Đột biến gen col1A1 trên bệnh nhân tạo xương bất toàn

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013 20 ĐỘT BIẾN GEN COL1A1 TRÊN BỆNH NHÂN TẠO XƯƠNG BẤT TOÀN Bùi Thị Hồng Châu*, Trần Vân Khánh*, Hồ Cẩm Tú*, Trần Huy Thịnh * Tạ Thành Văn* TÓM TẮT Mở đầu: Tạo xương bất toàn là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, 85% gây nên do đột biến gen tổng hợp collagen týp 1 (COL1A1). Bố hoặc mẹ mắc bệnh có khả năng truyền bệnh cho con 50%. Mục tiêu: Xác định đột biến gen COL1A1 ở bệnh nhân và bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn. Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 07 bệnh nhân tạo xương bất toàn và bố mẹ bệnh nhân được lựa chọn nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen trực tiếp được sử dụng để phát hiện đột biến. Kết quả: 5/7 bệnh nhân tạo xương bất toàn được phát hiện là có đột biến gen COL1A1, trong đó 2 trường hợp là di truyền từ bố và 2 trường hợp là di truyền từ mẹ, 1 trường hợp là đột biến mới phát sinh. Kết luận: Phát hiện đột biến gen trên bố, mẹ bệnh nhân đóng vai trò quan trọng trong công tác tư vấn di truyền Từ khóa: Bệnh tạo xương bất toàn, COL1A1, đột biến ABSTRACT MUTATIONAL SPECTRUM OF COL1A1 GENE IN PATIENTS WITH OSTEOGENESIS IMPERFECTA Bui Thi Hong Chau, Tran Van Khanh, Ho Cam Tu, Tran Huy Thinh, Ta Thanh Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - No 1 - 2013: 20 - 24 Background: Osteogenesis imperfecta, an autosomal dominant disease, is caused by mutation on gene coded for collagen type 1 (COL1A1). Parent with this genetic disease deliver 50% of the ability of osteogenesis imperfecta for their children. Objective: Identification of COL1A1 gene mutation in OI patients and their parent. Method: 7 osteogenesis imperfecta patients and their parents were selected for this study. Direct sequencing was used to detect the mutation. Results: The results showed that 5/7 patients were found to have the mutation in COL1A1 gene; including two cases are inherited from the father and the two cases are inherited from the mother, one case was found as de novo mutation. Conclusion: Identify the mutations in COL1A1 gene is important for genetic counseling. Keywords: Osteogenesis imperfecta, COL1A1, mutation MỞ ĐẦU Tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imferfecta – OI) là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường, chủ yếu do đột biến gen tổng hợp collagen týp 1 (COL1A1). Nguy cơ mắc bệnh ở nam và nữ là như nhau. Khi người bố hoặc người mẹ bị bệnh, nguy cơ sinh con bị bệnh là 50% và không bị bệnh là 50%. Chẩn đoán bệnh OI không phức tạp ở những trường hợp có tiền sử gia đình rõ hoặc biểu hiện bệnh nặng, có tiền sử gãy xương. Với những trường hợp không có tiền sử gia đình hoặc gãy xương không có kết hợp với những bất thường ngoài xương thì chẩn * Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Tác giả liên lạc: TS. Trần Vân Khánh ĐT: 0915958661 Email: vankhanh73md@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học 21 đoán tương đối khó khăn, ngoài những tiêu chuẩn chẩn đoán về mặt lâm sàng, cần kết hợp thêm với xét nghiệm số lượng và cấu trúc phân tử collagen týp 1 qua nuôi cấy nguyên bào sợi từ da bệnh nhân và kết hợp phân tích gen(9,2). Kết quả phân tích gen là tiền đề quan trọng giúp chẩn đoán trước sinh đối với các đối tượng có nguy cơ cao sinh con bị bệnh để đưa ra những tư vấn di truyền giúp ngăn ngừa và giảm tỉ lệ mắc bệnh(6, 3). Nghiên cứu này được thực hiện tại Trung Tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội với mục đích xác định đột biến gen COL1A1 ở bệnh nhân và bố mẹ bệnh nhân tạo xương bất toàn. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - 07 bệnh nhân được chẩn đoán bệnh OI tại Khoa Nội tiết- Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương dựa vào triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình. - Các cặp bố mẹ của các bệnh nhân trên. Phương pháp nghiên cứu Lấy mẫu bệnh phẩm Bệnh nhân được lấy 2ml máu tĩnh mạch chống đông trong EDTA, đảm bảo vô trùng. Tách chiết DNA DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần chống đông EDTA bằng dung dịch phenol: chloroform: isopropanol (25:24:1). Nồng độ và độ tinh sạch DNA được đo trên máy Nanodrop 1000. Kỹ thuật PCR Những mẫu DNA đạt giá trị OD 280/260 ≥ 1,8 được sử dụng để khuếch đại với các cặp mồi đặc hiệu. Chu kỳ nhiệt: 94oC/5phút - (94oC/1phút - 59oC/1phút - 72oC/ 2phút) x 35 chu kỳ - 72oC/5phút. Sản phẩm PCR được bảo quản ở 4oC. Giải trình tự gen Sản phẩm PCR tiến hành giải trình tự trên máy 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM. Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự trên GenBank (National center for biotechnology information, NCBI) để phát hiện đột biến. KẾT QUẢ Kết quả PCR Sau khi thu được DNA có nồng độ và độ tinh sạch cao, kỹ thuật PCR được tiến hành để khuyếch đại gen COL1A1. Hình 1: Hình ảnh PCR đoạn gen được khuyếch đại từ exon 39 - 41 của gen COL1A1. C mẫu đối chứng, 1-7 mẫu bệnh nhân. MK: Marker 100 bp Sản phẩm PCR được tiến hành giải trình tự gen trực tiếp để xác định đột biến, kết quả cho thấy 5/7 bệnh nhân được phát hiện có đột biến điểm trên gen COL1A1. Bố, mẹ của bệnh nhân cũng được tiến hành xác định đột biến để tìm nguyên nhân gây bệnh của người con có phải là di truyền do bố mẹ hay không. Trường hợp 1 Phân tích gen COL1A1 của bố mẹ bệnh nhân số 20 cho thấy người bố bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử 7599-31C>T tại intron 31, người mẹ bệnh nhân không có đột biến. Như vậy bệnh nhân số 20 có đột biến 7599-31C>T dị hợp tử tại intron 31 là do nhận 1 alen đột biến từ người bố (Hình 2). Tương tự, kết quả phân tích gen COL1A1 ở trường hợp 2, gia đình bệnh nhân số 43 cho thấy người bố bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử 3479+33T>C tại intron 33, người mẹ bệnh nhân không có đột biến, hai em gái và em trai bệnh nhân không có đột biến. Như vậy bệnh nhân số Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013 22 43 có đột biến 3479+33T>C tại intron 33 dị hợp tử là do nhận 1 alen đột biến từ người bố. (Hình 3). Hình 2: Đột biến 7599-31C>T tại intron 31 trên gen COL1A1 của bố mẹ bệnh nhân số 20. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi I II 1 1 2 Nam bị bệnh Nữ bị bệnh Nữ bình thường Hình 3 : Phả hệ gia đình mã số 20 (mũi tên: BN mã số 20) Trường hợp 3 Phân tích gen COL1A1 ở gia đình bệnh nhân số 8 cho thấy người bố bệnh nhân không có đột biến, người mẹ bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử thay thế G thành T tại vị trí 2183 làm cho bộ ba tại vị trí 686 mã hóa Glycin chuyển thành Valin (p.Gly686Val). Bệnh nhân số 8 và người em trai có đột biến dị hợp tử là do nhận 1 alen đột biến từ người mẹ (Hình 4). Tương tự, kết quả phân tích gen COL1A1 ở gia đình bệnh nhân số 23 cho thấy người mẹ bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử thay thế G thành A tại vị trí 2587 làm cho bộ ba tại vị trí 821 mã hóa Glycin chuyển thành Serin (p.Gly821Ser), người bố bệnh nhân không có đột biến. Bệnh nhân số 23 có đột biến là do nhận 1 alen đột biến từ người mẹ. Kết quả phân tích gen COL1A1 ở gia đình bệnh nhân bệnh nhân mã số 03, exon 6 có sự thay đổi nucleotid C653A (thay đổi Serin vị trí 176 thành Tyrosin) và C654G (không làm thay đổi acid amin) đều ở dạng dị hợp tử. Khi cả hai đột biến này xảy ra đồng thời sẽ biến đổi codon TCC (mã hoá cho Serin) thành mã kết thúc TAG (p.S176Stop). Người mẹ và người bố bệnh nhân không tìm thấy đột biến gen. (Hình 5) . Bệnh nhân mã số 20 Mẹ bệnh nhân mã số 20 c.7599-31C>T c.7599-31Cc.7599-31C>T Bố bệnh nhân mã số 20 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học 23 Hình 4: Hình ảnh đột biến c.2183 G>T
p.Gly686Val trên gen COL1A1 của các thành viên gia đình bệnh nhân 8. Mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí đột biến, các chữ số trên mũi tên chỉ vị trí nucleotid và acid amin thay đổi. Hình 5: Phả hệ gia đình mã số 8 (mũi tên: BN mã số 8) BÀN LUẬN OI là bệnh di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen tổng hợp collagen týp 1. Như vậy, chỉ cần một alen mang gen đột biến là người mang gen này đã mắc bệnh hoặc chỉ cần người bố hoặc người mẹ bị bệnh thì 50% khả năng sinh con mắc bệnh OI(8). Nghiên cứu cho thấy có 5/7 bệnh nhân OI có mang đột biến gen COL1A1. Trong đó, 2 trường hợp là di truyền từ người bố và 2 trường hợp là di truyền từ người mẹ. Chỉ có duy nhất 1 trường hợp do đột biến mới phát sinh, người mẹ và người bố đều bình thường. Có khoảng 250 đột biến được tìm thấy ở trên gen COL1A1 chủ yếu là dạng thay đổi một nucleotid, phá vỡ cấu trúc bộ ba Gly-X-Y dẫn đến sự mất đi tính bền vững của protein. Những dạng đột biến khác như mất, lặp đoạn hoặc bổ sung nucleotid hiếm gặp hơn(7). Các đột biến thay thế Glycin (Gly) cũng như cấu trúc Gly-X-Y có vai trò quan trọng và thường là nguyên nhân I II 1 1 2 Nam bị bệnh Nữ bị bệnhNữ bình thườngNam bình thường 2 3 Mẹ bệnh nhânBố bệnh nhân c. 2183G>T p.Gly686Valc. 2183G Em trai bệnh nhân c. 2183G>T p.Gly686Val Bệnh nhân mã số 8 c. 2183G>T p.Gly686Val Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 1 * 2013 24 gây rối loạn cấy trúc collagen I. Vùng này trải dài từ exon 6 đến exon 49 của gen COL1A1. Như vậy không chỉ các đột biến trong exon mà các đột biến nằm trong vùng intron đều ảnh hưởng đến cấu trúc chuỗi xoắn bậc ba. Thực tế đã chứng minh, 18% đột biến intron ở chuỗi DNA của gen COL1A1 được công bố gây bệnh OI (Osteogenesis Imperfecta Variant Database). Hiện nay có 217 đột biến tại vùng intron của gen COL1A1 được công bố tại ngân hàng dữ liệu Osteogenesis Imperfecta Variant Database. Đột biến 7599-31C>T dị hợp tử tại intron 24 xuất hiện ở bệnh nhân mã số 20 và người bố của bệnh nhân. Đột biến này cách đầu 5’ của exon 25 khoảng 31 nucleotid có thể gây nhiễu vị trí cắt nối giữa exon 24 và 25. Tương tự ở bệnh nhân mã số 43, người bố của bệnh nhân xuất hiện đột biến dị hợp tử tại intron 7, cách đầu 3’ của exon 7 