Đồ án Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của vi khuẩn lên men lactic để chọn chủng tiềm năng probiotic

antibiotic, 3.5 kDa, 34 amino acids, Lacticin 3147 Clostridium sp Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Streptococcus dysgalactiae Enterococcus faecalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans Lôùp I: caáu thaønh töø 2 lantibiotic, 4.2 kDa, beàn vôùi nhieät. Lactococcus lactis subsp. cremoris Lactococcin B Lactobacillus Lôùp II: khoaûng 5 kDa, phoå taùc ñoäng heïp. Lactobacillus acidphilus Acidocin CH5 Vi khuaån gram döông Lactobacillus Lôùp II: caáu thaønh töø caùc phaân töû khoái löôïng lôùn. Lactacin F Lactobacillus fermentum Enterococcus faecalis Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus helveticus Lôùp II: 6.3 kDa, 57 amino acid, chòu ñöôïc nhieät ñoä 1210C trong 15 phuùt. Lactacin B Lactobacillus debrweckii Lactobacillus helveticus Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis Lôùp III: 6.3 kDa, chòu ñöôïc nhieät, chæ ñöôïc toång hôïp khi nuoâi caáy ôû ñieàu kieän pH 5.0-6.0 Lactobacillus amylovorus Lactobin A Lactobacillus acidophilus Lactobacillus debrweckii Lôùp II: 4.8 kDa, 50 amino acid, phoå taùc ñoäng heïp. Lactobacillus casei Lactocin 705 Listeria monocytogens Lactobacillus plantarum Lôùp II: caáu thaønh töø 2 bacteriocin (moãi bacteriocin 3.4 kDA, 33 amino acid) Leuconostoc gelidum Leucocin A Lactobacillus Enterococcus faecalis Listeria moâncytogenes Lôùp II: 3.9 kDa, 37 amino acid, oån ñònh ôû pH thaáp, chòu ñöôïc 1000C ôû 20 phuùt. Leuconostoc mesenteroides Mesentericin Y105 Enterococcus faecalis Listeria monocytogenes Lôùp II: 3.8 kDa, 37 amino acid, chòu ñöôïc nhieät ñoä 600C trong 120 phuùt ôû pH 4.5 Peliococcus acidilactici Pediocin F vi khuaån gram döông Lôùp II: 4.5 kDa, thuoäc enzyme proteolytic, beàn vôùi nhieät, hoøa tan chaát höõu cô, hoaït ñoäng ôû khoaûng pH roäng. Pediocin PA-1 Listeria monocytogenes Lôùp II: 4.6 kDA, 44 amino acid. Pediocin AcH Vi khuaån gram aâm vaø gram döông Lôùp II: 4.6 kDa, 44 amino acid, phoå taùc ñoäng roäng. Pediococcus pentosaceous Pediocin A Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc Pediococcus Staphylococcus Enterococcus Listeria Clostridum Lôùp II: 2.7 kDa, thuoäc enzyme proteolytic, toàn taïi ôû 1000C trong 10 phuùt. Lactobacillus sake Lactocin S Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Lôùp I: 3.7 kDa, hoaït ñoäng ôû pH 4.5-7.5 Sakacin P Listeria monocytogenes Lôùp II: 4.4 kDa, chòu nhieät Lactobacillus curvatus Curvacin A Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Lôùp II: 4.3 kDa Lactobacillus helveticus Helveticin J Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis Lôùp III: 37 kDa, phoå taùc ñoäng heïp, giaûm hoaït ñoäng sau 30 phuùt ôû 1000C Caùc chaát coù khaû naêng khaùng khuaån khaùc Caùc LAB cuõng coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc vi sinh vaät gaây beänh thoâng qua moät soá caùc saûn phaåm bieán döôõng khaùc ngoaøi bacteriocin nhu: hydrogen peroxide, cacbon dioxide vaø diacetyl, acid höõu cô chuû yeáu laø acid lactic. Quaù trình bieán döôõng cuûa LAB coù aûnh höôûng ñeán khaû naêng khaùng laïi caùc vi sinh vaät coù haïi caùc daïng hoaït ñoäng khaùc cuûa chuùng. Ñöôïc theå hieän roõ qua baûng sau: Baûng 2.8: Kieåu hoaït ñoäng ñoái khaùng cuûa caùc saûn phaåm bieán döôõng Saûn phaåm bieán döôõng Kieåu hoaït ñoäng ñoái khaùng CO2 ÖÙc cheá quaù trình decarboxylation, giaûm tính thaám qua maøng ( khöû Carboxyl). Diacetyl Taùc ñoäng leân protein gaén arginine. Hydrogen peroxide Lactoperoxide Oxy hoùa caùc protein cô baûn. Acid lactic Acid lactic khoâng bò phaân huûy maø thaám vaøo maøng laøm giaûm pH noäi baøo. Noù cuõng lieân quan tôùi quaù trình bieán döôøng nhö: phosphoryl oxy hoùa. Vi sinh vaät chæ thò Giôùi thieäu veà vi sinh vaät chæ thò (indicator strains) Vi sinh vaät chæ thò laø nhöõng vi sinh vaät gaây beänh roái loaïn heä tieâu hoùa coù nguoàn goác thöïc phaåm. Ñeå choïn loïc Probiotic, ngöôøi ta kieåm tra khaû naêng öùc cheá cuûa caùc vi sinh vaät probiotic leân söï sinh tröôûng phaùt trieån cuûa vi sinh vaät chæ thò. Moät soá ví duï veà caùc vi sinh vaät chæ thò naøy laø: Baûng 2.9: Moät soá vi sinh vaät chæ thò ñieån hình söû duïng trong nghieân cöùu choïn loïc probiotic Vi sinh vaät chæ thò Nguoàn nghieân cöùu Bacillus cereus Clostridium perfringens Listeria spp Staphylococcus aureus Carherine B. Lewus, Thomas J. Montville, USA, 1991 Listeria monocytogenes Escherichia coli Salmonella N. Chauteu, I. Castellanos, A.M. Deschamps. France, 1992 Helicobacter pylori Clostridium difficile Campylobacter jejuni Escherichia coli J. Nowroozi, M. Mirzaii, M. Norouzi, Iran, 2004 Escherichia coli Klebsiella pneumonia Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Pediococcus acidilaticii Lactobacillus helveticus Jin-Woo Kim, S.N. Rajagopal, USA, 2001 Samonella Enteritidis Escherichia coli Clostridium perfringens Magdalena Kizerwetter-Swida, Marian Binek, Poland, 2005 Shigella dysenteriae Escherichia coli Salmonela typhi Yersinia enterocolitica V. Padmanabha Reddy, M.D. Christopher, I. Sankara Reddy, 2006 Raát nhieàu nghieân cöùu choïn Escherichia coli laø vi sinh vaät chæ thò, ñaëc bieät laø chæ thò cho nhöõng beänh lieân quan tôùi thöïc phaåm hay ñöôøng tieâu hoùa. Chính vì vaäy, ñeà taøi naøy ñaõ thöïc hieän choïn loïc probiotic baèng caùch kieåm tra söï öùc cheá sinh tröôûng cuûa probiotic leân vi khuaån chæ thò Escherichia coli. Vi khuaån chæ thò gaây beänh ñöôøng ruoät - Escherichia coli [4], [35] Ñaëc ñieåm hình daïng, nuoâi caáy vaø tính chaát sinh hoùa Vi khuaån E.coli coù nhieàu trong töï nhieân, trong ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø gia suùc. Trong ñöôøng ruoät, chuùng hieän dieän nhieàu ôû ñaïi traøng neân coøn goïi laø vi khuaån ñaïi traøng. Vi khuaån E.coli nhieãm vaøo ñaát, nöôùc… töø phaân cuûa ñoäng vaät. Chuùng trôû neân gaây beänh khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï phaùt trieån cuûa chuùng. Phaân loaïi khoa hoïc: Vöïc (Domain): Bacteria Ngaønh (Phylum): Proteobacteria Lôùp (Class): Gamma Proteobacteria Boä (Ordo): Enterobacteriales Hoï (Familia): Enterobacteriaceae Chi (Genus): Escherichia Loaøi (Species): E. coli Hình daïng: Vi khuaån thuoäc loaïi