Giáo trình Kiểm nghiệm dược phẩm

qui định. 8. Đầu mỗi buổi học sinh viên ký nhận dụng cụ. Cuối buổi dụng cụ phải được rửa sạch sẽ, sắp xếp đúng qui định, kiểm tra và ký trả vào sổ. Tiểu nhóm thực tập phải chịu trách nhiệm về sự mất mát, hư hỏng, bể vỡ dụng cụ của tiểu nhóm. 9. Cấm hút thuốc, đùa giỡn, nghe điện thoại trong phòng thí nghiệm. 10. Không được cười nói ồn ào, làm việc riêng trong khi thực tập. Không được qua vị 4 trí của tiểu nhóm khác để gây mất trật tự. 11. Không được ăn uống trong phòng thực tập, nước uống phải để bên ngoài. 12. Mỗi sinh viên phải mang theo 01 quyển giáo trình thực tập. Nếu không đem theo giáo trình sẽ không được thực tập. 13. Không được tự ý sử dụng/ di chuyển những dụng cụ, hóa chất, máy móc ngoài phạm vi bàn thực tập của mình. Không được tự ý thực hiện những thí nghiệm không có trong bài thực hành. 14. Trước khi thực tập, sinh viên phải đọc kỹ bài thực tập trước ở nhà, và bài lý thuyết liên quan. Chuẩn bị những dụng cụ cá nhân hỗ trợ cho bài thực tập hôm đó như bao tay, khẩu trang, khăn giấy, 15. Cuối mỗi buổi thực tập, nhóm trưởng phân công các tiểu nhóm thay nhau trực vệ sinh phòng (dọn dẹp dụng cụ, hóa chất dùng chung, lau bàn, vệ sinh cân, quét nhà, lau nhà, vệ sinh các máy móc có sử dụng, dọn lavabo, giặt khăn phơi lên cửa sổ, châm đầy các bình nước cất, đổ rác, đóng cửa sổ). Nhóm trực bỏ về không trực sẽ nhận 0 điểm. 16. Sinh viên nộp bài báo cáo vào đầu mỗi buổi thực tập của bài kế tiếp vào đúng 15 phút đầu giờ. Sau thời điểm này sẽ không nhận bài và sinh viên phải nhận 0đ cho bài báo cáo đó. 17. Mỗi tiểu nhóm phải mang theo 01 bộ đồ dùng cá nhân như sau: - 01 khăn vải sạch, 01 bịt khăn giấy - Găng tay y tế, khẩu trang y tế - Viết mực, viết chì, thước, đồ bấm - 01 viết lông màu xanh (loại viết lên thủy tinh được) - 01 nhíp y tế, 01 muỗng nhựa sạch - 01 bơm tiêm 1ml, 01 lưỡi lam Cần Thơ, ngày tháng .. năm.... Sinh viên ký tên Họ tên:.. 5 BÀI 1 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CALCICLORID DIHYRAT (XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN TẠP CHẤT) MỤC TIÊU 1. Trình bày được cách xác định giới hạn tạp chất trong kiểm nghiệm nguyên liệu. 2. Thực hiện được các phương pháp xác định các giới hạn tạp chất. NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KIỂM NGHIỆM 1.1. Hình thức: bột kết tinh trắng, dễ hút nước. Dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96%. 1.2. Định tính: phải cho những phản ứng đặc trưng của ion calci và clorid. 1.3. Độ trong và màu sắc dung dịch: có màu không đậm hơn mẫu V6 (phụ lục 9.2 và 9.3) 1.4. Giới hạn acid – kiềm: dung dịch của nguyên liệu không được acid quá hoặc kiềm quá. 1.5. Các giới hạn tạp chất: 1.5.1. Sulfat: không được quá 0,03% (phụ lục 9.4.14) 1.5.2. Nhôm 1.5.3. Bari: không được đục hơn dung dịch gồm 10% dung dịch chuẩn + 1 ml nước. 1.5.4. Kim loại nặng: không được quá 20ppm (phụ lục 9.4.8). 1.5.5. Sắt: không được quá 10ppm (phụ lục 9.4.13). 1.5.6. Magnesi và muối kiềm: cắn không được quá 0,5%. 1.6. Định lượng: hàm lượng CaCl2.2H2O từ 97,0-103,0%. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Hình thức: như ghi trong yêu cầu kiểm nghiệm 2.2. Định tính - Dung dịch S: Hòa tan 10g CaCl2.2H2O trong nước không có carbon dioxyd (TT) và thêm nước vừa đủ 100ml (nước cất dun sôi để nguội). A. Lấy khoảng 2mg chế phẩm cho vào một ống nghiệm, thêm 2ml nước để hòa tan, acid hóa bằng dung dịch acid nitric 2M (TT), thêm 0,4ml dung dịch bạc nitrat 2% 6 (TT), lắc và để yên, sẽ tạo tủa trắng lổn nhổn. Lọc lấy tủa, rửa tủa 3 lần, mỗi lần với 1ml nước, phân tán tủa trong 2ml nước và thêm 1,5ml dung dịch amoniac 10M, tủa tan ra dễ dàng. B. Lấy 20mg chế phẩm cho vào một ống nghiệm, thêm 5ml dung dịch acid acetic 5M (TT) lắc cho tan, thêm 0,5ml dung dịch kali ferocyanid (TT), dung dịch vẫn trong, cho thêm khoảng 50mg amoni clorid (TT), tạo thành tủa kết tinh trắng. C. Lấy 2ml dung dịch S cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch amoni oxalat 4% (TT), tạo thành tủa trắng, tủa này ít tan trong dung dịch acid acetic 6M (TT), nhưng tan trong acid hydrocloric (TT). 2.3. Độ tan và màu sắc của dung dịch: (bài thực tập 2) 2.4. Giới hạn acid – kiềm Lấy 10ml dung dịch S mới pha, thêm 0,1ml dung dịch phenolphtalein (TT). Nếu dung dịch có màu đỏ, thêm 0,2ml dung dịch acid hydrocloric 0,01M (CĐ), dung dịch phải mất màu. Nếu dung dịch không màu, nó phải chuyển sang màu đỏ khi thêm không quá 0,2ml dung dịch natri hydroxyd 0,01M (CĐ). 2.5. Các giới hạn tạp chất 2.5.1. Sulfat: không được quá 0,03% (phụ lục 9.4.14). Lấy 5ml dung dịch S, pha loãng với nước thành 15ml để thử. Chuẩn bị đồng thời hai ống chuẩn và thử theo bảng sau: Bảng 1.1. Quy định chuẩn bị ống thử và ống chuẩn Ống thử Ống chuẩn Bari clorid 25% 1ml 1ml Dung dịch sulfat mẫu 10 phần triệu 1,5ml 1,5ml Lắc và để yên 1 phút Chế phẩm thử 5ml dd S + 10ml nước cất 15ml 0ml Dung dịch sulfat mẫu 10 phần triệu 15ml Dung dịch acid acetic 5M (TT) 0,5ml 0,5ml Lắc và để yên 5 phút Độ đục tạo thành trong ống thử không được đậm hơn trong ống chuẩn. 2.5.2. Nhôm 10ml dd S, thêm 2ml dd amoniclorid 10,7% và 1ml dd amoniac 10% (TT) đun nóng 7 tới sôi, dd không được vẩn đục hay tủa. Nếu dùng chế phẩm dùng để pha các dd thẩm tích thì nó phải đạt yêu cầu phép thử sau đây thay cho phép thử trên: Tối đa 1 phần triệu (Phụ lục 9.4.9) Dung dịch thử: Hòa tan 4g chế phẩm trong 100ml nước, thêm 10ml dung dịch đệm acetat pH 6,0. Dung dịch đối chiếu: Trộn 2ml dung dịch nhôm mẫu (2 phần triệu), 10ml dung dịch đệm acetat pH 6,0 và 98ml nước. Dung dịch mẫu trắng: Trộn 10ml dung dịch đệm acetat pH 6,0 với 100ml nước. 2.5.3. Bari Lấy 10ml dung dịch S, thêm 1ml dung dịch calci sulfat (TT). Sau ít nhất 15 phút, dung dịch không được đục hơn dung dịch gồm 10ml dung dịch S và 1ml nước. 2.5.4. Kim loại nặng: không được quá 20 phần triệu (phụ lục 9.4.8) Dung dịch thử: lấy 12ml dung dịch S thử theo phương pháp 1 của phụ lục 9.4.8 trong DĐVN IV. Dùng dung dịch chì mẫu 2 phần triệu để pha ống mẫu đối chiếu. Phương pháp 1: chuẩn bị đồng thời 3 ống nghiệm Bảng 1.2. Quy trình chuẩn bị ống thử, ống chuẩn và ống trắng Ống thử Ống chuẩn Ống trắng Chế phẩm S (ml) 12ml 2ml 2ml Dung dịch ion chì mẫu 2 phần triệu (TT) (ml) 10ml Nước cất (ml) 10ml Dung dịch đệm acetat pH 3,5 (ml) 2ml 2ml 2ml Dung dịch thioacetamid (TT) (ml) 1,2ml 1,2ml 1,2ml Lắc ngay và để yên 2 phút So sánh màu tạo trong ống thử và ống chuẩn. Màu nâu trong ống thử không được đậm hơn màu trong ống chuẩn. Ống chuẩn có màu nâu nhạt khi được so sánh với ống trắng. 2.5.5. Sắt: không được quá 10 phần triệu (phụ lục 9.4.13) Tiến hành đồng thời theo bảng sau: 8 Bảng 1.3. Quy trình chuẩn bị ống thử và ống chuẩn thử giới hạn sắt Ống thử (Nessler thử) Ống chuẩn (Nessler chuẩn) Chế phẩm S (ml) 10 0 Dung dịch sắt mẫu 1ppm (TT) (ml) 10 Acid citric (ml) 2 ml 2ml Acid mercapto acetic 10M (ml) 0,1ml 0,1ml Lắc đều Dung dịch amoniac 10M (TT) (ml) Kiềm hóa Kiềm hóa Nước cất (ml) Vừa đủ 20ml Vừa đủ 20ml Màu hồng tạo thành trong dung dịch thử không được đậm hơn màu chuẩn. 2.5.6. Magnesi và muối kim loại kiềm: không được quá 0,5% Lấy 20ml dung dịch S, thêm 80ml nước, 2g amoni clorid (TT) và 2ml dung dịch amoniac 10% (TT). Đun sôi. Rót vào dung dịch đang sôi này một dung dịch đang nóng gồm 5g amoni oxalat (TT) đã hòa tan trong 75ml nước. Để yên trong 4 giờ. Pha loãng thành 200ml bằng nước rồi lọc. Lấy 100ml dịch lọc, thêm 0,5ml acid sulfuric (TT). Bốc hơi cách thủy đến khô rồi nung ở 600 0C đến khối lượng không đổi. Lượng cặn không quá 5mg. 2.6. Định lượng Cấn chính xác khoảng 0,735g CaCl2.2H2O (khoảng 0,05M) cho vào bình định mức 100ml. Điền nước đến vạch. Lắc đều. Hút chính xác 10ml cho vào bình nón 250ml. Thêm 90ml nước cất, 10ml NaOH 2N, thêm 0,1g chỉ thị Muretxit (khoảng một hạt đậu xanh). Định lượng bằng dung dịch EDTA 0,05M. 1ml dung dịch EDTA 0,05M tương đương với 7,35mg CaCl2.2H2O Định lượng Calci clorid theo DĐVN IV (sinh viên tham khảo thêm) Hòa tan 0,280g chế phẩm trong 100ml nước và tiến hành định lượng calci bằng phương pháp chuẩn độ complexon (phụ lục 10.5). 1ml dung dịch Trilon B 0,1M (CĐ) tương đương với 14,70mg CaCl2.2H2O. Lấy một lượng dung dịch chế phẩm như chỉ dẫn trong chuyên luận cho vào một bình nón 500ml rồi pha loãng với nước cất thành 300ml. Thêm 6ml dung dịch natri hydroxyd 10M (TT) và khoảng 15mg hổn hợp calcon (TT) rồi chuẩn độ bằng dung dịch trilon B 0,1M 9 (CĐ) đến khi màu của dung dịch chuyển từ tím sang xanh hoàn toàn. 1ml dung dịch trilon B 0,1M tương đương với 14,70mg CaCl2.2H2O. 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ: viết báo cáo theo phiếu kiểm nghiệm. CÂU HỎI 1. Tại sao phải xác định giới hạn acid- base trong kiểm nghiệm nguyên liệu ? 2. Tại sao phải xác định giới hạn tạp chất trong nguyên liệu ? 3. Định lượng Calci clorid theo nguyên tắc nào trong phép chuẩn độ thể tích. 10 BÀI 2 KIỂM NGHIỆM THUỐC VIÊN NANG DOPAGAN (PARACETAMOL 500 mg) (TCCS) MỤC TIÊU Thực hiện những yêu cầu kỹ thuật đã được học trong phần lý thuyết của bài KIỂM NGHIỆM THUỐC VIÊN NANG. NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KIỂM NGHIỆM 1.1. Hình thức cảm quan: Viên nang cứng, một đầu đỏ, một đầu trắng. Mặt nang khô, bóng, thuốc chứa trong nang màu trắng. 1.2. Thời gian thử rã: không quá 15 phút (phụ lục 11.6 DĐVN IV) 1.3. Chênh lệch về khối lượng: được phép ±7,5% so với khối lượng trung bình của bột thuốc trong một nang (phụ lục 11.3 DĐVN IV) 1.4. Định tính: phải có phản ứng đặc trưng của paracetamol và phổ IR của paracetamol trong nang phải giống với phổ IR của paracetamol đối chiếu. 1.5. Định lượng: chế phẩm phải chứa 475 – 525 mg paracetamol trong một nang tính theo khối lượng trung bình của bột thuốc chứa trong một nang. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Hình thức cảm quan: thử bằng cảm quan chế phẩm phải đạt yêu cẩu nêu trên 2.2. Độ đồng đều khối lượng: tiến hành với 20 nang. Cân riêng từng nang (cả vỏ và thuốc). Sau đó, dốc hết hoạt chất ra có thể dùng bông gòn để lau cho thật sạch đối với nang cứng hoặc dùng ether hay một dung mội thích hợp để rửa nang cho sạch đối với nang mềm. Cân vỏ nang rỗng, khối lượng của từng nang là hiệu số giữa hai lần cân. Xác định khối lượng trung bình của nang. Mẫu thử đạt yêu cầu khi có khộng được quá 2 viên có khối lượng lệch quá độ lệch phần trăm của khối lượng trung bình và không có viên nào vượt quá 2 lần độ lệch đó. Bảng 3.1. Bảng quy định độ đồng đều khối lượng của viên nang Khối lượng trung bình % chênh lệch so với khối lượng trung bình Nhỏ hơn 300mg ±10 Lớn hơn hoặc bằng 300mg ±7,5 2.3. Định tính - Lắc 0,5 gam chế phẩm trong 10 ml nước, thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid (TT) 11 xuất hiện màu xanh tím hơi nâu, để lâu chuyển thành màu nâu. - Lấy 0,5 gam chế phẩm đun trong 2ml dung dịch hydroclorid 10% (TT) đun sôi trên đèn cồn trong 3 phút, thêm 10 giọt nước, để nguội, vài 1 giọt dung dịch kali dicromat 5% (TT) xuất hiện màu tím hơi đỏ sau 30 phút sẽ chuyển sang tím hoàn toàn, không được chuyển sang đỏ. - Đo phổ IR: lấy cắn trên đo phổ IR, so sánh với phổ IR của paracetamol chuẩn 2.4. Định lượng 2.4.1. Bằng phương pháp đo quang Lấy 20 viên tán thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương ứmg với 100m paracetamol, cho vào bình định mức 100ml, thêm 20ml dung dịch NaOH 0,1N (TT), thêm 10ml nước cất, lắc 15 phút, thêm nước cất tới vạch. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20 – 30 ml dung dịch đầu. lấy chính xác 5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 50ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều. Lấy chính xác 5ml dunh dịch trên cho vào bình định mức 50 ml, thêm 5ml dung dịch NaOH 0,1N, thêm nước cất tới vạch, lắc đều. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 257 nm, cốc dày 1cm. Mẫu trắng là dung dịch NaOH 0,01N, lấy 11A của paracetamol tinh khiết ở 257 nm là 715. Kết quả: lượng paracetamol có trong một viên được tính theo công thức 2.4.2. Bằng phương pháp sắc ký hiệu năng cao Điều kiện sắc ký tối ưu - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 elite. - Cột Phenomenex lunar RP – C18 (250 x 4,6mm, 5µm) - Pha động (MP): MeOH: H2O: acid acetic băng = (20:76:4) - Đầu dò UV – Vis: phát hiện ở bước sóng 257 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20µl - Tốc độ dòng 1ml/phút Pha dung dịch chuẩn đối chiếu:pha dung dịch Paracetamol đối chiếu trong pha động. Cân 50 mg pha động trong bình định mức 50ml vối pha động, hút chính xác 2ml pha loãng trong bình định mức 50ml, lọc qua màng lọc milipore 0,46µm. Pha dung dịch thuốc thử: lấy 20 viên, tán thành bột mịn. cân một lượng bột viên tương ứng với 100mg paracetamol, cho vào bình định mức 100ml. Cho pha động vào siêu )(10 100 1 715 )( 7 mg P mA mgC tbxx  12 âm 10 phút. Lọc qua giấy lọc bỏ 20-30 ml, thu được dung dịch B. Hút chính xác 2ml dung dịch B cho vào bình định mức 50 ml. thêm pha động vào tới vạch, lọc qua màn lọc milipore 0,46µm. Dung dịch này sẽ được dùng để định lượng paracetamol có trong viên nang bằng phương pháp sắc ký lỏng, kết quả: lượng paracetamol có trong 1 viên được tính theo công thức St: dt đỉnh paracetamol có trong dung dịch mẫu thử Sc: dt đỉnh paracetamol có trong dung dịch mẫu chuẩn tiêm vào cột (mg/ml) m: khối lượng trung bình của bột thuốc trong một viên nang p: lượng mẫu thử đã cân để pha dung dịch thử (g) 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ: theo phiếu kiểm nghiệm. CÂU HỎI 1. Nêu rõ cácch kiểm nghiệm độ chênh lệch về khối lượng của viên nang? 2. Nêu vài phương pháp định tính paracetamol? 3. Nêu vài phương pháp định lượng paracetamol? 4. Thiết lập công thức tính hàm lượng paracetamol khi định lượng paracetamol khi định lượng bằng phương pháp đo quang? pS mmS mgP c tbct    2550 25100 )( 13 Bài 3 KIỂM NGHIỆM THUỐC TIÊM VITAMIN B12 1000  (g/ml) (TC DĐVN IV) MỤC TIÊU 1. Thực hiện được những yêu cầu kỹ thuật chung đã học trong bài “Kiểm nghiệm thuốc tiêm” (xem phụ lục thuốc tiêm PL27 DĐVN IV). 2. Thực hiện phương pháp UV-Vis để định tính và định lượng NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KIỂM NGHIỆM 1.1. Tính chất: chế phẩm ở dạng lỏng, trong suốt, màu đỏ mận, đóng trong ống thủy tinh không màu. 1.2. Độ trong: chế phẩm phải trong và hầu như không có tạp chất cơ học nhìn thấy được 1.3. Độ đồng đều thể tích: thể tích của mỗi ống phải từ 100-115% của thể tích ghi trên nhãn. 1.4. pH: 4,0-5,5 (PL 6.2 DĐVN IV, trang PL144) 1.5. Tạp chất liên quan: không quá 6% 1.6. Định tính: phải có các phản ứng đặc trưng của vitamin B12 khi đo phổ UV-Vis. 1.7. Định lượng: hàm lượng vitamin B12 trong 01 ống phải đạt từ 950-1150 mcg/ml. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ Theo chuyên luận thuốc tiêm vitamin B12, DĐVN IV, trang 203. 