, 2001; Jing và cộng sự, 2005). 6.1.2 Sự phân loại và cấu trúc phân tử Theo cấu trúc phân tử của chúng, các xylanase, giống các cellulase và các carbonhydratase khác, có thễ được phân loại thành hai loại: enzyme cấu trúc đơn và enzyme cấu trúc đa. Các enzyme xylanase của lọai đầu tiên chứa cấu trúc đơn, trong khi các xylanase đa cấu trúc có cấu trúc phân tử mà bao gồm, thêm vùng xúc tác, nhiều vùng phụ thuộc liên kết với nhau bởi các liên kết liên tục (Gilkes và cộng sự, 1991; Gilbert và Hazlewood, 1993). Những vùng này có thể gấp nếp và hoạt động độc lập và có thể làm trung gian kết lại với cellulose ( những vùng liên kết cellulose, CBD), xylan (những vùng liên kết xylan), hoặc những protein có giàn cellulosome (những vùng dokerin) hoặc chúng có thể có những chức năng mà chưa được xác định rõ như cấu trúc Fn3 (Kataeva và cộng sự, 2001) hoặc cấu trúc SLH (Ali và cộng sự, 2001). Những vùng liên kết cellulose, những vùng không xúc tác thường thấy nhất trong các xylanase, đã được xác định đặc điểm và được xếp vào nhiều nhóm loài khác nhau (Tomme và cộng sự, 1998). Chúng đẩy mạnh thành các dạng khác nhau của cellulose kết tinh hoặc không kết tinh và có thể phá vỡ những vi sợi cellulose để tạo thuận lợi cho sự phân rã bởi cellulase (Linder và Teeri, 1997). Những module mà liên kết trung gian với các xylan đã được xác định đặc điểm (Black và cộng sự, 1995). Chúng bao gồm những cấu trúc chịu nóng được xác định trước đây, được tìm thấy trong một số sinh vật ưa nhiệt (Lee và cộng sự, 1993) và cũng được tìm thấy trong các xylanase thịt lá (Blanco và cộng sự, 1999), mà xuất hiện sau đó để gia tăng liên kết đối với xylan (Sunna và cộng sự, 2000). Việc nhận biết những cấu trúc làm gia tăng liên kết đối với các carbonhydrate khác như chitin và tinh bột đã thúc đẩy module liên kết các loại carbonhydrate để nhóm tất cả các cấu trúc làm trung gian liên kết các carbonhydrate (Boraston và cộng sự, 2004). Sự không đồng nhất và bản chất phức tạp của xylan đưa đến kết quả là sự đa dạng của các xylanase với những tính chất khác biệt, sự phù hợp và những nếp gấp (Wong và cộng sự, 1998) phân loại xylanase thành hai loại tùy theo đặc điểm hóa lý: một nhóm có phân tử lượng thấp ( 30kDa) và pI acid. Mặc dù nhiều xylanase phù hợp trong những nhóm này, số lượng các xylanase được mô tả trước đây đã gia tăng rất nhiều, và hiện tại nhiều xylanase có những đặ tính trung gian được nhận biết mà không phù hợp với bất kỳ nhóm phân loại nào. Hệ thống phân loại hoàn thiện hơn được giới thiệu vào năm 1991 cho các enzyme thủy phân glycoside (EC 3.2.1.x), một nhóm các 49 enzyme mà trong đó có các xylanase, mà được dựa trên sự so sánh cấu trúc bậc một của cấu trúc xúc tác và nhóm các enzyme trong những họ của các dãy liên quan (Henrisat, 1991). Từ 30 họ được xác định vào năm 1991, sự phân loại đã được cập nhật thường xuyên với những enzyme mới phù hợp và hiện tại gồm có trên 100 họ (GH1 tới GH106) (Coutinho và Henrisat, 1999; Carbonhydrate active enzyme CAZY theo đường link mrs.fr/CAZY/). Hầu hết những họ bao gồm các enzyme với những đặc tính cơ chất giống nhau, mặc dù nhiều họ có nhiều đặc điểm và bao gồm các enzyme hoạt động trên các carbonhydrate khác nhau. Việc tìm kiếm những cấu tr1uc liên quan trong các họ khác nhau dẫn đến kết quả trong việc giới thiệu mức độ thứ bậc của sự phân loại được biết đến như là siêu họ hoặc quần hợp nhỏ. Một quần hợp nhỏ là một nhóm những họ mà được tin rằng có chung tổ tiên và chỉ ra những cấu trúc bậc ba có liên quan cùng nhau trong việc duy trì, bảo tồn những phần dư xúc tác và cơ chế xúc tác (Henrisat và Bairoch, 1996). Hình 6.1: Họ xylanase Các xylanase thường được phân loại vào các enzyme thủy phân glycoside các họ 10 (trước đây là F) và 11 (trước đây là G). hai họ này lần lượt bao gồm các xylanase của các nhóm phân tử lượng cao, pI thấp và phân tử lượng thấp, pI cao đã được đề cập trước đây; nhưng mỗi họ bao gồm nhiều xylanase khác với những đặc điểm hóa lý khác biệt rộng rãi từ hai nhóm này (Sunna và Antranikian, 1997; Beg và cộng sự, 2001). Nhóm 10 bao gồm các enzyme thủy phân cellobiose (dẫn xuất của cellulose) (exocellulases) và endo-β-1,3-xylanase so với xylanase (endo-β-1,4-xylanase) trong khi họ 11 là đơn tính chất, bao gồm các xylanase duy nhất. Một số lượng nhỏ các xylanase gần đây đã được xác định đặc điểm không xuất hiện sự tương tự phù hợp đối với họ 10 và 11. Thay vào đó, những xylanase này phơi bày những tương đồng đối vơi các enzyme thuộc họ cácenzyme thủy phân glycoside, họ 5, 7, 7 và 43. Theo đó, nhóm các họ chứa các xylanase nên được mở rộng để bao gồm những enzyme mới này (Collins và cộng sự, 2005). 