tröïc khuaån gram aâm, di ñoäng baèng tieâm mao quanh teá baøo, khoâng taïo baøo töû, loaïi coù ñoäc löïc thì coù bao nang, loaïi khoâng coù ñoäc löïc khoâng coù bao nang. Kích th öôùc trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai ñaàu troøn. Moät soá doøng coù khuaån mao (pili). Ñaëc ñieåm nuoâi caáy vaø sinh hoùa: Laø loaïi hieáu khí hay hieáu khí tuøy nghi. Nhieät ñoä thích hôïp 370C nhöng coù theå moïc treân 400C, pH 7,4. Treân moâi tröôøng thaïch dinh döôõng TSA taïo khoùm troøn öôùt (daïng S) maøu traéng ñuïc. Ñeå laâu khoùm trôû neân khoâ nhaên (daïng R). Kích thöôùc khoùm 2-3mm. Treân thaïch maùu: Coù chuûng dung huyeát aù, coù chuûng khoâng dung huyeát aù. Treân moâi tröôøng chaån ñoaùn chuyeân bieät EMB (Eozin Methyl Blue) taïo khoùm tím aùnh kim. Treân moâi tröôøng Rapid’ E.coli taïo khuaån laïc maøu tím. Treân moâi tröôøng Endo, SS taïo khoùm hoàng ñoû. Treân caùc moâi tröôøng ñöôøng: Leân men lactose sinh hôi, glucose, galactose. Leân men khoâng ñeàu saccarose vaø khoâng leân men dextrin, glycogen. Caùc phaûn öùng sinh hoùa: Indol döông tính, Methyl Red (phaûn öùng MR) döông tính, Voges-Proskauer (phaûn öùng VP) aâm tính vaø Citrat aâm tính, H2S aâm tính, , Lysine decarboxylase döông tính. E. coli 157:H7 E. coli Hình 2.10: Giôùi thieäu veà hình thaùi Escherichia coli [44], [45], [46] Ñaëc ñieåm khaùng nguyeân vaø ñoäc toá Goàm 4 loaïi khaùng nguyeân: O, K, H, F vaø noäi ñoäc toá gaây tieâu chaûy, ngoaïi ñoäc toá gaây tan huyeát vaø phuø thuûng. Ñoäc toá cuûa E.coli: Loaïi E.coli coù giaùp moâ (khaùng nguyeân K) gaây ngoä ñoä maïnh hôn loaïi khoâng giaùp moâ. Khaùng nguyeân K coù 13 loaïi KA, KB, KL. Ví duï coâng thöùc khaùng nguyeân cuûa moät E.coli laø: O55K5H21F5. Noäi ñoäc toá ñöôøng ruoät: Goàm 2 loaïi chòu nhieät vaø khoâng chòu nhieät. Caû hai loaïi naøy ñeàu gaây tieâu chaûy. Loaïi chòu nhieät ST (Thermostable): goàm caùc loaïi STa, STb. Loaïi khoâng chòu nhieät LT (Thermolabiles): goàm caùc loaïi LT1, LT2. Nhöõng doøng E.coli saûn sinh ñoäc toá (ETEC) goàm nhieàu type huyeát thanh khaùc nhau nhöng thöôøng gaëp nhaát laø caùc type O6H16, O8H9, O78H12, O157. Moät soá beänh ñieån hình do E.coli gaây ra cho gia suùc vaø gia caàm [49] Beänh gaây cho gaø Nguyeân nhaân: Do vi khuaån E.coli gaây ra. Phöông thöùc laây truyeàn: Laây qua tröùng do cô theå meï bò nhieãm beänh. Laây qua ñöôøng hoâ haáp hoaëc da, nieâm maïc. Laây qua voû tröùng do nhieãm baån töø phaân hoaëc moâi tröôøng cuûa chuoàng traïi bò nhieãm truøng. Laây qua thöùc aên, nöôùc uoáng bò nhieãm truøng.  Trieäu chöùng vaø beänh tích: Gaø con môùi nôû: Roán vieâm, öôùt, coù maøu xanh. Buïng söng to, loøng ñoû khoâng tieâu. Tieâu chaûy. Gaø con töø 1-5 tuaàn tuoåi: gaø soát cao, uoáng nhieàu nöôùc, khoù thôû, boû aên, söng maët, vieâm keát maïc maét. Vieâm maøng bao tim, vieâm maøng buïng, vieâm maøng quanh gan laøm cho bao tim ñuïc, maøng buïng coù dòch vieâm, quanh gan thöôøng phuû moät lôùp Fibrin maøu traéng ñuïc. Vieâm tuùi khí. Vieâm phoåi Gaø ñeû: giaûm tyû leä ñeû, gaø aên keùm, gaày oám daàn, moät soá con coù daáu hieäu vieâm khôùp. Moå khaùm cho thaáy: oáng daãn tröùng bò vieâm, laùch vaø gan thöôøng söng to vaø sung huyeát Vieâm maøng bao tim Vieâm maøng buïng Gan söng to sung huyeát Vieâm phoåi Hình 2.11: Aûnh höôûng do E.coli gaây ra ôû gaø [49] Beänh gaây cho heo: Beänh nhieãm truøng huyeát do E.coli ôû heo con Nguyeân nhaân : thöôøng xaûy ra ôû caùc ñaøn khoâng aám aùp, veä sinh keùm, thieáu hoaëc ít söõa ñaàu, nöôùc uoáng khoâng toát, söõa meï keùm laøm giaûm hoaëc maát nhu ñoäng ruoät, coù theå do thieáu maùu, thieáu vitamin (A, PP, B5…). Vi khuaån E.coli seõ xaâm nhaäp vaø nhaân leân trong ruoät, vaøo maùu vaø gaây nhieãm truøng maùu. Trieäu chöùng: Heo bò nhieãm beänh trong voøng 12h sau khi sanh vaø coù theå cheát trong voøng 48 giôø vôùi caùc bieåu hieän sau: Heo beänh löôøi vaän ñoäng, ñöùng rieâng ra khoûi ñaøn, uû ruõ, ñuoâi ruõ xuoáng hoâng. Ñoâi khi oùi möûa, run raåy vaø coù theå cheát sau khi hoân meâ, co giaät (tyû leä cheát coù theå 80-90%). Beänh tích: Vieâm maøng ngoaøi vaø van tim, sung huyeát thaän, laù laùch, coù theå vieâm da vaø khôùp. Beänh tieâu chaûy phaân traéng ôû heo con: Beänh thöôøng xaûy ra ôû giai ñoaïn heo con sô sinh ñeán giai ñoaïn cai. Nguyeân nhaân: Beänh xaûy ra ôû caùc ñaøn uùm khoâng ñuû aám, veä sinh chuoàng vaø thöùc aên nöôùc uoáng keùm, thieáu hoaëc ít söõa ñaàu, söõa meï keùm, thieáu maùu, thieáu vitamin. Beänh thöôøng keát hôïp nhieät ñoä quaù thaáp, möa laïnh, aåm öôùt, stress… Trieäu chöùng: Heo tieâu chaûy phaân maøu vaøng traéng, traéng xaùm, veà sau coù maøu vaøng xanh, muøi hoâi. Heo maát nöôùc, gaày suùt nhanh, buù keùm, ñi laïi khoâng vöõng vaø noân ra söõa ñoâng khoâng tieâu. Heo con beänh yeáu ñi raát nhanh neáu khoâng ñieàu trò kieäp thôøi thì heo yeáu daàn, loâng xuø vaø cheát (tyû leä cheát coù theå leân ñeán 80-90%). Beänh tích: Cô theå maát nöôùc, oám, phaân dính beát vaøo haäu moân. Maïch maùu ruoät vaø haïch ruoät sung huyeát caáp tính. Ít thaáy vieâm daï daøy ruoät xuaát huyeát, daï daøy chöùa söõa khoâng tieâu. Heo con bò tieâu chaûy phaân traéng Heo con yeáu daàn roài cheát Hình 2.12: Aûnh höôûng cuûa beänh tieâu chaûy phaân traéng leân heo con [49] Beänh phuø thuûng treân heo cai söõa: Beänh thöôøng xaûy ra treân heo cai söõa hoaëc sau cai söõa 1-3 tuaàn tuoåi. Beänh thöôøng xaûy ra treân nhöõng con lôùn nhaát ñaøn sau laây qua nhöõng con khaùc. Nguyeân nhaân: Do chuoàng traïi veä sinh khoâng toát, aåm thaáp. E.coli coù saün trong cô theå keát hôïp vôùi stress khi taùch meï thì seõ nhaân leân nhanh trong ruoät. Thay ñoåi thöùc aên ñoät ngoät, heo con khoâng coøn ñöôïc buù do ñoù seõ aên quaù nhieàu thöùc aên daãn ñeán khoâng tieâu hoùa heát thöùc aên. Söï sinh beänh: vi khuaån E.coli gaây beänh phaùt trieån trong nieâm maïc ruoät laøm saûn sinh ñoäc toá phaù huûy mao maïch daãn ñeán phuø thuûng khaép cô theå. Trieäu chöùng: Beänh thöôøng xaûy ra ñoät ngoät ôû giai ñoaïn vaøi ngaøy ñeán moät tuaàn sau cai söõa vaø treân heo lôùn troäi cuûa baày. Luùc môùi nhieãm beänh heo coù daáu hieäu keùm aên, keùm linh hoaït. Theå quaù caáp heo cheát ñoät ngoät vaø tröôùc khi cheát coù trieäu chöùng phuø. ÔÛ theå caáp tính, beänh dieãn bieán 2-3 ngaøy. Ngaøy