2.1. Tính chất Quan sát các ống thuốc tiêm dưới ánh sáng ban ngày bằng mắt thường và so sánh với yêu cầu. 2.2. Độ trong Dung dịch thuốc tiêm khi soi bằng mắt thường ở điều kiện thích hợp phải trong và hầu như không có tạp chất cơ học (PL 11.8). Thực hiện trên 20 ống (V  5 ml), có  02 ống có nhiều nhất 01 vật thể nhìn thấy được. 2.3. Độ đồng đều thể tích (PL 11.1) Lấy 6 ống (01 ống tráng bơm tiêm, 05 ống để đo thể tích). Kiểm tra bằng cảm quan 14 các ống thử phải có thể tích thuốc tiêm gần bằng nhau. Dùng bơm tiêm khô sạch có kim tiêm thích hợp, có dung tích không quá 2,5 lần so với thể tích cần đo. Lấy thuốc vào bơm tiêm sao cho bơm tiêm không có bọt khí và trong kim tiêm vẫn chứa đầy thuốc tiêm. Lần lượt lấy hết thuốc trong từng ống để đo theo cách đó. Kết quả thể tích của từng ống phải từ 100 -115% của thể tích ghi trên nhãn. 2.4. pH Theo PL 6.2 Đo trên pH kế với điện cực Calomel- thủy tinh. Chuẩn hóa máy với 2 dung dịch đệm chuẩn 4,01 và 6,86 (250C). Thể tích dung dịch đo: 10ml 2.5. Tạp chất liên quan Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu của chuyên luận thuốc tiêm cyanocobalamin của DĐVN IV trang 204. Tiến hành như sau:  Cột RP-C18 (150 x 4,6mm, 5m)  Pha động (MP): MeOH – acid phosphoric 0,1% (26: 74)  Bước sóng: 361 nm  Thể tích tiêm mẫu: 20 l  Tốc độ dòng: 1 ml/ phút Dung dịch thử: Pha loãng mẫu thử trong pha động để có 500 g cyanocobalamin/ 1ml. Dung dịch chuẩn a: Pha loãng mẫu thử trong pha động để có 30g cyanocobalamin/ 1ml. Dung dịch thử b: Pha loãng mẫu thử trong pha động để có 10g cyanocobalamin/ 1ml. Dung dịch thử c: Lấy 1 thể tích mẫu thử có chứa 5mcg cyanocobalamin, thêm 1ml cloramin T 0,1% (kl/tt) và 0,1 ml dung dịch HCl 0,05M rồi thêm nước cho vừa đủ 10ml, lắc đều để yên 5 phút. Pha loãng 2ml dung dịch này với pha động cho vừa đủ 10ml. Chú ý: dung dịch chuẩn c phải đo ngay sau khi pha, các dung dịch khác không được để quá 1 giờ. Thời gian phân tích mẫu trên HPLC gấp ít nhất 3 lần thời gian lưu của cyanocobalamin. 15 Cách đánh giá: Trong sắc ký đồ của dung dịch thử, tổng diện tích của các pic phụ ngoài pic chính không được lớn hơn diện tích pic chính thu được trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn a (3%). Bỏ qua tất cả các pic mà diện tích của chúng nhỏ hơn diện tích pic chính thu được trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn b. Phép thử chỉ có giá trị khi trong sắc ký đồ của dung dịch chuẩn c có 2 pic chính và hệ số phân giải giữa 2 pic này ít nhất là 1,5. Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn b có 1 pic chính và tỉ số diện tích của pic này so với độ nhiễu của đường nền không nhỏ hơn 5. 2.6. Định tính Trong phần định tính, phổ tử ngoại của dung dịch mẫu thử có các hấp thụ cực đại ở 278 nm, 361 nm và ở khoảng 547 đến 559 nm. Tỷ số độ hấp thụ ở cực đại 361 nm so với độ hấp thụ ở cực đại khoảng 547nm đến 559 nm từ 3,15 đến 3,45. Tỷ số độ hấp thụ ở cực đại 361 nm so với độ hấp thụ ở cực đại 278 nm từ 1,70 đến 1,90. 2.7. Định lượng 2.7.1. Phương pháp UV-Vis Pha loãng dung dịch chế phẩm với nước để có nồng độ 0,0020% (20g/ml). Lấy chính xác 1ml cho vào bình định mức 50ml. Thêm nước cất đến vạch để pha loãng. Đo độ hấp thu ở bước sóng 361 nm trong cốc đo dày 1cm, mẫu trắng sử dụng là nước cất pha tiêm (chú ý trong suốt quá trình định lượng phải tránh ánh sáng). Hàm lượng vitamin B12 tính theo % hàm lượng ghi trên nhãn được tính theo công thức sau (lấy A(1%, 1cm) = 207). 207 50.10. 4TAX  Trong đó: X: Hàm lượng của vitamin B12 AT: độ hấp thu của mẫu thử 2.7.2. Phương pháp HPLC Dung dịch thử: pha loãng chính xác 1 ml chế phẩm với nước để có nồng độ 0,002% (20 mcg/ml) trong bình địnhm mức 50 ml. Dung dịch chuẩn: cân chính xác khoảng 0,01 g vitamin B12 chuẩn đối chiếu, pha 16 trong bình định mức 50 ml với nước, sau đó pha loãng 10 lần với nước để có dung dịch chuẩn có nồng độ 0,002% (20 mcg/ml). Điều kiện sắc ký:  Cột RP-C18 (150 x 4,6mm, 5m)  Pha động (MP): MeOH – acid phosphoric 0,1% (26: 74)  Bước sóng: 361 nm  Thể tích tiêm mẫu: 20 l  Tốc độ dòng: 1 ml/ phút 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ Viết phiếu kiểm nghiệm và phiếu phân tích. Trả lời câu hỏi. CÂU HỎI 1. Vẽ công thức cấu tạo của vitamin B12. Tên IUPAC của chất này là gì? Vitamin B12 còn có tên gọi khác là gì? 2. Điều kiện để một chất có thể định lượng bằng phương pháp UV-Vis là gì? Vitamin B12 thỏa được điều kiện nào? 3. Kể tên một số tạp chất liên quan trong thuốc tiêm vitamin B12 4. Vitamin B12 khi đo quang có bao nhiêu đỉnh cực đại? Người ta hay dùng đỉnh nào để định lượng? Tại sao? 5. Nêu 2 phương pháp xác định thể tích thuốc tiêm 6. So sánh 2 phương pháp định lượng UV-Vis và HPLC 7. Mục đích của việc xác định tỉ số hấp thu trong phần định tính là gì? 8. Khi đo pH của dung dịch vitamin B12 phải sử dụng cặp điện cực gì? Cấu tạo của cặp điện cực trên. 9. Tại sao phải chuẩn máy pH với dung dịch đệm 4,01 và 6,86? Qua ngày hôm sau có cần chuẩn lại không? Cơ chế đo pH của cặp điện cực trên là gì? 10. Tại sao trong quá trình định lượng vitamin B12 phải tránh ánh sáng? Viết phương trình phản ứng xảy ra. 11. Kể tên một số chế phẩm có chứa vitamin B12. 