6.1.3 Cấu trúc Những cấu trúc ba chiều của nhiều enzyme xylanase nguồn gốc vi khuẩn và nấm từ họ 10 và 11 đã được trình bày. Thêm vào đó, những cấu trúc tinh thể từ các xylanase mới thuộc các họ 5 và 8 được làm sáng tỏ trong những năm trở lại đây. Enzyme thủy phân glycoside các họ 5 và 10 là thành phần của quần hợp GH-A mà bao gồm 17 họ enzyme thủy phân glycoside. Mặc dù có sự khác biệt lớn vế kích thước và trình tự sắp xếp, các thành phần của quần hợp nhỏ này sở hữu một cấu trúc xúc tác khoảng 250 – 450 acid amin mà chia sẻ chung nếp gấp (α/β)s TIM – barrel và một sự bảo toàn rõ rệt của cấu trúc 3D của vị trí hoạt động (Hình 6.2a). Nhiều enzyme họ 10 được lắp ráp, chứa đựng chứa một đon vị liên kết liên kết carbonhydrate được kết nối với cấu trúc xúc tác bởi một liên kết linh động. Giới hạn, chỉ duy nhất những cấu trúc tinh thể của xylanase co chiều dài đủ được biết đến cho họ này là những cái của Xyn10A từ Streptomyces olivaceoviridis 50 (Fujimoto và cộng sự, 2000) mà biểu diễn một cấu trúc liên kết cơ chất nhỏ được liên kết bởi một vùng giàu Gly/Pro, và Xyn10C từ Cellvibrio japonicus mà sản sinh ra một đon vị liên kết carbonhydrate họ 15 (Pell và cộng sự, 2004a). Trong cả hai trường hợp, liên kết không thể trông thấy được trong những bản đồ mật độ electron. Những nỗ lực để kêt tinh các xylanase họ 10 khác trong các dạng đa cấu trúc không bị ảnh hưởng của chúng đã không thành công lâu dài, có thể là do tính lưu động của những enzyme này được phép bởi tính chất mềm dẻo, dễ uốn của các liên kết này mà liên kết với các cấu trúc. Ba cấu trúc to lớn của XynA xylanase họ 5 từ Erwinia chrysanthemi đã được trình bày (Larson và cộng sự, 2003). Enzyme này chứa một đơn vị ngắn khoảng 100 residues tại vị trí đầu C tận cùng, mà tương tự đối với những đơn vị liên kết carbonhydrate của họ 20 và được cho là để gia tăng liên kết xylan (Hình 6.2b). Sự so sánh của XynA với những cấu trúc xúc tác đã được biết đến của những họ 5 và 10 chỉ ra rằng XynA không có sự cân bằng về cấu trúc đối với họ 5 hơn nó là đới với xylanase họ 10 (Larson và cộng sự, 2003). Các xylanase họ 11 thường có những cấu trúc xúc tác của 180 – 200 residues mà gấp vào trong một tấm xoắn β được biết đến như là tấm cuộn β vòn xoắn (Hình 6.2c) và chia sẻ với cellulase họ 12, kể cả các thành phần của quần hợp GH-C. Rất thú vị là các enzyme của họ 11 đều đặc biệt hơn đối với xylan, và chúng thường không chứa những cấu trúc thêm vào, mặc dù một số mẫu về họ này như là TfxA từ Thermobifida fusca chỉ ra những cấu trúc cho liên kết cơ chất (Irwin và cộng sự, 1994). Cuối cùng, những cấu trúc của hai enzyme họ 8, một xylanase từ Pseudoalteromonas haloplanktis (Van Petegem và cộng sự, 2003) và enzyme BH2105 từ Bacillus halodurans mà thủy phân những xylooligosaccharide nhưng nó không có hoạt tính trên xylan (Honda và Kitaoka, 2004), đã được trình bày. Chúng gấp lại thành một barrel (α/α)6, có chung trong các enzyme glycosidase nghịch chuyển: các endoglucanase họ 9, các glucoamylase họ 15 và các cellobiohydrolase họ 48 (Hình 6.2d). Vị trí hoạt động của các xylanase là một khe được mở rộng ra phù hợp với phương thức hoạt động bên trong của chúng. Nó thường được biểu diễn giữa subsite bốn và bảy cho việc liên kết những vòng xylopyranose trong vùng lân cận của vị trí xúc tác. Các vị trí liên kết được đánh số theo một hướng từ vị trí xúc tác và là những số chẵn được phân chia theo một hướng của việc giảm đến tận cùng của cơ chất, mà tạo thành nhóm nghỉ (hợp chất không đường) và những số lẻ theo hướng không giảm tận cùng, mà còn lại giới hạn đối với vị trí xúc tác trong tình trạng phức sản phẩm trung gian (Hình 6.2e). Những cấu trúc tinh thể của các enzyme xylanase họ 10 và 11trong phức với các oligosaccharide và các chất ức chế đã phát hiện những thông tin chi tiết về việc làm thế nào mà trục xylan liên kết với những enzyme này (Lo Leggio và cộng sự, 2000; Sabini và cộng sự, 2001). Những dữ liệu chỉ ra rằng những phần còn lại mà hình thành subsite – 2 và – 1 được bảo toàn trong mỗi họ, trong khi một nửa hợp chất không đường có thể đặt tại những vị trí riêng biệt. 51 Hình 6.2: Cấu trúc 3 phần của xylanase và những phức của chúng với oligosaccharaide 52 Hình 6.3: Cấu trúc phân tử của một số endo-β-1,4-xylanase Những so sánh về các đặc tính xúc tác của các enzyme xylanase trong hai họ chủ yếu, 10 và 11, chỉ ra rằng các enzyme xylanase họ 10 thể hiện tính linh hoạt xúc tác nhiều hơn và đặc trưng chất nền thấp hơn các enzyme của họ 11, và cũng có thể thể hiện hoạt tính trên một số cơ chất cellulosic như aryl cellobioside (Biely và cộng sự, 1997). Thêm nữa, các enzyme xylanase họ 