ñaàu heo boû aên, sang ngaøy thöù 2 hoaëc ngaøy thöù 3 coù trieäu chöùng phuø. Trieäu chöùng phuø thuûng xuaát hieän chuû yeáu ôû vuøng ñaàu nhö: mí maét, vuøng haàu, goác tai, ñoâi khi söng caû maët. Phuø naõo, naõo bò cheøn eùp bôûi dòch thoaùt ra töø maïch maùu neân gaây nhuõn naõo daãn ñeán trieäu chöùng thaàn kinh nhö: co giaät kieåu bôi cheøo, ñi xieâu veïo, hay ñaâm ñaàu vaøo töôøng, ñi laïi khoâng ñònh höôùng. Do thuûy thuûng ôû thanh quaûn neân hay keâu khaøn gioáng tieáng chim. Nhieät ñoä khoâng taêng, sung huyeát ôû nieâm maïc vaø xanh tím ôû tai, moõm, choùp ñuoâi…Heo raát khoù thôû tröôùc khi cheát. Beänh tích: Vuøng môõ lieân keát döôùi da bò thuûy thuûng. Haïch vuøng beïn, haïch ruoät bò thuûy thuûng, xoang buïng chöùa dòch phuø, phuø thuûng ôû maøng trong ruoät. Thuûy thuûng mí maét, loã tai, ôû quanh tim, thanh quaûn. Baày heo beänh chæ naèm vaø coù tö theá ngoài kieåu choù Phuø thuûng ôû keát traøng vaø chöùa nhieàu dòch thuûy thuûng Xuaát huyeát ruoät non, phuø maøng treo ruoät vaø söng haïch maøng treo ruoät Hình 2.13: Aûnh höôûng cuûa beänh phuø thuûng treân heo cai söõa [49] Chöông 3: Vaät Lieäu & Phöông Phaùp Nghieân Cöùu Vaät lieäu Ñòa ñieåm thöïc hieän ñoà aùn Ñoà aùn ñöôïc thöïc hieän taïi heä thoáng phoøng thí nghieäm Khoa Moâi Tröôøng vaø Coâng Ngheä Sinh Hoïc. Tröôøng Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä Thaønh Phoá Hoà Chí Minh. Heä thoáng phoøng goàm coù: Phoøng 15: phoøng thí nghieäm hoùa Phoøng 14: phoøng thí nghieäm vi sinh Phoøng 9 : phoøng thí nghieäm thöïc vaät Gioáng vi sinh vaät Vi khuaån leân men lactic do sinh vieân Nguyeãn Thò Bích Thuøy cung caáp töø keát quaû cuûa ñoà aùn toát nghieäp khoùa 05 - lôùp 05DSH - Khoa Moâi Tröôøng vaø Coâng Ngheä Sinh Hoïc – Tröôøng ÑH Kyõ Thuaät Coâng Ngheä TPHCM: “Phaân laäp caùc vi khuaån lactic coù nguoàn goác thöïc phaåm vaø döôïc phaåm mang hoaït tính probiotic” Vi khuaån E.coli M15 ñöôïc cung caáp töø Ñaïi Hoïc Y döôïc TP HCM. Baûng 3.1: Caùc chuûng ñöôïc kieåm tra hoaït tính probiotic Sản phẩm Teân saûn phaåm Kí hieäu caùc chuûng phaân laäp Söõa chua Söõa ñeå chua töï nhieân 1 S1a, S1b Söõa ñeå chua töï nhieân 2 S2 Söõa ñeå chua töï nhieân 3 S3 Söõa ñeå chua töï nhieân 4 S4 Kefir leân men töø PTN 1 S5 Kefir leân men töø PTN 2 S6 Nem Nem 1 N1 Nem 3 N3 Nem 4 N4 Nem 5 N5 Döa muoái Döa muoái 2 D2 Döa muoái 3 D3 Caø muoái chua Caø muoái C1 Cheá phaåm döôïc Biolactyl T1a,T1b, T1c Biosubtyl DL T2c L-Bio-M T3c Lactomin plus T4c Probio T7b Ybio T8b Thaønh phaàn vi sinh trong 1 goùi cheá phaåm goàm: + L-Bio: Lactobacillus acidophilus + Biolactyl: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bungaricus, Streptococcus lactic. + L-Bio_M: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis. + Lactomin plus: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum, Streptococcus faecalis. + Antibio Granules: Lactobacillus acidophilus. + Biosubtyl DL: Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtillis. + Probio: Lactobacillus acidophilus. + Ybio: Lactobacillus acidophilus. Hoùa chaát Moâi tröôøng Moâi tröôøng Pepton Water: taêng sinh khoái vi khuaån E.coli Moâi tröôøng TSA (Tripton soya agar): giöõ gioáng vi khuaån E.coli Moâi tröôøng BHI (Brain Heart Infusion ): moâi tröôøng phaùt trieån cuûa E.coli söû duïng trong thí nghieäm thöû hoaït tính khaùng khuaån cuûa LAB BHI Broth 1000ml Beef heart infusion 250.0g Calf brain in fusion 200.0g Proteose peptone 10.0g NaCl 5.0g Na2HPO4.12H2O 2.5g Glucose 2.0g pH 7.4 ± 0.2, 250C BHI thaïch, boå sung 2% agar Moâi tröôøng MRS (DeMan, Rogosa, Sharpe) Broth: moâi tröôøng taêng sinh LAB MRS Broth 1000ml Glucose 20.0g Peptone 10.0g Beef extract 8.0g Yeast extract 4.0g CH3COONa 3.0g K2HPO4.3H2O 2,623g Mg2SO4.7H2O 0.2g MnSO4.4H2O 0.03786g Triamonium citrate 4.0g Tween 80 1ml Moâi tröôøng MRS thaïch: moâi tröôøng trong thí nghieäm thöû hoaït tính khaùng khuaån cuûa LAB: MRS loûng boå sung 2% agar. Hoùa chaát Coàn 700, 960 Caùc hoùa chaát pha moâi tröôøng dinh döôõng Duïng cuï vaø thieát bò Duïng cuï OÁng nghieäm coù naép OÁng nghieäm khoâng naép Ñóa petri Coác 50ml, 100ml, 250ml, 1000ml Erlen 250ml, 500ml Pitpet 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Pipet man 10µl-100 µl, 20 µl-200 µl, 100 µl-1000 µl Ñaàu típ 100 µl, 1000 µl OÁng ly taâm eppendorf OÁng ñuïc loã Giaáy thaám Que caáy, que gaép, que taêm boâng, que trang Thöôùc ño cm, mm Ñuõa thuûy tinh Giaù ñeå oáng nghieäm, roå nhöïa Boâng thaám nöôùc Boâng khoâng thaám nöôùc Bao nilon haáp, daây thun, giaáy goùi Thieát bò Tuû caáy vi sinh (Brlad France) Tuû uû (Memmert Germany) Tuû saáy (Memmert Germany) Tuû laïnh Toshiba Autolave (Huxky Ñaøi Loan) Maùy ño quang (Hach) Maùy ly taâm (Tuttligen Germany) Maùy ño pH (Hach-Germany) Caân phaân tích (Orbital Germany) Beáp töø (Billy – England) Maùy nöôùc caát (Branstead USA) Phöông phaùp nghieân cöùu Chuaån bò gioáng vi sinh vaät Chuaån bò gioáng vi khuaån leân men lactic: Gioáng vi khuaån leân men lactic ñöôïc cung caáp töø oáng nghieäm thaïch nghieäm MRS agar, ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh 40C. Chuaån bò moâi tröôøng: Pha moâi tröôøng MRS loûng Phoái vaøo moãi oáng nghieäm 10ml MRS loûng Ñaäy naép hoaëc laøm nuùt boâng, cho vaøo bòch haáp Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave1200C, 15 phuùt, 1 atm Nuoâi caáy LAB: Moïi thao taùc ñöôïc thöïc hieän sau khi ñaõ saùt truøng duïng cuï, tuû caáy, vaøo thaùo taùc döôùi ngoïn löûa ñeøn coàn. Laáy sinh khoái, caáy chuyeån vaøo oáng nghieäm chöùa MRS loûng. Quaán parafin quanh mieäng oáng nghieäm ñeå nuoâi caáy kò khí. Ñem uû ôû 370C töø 16-24h. Chuaån bò gioáng E.coli: Gioáng LAB ñöôïc cung caáp töø oáng nghieäm thaïch nghieäm MRS agar, ñöôïc baûo quaûn trong tuû laïnh 40C. Chuaån bò moâi tröôøng: Pha moâi tröôøng Peptone Water Phoái vaøo moãi oáng nghieäm 10ml Peptone Water. Ñaäy naép hoaëc laøm nuùt boâng, cho vaøo bòch haáp Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave1200C, 15 phuùt, 1 atm Nuoâi caáy E.coli taêng sinh khoái: Moïi thao taùc ñöôïc thöïc hieän sau khi ñaõ saùt truøng duïng cuï, tuû caáy, vaøo thaùo taùc döôùi ngoïn löûa ñeøn coàn. Laáy sinh khoái, caáy chuyeån vaøo oáng nghieäm chöùa Peptone Water. Ñem uû hieáu khí 24h, 370C Söû duïng E.coli sau khi nuoâi caáy qua ñeâm pha loaõng 10-2 ( töông ñöông 10-5 tb/ml) ñeå kieåm tra hoaït tính khaùng khuaån cuûa caùc vi khuaån lactic. Chuaån bò moâi tröôøng test Moâi tröôøng BHI agar (2%), Moâi tröôøng MRS agar (2%): Pha moâi tröôøng theâm agar 2% treân moãi lít moâi tröôøng. Ñun soâi moâi tröôøng cho agar tan ñeàu, cho vaøo bình Erlen. Laøm nuùt boâng, bòt laïi baèng nilon hoaëc giaáy baïc. Ñóa petri, röûa saïch, saáy khoâ, goùi giaáy, boû bòch. Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave, 1200C, 15 phuùt, 1 atm. Ñoå ñóa khi moâi tröôøng ôû 60-700C, moãi ñóa ñoå khoaûng 15ml Ñeå agar ñoâng, boû vaøo tuû uû qua ñeâm ñeå kieåm tra vaø loaïi boû ñóa bò nhieãm. Baûo quaûn trong tuû laïnh 40C. Tröôùc khi söû duïng boû vaøo saáy 600C, 15p Moâi tröôøng BHI loûng (0.7%) Pha moâi tröôøng theâm agar 0.7 % treân moãi lít moâi tröôøng. Ñun soâi moâi tröôøng cho agar tan ñeàu. Phoái vaøo 7ml/ oáng nghieäm. Laøm nuùt boâng hoaëc ñaäy naép oáng nghieäm Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave, 1200C, 15 phuùt, 1 atm. Ñeå nguoäi, baûo quaûn ôû tuû laïnh 40C. Moâi tröôøng peptone water Pha moâi tröôøng Phoái 8ml/oáng nghieäm Laøm nuùt boâng hoaëc ñaäy naép oáng nghieäm Ñem haáp khöû truøng baèng Autoclave, 1200C, 15 phuùt, 1 atm. Ñeå nguoäi, baûo quaûn ôû tuû laïnh 40C. Boá trí thí nghieäm Thí nghieäm kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Spot on lawn Nguyeân taéc: döïa vaøo söï ñoái khaùng tröïc tieáp giöõa vi khuaån leân men lactic vaø vi khuaån chæ thò. Taïo ñieàu kieän moâi tröôøng thích hôïp cho caû hai vi khuaån phaùt trieån. Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h. Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C Ñóa moâi tröôøng MRS agar, saáy khoâ ôû 600C. Moâi tröôøng BHI (0.7% agar) giöõ ôû nhieät ñoä 500C Thöôùc ño voøng khaùng (cm, mm) Caùch thöïc hieän nhö sau: Ñoå ñóa mt MRS (2% agar) Nhoû 10µl LAB (nuoâi caáy kò khí 24h, 370C) leân maët thaïch uû (1) E.coli nuoâi caáy taêng sinh qua 21h Huùt 1ml dòch nuoâi caáy vaøo 7ml BHI (0.7% agar). (2) Ñoå hoãn hôïp VK chæ thò + BHI agar (2) leân beà maët thaïch MRS (1) UÛ hieáu khí 24-48h, 370C Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng Ñoái chöùng: thay vì gioït dòch chöùa LAB, gioït MRS loûng. Laøm ñoái chöùng khoâng coù söï ñoái khaùng. Thí nghieäm kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar spot test (khueách taùn treân beà maët thaïch) Nguyeân taéc: Döïa treân söï ñoái khaùng tröïc tieáp cuûa vi khuaån leân men lactic vôùi vi khuaån chæ thò ngay taïi vò trí nhoû vi khuaån leân men lactic. Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h. Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C Ñóa moâi tröôøng BHI agar, saáy khoâ ôû 600C. Caùch thöïc hieän: Traûi 0.1 ml dòch chöùa E.coli moâi tröôøng BHI agar (2%) Nhoû 10µl dòch nuoâi caáy LAB leân beà maët ñóa UÛ hieáu khí, 370C, 18-24h Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng Ñoái chöùng: nhoû gioït moâi tröôøng MRS loûng leân ñóa, ñaùnh daáu vò trí. So saùnh vôùi caùc vò trí gioït chöùa LAB. Thí nghieäm xaùc ñònh khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp disc diffusion assay (khueách taùn qua voøng giaáy loïc) Chuaån bò: Giaáy loïc ñöôøng kính 8mm Moâi tröôøng Peptone water 8ml moãi oáng nghieäm Dòch nuoâi caáy E.coli (21h, 370C) . Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C Caùch thöïc hieän: Ñoå ñóa mt BHI agar (2%) Traûi 0.1 ml dòch chöùa E.coli Ly taâm dòch nuoâi caáy LAB Cho 20µl dòch ly taâm Ñaët giaáy thaám UÛ hieáu khí 24h, 370C Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng LAB sau khi nuoâi caáy trong MRS loûng qua ñeâm 18-24h, laáy 1,2ml dòch nuoâi caáy cho vaøo oáng effendorf, ñem ly taâm 14000prm trong 10 phuùt. Ñaët naêm mieáng giaáy thaám treân beà maët agar. Ñoái chöùng: mieáng ôû trung taâm chæ thaám vaøo MRS broth Giaáy thaám phaûi ñöôïc khöû truøng tröôùc khi söû duïng. Duøng keïp khöû truøng qua ngoïn löûa ñeøn coàn ñeå gaép giaáy thaám. Thí nghieäm kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar well diffusion assay (khueách taùn qua gieáng thaïch) Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli (21h, 370C) . Pha loaõng 10-1, 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105-106 teá baøo/ml. Khaûo saùt hai noàng ñoä naøy Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C. Ñem ly taâm 14000 voøng/ phuùt, trong 10 phuùt. Loaïi boû sinh khoái. OÁng ñoàng ñuïc loã ñöôøng kính 8mm. Khaûo saùt ñoä daøy moâi tröôøng laø 5mm töông öùng vôùi 25ml moâi tröôøng/ñóa, 3mm töông öùng vôùi 15ml moâi tröôøng/ñóa. Caùch thöïc hieän: Traûi 0.1 ml dòch chöùa E.coli moâi tröôøng BHI agar (2%) Ñuïc loå treân thaïch ñöôøng kính 8mm Laáy 0.1ml dòch nuoâi caáy LAB (nuoâi caáy kò khí 24h, 370C) vaøo loã. UÛ hieáu khí, 370C, 18-24h Kieåm tra söï taïo voøng khaùng. Ño ñöôøng kính voøng khaùng Quaù trình ñuïc loã: Môû naép ñóa petri, duøng oáng ñoàng ñöôøng kính 8mm, khöû truøng treân ngoïn löûa ñeøn coàn, ñeå nguoäi, ñuïc 5 loã treân thaïch. Laáy que gaép, khöû truøng, ñeå nguoäi, gaép thaïch ra khoûi taïo gieáng thaïch. Hô khöû truøng naép petri, ñaäy naép petri. Ñoái chöùng: gieáng ôû trung taâm ñóa, cho 0.1ml MRS broth ñeå ñoái chöùng. 3.2.3.4 Thí nghieäm xaùc ñònh khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Turbidometric assay (ño ñoä ñuïc) Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp ño ñoä ñuïc: Baèng maùy quang phoå ño maät ñoä teá baøo vi sinh vaät coù trong dòch nuoâi caáy ôû böôùc soùng 600nm. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh vôùi 2 nghieäm thöùc: Nghieäm thöùc 1: xaùc ñònh hoaït tính döïa treân söï öùc cheá vi khuaån chæ thò E.coli baèng caùc chaát ñöôïc sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát cuûa caùc chuûng LAB. Nghieäm thöùc 2: xaùc ñònh hoaït tính treân söï öùc cheá vi khuaån chæ thò E.coli baèng caùc chaát ñöôïc sinh ra trong quaù trình phaùt trieån cuûa caùc chuûng LAB nhöng ñaõ loaïi boû yeáu toá acid lactic baèng caùch trung hoøa bằng dung dòch NaOH 1N. Chuaån bò: Dòch nuoâi caáy E.coli (21h, 370C) . Pha loaõng 10-2 ñöôïc noàng ñoä söû duïng laø 105 teá baøo/ml Dòch nuoâi caáy LAB trong MRS loûng 18- 24h, ôû 370C. Nghieäm thöùc 1: Ñem ly taâm dòch nuoâi caáy LAB 14000 voøng/ phuùt, trong 10 phuùt. Loaïi boû sinh khoái. Nghieäm thöùc 2: Trung hoøa dòch nuoâi caáy veà pH 6 baèng NaOH 1N, tieán haønh thanh truøng 800C trong 10 phuùt. Ñem ly taâm 14000 voøng/ phuùt, trong 10 phuùt. Loaïi boû sinh khoái. Coâng thöùc tính nhö sau: %OD= Vôùi: OD: laø giaù trò ño OD cuûa oáng coù chöùa hôïp chaát khaùng khuaån. ODdc: laø giaù trò ño OD cuûa oáng ñoái chöùng khoâng coù chöùa hôïp chaát khaùng khuaån. Caùch thöïc hieän: Dòch nuoâi caáy E.coli nuoâi caáy taêng sinh qua 24h, pha loaõng 10-2 Laáy 1ml 1ml dòch ly taâm LAB Cho vaøo 8ml BHI+1ml MRS Broth UÛ hieáu khí 24h, 370C Ño OD Cho vaøo 8ml BHI UÛ hieáu khí 24h, 370C Ño OD So saùnh ñoä ñuïc, keát luaän Coù theå laäp theo baûng sau: Nghieäm Thöùc 1 Nghieäm Thöùc 2 OÁng kieåm tra hoaït tính 1ml dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h, noàng ñoä 105 teá baøo/ml. + 1ml dòch ly taâm moâi tröôøng nuoâi caáy LAB sau 18-24h. + 8ml moâi tröôøng peptone water. 1ml dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h, noàng ñoä 105 teá baøo/ml. + 1ml dòch ly taâm ñaõ trung hoøa acid baèng NaOH 1N. + 8ml moâi tröôøng peptone water. OÁng ñoái chöùng 1ml dòch nuoâi caáy E.coli qua 21h, noàng ñoä 105 teá baøo/ml. + 1ml MRS loûng + 8ml moâi tröôøng peptone water. Chöông 4: Keát Quaû vaø Bieän Luaän Kieåm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Spot on lawn Phöông phaùp naøy coù daïng gioáng chieác baùnh Sandwich vôùi 2 maët keïp laø moâi tröôøng MRS agar vaø BHI agar, khaû naêng khaùng vi sinh vaät chæ thò döïa treân söï tieáp xuùc tröïc tieáp giöõa chuùng vôùi vi khuaån lactic. Theo nghieân cöùu cuûa Carherine B. Lewus vaø Thomas J. Montville (1991) voøng khaùng khuaån theå hieän raát roõ raøng vôùi khaû naêng laëp laïi cao vaø nhanh choùng. Cho ñến gần ñaây, Bilge H. Cadirci vaø Sumru Citak (2005) nhận đñịnh rằng phöông phaùp naøy döôøng nhö cho keát quaû toát nhaát. Tuy nhieân, hoaït tính khaùng vi sinh vaät ôû ñaây laø hoaït tính toång hôïp cuûa taát caû caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lactic nhö: acid lactic, acid acetic, diacetyl, bacteriocin…Vì vaäy, ñeå xaùc ñònh hoaït tính rieâng cuûa töøng chaát khaùng vi sinh vaät cuûa vi khuaån lactic caàn coù caùc phöông phaùp boå sung. Khi thöïc hieän phöông phaùp naøy moät soá khoù khaên thöôøng gaëp laø: Ñeå thöïc hieän kieåm tra, ta phaûi traûi moät lôùp moûng moâi tröôøng MRS, roài nhoû moät löôïng nhoû vi khuaån LAB leân treân beà maët agar. Sau ñoù, nhoû tieáp 1 gioït moâi tröôøng BHI (0,7% agar) leân treân vi khuaån lactic ñeå coá ñònh chuùng treân beà maët thaïch. Neáu löôïng moâi tröôøng BHI nhoû leân quaù lôùn seõ röûa troâi vi khuaån lactic. Ñeå traûi moät lôùp moûng moâi tröôøng BHI 0,7 % agar chöùa vi khuaån chæ thò E. coli leân treân beà maët MRS agar ñaõ nhoû vi khuaån lactic, ta caàn hoùa loûng moâi tröôøng BHI ôû nhieät ñoä 500 C. ÔÛ nhieät ñoä naøy, E.coli deã bò toån thöông vaø BHI deã hoøa laãn vôùi MRS agar. Ngöôïc laïi, neáu haï nhieät ñoä thaáp hôn, moâi tröôøng deã ñoâng, khoâng taïo ñöôïc lôùp moûng ñeàu treân MRS agar nhö mong muoán. BHI agar töø oáng nghieäm ñöôïc chuyeån sang ñóa petri baèng caùch roùt tröïc tieáp treân ngoïn löûa ñeøn coàn, nguy cô bò nhieãm vi khuaån hay baøo töû töø khoâng khí raát cao. MRS agar sau khi ñoå ñóa saáy khoâ 15 phuùt ñeå beà maët ñóa khoâ, khoâng bò ñoïng nöôùc traùnh bò nhieãm do nöôùc. Qua thöû nghieäm phöông phaùp naøy, vì nhöõng khoù khaên gaëp phaûi cuõng nhö ñieàu kieän taïi phoøng thí nghieäm khoâng thuaän lôïi ñeå thöïc hieän, phöông phaùp naøy bò taïm ngöng ñeå tieán haønh phöông phaùp khaùc. Kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar spot test (khueách taùn treân beà maët thaïch) Töông töï nhö phöông phaùp treân, ñaây laø phöông phaùp kieåm tra khaû naêng khaùng vi sinh vaät chæ thò döïa treân söï tieáp xuùc tröïc tieáp giöõa chuùng vôùi vi khuaån lactic. Tuy nhieân, ôû ñaây moâi tröôøng BHI ñöôïc traûi tröôùc leân ñóa Petri vaø caáy gioáng vi sinh vaät chæ thò. Ngaøy hoâm sau vi khuaån lactic nuoâi tröôùc trong moâi tröôøng MRS môùi ñöôïc nhoû leân maët thaïch seõ taïo voøng khaùng khuaån xung quanh gioït vi khuaån lactic. Töông töï nhö phöông phaùp thöù nhaát, phöông phaùp naøy cuõng nhaèm ñaùnh giaù khaû naêng khaùng vi sinh vaät cuûa taát caû caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát nhöng quy trình thöû nghieäm ñôn giaûn hôn. Tuy nhieân vaãn gaëp khoù khaên laø: Khi löôïng vi khuaån lactic quaù ít seõ khoâng ñuû öùc cheá vi sinh vaät chæ thò Löôïng vi khuaån lactic quaù lôùn seõ traøn treân maët thaïch hoøa laãn vôùi E.coli neân khoâng nhaän ñöôïc keát quaû khaùng. Nhö vaäy ñoái vôùi phöông phaùp 1 vaø 2 noàng ñoä vi khuaån lactic trong dung dòch MRS vaø noàng ñoä vi sinh vaät chæ thò caàn ñöôïc toái öu hoùa ñeå ñaït keát quaû thöû nghieäm mong muoán. C1 Dòch nhoû LAB bò traøn treân beà maët thaïch N3 Löôïng nhoû LAB quaù ít T7b Löôïng nhoû LAB quaù ít T8b Dòch nhoû LAB bò traàn treân beà maët thaïch Hình 4.1: Thử nghiệm khoâng thaønh coâng phöông phaùp Agar spot test Nhö vaäy, taïi phoøng thí nghieäm tröôøng Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä, phöông phaùp naøy bò taïm ngöng ñeå tieán haønh phöông phaùp khaùc. Kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Disc diffusion assay (khueách taùn qua voøng giaáy loïc) Khaùc vôùi hai phöông phaùp treân, trong phöông phaùp naøy vi khuaån lactic khoâng ñoái khaùng tröïc tieáp vi sinh vaät chæ thò maø chæ coù saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa chuùng khueách taùn qua moâi tröôøng thaïch aûnh höôûng leân taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät chæ thò. Trong taøi lieäu phöông phaùp naøy thöôøng ñöôïc tieán haønh song song vôùi moät trong nhöõng phöông phaùp treân. AÙp duïng phöông phaùp naøy ta coù theå taùch rôøi aûnh höôûng cuûa töøng yeáu toá khaùng khuaån. Ví duï nhö taùc duïng khaùng khuaån cuûa acid höõu cô coù theå loaïi tröø nhôø trung hoøa dòch nuoâi caáy sau khi ly taâm loaïi boû teá baøo; taùc duïng cuûa H2O2 ñöôïc loaïi tröø nhôø xöû lyù dòch ly taâm vôùi enzyme catalase…. Baèng caùch ñoù coù theå ñaùnh giaù hoaït tính khaùng khuaån cuûa bacteriocin do vi khuaån lactic toång hôïp. Khueách taùn qua voøng giaáy loïc (disc diffusion assay) töông töï phöông phaùp