12. Trình bày các bước tiến hành quét phổ (định tính) trên máy UV đã học 13. Trình bày các bước tiến hành đo điểm (định lượng) trên máy UV đã học. 14. Vẽ hình hệ thống máy UV-Vis đã học. Chú thích các bộ phận. 17 BÀI 4 KIỂM NGHIỆM THUỐC NHỎ MẮT NEODEX MỤC TIÊU 1. Thực hiện những yêu cầu kỹ thuật đã được học trong phần lý thuyết của bài KIỂM NGHIỆM THUỐC NHỎ MẮT 2. Ứng dụng được kỹ thuật sắc ký lớp mỏng vào kiểm nghiệm chế phẩm nhiều thành phần hoạt chất. NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KIỂM NGHIỆM 1.1. Hình thức Dung dịch không màu hoặc có màu vàng nhạt, không mùi, vị mặn, hơi đắng. 1.2. Chênh lệch thể tích: + 10% so với thể tích ghi trên nhãn. 1.3. Độ trong: phải đạt theo tiêu chuẩn quy định 52 TCN 315-87. 1.4. pH: 6,0 – 7,7. 1.5. Định tính Phải có phản ứng hóa học đặc trưng của neomycin sulfat và dexamethason natri phosphat hoặc dexamethason. 1.6. Định lượng Chế phẩm phải chứa: - Neomycin từ 306,000 – 442,000 UI. - Dexamethason natri phosphat từ 90 – 110% hàm lượng ghi trên nhãn cho 100 ml chế phẩm. 1.7. Độ nhiễm khuẩn Phải đạt các tiêu chí quy định thử nghiệm vô khuẩn (PL 13.7 trang PL 266). 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Hình thức: chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu trên. 2.2. Chênh lệch thể tích Lấy 5 chai bất kỳ, xác định thể tích thuốc nhỏ mắt có trong từng chai bằng bơm tiêm chuẩn hoặc bằng ống đong sạch, khô, có độ chính xác phù hợp. Thể tích mỗi đơn vị phải nằm trong giới hạn cho phép. Nếu có 1 chai không đạt thì phải kiểm tra lại lần thứ 2 giống như lần đầu. Chế phẩm này đạt yêu cầu nếu trong lần thử này không có đơn vị nào có thể tích nằm ngoài giới hạn cho phép. 18 2.3. Độ trong Dùng ống nghiệm có nút đậy, rửa sạch và dùng nước cất soi đảm bảo không có bụi, tạp chất cơ học. Đổ nước ra, cho dung dịch chế phẩm vào soi. Chế phẩm phải trong suốt không có bụi, cặn, xơ bông hay những tạp chất cơ học khác, 2.4. pH: thử theo DĐVN IV, phụ lục 6.2 – PL 144. 2.5. Định tính 2.5.1. Định tính Neomycin sulfat Lấy 2 ml chế phẩm cho vào ống nghiệm, thêm 0,1 ml Pyridin và vài giọt dung dịch Ninhydrin 0,1%, đun cách thủy ở 65 – 70 0C trong 5 – 10 phút sẽ xuất hiện màu tím đậm. Lấy 0,5 ml chế phẩm cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch HCl (TT) và 1 ml dung dịch BaCl2 (TT), lắc đều, để yên trong 10 phút sẽ xuất hiện tủa trắng. 2.5.2. Định tính Dexamethason 2.5.2.1. Bằng phản ứng hóa học Lấy 2 ml chế phẩm cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch HCl loãng (TT) và 2 ml dung dịch INH 0,05% trong MeOH, đun cách thủy ở 65 – 70 0C trong 5 – 10 phút sẽ xuất hiện màu vàng. Lấy 2 ml chế phẩm cho vào ống nghiệm, thêm 3 giọt dung dịch xanh tetrazolium 1% trong MeOH, 1 ml NaOH/MeOH, 1 ml tetramethylamonium hydroxyd 10%, lắc đều và để tránh ánh sáng (hay đun cách thủy 5 phút) dung dịch sẽ có màu hồng tím. 2.5.2.2. Bằng sắc ký lớp mỏng Bản mỏng 5 x 20 cm Silicagel F254 tráng sẵn. Dung dịch thử: lấy 2 ml chế phẩm cô cách thủy còn khoảng 0,1 ml, chấm khoảng 20 µl dịch này lên bản mỏng. Dung dịch đối chiếu: 10 mg dexamethason natriphosphat hòa tan trong 1 ml nước, chấm khoảng khoảng 20 µl dịch này lên bản mỏng. Hệ dung môi khai triển: n-butanol – acid acetic – nước (4: 1: 5). Thuốc thử phát hiện: phun H2SO4 10%/cồn và thêm vài giọt formol rồi sấy ở 110 0 C trong 10 phút (hay hơ hơi iod). Kết quả: dịch chấm của chế phẩm phải cho 1 vết tương đương về màu sắc và Rf với dung dịch dexamethason natriphosphat chuẩn (có thể soi UV). 2.6. Định lượng 19 2.6.1. Phương pháp UV – Vis Hút chính xác 1 ml chế phẩm cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều. Đo mật độ quang của dung dịch này ở bước sóng 241 nm trong cốc đo dày 1 cm, dùng nước cất làm mẫu trắng. % Hàm lượng dexamethason natri phosphat tính theo công thức: 100 5,5297 550   TA Với AT: độ hấp thu của dexamethason natri phosphat trong mẫu thử ở 241 nm. 297: E1cm của dexamethason natri phosphat trong mẫu chuẩn ở 241 nm. 2.6.2. Phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký tối ưu - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu - Cột RP-C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm). - Pha động (MP): CAN: đệm phosphat (20: 80) (KH2PO4 0,01 M pH 3,97 trong hỗn hợp đồng lượng MeOH-H2O) - Đầu dò UV – Vis: phát hiện ở bước sóng 242 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. - Tốc độ dòng: 1,4 ml/phút. Dung dịch chuẩn (được pha chế ngay khi dùng): dung dịch dexamethason natri phosphat chuẩn trong pha động có nồng độ chính xác khoảng 110 µg/ml, tính theo dexamethason phosphat. Dung dịch thử: lấy chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với khoảng 1,1 mg dexamethason phosphat pha loãng thành 10 ml bằng pha động và trộn đều. Cách tiến hành: kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký: tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của các diện tích đáp ứng từ 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0%. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch thử và dung dịch chuẩn. % Hàm lượng dexamethason natri phosphat tính theo công thức: 100 5,5 5 10  C C T C S S CC: nồng độ mẫu chuẩn (µg/ml) ST: diện tích đỉnh mẫu thử 20 SC: diện tích đỉnh mẫu chuẩn 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ: theo phiếu kiểm nghiệm CÂU HỎI 1. Hãy kể vài dạng chế phẩm nhỏ mắt có chứa dexamethason trên thị trường (nội và ngoại nhập) 2. Nhóm chức nào trong phân tử dexamethason phản ứng với thuốc thử Fehling? 3. Nêu các phản ứng đặc trưng để định tính dexamethason. 4. Trình bày các chỉ tiêu chung của thuốc nhỏ mắt cần thực hiện theo quy định (PL 1.14 trang PL-21) 5. So sánh kết quả giữa hai phương pháp định lượng. 21 BÀI 5 KIỂM NGHIỆM THUỐC BỘT PABEMIN TRẺ EM (TCCS) MỤC TIÊU Thực hiện những yêu cầu kỹ thuật đã được học trong phần lý thuyết của bài KIỂM NGHIỆM THUỐC BỘT, CỐM. NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KIỂM NGHIỆM 1.1. Hình thức cảm quan: dạng bột đôi khi hạt nhỏ, màu cam, vị đắng, có mùi thơm. Bột để ngoài không khí trong vòng 24 giờ phải không được chảy nước. 1.2. Chênh lệch khối lượng đóng gói: ±5% so với khối lượng ghi trên nhãn. 1.3. Độ ẩm: không quá 2% nếu là thuốc cốm (sấy ở 105oC). 1.4. Định tính - Phải có phản ứng của thiamin nitrat, clorpheniramin maleat, paracetamol. - Phải có phổ hồng ngoại của paracetamol trong chế phẩm giống với phổ paracetamol chuẩn. 1.5. Định lượng: trong 1 gói phải chứa: - Paracetamol: 308,8 – 341,3 mg - Thiamin nitrat: 9,0 – 11,0 mg - Clorpheniramin maleat: 1,8 – 2,2 mg Tính theo khối lượng trung bình của 1 gói. 1.6. Độ mịn: theo tiêu chuẩn cơ sở. 1.7. Độ đồng đều hàm lượng: clorpheniramin maleat 1,8 – 2,2 mg. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Hình thức cảm quan: thuốc phải đạt yêu cầu đã nêu. 2.2. Chênh lệch khối lượng Cân từng gói trong số 5 gói được lấy bất kỳ. Tất cả các gói phải đạt quy định 5% so với khối lượng ghi trên nhãn. Nếu có 1 gói có khối lượng lệch ra ngoài quy định này thì phải thử lại với 5 gói khác. Tất cả 5 gói thử lại lần 2 phải đạt thì mới đạt. Chú ý: sau khi cân phải bỏ hết thuốc ra, dùng bông lau sạch thuốc trong vỏ, rồi tính 22 khối lượng từng gói. 2.3. Độ ẩm: sấy 1 gam bột ở 100oC – 105oC đến khi trọng lượng không đổi, độ ẩm không quá 2%. 2.4. Định tính 2.4.1. Định tính clorpheniramin maleat (dùng sắc ký lớp mỏng): - Chuẩn bị mẫu chuẩn: cân 10 mg Clorpheniramin maleat hòa tan với 10ml cloroform. - Chuẩn bị mẫu thử: lấy khoảng 1/2 gói cốm chiết với 10ml cloroform trong một ống nghiệm, lắc kỹ, lọc vào một chén sứ, làm bay hơi dịch lọc còn 1ml. - Thực hiện sắc ký: + Bản mỏng tráng sẵn lớp silica gel F254 dày 0,25mm, kích thước 3cm x 10cm. + Chấm 10 μl mẫu thử và chấm 10 μl mẫu chuẩn lên bảng mỏng. + Triển khai với hệ dung môi: Benzen – EtOH – NH4OH (85:15:1). + Sau khi triển khai, để khô bảng mỏng ở nhiệt độ phòng, phun thuốc thử hiện màu Dragendoff, hoặc hơ hơi iod. Mẫu thử, mẫu chuẩn phải cho vết cùng Rf (Rf ≈ 0,45) và cùng màu (màu vàng sậm mất nhanh ngoài không khí). 2.4.2. Định tính thiamin nitrat - Lấy 1,5 gam bột cốm đã nghiền mịn cho vào ống nghiệm, thêm vào 10ml nước cất, lắc kỹ, lọc vào một ống nghiệm khác. Lấy 5ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch NaOH (TT) lắc kỹ và vài giọt kaliferrycianid 5% (TT) với 2ml n-BuOH. Lắc mạnh 1-2 phút. Để yên, lớp cồn có màu xanh tím khi xem dưới đèn tử ngoại. Khi acid hóa dung dịch, lắc mạnh, quỳnh quang sẽ mất đi, kiềm hóa dung dịch thì quỳnh quang trở lại. - Thử nitrat: lấy 3ml dịch lọc, thêm từ từ 1ml dung dịch FeSO4 10% cho cẩn thận theo thành ống nghiệm 2ml acid sulfuric đậm đặc, để nguội dung dịch, ở vùng tiếp giáp giữa hai chất lỏng có một vòng màu nâu. 2.4.3. Định tính paracetamol - Phản ứng trong ống nghiệm: lắc 0,5 gam chế phẩm trong 10ml nước, thêm vài giọt sắt (III) clorid (TT) xuất hiện màu xanh tím hơi nâu, để lâu sẽ chuyển sang màu nâu. - Lắc kỹ 1,0 gam chế phẩm với 10ml aceton, lọc lấy dịch. Để dịch aceton bốc hơi tới cắn, Hòa tan một ít cắn trong 2ml dung dịch acid hydroclorid 10% (TT), đun sôi trên đèn cồn trong 3 phút, thêm 10 giọt nước, để nguội, thêm 1 giọt dung dịch kali dicromat 5% (TT) xuất hiện màu tím hơi đỏ sau 30 phút sẽ chuyển sang tím hoàn toàn, 23 không được chuyển sang đỏ. - Đo phổ IR: lấy cắn trên đo phổ IR, so sánh với phổ IR của paracetamol chuẩn. 