10 chỉ ra hoạt tính xúc tác nhiều hơn trong các xylooligosaccharide ngắn hơn là các enzyme họ 11, chỉ ra sự tồn tại của những vị trí liên kết nhỏ. Theo quan điểm này, những enzyme từ họ 10 sảm xuất những sản phẩm thủy phân nhỏ hơn từ glucuronolylan và rhodemenan (β-1,3-β-1,4 xylan), việc thủy phân thêm các oligosaccharide mà được giải phóng khỏi các polysaccharide này bởi các enzyme xylanase họ 11, và thường phân tách xylan tới mức độ lớn hơn (Kolenová và cộng sự, 2005) Sự thay thế nguyên tử trong chuỗi phân tử xylan dường như ảnh hưởng đến xylanase cách rõ rệt và xuất hiện để tạo thành trở lực không gian nghiêm trọng hơn đối với các bộ phận họ 11. Thực vậy, một trong những sự khác biệt giữa hai họ chính của xylanase là các enzyme họ 11 thủy phân những khu vực không thay thế của xylan, trong khi cácxylanase họ 10 tướng ứng của xylanase có thể tấn công vào những khu vực được phân biệt của polysaccharide. Những nghiến cứu gần đây trên Xyn10B từ Cellvibrio mixtus trong phức với các xylooligosaccharide phân biệt biểu lộ rằng hai nhóm có sự phân biệt chính của xylan là arabinose và acid 4-O-methylglucuronic, có thể điều tiết trong phần phía dưới của hợp chất có đường và không đường chọn lọc của các enzyme họ 10 (Pell và cộng sự, 2004b) (Hình 6.2e). Những cấu trúc tinh thể gần đây hơn của enzyme xylanase họ 10 từ Thermoascus aurantiacus trong phức với một cơ chất arabinofuranosyl- ferulate mà chỉ ra những tác động qua lại rộng rãi của arabinose với enzyme, do đó việc đề nghị vai trò của những chuỗi mạch bên xylan như yếu tố quyết định đặc trưng cho họ các enzyme xylanase này (Vardakou và cộng sự, 2005). 6.1.4 Cơ chế xúc tác Các enzyme thủy phân glycoside hoạt động theo hai cơ chế chủ yếu mà kết quả trong sự giữ lại mạng lưới hoặc sự nghịch đảo của hình dạng chuyển hóa (Rye và Withers, 2000; Collins và cộng sự, 2005). Các enzyme xylanase từ họ 10 và 11 xúc tác sự thủy phân bởi một cơ chế thay thế đôi với việc giữ lại hình dạng chuyển hóa. Hai gốc glutamate được bảo toàn đặt tại vị trí hoạt động thích hợp (cách nhau khoảng 5,5 Ao) là những gốc hoạt tính xúc tác. Một trong những gốc glutamate hoạt động như một chất xúc tác acid chung chung mà proton hóa oxy của glycosidic, trong khi cái thứ hai đóng vai trò như một chất cho electron mà đem đến kết quả trong việc bứt ra nhóm rời và hình thành một α-glycosyl/ enzyme trao đổi trung gian. Trong bước thứ hai, gốc xúc tác thứ nhất bay giờ có chức năng như một base chung 53 chung, lấy một proton từ một phân tử nước mà tấn công carbon chuyển hóa và thủy phân chất trung gian enzyme glycosyl. Sự thay thế thứ hai này tại carbon anomeric tạo ra một sản phẩm có cùng cấu trúc hóa học lập thể như cơ chất, do đó giữa lại cấu hình chuyển hóa (Collins và cộng sự, 2005). Cơ chế xúc tác tương tự trong các enzyme họ 5. Ngược lại, các enzyme thủy phân glycoside họ 8 hoạt động vớ sự nghịch đảo cấu hình chuyển hóa. Glutamate và aspartate được tin rằng là những gốc xúc tác. Một cái hoạt động như một chất xúc tác acid chung chung trong khi cái còn lại hoạt động như một chất xúc tác base chung chung, và cả hai đều được phân cách cụ thể trong trung tâm hoạt động bởi một khoảng cách khoảng 9,5Ao cho phép sự điều tiết giữa các phân tử nước giữa carbon chuyển đổi và base chung chung. Kết quả của cơ chế thay thế đơn, hình dạng của trung tâm chuyển đổi bị đảo ngược. Bảng 6.1: Tính chất của các enzyme xylanase từ vi khuẩn Tính chất Bacillus sp No. C-59-2 B. subtilis C-2 Streptomyces xylophagus Bacillus sp No.C-11 pHopt 6.0 – 8.0 6.0 – 6.2 6.2 7.0 topt ( oC) 60 37 – 40 55 – 60 Tính bền cặn 3.5 Điểm đẳng điện 6.3 pH bền vững 7.0 – 7.5 5.0 – 7.0 5.3 – 7.3 5.5 – 9.0 Nhiệt độ bền vững (oC) Lên đến 60 Lên đến 45 Lên đến 40 Sản phẩm vượt trội X2 > X5 > X4 Ara, X2, X3 X, X2 X, X2, X3 Tỉ lệ thủy phân tối đa (%) 40 38 Bảng 6.2: Các xylanase được sản xuất từ các chủng Baciilus alkaliphilic 54 Hình 6.3: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của xylanase Ký hiệu: ○: xylanase của E. coli HB101 mang pCX311 ●: xylanase A của Bacillus sp alkaliphilic No. C-125 Δ: xylanase N của Bacillus sp alkaliphilic No. C-125 Bảng 6.3: Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA trên hoạt tính của xylanase Đối với trường hợp các ion kim loại. dung dịch enzyme được trộn với nồng độ cuối cùng 50 nM ECTA và được thẩm tích với vùng đệm 3 HCl (pH 7.0). Sau đó các dung dịch enzyme được xử lý EDTA được tái ủ trong hỗn hợp chứa nhiều chất hóa học khác nhau (1 mM) tại 30ºC khoảng 1 giờ, sau khi hoạt tính đã được tái hoạt hóa thì được đo dưới những điều kiện thí nghiệm tiêu chuẩn (Được tái sản xuất dưới sự cho phép trừ K. Ratanakhanokchai và cộng sự. Appl. Environ. Microbiol., 65. 