cuûa Kirby Bauer thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå kieåm tra tính maãn cuûa vi sinh vaät ñoái vôùi khaùng sinh [9]. Voøng giaáy thaám ñöôïc ñaët leân beà maët ñóa Petri ñaõ cấy vi sinh vật chỉ thị roài thaám dòch nuoâi caáy vi khuaån lactic li taâm roài. Tuy nhieân, khi thöû nghieäm phöông phaùp naøy ñaõ khoâng thaønh coâng. Keát quaû theå hieän theo nhö hình 4.4. T1a T8b C1 T7b Hình 4.2. Thöû ngieäm khoâng thaønh coâng phöông phaùp Disc diffusion assay Töø keát quaû naøy coù moät soá nhaän xeùt nhö sau: Ñoä haáp thuï caùc chaát khaùng khuaån thu ñöôïc töø dòch ly taâm bò haïn cheá ôû möùc 20µl, cho thaáy löôïng chaát ñöôïc duøng ñeå thöû hoaït tính laø quaù ít. Caùc chaát khaùng khuaån ñöôïc thaám trong giaáy loïc coù söï khueách taùn leân moâi tröôøng thaïch laø khoâng cao. Caû hai nhaän ñònh naøy ñeàu giaûi thích cho keát quaû khoâng thaønh coâng. Tuy phöông phaùp naøy coù khaû naêng taùch rieâng kieåm tra ñònh tính caùc chaát khaùng khuaån (acid lactic, H2O2, bacteriocin…), nhöng qua thöû nghieäm nhaän thaáy noàng ñoä chaát khaùng khuaån ñöôïc sinh ra laø khoâng cao, vaø phöông phaùp naøy haïn cheá veà theå tích ñöa vaøo giaáy loïc. Vì vaäy phöông phaùp khoâng mang laïi yù nghóa cao trong vieäc taùch rieâng ñònh tính töøng chaát. Nhö vaäy, taïi phoøng thí nghieäm tröôøng Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä, phöông phaùp naøy bò taïm ngöng ñeå tieán haønh thöû nghieäm phöông phaùp khaùc. Kiểm tra khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Agar Well Diffusion Assay (khueách taùn qua gieáng thaïch) Phöông phaùp Agar well diffusion assay hay coøn goïi laø phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch, vi sinh vaät chæ thò ñöôïc traûi moät lôùp moûng treân beà maët moâi tröôøng BHI agar, cho dòch nuoâi caáy LAB (coù theå laáy dòch ly taâm) vaøo gieáng, ngay taïi gieáng chöùa LAB phaùt trieån vaø tieát caùc chaát ñoái khaùng vôùi vi khuaån chæ thò, ngaên caûn söï phaùt trieån cuûa vi khuaån chæ thò xung quanh gieáng. Töông töï nhö phöông phaùp treân, khueách taùn qua gieáng thaïch (well diffusion assay) laø phöông phaùp ñaùnh giaù aûnh höôûng caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån lactic leân vi sinh vaät chæ thò maø khoâng caàn söï tieáp xuùc tröïc tieáp giöõa chuùng, cuõng nhö khaû naêng ñaùnh giaù rieâng taùc ñoäng cuûa bacteriocin sau khi loaïi boû taùc ñoäng cuûa caùc yeáu toá khaùc nhö acid höõu cô, H2O2…. Phöông phaùp naøy coù öu ñieåm so vôùi phöông phaùp treân laø gieáng thaïch coù khaû naêng chöùa moät theå tích dòch ly taâm lôùn hôn ñaùng keå so vôùi dòch thaám vaøo giaáy loïc, neân khaû naêng khueách taùn caùc chaát khaùng khuaån vaøo moâi tröôøng thaïch cuõng cao hôn so vôùi phöông phaùp dics diffusion assay. Ñeå ño ñöôïc voøng khaùng khuaån thöïc söï baèng phöông phaùp naøy, beà daøy moâi tröôøng BHI trong ñóa Petri caàn ñöôïc chuaån hoùa. Moâi tröôøng quaù daøy ngaên caûn söï khueách taùn cuûa caùc chaát khaùng khuaån trong thaïch. Noàng ñoä vi khuaån chæ thò cuõng aûnh höôûng leân ñoä trong suoát cuûa voøng khaùng khuaån. Ñieàu naøy cho thaáy söï töông öùng giöõa chaát khaùng khuaån vôùi maät ñoä teá baøo vi khuaån chæ thò. Sau khi thöû nghieäm phöông phaùp vôùi ñoä daøy khaùc nhau (5mm, 3mm), ñoä daøy 3mm töông öùng vôùi 15 ml moâi tröôøng thaïch laø thích hôïp. Töông töï noàng ñoä vi khuaån chæ thò ñeå nhaän roõ voøng khaùng khuaån laø 105 teá baøo/ml. Hình 4.3 theå hieän roõ keát quaû thu ñöôïc. Moâi tröôøng daøy (5mm) vaø E.coli 106 teá baøo/ml Moâi tröôøng thích hôïp (3mm) vaø E.coli 105 teá baøo/ml Hình 4.3. So saùnh keát quaû C1 ôû hai ñóa moâi tröôøng vôùi ñoä daøy vaø noàng ñoä vi khuaån chæ thò khaùc nhau Vieäc chuaån hoùa cho phöông phaùp naøy coøn can phaûi thöïc hieän chuaån hoùa noàng ñoä vi khuaån leân men lactic trong MRS loûng. Khi caáy chuyeån vaøo moâi tröôøng loûng löôïng sinh khoái laáy khoâng ñoàng ñeàu. Theo ñoù sau khi nuoâi caáy qua 18-24h, löôïng teá baøo taêng sinh trong moâi tröôøng cuõng khaùc nhau. Khi söû duïng cuøng moät theå tích dòch nuoâi caáy cuûa caùc chuûng ñeå tieán haønh thí nghieäm noàng ñoä teá baøo /ml seõ khoâng ñöôïc coá ñònh, vì vaäy maø keát quaû coù ñoä tin caäy thaáp hôn. Vieäc chuaån hoùa naøy ñöôïc thöïc hieän döïa treân döïng ñöôøng chuaån veà noàng ñoä teá baøo vi khuaån. Khi tieán haønh ño voøng khaùng ôû ñóa petri, phöông phaùp ño raát thoâ sô, chæ döïa treân maét thöôøng vaø duøng thöôùc mm ñeå ño. Keát quaû naøy coù khoâng ñoä tin caäy cao, chöa coù ñoä nhaïy trong keát quaû, vì theá caàn phaûi nghieân cöùu moät phöông phaùp khaùc coù ñoä nhaïy cao hôn. T1a (d= 17 mm) T7b (d= 17 mm) N3 (d= 16 mm) C1 (d=18mm) Hình 4.4: Voøng khaùng cuûa nhöõng chuûng ñieån hình Hai möôi hai chuûng vi khuaån lactic ñöôïc kieåm tra hoaït tính khaùng khuaån toång quaùt nhôø phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch vôùi ñoä daøy moâi tröôøng vaø noàng ñoä E.coli thích hôïp laø: ñoä daøy 3mm vaø noàng ñoä 105 teá baøo/ml. Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån ñöôïc ño bao goàm caû ñöôøng kính gieáng thaïch (Hình 4.2 vaø Baûng 4.1). Ta coù coâng thöùc tính beà roäng vaønh khaùng khuaån: Beà roäng vaønh khaùng khuaån = [d voøng khaùng – d gieáng thaïch]/2 (mm) Schillinger vaø Lucke (1989) cho raèng khi beà roäng vaønh khaùng khuaån > 1 mm thì khaû naêng khaùng cuûa caùc vi khuaån lactic ñoái vôùi vi sinh vaät chæ thò coi nhö laø maïnh; khi giaù trò naøy naèm trong khoaûng 0,5 – 1 mm töông öùng khaû naêng khaùng trung bình. Coøn theo nghieân cöùu cuûa V. Rosenfeldt Nielsen, C. N. Jacobsen, A. E. Hayford, P. L. Molller, K. F. Michaelsen, A. Perrehaard, B. Sandstrom, M. Tvede, M. Jakobsen (1999) thì beà roäng vaønh khaùng khuaån ñöôïc xeùt trong khoaûng 2-5mm cho khaû naêng khaùng trung bình vaø treân 5mm cho khaû naêng khaùng maïnh. Gaàn ñaây, V. Padmanabha Reddy, M.D. Christopher, I. Sankara Reddy (2006) ño ñöôïc beà roäng voøng khaùng khuaån 3-5mm cuûa Lactobacillus acidophilus ñoái vôùi vi sinh vaät chæ thò E.coli. Theo baûng 4.1, beà roäng voøng khaùng khuaån ño ñöôïc cuûa chuùng toâi khoâng khaùc bieät vôùi caùc taùc giaû neâu treân. Beà roäng vaønh khaùng khuaån phuï thuoäc vaøo noàng ñoä chaát khaùng khuaån trong dòch ly taâm. Moät soá taùc