một khoảng 33 nucleotid, 3479+33T>C. Đột biến này có thể gây ảnh hưởng quá trình cắt nối giữa exon số 7 và 8. Trường hợp bệnh nhân mã số 08, đột biến thay thế G vị trí 2183 trên mRNA của gen COL1A1 (NM_000088.3) thành T làm thay đổi acid amin Glycin vị trí 686 thành Valin, cũng tìm thấy ở người mẹ và người em trai của bệnh nhân (đều bị bệnh OI). Đột biến này đã được công bố hai lần tại ngân hàng dữ liệu Osteogenesis Imperfecta Variant Database và được khẳng định là đột biến gây bệnh OI(7,5). Một trường hợp khác, đột biến p.Gly821Ser ở bệnh nhân mã số 23 cũng được công bố 13 lần ở châu Âu, châu Á và châu Mỹ với tỷ lệ khoảng 11% trong tổng số đột biến tìm thấy trên gen COL1A1. Trường hợp bệnh nhân mã số 03, xuất hiện hai đỉnh trùng nhau ở hai vị trí 653, 654 (NM_000088.3, NCBI) đã tạo ra mã kết thúc (nonsense mutation). Tuy nhiên, khi phân tích trên bố, mẹ bệnh nhân tại vị trí này không thấy có đột biến chứng tỏ bệnh nhân không nhận được alen đột biến từ người mẹ hoặc từ người bố nên đây là đột biến mới phát sinh(7,1). KẾT LUẬN Đã phát hiện được 5/7 bệnh nhân có đột biến gen COL1A1 trong đó 2 trường hợp là di truyền từ bố và 2 trường hợp là di truyền từ mẹ, 1 trường hợp là đột biến mới phát sinh. Chú thích: Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội trên cơ sở của đề tài cấp Bộ: “Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đột biến gen (COL1A1, COL1A2) gây bệnh tạo xương bất toàn (Osteogenesis Imperfecta: OI) ở trẻ em Việt Nam” - Chủ nhiệm đề tài: TS.TRẦN VÂN KHÁNH - Với sự tài trợ kinh phí từ Ngân sách Sự Nghiệp Khoa Học cấp Bộ Y tế đã được duyệt năm 2011. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Thị Hồng Châu, Trần Vân Khánh, Hồ Cẩm Tú, Trần Huy Thịnh, Vũ Chí Dũng, Tạ Thành Văn (2012), “Một trường hợp đột biến tạo mã kết thúc trên gen COL1A1 ở bệnh nhân tạo xương bất toàn”, Tạp chí nghiên cứu Y học 78, (1), tr. 10-3 2. Buisson O, Senat MV, Laurenceau N, Ville Y (2006), “Prenatal diagnosis of type II osteogenesis imperfecta, describing a new mutation in the COL1A1 gene”, Prenat Diagn., 26, pp. 394. 3. Frank Rauch, Francis H Glorieux (2004), “Osteogenesis Imperfecta”, The Lancet, 363. 4. Hồ Cẩm Tú, Trần Vân Khánh, Trần Huy Thịnh, Bùi Thị Hồng Châu, Lê Hoài Chương, Tạ Thành Văn (2012), “Phát hiện đột biến gen COL1A1 ở bệnh nhi tạo xương bất toàn”, Tạp chí nghiên cứu Y học 78, (1), tr. 5-10. 5. Leśniewicz R and al. (2001), “Prenatal and neonatal diagnosis of osteogenesis imperfecta in obstetrical practice”, Ginekol Pol., 72, pp. 456-465. 6. Leśniewicz R, Galicka A, Anchim T, Skotnicki M, Wołczyński S, Urban J (2001), “Prenatal and neonatal diagnosis of osteogenesis imperfecta in obstetrical practice”, Ginekol Pol., 72, pp. 456-65. 7. Liu W and al. (2007), “A novel COL1A1 nonsense mutation causing osteogenesis imperfecta in a Chinese family”, Mol Vis., 13, pp. 360-5. 8. Pollitt R, McMahon R, Nunn J, Bamford R, Afifi A, Bishop N, Dalton A (2006), “Mutation analysis of COL1A1 and COL1A2 in patients diagnosed with osteogenesis imperfecta type I-IV”, Hum Mutat., 27, pp. 716. 9. Trần Vân Khánh (2011), “Bệnh tạo xương bất toàn”, Bệnh học phân tử, Nhà xuất bản y học, tr. 208-16. Ngày nhận bài: 10/12/2012 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 06/01/2013 Ngày bài báo được đăng: 31/01/2013