694 (1999)) 55 6.2 Xác định hoạt tính enzyme xylanase 6.2.1 Thí nghiệm hoạt tính enzyme của xylanase Nguyên lý xylanase Xylan + H2O Đường khử (Quy về xylose) Điều kiện: T = 30oC, pH = 4.5, A 540nm, khe sáng = 1 cm Phương pháp: dùng sắc độ kế, phương pháp so màu Thuốc thử : A. 50 mM dung dịch natri acetate CH3COONa, pH = 4.5 tại 30 oC (Chuẩn bị 50ml trong nước khử ion sử dụng natri acetate, ngậm 3 nước. Canh tới pH = 4.5 tại 30oC với 1M HCl) B. 1% (w/v) dung dịch cơ chất xylan (xylan) (Chuẩn bị 5ml trong thuốc thử A sử dụng xylan) C. 0.05% (w/v) bovine serum albumin (Enz pha loãng) (Chuẩn bị 25ml trong thuốc thử A sử dụng albumin, bovine) D. Dung dịch enzyme xylanase (Ngay lập tức trước khi sử dụng, chuẩn bị một dung dịch chứa 5 – 10 đơn vị/ ml xylanase trong thuốc thử C lạnh) E. 16 mM đồng sulfate, 1.3 M natri sulfate, 226 mM natri carbonate, 190 mM natri bicarbonate và 43 mM dung dịch tartrate kali natri (Đồng Soln)(Chuẩn bị một lít trong nước khử ion sử dụng đồng II sulfate ngậm 5 nước, natri bicarbonate, natri sulfate dạng muối khan, natri carbonate dạng muối khan và tartrate kali natri ngậm 4 nước) F. 40 mM acdi molybdic, 19 mM acid arsen và 765 mM dung dịch acid sulfuric (Ars- Mol) (Chuẩn bị một lít trong nước khử ion sử dụng acid molybdic, muối amoni ngậm 4 nước, acid arsen, muối natri và acid sulfuric) G. 1 mg/ml dung dịch xylose chuẩn (Xylose Std) (Chuẩn bị 10ml trong nước khử ion sử dụng D (+) xylose) Tiến hành Pipette ( trong ml) những thuốc thử theo đó cho vào trong vật chứa đựng thích hợp : Test Blank Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std Blank Thuốc thử B (Xylan) 1.90 1.90 …. .... …. …. .... Thuốc thử G (Xylose Std) .... .... 0.02 0.05 0.07 0.10 .... Thuốc thử C (Enz pha loãng) .... …. 1.98 1.95 1.93 1.90 2.00 Trộn bởi xoáy cuốn và cân bằng ở 30oC. Sau đó, thêm vào: Thuốc thử D (Enzyme Soln) 0.10 …. …. …. …. …. …. Thuốc thử C (Enz pha loãng) …. 0.10 …. …. …. …. …. Trộn bởi xoáy cuốn và ủ tại 30oC đến chính xác 10 phút. Sau đó thêm vào: Thuốc thử E (Đồng Soln) 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 56 Trộn bằng xoáy cuốn. Đặt một đá hoa ngang qua đỉnh của các ống và chuyển ống tới chậu nước nóng. Ủ khoảng 10 phút. Di chuyển các ống từ chậu nước nóng và để cho lạnh cho tới nhiệt độ phòng. Sau đó thêm vào: Thuốc thử F (Ars-Mol) 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 Lắc và cuốn xoáy ống cho tới khi sủi bọt thì dừng lại và bất kỳ sự có mặt của kết tủa nào cũng bị phân rã. Ly tâm để lọc. Chuyển dung dịch vào các cuvett thích hợp. Đạt đến A 540nm cho mẫu kiểm tra, mẫu trắng và mẫu tiêu chuẩn hóa, sử dụng máy đo phổ. Tính toán Đường cong tiêu chuẩn ΔA540nm Std = A540nm Std – A540nm Std mẫu trắng Chuẩn bị đường cong chuẩn bằng vẽ sơ đồ đường chuẩn ΔA540nm so với μmol xylose. Tính toán mẫu ΔA540nm mẫu = A540nm mẫu kiểm tra – A540nm Std mẫu trắng Quyết định μmol của xylose sử dụng đường cong tiêu chuẩn (μmol xylose được giải phóng)(df) Đơn vị/ml enzyme = (10) (0.1) df = nhân tố pha loãng 10 = thời gian thí nghiệm (theo phút) trên từng đơn vị xác định 0.1 = thể tích (tính theo ml) của enzyme sử dụng đơn vị/ml enzyme Đơn vị/mg rắn = mg rắn/ml enzyme đơn vị/ml enzyme Đơn vị/mg protein = mg protein/ml enzyme Xác định đơn vị Một đơn vị sẽ giải phóng 1.0 μmol đường khử được đo bởi sự cân bằng xylose từ xylan (X – 0627) trên mỗi phút tại pH = 4.5 tại 30oC. Những nồng độ thí nghiệm cuối cùng Trong một hỗn hợp phản ứng 2.00 ml, những nồng độ cuối cùng là 50 mM natri acetate, 0.95% (w/v) xylan, 0.003% (w/v) bovine serum albumin, và 0.5 – 1.0 đơn vị xylanase. Chú ý Natri sulfate, natri carbonate và natri kali tartrate hòa tan trong khoảng 500ml nước khử ion. Đồng II sulfate hòa tan trong khoảng 100ml nước khử ion và thêm vào từ 57 dung dịch phía trên để tránh sự kết tủa. Natri bicarbonate hòa tan đầu tiên trong nước khử ion và sau đó được thêm vào dung dịch phía trên. Pha loãng dung dịch tới 1 l. Nếu kết tủa hình thành, nó nên được di chuyển bằng màng lọc trước khi sử dụng. Tồn trữ trong chai hổ phách và tránh phơi trực tiếp dưới ánh sáng. Tồn trữ ở nhiệt độ phòng. Acid molybdic hòa tan trong khoảng 300ml nước khử ion Thêm acid sulfuric từ từ. Chú ý, đây là phản ứng tỏa nhiệt. Acid arsenic hòa tan trong khoang 300ml nước khử ion và được thêm vào bởi dung dịch trên. Dung dịch được pha loãng với tổng thể tích là 1 l và được ủ tại 37º khoảng 48 – 72 giờ. Nếu kết tủa hình thành, nó nên được di dời bằng màng lọc trước khi us73 dụng. Tồn trữ trong chai hổ phách và tránh phơi trực tiếp dưới ánh sáng. Tồn trữ ở nhiệt độ phòng trong miếng trùm khí. 6.2.2 Tổ chức nghiên cứu khoa học và công nghệ khối thịnh vương chung, Australia Các enzyme endo-1,4-β-D-xylanase được sản xuất bởi nấm Ceratocystis paradoxa, Celphalosphorium sacchari, Sclerotium, rolfsii, Monilia sp, Trichoderma reesei QM 9414 và C-30, Aspergillus niger, và Sporotrichum pulverulentum đã được nghiên cứu. Trong thí nghiệm xác định hoạt tính của xylanase, rất khó để tìm một cơ chất ổn định (xylan tạp) mà sẽ chỉ ra mối quan hệ tuyến tính giữa số lượng đường khử được sản xuất và thời gian thủy phân. Nhiều xylan tạp, phụ thuộc vào nguồn gốc của nó, có thể hòa tan trong nước và dịch đệm có pH 4.0 – 6.0. Tuy nhiên, những cơ chất xylan khác hòa tan ít ỏi trong nước hoặc các dịnh đệm. Ví dụ như hemicellulose B phân nhánh cao cũng có thể hòa tan trong nước. Mặt khác, hemicellulose A ít bị phân nhánh hơn và ít hòa tan trong nước. Có cơ chất xylan tạp là hòa tan được trong nước hay không thì không quan trọng thiềt lập mối quan hệ giữa hoạt tính của enzyme và thời thủy phân (ít nhất là tới 30 phút) là tuyến tính. Mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính enzyme và nồng độ enzyme cũng quan trọng. Nguyên do được tìn rằng là sự có mặt của các chất kiềm hãm trong việc pha chế enzyme (có thể là phenolic trong tự nhiên mà được giải phóng từ lignocellulose trong tiến trình phát triển của nấm). Sự kiềm hãm hoạt tính của xylanase có thể được giảm bớt trong một số vùng bằng sự cắt bỏ những chất kiềm hãm từ mội trường enzyme bằng sự hút bám của nó trên polyvinylporrolidome, nhưng thậm chí sau bước này, mối tương quan vẩn chưa là tuyến tính. Nơi nguồn nguyên liệu kìm hãm có mặt trong môi trường enzyme. Tốt nhất để pha loãng môi trường enzyme như nồng độ của chất kìm hãm là thấp, ví thế để không gây trở ngại với hoạt tính enzyme và sử dụng môi trường pha loãng để thực nghiệm hoạt tính của enzyme. Dưới những điều kiện này, vận tốc ban đầu của phản ứng nên được đo thông qua một khoảng thời gian nghỉ càng ngắn (1 – 5 phút) càng tốt. Đường khử được giải phóng trong suốt tiền trình thủy phân hemicellulose trong những điều kiện đã kể trên được đo bởi phương pháp Nelson. Sự đo lường khả năng hấp thu bức xạ được thực hiện trên máy đo quang phổ Pye Unicam SP – 550 UV – Vis được trang bị với tế bào chảy suốt. Đường cong xylose tiêu chuẩn được kiểm tra kích cỡ với D-xylose (BDH) trong vùng 0 – 180 ug/ml. Thí nghiệm được dùng cho enzyme từ T. reesei QM 9414 diễn ra như sau: Xylanase: ủ enzyme (0.1 ml dòng canh trường tế bào tự do hoặc giống như là được pha loãng thích hợp) với hemicellulose A (từ bã mía, bã củ cải đường 20mg khối lượng khô; hoặc sử dụng 0.8ml 2.5% w/v, dung dịch hemicellulose A trong 50 mM đệm citrate phosphate, pH 5.0) và đệm citrate phosphate (pH 5.5) trong thể tích cuối cùng của 1ml tại 50ºC trong 20 phút. Di chuyển phần ước số (0.1ml) pha loãng với nước nếu cần thiết, và xác định số lượng đường khử bằng phương pháp Nelson. 58 Tính toán Hoạt tính xylanase = A520 * DF * (1/X) * (1/Y)* (1/t) * (1/độ dốc) A520 là khả năng hấp thu bức xạ tại 520 nm của tổng số đường khử được sản xuất X : thể tích enzyme sử dụng Y : thể tích enzyme tiêu hóa (thủy phân) được dùng trong bài thí nghiệm về đường khử t : thời gian thủy phân (20 phút) 1/độ dốc: được quyết định từ đường cong tiêu chuẩn của A520 đối với nồng độ xylose (umol/ml) DF: tác nhân pha loãng (cũng là đối với enzyme hoặc sự pha loãng thủy phân) Hoạt tính của xylanase được biểu thị là số umol của đường khử được sản xuất trên phút của sự thủy phân trên ml của enzyme được sử dụng, nghĩa là số đơn vị quốc tế (IU) trên ml. 6.2.3 Đại học Osaka – Nhật Bản Sự phân rã của xylan bởi Baciilus pumulus IPO diễn ra như sau: Xylanase: hỗn hợp phản ứng chứa 1ml dung dịch xylan 1% trong 50 mM đệm phosphte, pH 6.5 và 0.5ml dung dịch enzyme được ủ tại 40ºC trong khoảng 40 phút. Đường khử mà được giải phóng thì được đo bằng cách thêm vào 5ml thuốc thử Somogyl, và được đun sôi torng khoảng 10 phút, được làm lạnh và chuẩn độ với 0.0025N Na2S2O3 sau khi thêm vào 1ml H2SO4 5N. Chuẩn bị xylan: đun sôi xylan (gỗ thông, Sigma No. X-3875 lô 128C – 03641) trong 50mM đệm kali phosphate, pH 6.5 cho đến khi bị phân rã kỹ. Xylosidase: dung dịch enzyme được chuẩn bị bằng cách phá vỡ tế bào bởi sóng âm tại 20MHz trong 3 phút (khoảng nghỉ 1 phút) tại 0ºC. Dịch chiết này sau đó được ly tâm với 10000g trong 10 phút và chất lỏng bề mặt được sử dụng cho thí nghiệm enzyme này. Hỗn hợp phản ứng gồm có 1ml p-nitrophenyl-β-D-xyloside 1 mg/ml (ánh sáng Koch) trong 50 nM dịch đệm phosphate, pH 7.0 và 1ml enzyme được ủ tại 37ºC trong 10 phút. Phản ứng dừng lại bằng việc