giaû coøn coâ ñaëc dòch teá baøo ly taâm 5, 10 laàn ñeå taêng noàng ñoä chaát khaùng khuaån nhaèm taêng beà daøy vaønh khaùng khuaån [36] Baûng 4.1. Đường kính vòng kháng khuẩn đo đường bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (well diffusion assay) Soá TT Chuûng Giaù trò trung bình ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Giaù trò trung bình beà roäng vaønh khaùng khuaån (mm) Phaân loaïi hoaït tính khaùng khuaån 1 T8b 18.0 5.0 +++ 2 C1 18.0 5.0 +++ 3 T1a 17.0 4.5 +++ 4 T7b 17.0 4.5 +++ 5 D3 16.0 4.0 ++ 6 N3 16.0 4.0 ++ 7 T1c 15.0 3.5 ++ 8 T3c 15.0 3.5 ++ 9 S6 15.0 3.5 ++ 10 N4 14.0 3.0 ++ 11 S2 14.0 3.0 ++ 12 S4 14.0 3.0 ++ 13 N1 13.0 2.5 + 14 T2c 13.0 2.5 + 15 N5 10.0 1.0 + 16 S1a 10.0 1.0 + 17 S1b 10.0 1.0 + 18 S3 10.0 1.0 + 19 T1b 10.0 1.0 + 20 D2 10.0 1.0 + 21 T4c 8.0 0 0 22 S5 8.0 0 0 Ñeå tieän theo doõi vaø ñaùnh giaù hoaït tính khaùng khuaån cuûa caùc chuûng vi khuaån lactic phaân laäp ñöôïc trong phoøng thí nghieäm, chuùng toâi ñeà nghò phaân loaïi hoaït tính khaùng khuaån (taïm thôøi ñoái vôùi vi khuaån chæ thò E.coli) nhö sau: Beà daøy vaønh khaùng khuaån >4.0 mm töông öùng hoaït tính maïnh (+++) Beà daøy vaønh khaùng khuaån = 3.0mm ¸ 4.0 mm töông öùng hoaït tính trung bình (++) Beà daøy vaønh khaùng khuaån < 3.0 mm töông öùng hoaït tính yeáu (+) Beà daøy vaønh khaùng khuaån = 0 mm töông öùng khoâng coù hoaït tính (0) Nhö vaäy, trong soá boán phöông phaùp khueách taùn trong moâi tröôøng thaïch laø spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay, vaø well diffusion assay, thì phöông phaùp cuoái cuøng sau khi chuaån hoùa veà ñoä daøy moâi tröôøng vaø noàng ñoä vi sinh vaät coù theå aùp duïng ñeå so saùnh hoaït tính khaùng khuaån cuûa caùc chuûng vi khuaån nguoàn goác khaùc nhau qua ñöôøng kính voøng khaùng. Tuy nhieân, ñeå keát quaû coù theå so saùnh baèng phöông phaùp thoáng keâ caàn taêng soá laàn laëp laïi. Chuùng toâi ñaõ aùp duïng phöông phaùp naøy ñeå so saùnh hoaït tính khaùng khuaån toång theå ñoái vôùi E.coli cuûa 22 chuûng vi khuaån lactic. Ñeå xaùc ñònh baûn chaát khaùng khuaån laø do acid lactic, H2O2 hay bacteriocin, caàn tieán haønh moät soá phöông phaùp boå sung nhö trung hoøa dòch teá baøo ly taâm, boå sung catalase….Ngoaøi ra, caùc phöông phaùp khueách taùn qua moâi tröôøng thaïch chæ coù theå aùp duïng ñeå saøng loïc ban ñaàu trong quy trình tìm kieám caùc chuûng coù hoaït tính probiotic. Ñeå so saùnh mang tính ñònh löôïng caàn tìm kieám nhöõng phöông phaùp coù ñoä tin caäy cao hôn. Thí nghieäm xaùc ñònh khaû naêng ñoái khaùng baèng phöông phaùp Turbidimetric assay (ño ñoä ñuïc) Teá baøo vi sinh vaät laø moät thöïc theå neân khi hieän dieän trong moâi tröôøng laøm cho moâi tröôøng trôû neân ñuïc. Ñoä ñuïc cuûa huyeàn phuø tæ leä thuaän vôùi maät ñoä teá baøo. Do ñoù, thoâng qua vieäc ño ñoä ñuïc baèng maùy quang phoå keå ôû böôùc soùng nhaát ñònh cuûa dòch huyeàn phuø teá baøo ta coù theå ñònh tính ñöôïc maät ñoä teá baøo ôû ñieàu kieän caàn khaûo saùt. Khi thöïc hieän phöông phaùp ño ñoä ñuïc, chuùng toâi coù thay ñoåi quy trình so vôùi taøi lieäu tham khaûo [16], [31]. Thay vì tieät truøng dòch ly taâm baèng phöông phaùp loïc, chuùng toâi khöû truøng tröôùc eppendorf tube duøng ñeå ly taâm, sau ly taâm chæ thanh truøng Pasteur ôû 80o C 10 phuùt ñeå traùnh bieán tính bacteriocin vaø ñôn giaûn hoùa thao taùc. Moïi thao taùc caáy truyeàn ñeàu ñöôïc baûo ñaûm ñieàu kieän voâ truøng. Phöông phaùp naøy vaãn döïa treân nguyeân taéc chung cuûa caùc phöông phaùp phaùt hieän chaát khaùng vi sinh vaät laø ño khaû naêng öùc cheá taêng tröôûng cuûa vi khuaån chæ thò cuûa caùc chaát khaùng khuaån ñöôïc sinh ra töø quaù trình trao ñoåi chaát cuûa vi khuaån leân men lactic. Khoâng gioáng nhö boán phöông phaùp ñaõ thöïc hieän ôû treân, phöông phaùp ño ñoä ñuïc döïa treân söï khueách taùn caùc chaát khaùng khuaån trong moâi tröôøng loûng. Tæ leä phaàn traêm OD E. coli uû vôùi dòch ly taâm teá baøo vi khuaån LAB so vôùi OD E. coli uû vôùi ñoái chöùng (thay dòch ly taâm LAB baèng moâi tröôøng MRS cuøng theå tích) cho ta tæ leä soáng soùt cuûa E. coli sau khi uû vôùi caùc chaát khaùng khuaån trong dòch nuoâi caáy teá baøo LAB. Nhö vaäy bieân ñoä thay ñoåi cuûa caùc giaù trò ño ñöôïc vaø tính ñöôïc roäng hôn so vôùi phöông phaùp well diffusion assay (Hình 4.5 vaø Baûng 4.2). Cuõng treân cô sôû phöông phaùp naøy coù nhieàu öu ñieåm so vôùi caùc phöông phaùp tröôùc, ngoaøi vieäc khaûo saùt hoaït tính khaùng khuaån toång quaùt, chuùng toâi böôùc ñaàu tìm hieåu baûn chaát khaùng khuaån trong dòch nuoâi caáy vi khuaån LAB ly taâm. Thöïc hieän quaù trình nuoâi caáy vi khuaån leân men lactic trong MRS loûng vôùi ñieàu kieän kò khí, dòch nuoâi caáy ñem phaân tích haøm löôïng H2O2 sinh ra. Keát quaû cho thaáy H2O2 khoâng ñöôïc sinh ra trong quaù trình nuoâi caáy kò khí, nhö vaäy hai chaát khaùng khuaån ñaùng quan taâm coøn laïi laø acid höõu cô vaø bacteriocin. Ñeå loaïi boû taùc duïng cuûa acid höõu cô trong hoaït tính khaùng khuaån, chuùng toâi tieán haønh trung hoøa dòch nuoâi caáy LAB roài môùi ñem ly taâm tieáp ñoù tieán haønh quy trình ño ñoä ñuïc nhö treân. Keát quaû cuõng ñöôïc trình baøy trong baûng 4.2. OÁng nghieäm beân phaûi: Dòch nuoâi caáy C1 ly taâm (khoâng trung hoøa) uû vôùi E. coli OÁng nghieäm beân phaûi: Dòch nuoâi caáy C1 ly taâm (sau khi trung hoøa) uû vôùi E. coli OÁng nghieäm beân traùi : ñoái chöùng (thay dòch nuoâi caáy C1 baèng moâi tröôøng MRS cuøng theå tích) Hình 4.5: Kieåm tra hoaït tính baèng phöông phaùp ño ñoâ ñuïc Baûng 4.2. Tæ leä soáng soùt cuûa E. coli sau khi uû vôùi dòch nuoâi caáy LAB ly taâm Soá TT Chuûng vi khuaån lactic Tæ leä soáng soùt cuûa E.coli (%) khi uû vôùi dòch ly taâm khoâng trung hoøa Tæ leä soáng soùt cuûa E.coli (%) khi uû vôùi dòch ly taâm sau khi trung hoøa 1 T8b 4.6 56.1 2 C1 4.1 52.7 3 T1a 3.2 62.1 4 T7b 4.5 57.1 5 D3 15.3 80.1 6 N3 4.2 63.2 7 T1c 48.2 74.3 8 T3c 20.0 68.8 9 S6 34.3 63.4 10 N4 41.9 67.9 11 S2 12.3 76.8 12 S4 34.0 54.3 13 N1 15.8 55.8 14 T2c 63.2 63.5 15 N5 48.1 65.6 16 S1a 45.7 58.0 17 S1b 85.1 76.0 18 S3 46.5 58.1 19 T1b 92.6 80.3 20 D2 57.0 57.6 21 T4c 89.5 77.5 22 S5 53.2 73.5 Töø baûng 4.2 ta coù theå thaáy raèng tæ leä soáng soùt cuûa E. coli caøng thaáp thì hoaït tính khaùng vi sinh vaät caøng