2.5. Định lượng Định lượng đồng thời ba hợp chất bằng phương pháp HPLC - Chuẩn bị mẫu: Dung dịch clorpheniramin maleat chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 20mg clorpheniramin maleat chuẩn, hòa tan trong khoảng 30ml đệm phosphat pH 7 cho vào bình định mức dung tích 100ml, sao đó thêm đệm phosphat pH 7 vừa đủ, lắc đều và lọc qua màng lọc kích thước 0,45μm được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ clorpheniramin maleat khoảng 200μm/ml. Dung dịch thiamin mononitrat chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 40mg thiamin mononitrat chuẩn, hòa tan trong khoảng 30ml đệm phosphat pH 7 cho vào bình định mức dung tích 100ml, sau đó thêm đệm phosphat pH 7 vừa đủ, lắc đều và lọc qua màng lọc kích thước 0,45μm được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ clorpheniramin maleat khoảng 400μm/ml. Dung dịch hỗn hợp chuẩn paracetamol, clorpheniramin maleat, thiamin mononitrat: Cân chính xác khoảng 32,5mg paracetamol chuẩn, hòa tan trong khoảng 20ml đệm phosphat pH 7 cho vào bình định mức dung tích 50ml, sau đó thêm chính xác 1ml dung dịch clorpheniramin maleat chuẩn gốc và chính xác 2,5ml dung dịch thiamin mononitrat chuẩn gốc vào bình. Lắc đều và thêm đệm pH 7 vừa đủ. Lắc đều và lọc qua màng lọc kích thước 0,45μm được dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ paracetamol khoảng 650μg/ml, clorpheniramin maleat khoảng 4μg/ml và thiamin mononitrat khoảng 20μg/ml. Mẫu thử từ chế phẩm Pabemin®: Cho 5 gói Pabemin® vào trong cối, nghiền trộn đều. Cân chỉnh khoảng 0,125g chế phẩm, hòa tan trong khoảng 10ml đệm phosphat pH 7 cho vào bình định mức dung tích 25ml, sau đó thêm đệm phosphat pH 7 vừa đủ, lắc đều và lọc qua màng lọc kích thước 0,45μm được dung dịch mẫu thử để tiêm sắc ký. - Điều kiện sắc ký tối ưu khảo sát được cho quy trình định lượng Pabemin®: + Hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000, DAD L-2455. + Pha tĩnh: cột Phenomenex Gemini RP-C18 (150mm x 4,6mm, 5μm, 110Å). + Thể tích tiêm mẫu: 20μl 24 + Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng + Chương trình chạy: Bảng 7.2. Chương trình chạy mẫu tối ưu khảo sát được Thời gian (phút) AcN (%) Methanol (%) Nước (%) Đệm pH 7 (%) Tốc độ dòng (ml/ phút) 0 0,8 7,2 0 92 2 3,5 0,8 7,2 0 92 2 3,6 5 25 0 70 2 20 5 25 0 70 2 + Bước sóng phát hiện paracetamol tại 300nm, clorpheniramin maleat tại 225nm, thiamin mononitrat tại 275nm. - Tiêm lần lượt các mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống HPCL/PDA, xác định diện tích đỉnh paracetamol, clorpheniramin maleat và thiamin mononitrat của mẫu hỗn hợp chuẩn và mẫu thử, rồi tính toán hàm lượng paracetamol, clorpheniramin maleat trong 2,5g chế phẩm. - Hàm lượng paracetamol (mg) trong 2,5g chế phẩm được tính theo công thức: Xparacetamol = 2 mPab ST1 SC1 .m1.a1.2,5 (1) Hàm lượng clorpheniramin maleat (mg) trong 2,5g chế phẩm được tính theo công thức: Xclorpheniramin = 1 mPab.50 ST2 SC2 .m2.a2.2,5 (2) Hàm lượng thiamin mononitrat (mg) trong 2,5g chế phẩm được tính theo công thức: Xthiamin = 2.5 mPab ST3 SC3 .m3.a3.2,5 (3) Trong đó: mPab: là khối lượng bột thuốc Pabemin® (g). ST1, ST2, ST3: lần lượt là diện tích đỉnh của paracetamol, clorpheniramin maleat và thiamin mononitrat trong mẫu thử. SC1, SC2, SC3: lần lượt là diện tích đỉnh của paracetamol, clorpheniramin maleat và thiamin mononitrat trong mẫu chuẩn. m1, m2, m3: lần lượt là khối lượng paracetamol chuẩn, clorpheniramin maleat chuẩn và thiamin mononitrat chuẩn (mg). 25 a1, a2, a3: lần lượt là độ tinh khiết của các chất chuẩn paracetamol, clorpheniramin maleat và thiamin mononitrat. 2.6. Độ đồng đều hàm lượng (clopheniramin maleat) Chuẩn bị mẫu thử Lấy hết bột thuốc trong 1 gói nghiền mịn, cân khoảng 0,125 g chế phẩm, hòa tan trong khoảng 10 ml đệm phosphat pH 7 cho vào bình định mức dung tích 25 ml, sau đó thêm đệm phosphat pH 7 vừa đủ, lắc đều và lọc qua màng lọc kích thước 0,45 μm được dung dịch mẫu thử để tiêm sắc ký. Làm tương tự với 9 gói nữa. Định lượng thành phần clorpheniramin maleat theo phương pháp định lượng như trên. Tính độ đồng đều hàm lượng clopheniramin theo DDVN IV (phương pháp 1 phụ lục 11.2 trang PL-221): - Chế phẩm đem kiểm tra đạt yêu cầu phép thử nếu không quá 1 đơn vị có giá trị hàm lượng nằm ngoài giới hạn 85 – 115% của hàm lượng trung bình và không đơn vị nào nằm ngoài giới hạn 75 – 125% của hàm lượng trung bình. - Chế phẩm không đạt yêu cầu phép thử nếu có quá 3 đơn vị có giá trị hàm lượng nằm ngoài giới hạn 85 – 115% của hàm lượng trung bình hoặc có 1 hay nhiều đơn vị nằm ngoài giới hạn 75 – 125% của hàm lượng trung bình. - Nếu có 2 hoặc 3 đơn vị có giá trị hàm lượng nằm ngoài giới hạn 85 – 115% của hàm lượng trung bình nhưng ở trong giới hạn 75 – 125% của hàm lượng trung bình thì thử lại trên 20 đơn vị khác, lấy ngẫu nhiên. Chế phẩm kiểm tra đạt yêu cầu phép thử nếu không quá 3 đơn vị trong tổng số 30 đơn vị đem thử có giá trị hàm lượng nằm ngoài giới hạn 85 – 115% của hàm lượng trung bình và không có đơn vị nào nằm ngoài giới hạn 75 – 125% của hàm lượng trung bình. 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ: theo phiểu kiểm nghiệm. CÂU HỎI 1.Viết công thức khai triển của paracetamol, thiamin hydroclorid, clorpheniramin maleat. Có thể nhận xét rằng thiamin hydroclorid và clorpheniramin maleat có cấu trúc như một base hữu cơ được không? Tại sao? 2. Giải thích cơ chế định lượng? 