thêm 2ml Na2CO3 0.4M và khả năng hấp thu bức xạ của p-nitrophenol mà được giải phóng đo tại mức 405 nm. Hoạt tính enzyme được biểu diễn là umol p-nitrophenol được giải phóng trên ml trên phút. 6.2.4 Học viện Công nghệ sinh học, Julich, FRG Endoxylanase: mẫu Aspergillus niger Thuốc thử : tất cả hóa chất (p.a) lấy từ E. Merck (Đức) Nelson A 25g Na2CO3 (dạng khan) 25g K – Na – Tartrate 200g Na2SO4 (dạng khan) 20g NaHCO3 59 Hòa tan trong khoảng 800ml H2O và pha loãng tới 1000ml. Giữ ở nhiệt độ phòng. Nelson B 15g CuSO4.5H2O trong 100ml nước chứa 2 giọt H2SO4 đậm đặc. Nelson A/B trộn 25ml Nelson A + 1ml Nelson B Nelson C 25g (NH4)6Mo7O24.4H2O / 450 ml H2O, thêm vào 21ml H2SO4 đậm đặc; trộn và thêm 3g Na2HAsO4.7H2O / 25ml Giữ ở 37ºC trong 2 ngày và giữ trong chai màu nâu tại nhiệt độ phòng. Cơ chất: đồng nhất 2% thể vẩn cảu sóng siêu âm xử lý xylan từ vỏ yến mạch (Roth, Karlsruhe, Đức) trong 0.05M đệm acetate, pH 4.6 Thực nghiệm enzyme: 1 ml thể vẩn xylan 2% + 0.9 ml đệm acetate (0.05M, pH 4.6) + 0.1 ml enzyme Mẫu trắng : 1 ml thể vẩn xylan 2% + 1 ml đệm ủ 20 phút tại 40ºC, dừng phản ứng bằng việc thêm vào 2 ml Nelson A/B, ly tâm để di chuyển xylan không bị thủy phân. Xác định đường khử : đun sôi hỗn hợp phản ứng (0.4 ml) tại 100ºC trong 20 phút, thêm 0.2 ml Nelson C, trộn và pha loãng đến 5 ml với H2O. Đo sự phân hủy tại 520 nm (Tiêu chuẩn xylose). Một đơn vị hoạt tính xylanase được xác định là số lượng enzyme mà giải phóng một umol đường khử (quy về xylose) trên phút. Khoảng tiêu chuẩn Hoạt tính (U/ml) Enzyme n X S S (%) β-xylanase 5 806 12 1.5 Bảng 6.4: Hoạt tính của xylanase trong canh trường chất lỏng bề mặt và dịch chiết tế bào tự do Hoạt tính xylanase (U/ml canh trường) Qui mô nhỏ (2 ml) Qui mô lớn (100 ml) Chất lỏng bề mặt Dich chiết tế bào tự do Chất lỏng bề mặt Dich chiết tế bào tự do APNC (XynA) 0.60 0.07 1.45 0.32 APNc 0.01 0.01 ND ND APnc 0.56 0.07 0.28 1.21 Apnc 0.77 0.05 0.38 1.48 aPNC 0.01 0.01 ND ND apNC 0.01 0.01 ND ND apnC 0.02 0.02 ND ND apnc (XynB) 0.33 0.29 0.14 1.98 ND: no data (Được tái sản xuất với sự cho phép tử M. Nishimoto và cộng sự, J. Biosci. Bioeng, 94.395 (2002)) 60 6.3 Số liệu tinh sạch enzyme 6.3.1 Tinh sạch β-xylanase từ Aspergillus Bảng 6.5: Tinh sạch β-xylanase từ Aspergillus Bước tinh sạch Thể tích (ml) Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (U mg –1)* Hiệu suất (%) Độ tinh sạch Enzyme thô (dịch lọc canh trường) 1000 50 3500 70 100 Cô đặc bằng máy siêu lọc (sau quá trình lọc thông qua một membrane giới hạn phân tử lượng 50000 sau đó qua một membrane giới hạn phân tử lượng 20000 50 30 3300 110 94 1.6 Xylanase sau khi lọc gel (độ phân đoạn Sephadex G-75) 50 12 2280 190 65 2.7 Xylanase sau khi qua sắc ky trao đổi cation (hấp phụ âm) (rửa giải từ cột carboxymethyl cellulose và polyethylene glycol 6000) 35 10.3 2100 204 60 2.9 * Người ta xác định 1 U hoạt tính đặc hiệu enzyme là lượng enzyme mà sản xuất 1 μmol đường khử quy về xylose trên phút trên mg protein thực hiện ở 60ºC và pH 5.5 (Applied and Environmental Microbiology, December 1994 American Society for Microbiology) 6.3.2 Xylanase từ Penicillium expansum Bảng 6.6: Tóm lược những giai đoạn tinh sạch từng phần xylanase của Penicillium expansum Giai đoạn Protein (μg) Hoạt tính (U) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Hiệu suất (%) Chỉ số tinh sạch Chất lỏng bề mặt 190000 50321 0.26 100 1 (NH4)2SO4 29000 20621 0.71 49.2 2.7 Lọc gel 3600 3050 0.84 5.7 3.2 Siêu lọc 2170 2600 1.19 4.8 4.5 Trao đổi ion 374 725 1.93 1.3 7.4 6.3.3 Xylanase phân lập từ Enterobacter sp MTCC 5112 Bảng 6.7: Các bước tinh sạch enzyme xylanase phân lập từ Enterobacter sp MTCC 5112 Các bước tinh sạch Hoạt tính xylanase (U) Protein (mg) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Chỉ số tinh sạch Hiệu suất (%) 61 Dịch lỏng 48360 1090 446 1 100 (NH4)2SO4 kết tủa 31360 78 3982 9 64.8 Sephadex G-20 30170 23 13020 29 62.3 DEAE Sepharose FF 20900 8 26050 58 43.2 CM Sepharose FF 17170 3.8 44940 100 35.5 6.3.4 Xylanase tù Bacillus pumilus (chủng I) Bảng 6.8: Enzyme, hiệu suất protein và chỉ số tinh sạch của Bacillus pumilus (chủng I) xylanase trong hệ thống 16 % PEG 6000/8 % K2HPO4 ngậm nước. % NaCl Hiệu suất enzyme Hiệu suất protein Chỉ số tinh sạch enzyme Đỉnh Đáy Đỉnh Đáy Đỉnh Đáy 0 64 58 37 87 1.73 0.67 3 130 45 66 16 1.96 2.90 6 56 50 82 12 0.69 4.16 9 172 46 94 16 1.85 1.25 12 41 41 114 0.8 0.36 57 6.3.5 Xylanase từ nhóm vi khuẩn EMSD5 Bảng 6.9: Tóm tắt sự tinh sạch của xylanase từ nhóm vi khuẩn EMSD5 Bước tinh sạch Hoạt tính tổng (U) Protein tổng (mg) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Hiệu suất (%) Độ tinh