cao. Nhö vaäy ñeå so saùnh tröïc tieáp khaû naêng öùc cheá taêng tröôûng E. coli cuûa caùc saûn phaåm trao ñoåi chaát vi khuaån LAB, chuùng toâi söû duïng ñaïi löôïng (100% – tæ leä % soá soùt cuûa E. coli) vaø bieåu dieãn treân ñoà thò 4.1. Ñoà thò 4.1: Tæ leä öùc cheá taêng tröôûng E. coli cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån lactic ly taâm khoâng trung hoøa vaø sau khi trung hoøa Ñoà thò 4.1 cho thaáy: Tæ leä öùc cheá taêng tröôûng vi sinh vaät chæ thò cuûa dòch nuoâi caáy LAB ly taâm khoâng trung hoøa thöôøng lôùn hôn maãu töông öùng sau khi trung hoøa (19/22 tröôøng hôïp) Ñieàu naøy hôïp lyù vì trung hoøa nhaèm loaïi boû taùc duïng cuûa acid höõu cô trong hoaït tính khaùng khuaån. Tröôøng hôïp S1b, T1b vaø T4c cho keát quaû ngöôïc laïi. Tuy nhieân caùc chuûng naøy khoâng gaây chuù yù ñaëc bieät vì tæ leä öùc cheá E. coli cao nhaát xaáp xæ 20%, thuoäc loaïi thaáp nhaát so vôùi caùc chuûng coøn laïi. Nhieàu chuûng coù theå öùc cheá treân 80% taêng tröôûng cuûa E. coli khi khoâng trung hoøa (T8b, C1, T1a, N3, S2, N1), nhöng sau khi loaïi boû taùc duïng cuûa acid höõu cô taïo thaønh thì khaû naêng öùc cheá coøn laïi treân döôùi 40%. Nhieàu chuûng hoaït tính khaùng E. coli laïi khoâng phaûi do acid höõu cô taïo thaønh maø chuû yeáu do yeáu toá khaùc, raát nhieàu khaû naêng laø do bacteriocin (T2c, N5, S1a, D2) vaø hoaït tính naøy cuõng xaáp xæ 40%. So saùnh vôùi keát quaû phöông phaùp khueách taùn trong gieáng thaïch (well diffusion assay) nhìn chung ta coù theå phaân bieät nhöõng chuûng coù hoaït tính maïnh vaø yeáu baèng caû hai phöông phaùp, ví duï moät soá chuûng ñöôïc ñaùnh giaù laø coù hoaït tính maïnh trong well diffusion assay öùc cheá treân 90% taêng tröôûng E. coli (maãu khoâng trung hoøa). Ngöôïc laïi nhieàu chuûng laøm giaûm ñoä ñuïc E.coli töông töï nhöng beà daøy vaønh khaùng khuaån laïi nhoû (T3c, S2, N1). Coù veû raèng nhöõng chuûng öùc cheá taêng tröôûng vi sinh vaät chæ thò caøng maïnh do taùc ñoäng cuûa acid höõu cô thì beà daøy vaønh khaùng khuaån caøng lôùn. Coù theå ñoù laø do khaû naêng khueách taùn cuûa bacteriocin trong moâi tröôøng thaïch keùm hôn acid höõu cô. Ñoà thò 4.2 bieåu dieãn töông quan giöõa tæ leä soáng soùt E. coli (A%) theo phöông phaùp ño ñoä ñuïc theo beà roäng vaønh khaùng khuaån (mm) vôùi soá lieäu xöû lyù vaø ñoà thò veõ baèng phaàn meàm Statgraphics. Ñoà thò 4.2: Söï töông quan giöõa phöông phaùp ño ñoä ñuïc (turbidimetric assay method) vaø phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch (well diffusion assay) Phöông trình bieåu dieãn töông quan laø: A(%) = 24.2 + 14.7 D ñöôïc thieát laäp vôùi heä soá töông quan (correlation coefficient) laø 0.8366 vaø R2 = 66.3 %. Nhö vaäy, veà maët thoáng keâ coi nhö khoâng coù söï töông quan giöõa keát quaû cuûa hai phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch ño ñoä ñuïc. Toùm laïi, phöông phaùp khueách taùn qua gieáng thaïch chæ cho keát quaû ñònh tính laïi toán nhieàu thôøi gian vaø coâng phu, coøn phöông phaùp ño ñoä ñuïc cho keát quaû mang tính ñònh löôïng hôn vì vaäy coù theå deã daøng söû duïng ñeå ñaùnh giaù hoaït tính khaùng vi sinh vaät cuûa caùc thaønh phaàn chaát khaùng khuaån. Chuùng toâi ñeà nghò phaùt trieån phöông phaùp naøy trong Phoøng thí nghieäm trong coâng vieäc tuyeån choïn caùc chuûng LAB laøm probiotics hay saûn xuaát bacteriocin. Chöông 5: Keát Luaän & Kieán Nghò Keát Luaän Ñeå choïn loïc caùc chuûng coù tieàm naêng probiotics, tuyeån choïn khaû naêng khaùng vi sinh vaät ñoùng vai troø quan troïng nhaát vaø laø haøng raøo tuyeån choïn ñaàu tieân caàn aùp duïng. Trong boán phöông phaùp thöû nghieäm treân moâi tröôøng thaïch laø spot on lawn, agar spot test, dics diffusion assay vaø well diffusion assay thì phöông phaùp thöù tö laø cho keát quaû trong phoøng thí nghieäm cuûa chuùng toâi. Phöông phaùp naøy duøng ñeå ñaùnh giaù hoaït tính toång hôïp caùc chaát khaùng khuaån do vi khuaån lactic sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát. Ñeå thöïc hieän caùc phöông phaùp naøy ñaõ toái öu hoùa ñieàu kieän laø: Söû duïng moâi tröôøng thaïch daøy 3mm töông öùng vôùi 15ml moâi tröôøng. Söû duïng E.coli noàng ñoä 105 teá baøo/ml duøng cho taát caû caùc phöông phaùp kieåm tra söï ñoái khaùng. Trong caùc phöông phaùp söû duïng ñeå kieåm tra hoaït tính khaùng vi sinh vaät chæ coù phöông phaùp ño ñoä ñuïc (turbidometric assay method) cho keát quaû ñònh löôïng. AÙp duïng phöông phaùp naøy coù theå ñaùnh giaù aûnh höôûng rieâng reõ cuûa caùc chaát khaùng vi sinh vaät chæ thò. Baèng phöông phaùp well diffusion assay chuùng toâi xaùc ñònh ñöôïc naêm chuûng coù voøng khaùng khuaån toát nhaát laø: C1, T8b, T1a, T7b, N3. Trong ñoù C1 vaø N3 coù nguoàn goác töø thöïc phaåm laø caø muoái vaø nem. Coøn T8b, T1a, T7b coù nguoàn goác töø döôïc phaåm, laø caùc cheá phaåm Biolactyl, Probio vaø Ybio. Baèng phöông phaùp ño ñoä ñuïc chuùng toâi xaùc ñònh ñöôïc naêm chuûng coù khaû naêng taïo chaát khaùng khuaån, öùc cheá söï taêng sinh cuûa vi khuaån chæ thò E.coli cho keát quaû toát nhaát laø : T1a, C1, N3, T7b, T8b, töông öùng vôùi thí nghieäm kieåm tra voøng khaùng khuaån. Kieán nghò Kieán nghò taïi phoøng thí nghieäm Ñaïi Hoïc Kyõ Thuaät Coâng Ngheä neân trieån khai phöông phaùp turbidometric assay trong nghieân cöùu choïn loïc chuûng tieàm naêng probiotic. Ñeå thöïc hieän hoaøn chænh phöông phaùp naøy caàn phaûi ñieàu chænh, toái öu hoùa moät soá ñieàu kieän nhö sau: Vieäc chuaån hoùa naøy ñöôïc thöïc hieän döïa treân döïng ñöôøng chuaån veà noàng ñoä teá baøo vi khuaån, kieåm soaùt vaø coá ñònh noàng ñoä teá baøo vi khuaån leân men lactic söû duïng trong phöông phaùp. Kieåm soaùt vaø coá ñònh noàng ñoä teá baøo E.coli söû duïng trong phöông phaùp Trích ly vaø ñònh löôïng bacteriocin vaø xöû lyù dòch ly taâm baèng proteinase K ñeå xaùc ñònh caùc hôïp chaát coù hoaït tính khaùng khuaån coù baûn chaát laø protein hay khoâng. Tieáp tuïc tieán haønh caùc kieåm tra hoaït tính Probiotic cuûa vi khuaån lactic vôùi caùc tieâu chí veà: khaû naêng baùm dính caïnh tranh vôùi vi khuaån chæ thò, khaû naêng chòu ñöôïc pH hoaëc dung hoøa vôùi acid, khaû naêng chòu ñöôïc noàng ñoä muoái maät cao, kieåm tra khaû naêng ñoái khaùng tröïc tieáp vôùi vi khuaån chæ thò trong ñieàu kieän in vivo.