sạch Thô 2640 62.4 42.3 100 1 80 % (NH4)2SO4 2434 48.9 49.7 92.2 1.18 DEAE- cellulose 1720 3.5 491 65.2 11.6 6.3.6 Xylanase từ Aspergillus carneus M34 Bảng 6.10: Tóm tắt sự tinh sạch xylanase từ Aspergillus carneus M34 Bước tinh sạch Protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính đặc hiệu (U/mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%) Dịch lỏng canh trường 184.11 3043.2 16.53 1 100 Ammonium sulfate 29.1 2492.0 85.64 5.2 81.9 DEAE- Sepharose 9.7 1875.9 193.4 11.70 61.6 Sephacryl S- 200HR 3.19 784.5 245.94 14.88 25.8 62 6.3.7 Xylanase từ Thermomyces lanuginosus Bảng 6.11: Sự tinh sạch xylanase từ dịch lọc canh trường phát triển của T. lauginosus Các bước Protein (mg) Carbonhydrates Hoạt tính (IU) Hoạt tính đặc hiệu (IU mg – 1 ) Hiệu suất (%) (mg) (%)* Mẫu thô 41.1 31.3 43.2 6890 168 100 Sephadex G-20 13.1 12.8 49.5 2322 177 33.7 DEAE Sepharose (I) 6.5 0.87 11.8 1108 171 16.1 DEAE Sepharose (II) 2.8 0.34 10.9 498 179 7.2 DEAE Sepharose (III) 2.0 0.20 10.5 150 225 6.5 Sephacryl (S- 200) 1.8 < 0.04 < 2.0 382 212 5.5 * Phần trăm carbohydrate được tính căn cứ vào tổng lượng mẫu (protein và carbonhydrate) 6.4 Ứng dụng của enzyme xylanase Các enzyme thủy phân hemicellulose vi khuẩn, đặc biệt là các xylanase, có những ứng dụng quan trọng trong công nghiệp bởi vì tiềm năng to lớn của chúng để giảm bớt và làm biến đổi lignocellulose và những nguyên liệu thành tế bào rất phong phú trong sinh khối thực vật mà được sử dụng rộng rãi đa dạng trong sản xuất công nghiệp. Sự áp dụng công nghệ sinh học của các xylanase bắt đầu vào khoảng những năm 1980 bằng việc chuẩn bị thức ăn cho gia súc, sau đó mở rộng cho thực phẩm, công nghiệp dệt và công ngiệp sản xuất giấy. Sau đó việc sử dụng công nghệ sinh học của các enzyme này đã gia tăng đột ngột, bao trùm một vùng rộng lớn các ngành công nghiệp. Hiện tại, enzyme xylanase cùng với cellulase và pectinase chiếm khoảng 20% thị trường enzyme công nghiệp toàn cầu. (Polizeli và cộng sự, 2005). Xylan hiện nay có số lượng lớn trong chất thải từ công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp. Xylanase vì thế có sự gia tăng quan trọng việc chuyển hóa hữu cơ thành nguồn năng lượng của sinh khối lignocellulosic, bao gồm các gốc rắn nội, thành xylose và các đường có thể lên men khác cho việc sản xuất nhiên liệu sinh học (ethanol) (Lee, 1997). Việc chuyển hóa hữu cơ thành năng lượng của xylan thành đường xylitol chứa chất ngọt có mức năng lượng thấp là một lĩnh vực hứa hẹn mà xylanase đóng một vai trò then chốt (Polizeli và cộng sự, 2005). Các ứng dụng tiềm năng của xylanase được chứng thực ít tốt hơn nhưng thứ khác bao gồm việc sử dụng chúng như phụ gia trong việc làm sạch, tẩy sạch, trong việc chuẩn bị thể nguyên sinh thực vật, việc sản xuất các oligosaccharide hoạt động có tinh dược lý như chât chống oxy hóa, và việc sử dụng các xylanase có hoạt tính transxylosidase cho sự tồng hợp của chất giảm hoạt bề mặt mới (Bhat, 2000; Collins và cộng sự, 2005). Các xylanase được sử dụng như chất phụ gia trong thức ăn gia súc cho các động vật nhai lại, cùng với các cellulase, peactinase và nhiều enzyme phân tách polymer khác. Sự phân tách enzyme của các arabinoxylan, thường được tìm thấy như là thành phần của thức ăn gia súc, giảm độ nhớt của các nguyên liệu thô do đó làn thuận tiện cho sự chuy6ẻn động và hấp thụ của các thành tố khác của thức ăn động vật và cải thiện giá trị dinh dưỡng (Polizeli và cộng sự, 2005). Sự hợp nhất của xylanase vào thức ăn hằng ngày - mà dựa trên lúa mì hoặc lúa mạch đen - của những con gà giò để nướng đưa đến kết quả trong việc cải thiện lợi ích tăng trọng của gà con và hiệu quả chuyển hóa thức ăn của chúng (Bedford and Classen, 1992). Những cải tiến tương tự có thể đạt được cho những con heo ăn thức ăn hằng ngày dựa trên lúa mì có bổ sung xylanase và phospholipase (Diebold và cộng sự, 2005). 63 Việc ứng dụng xylanase cùng với pectinase trong công nghiệp sản xuất rượu và nước ép tạo thuận lợi cho sự chiết và phân loại sản phẩm cuối cùng (Bhat, 2000). Những enzyme này có thể gia tăng tính ổn định cơm thịt trái cây và giải phóng những tiền chất thơm. Theo những quan tâm gần đây, một chủng nấm men tái tổ hợp vắt ép một xylanase nấm, sản xuất rượu vang với chất thơm từ trái cây được gia tăng (Ganga và cộng sự, 1999). Xylanase có thể được sử dụng trong việc sản xuất bia để giảm độ nhớt và độ đục của bia, và để gia tăng tính lọc cỏ (Polizeli và cộng sự, 2005). Như là chất phụ gia nướng bánh, các xylanase phân rã hemicellulose bột mỳ kết quả trong sự phân bố lại của nước từ pentosan vào gluten., do đó đưa đến sự gia tăng thể tích bánh mì và chất lượng mẩu vụn và một hiệu quả chống sự ôi hóa (Linko và cộng sự, 1997). Điều này có thể được nâng cao hơn khi amylase đượ sử dụng kết hợp với xylanase (Monfort và cộng sự, 1996). Việc ứng dụng của xylanase trong công nghiệp của yếu hiện nay là trong công nghiệp giấy và bột giấy nơi mà việc tiền xử lý xylanase tạo thuận lợi cho việc tẩu trắng hóa học bột giấy, kết quả trong việc tạo thuận lợi về môi trường và kinh tế quan trọng thông qua các quá trình không enzyme xúc tác (Viikari và cộng sự, 1994; Baipai, 2004). Các xylanase khjông dịch chuyển trực tiếp thể màu dựa vào lignin nhưng thay vào đó phân rã mạng lưới xylan mà bẫy lignin còn lại. Sự phân rã xylan trong phức xylan – lignin hoặc tái kết tủa trong bề mặt của các sợi sau khi nâu giấy gói hàng, cho phép sự chiết lignin hiệu quả hơn bằng các chất tẩy hóa học. Việc phân tích bột giấy tỉ mỉ chỉ ra rằng sự xử lý xylanase mở ra trên bề mặt sợi ma phô bày nguyên liệu được tách riêng, tương phản với bề mặt bằng phẳng, nhẵn, cảu các sợi chưa được xử lý (Hình 6.5)(Roncero và cộng sự, 2000). Việc tẩy trắng được gia tăng bởi xylanase đem đến sự tăng tiết kiệm 20 – 25% các chất hóa học dựa trên chlorine và giảm 15 – 20% trong việc sinh ra các hợp chất chlorine hữu cơ ô nhiễm từ sự phân rã lignin ( nhóm halogen hữu cơ bám, AOX) (Viikari và cộng sự, Baipai, 2004). Việc giảm hàm lượng tác nhân tẩy trắng hóa học đòi hỏi đạt được độ trắng cảu giấy cần đạt tới đã đóng góp vào việc thay thế chlorine hợp thành bởi chlorine dioxide ô nhiễm ít hơn trong tẩy trắng liên tục chlorine thành tố tự do (ECF), hoặc thay thế hoàn toàn các hợp chất chlorine bằng các tác nhân tẩy trắng thay thế như là hydrogene peroxide và ozone trong việc tẩy trắng liên tục chlorinre tự do toàn phần (TCF). 64 Hình 6.5: Phân tích SEM của những sợi cellulose Hiệu suất tẩy trắng của các xylanase từ vi khuẩn và nấm khác nhau đang được phân tích. Mặc dù nhiều enzyme được kiểm tra có hiểu quả cao như những phương tiện tẩy trắng, những khác biệt đáng kể có thể xuất hiện phụ thuộc vào họ và những nét đặc trưng của mỗi enzyme riêng biệt (Elegir và cộng sự, 1995; Clarke và cộng sự, 1997). Sự phản ứng lại đối với việc tẩy trắng bằng công cụ enzyme có thể bị ảnh hưởng bởi điều kiện tẩy trắng, những 65 mẩu gỗ có liên quan và phương pháp nghiển nhão (Suurnakki và cộng sự, 1996; Nelson và cộng sự, 1995; Christov và cộng sự, 2000). Hiện tại, nhiều xylanase có nguồn gốc vi khuẩn co sẵn trên thị trường và được sử dụng thành công trong các phân xưởng sản xuất bột giấy (Beg và cộng sự, 2001). Trong mối tương quan tới quá trình tẩy trắng, việc xử lý xylanase có thể làm giảm nhẹ các đặc tính của bột giấy tinh chế. Trong một số trường hợp, các enzyme được xử lý bằng enzyme đòi hỏi sự khuấy trọn lớn hơn, trong khi những tính chất về độ mạnh của giấy không bị ảnh hưởng hoặc chỉ gảim nhẹ một chút (Roncero và cộng sự, 2003; Vincuna và cộng sự, 1995). Sự gảim sút về nồng độ xylan bởi việc xử lý enzyme đã được trình bày nhằm làm giảm nhẹ sự trở lại của việc hóa già và độ sáng cảu bột giấy và giấy, mà có thể chỉ ra sự bền vững được gia tăng và khuynh hướng vàng hóa ít hơn sau khi xử lý enzyme (Buchert và cộng sự, 1997). Bên cạnh xylanase, các hemicellulase khác cũng được kiểm tra như là công cụ tẩy trắng với những kết quả khác biệt. Trong số chúng, β-mannanase được chỉ ra là tạo thuận lợi cho việct tẩy trắng, loại sạch các lignin còn dư và gia tăng độ sáng của giấy, mặc dù ảnh hưởng của mannanase thường ít được tuyên bố hơn là của xylanase (Montiel và cộng sự, 1999; Bhat, 2000). Những thuận lợi trong việc tìm hiểu sự phân rã lignin đạt được những kết quả đề nghị của chiến lược khác nhau cho việc tẩy trắng, liên quan sự dịch chuyển trực tiếp lignin bằng các enzyme depolymer hóa lignin (laccase và peroxidase). Laccase từ nhiều loại nấm và từ Streptomeces đã được phân tích thành công (Bourbonnais và cộng sự, 19997; Sigoillot và cộng sự, 2005; Arias và cộng sự, 2003) trong khi một vài ví dụ về sự cải thiện độ sáng với peroxidase manganese đã được báo cáo cập nhật. Sự ứng dụng của xylanase trong công nghiệp giấy và bột giấy bị hạn chế trong việc tẩy trắng. Những kết quả tốt đạt được trong lĩnh vực này đã kích thích sự ước lượng việc sử dụng xylanase trong các giai đoạn khác của việc sản xuất giấy và bột giấy. Sự ứng dụng của các xylanase trong việc nghiền nhão cơ học, sự tháo nước bột giấy hoặc deinking của những sợi tái chế, hiện nay đang được đánh giá và những kết quả hứa hẹn đạt được dẫn đến việc mở rộng sử dụng các xylanase trong ngành công nghiệp này và vị thế quan trọng càng gia tăng cho các xylanase trên thị trường enzyme thế giới. 66 67