3. Theo DĐVN IV, để tính sai số khối lượng của dang thuốc gói thì phải cần bao nhiêu gói và cách tính ra sao? 4. Viết cơ chế các phản ứng định tính paracetamol, thiamin HCl? 26 5. Trong quy trình định lượng, có thể thay helianin bằng 1 thuốc thử khác được không? Có thể thay cloroform bằng dung môi hữu cơ khác có được không? 6. Ngoài hệ đệm phosphat còn sử dụng hệ đệm nào khác không? Tại sao? 7. Giải thích công thức tính hàm lượng từng hoạt chất trong chế phẩm Pabemin? 8. Chương trình chạy trong điều kiện sắc ký ở trên là gradient, có thể chạy chương trình đẳng dòng được không? Loại dung môi dùng cho chạy gradient cũng dùng cho chạy đẳng dòng được không? 9. Có thể phân tích 3 hoạt chất trên ở cùng một bước sóng? Tại sao? 27 BÀI 6 KIỂM NGHIỆM THUỐC VIÊN NÉN SULFAGUANIDIN 500 mg MỤC TIÊU 1. Thực hiện những yêu cầu kỹ thuật đã được học trong phần lý thuyết của bài KIỂM NGHIỆM THUỐC VIÊN NÉN. 2. Thực hiện được phép chuẩn độ điện thế tự động. 3. Hiểu được cơ chế phản ứng của định lượng bằng phương pháp nitrit. NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KIỂM NGHIỆM 1.1 Hình thức cảm quan: viên màu trắng. 1.2. Độ đồng đều khối lượng: ± 5% so với khối lượng trung bình của thuốc trong viên. 1.3. Độ rã: thời gian rã không được quá 15 phút. 1.4. Định tính: phải có phản ứng của sulfaguanidin. 1.5. Định lượng: hàm lượng sulfaguanidin C7H10N4O2S từ 95,0 - 105,0% so với hàm lượng ghi trên nhãn. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Hình thức: nhận xét bằng cảm quan, viên phải đạt yêu cầu đã nêu. 2.2. Độ rã: thực hiện theo chuyên luận “thuốc viên nén”, phụ lục 1.20 của DĐVN IV (không thực hiện). 2.3. Độ đồng đều khối lượng: thực hiện theo chuyên luận “Phép thử độ đồng đều khối lượng”, phụ lục 11.3, phương pháp 1, của DĐVN IV. Bảng 11.3.1. Bảng quy định độ đồng đều khối lượng cho chế phẩm đơn liều Dạng bào chế Khối lượng trung bình (KLTB) % chênh lệch so với KLTB Viên nén Nhỏ hơn hoặc bằng 80 mg Lớn hơn 80 mg và nhỏ hơn 250 mg Bằng hoặc lớn hơn 250 mg 10 7,5 5 Cân riêng biệt 20 đơn vị lấy ngẫu nhiên, tính khối lượng trung bình. Không được có quá hai đơn vị có khối lượng nằm ngoài giới hạn chênh lệch so với khối lượng trung 28 bình quy định trong bảng 11.3.1 (phụ lục 11.3 DĐVN IV) và không được có đơn vị nào có khối lượng vượt gấp đôi giới hạn đó. 2.4. Định tính A. Lấy một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,2 g sulfaguanidin, thêm 5 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), đun sôi, sẽ có hơi amoniac bay lên. B. Lấy một lượng bột viên tương ứng với khoảng 50 mg sulfaguanidin, thêm 2 ml dung dịch acid hydrocloric 10% (TT), lắc kỹ, lọc. Làm lạnh dịch lọc trong nước đá, thêm 4 ml dung dịch natri nitrit 1% (TT), lắc đều. Lấy 1 ml dung dịch thu được, thêm 5 ml dung dịch 2-naphtol trong kiềm (TT) sẽ xuất hiện tủa đỏ thẫm. C. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: dicloromethan - methanol - acid formic khan (70 : 20 : 10) Dung dịch đối chiếu: hòa tan 10 mg sulfaguanidin chuẩn trong 5 ml aceton (TT). Dung dịch thử: Lấy một lượng bột viên tương đương với 20 mg sulfaguanidin, thêm 10 ml aceton (TT), lắc kỹ, lọc, dùng dịch lọc để chấm sắc ký. Cách tiến hành: chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 l mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp về màu sắc, kích thước và giá trị Rf với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu . 2.5. Định lượng: Tiến hành chuẩn độ bằng nitrit (Phụ lục 10.4 DĐVN IV). Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,200 g sulfaguanidin, thêm 15 ml dung dịch acid hydrocloric 25% (TT) và 50 ml nước. Lắc kỹ. Cho thêm 2 g kali bromid (TT), làm lạnh trong nước đá rồi chuẩn độ bằng dung dịch natri nitrit 0,1 M (CĐ) (phải để đầu nhỏ dung dịch chuẩn độ của buret ngập dưới mặt dung dịch cần chuẩn độ) . Trong quá trình chuẩn độ phải lắc bình liên tục, nhẹ nhàng sao cho không tạo ra dòng xoáy không khí trong dung dịch (tốt nhất là dùng máy khuấy từ). Nhỏ dung dịch chuẩn độ với tốc độ lúc đầu chừng 2 ml trong một phút, đến trước điểm tương đương khoảng 1 ml thì nhỏ từng 0,1 ml một và để yên ít nhất một phút sau mỗi lần thêm dung dịch. Điểm kết thúc xác định bằng chuẩn độ đo điên thế tự động: thực hiện theo SOP “Định lượng Sulfaguanidin” của bộ môn HPTKN 29 Điểm kết thúc xác định bằng chỉ thị màu: thêm 4 giọt chỉ thị Tropeolin 00, 2 giọt xanh methylene trước khi tiến hành chuẩn độ bằng dung dịch NaNO2 0,1 M, khuấy liên tục trong suốt quá trình chuẩn độ. Chuẩn độ kết thúc khi dung dịch từ bình định lượng chuyển từ màu tím sang xanh. Thực hiện song song với một mẫu trắng trong cùng điều kiện như trên để đối chiếu sự thay đổi màu của chỉ thị. 1 ml dung dịch natri nitrit 0,1 M (CĐ) tương đương với 21,42 mg C7H10N4O2S. 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ: theo phiếu kiểm nghiệm CÂU HỎI 1. Thiết lập công thức tính kết quả định lượng trong 2 trường hợp xác định điểm tương đương bằng 2 phương pháp khác nhau. Nhận xét cách tính và kết quả của 2 phương pháp chuẩn độ ? 2. Trong 20 viên đem tính độ đồng đều về khối lượng, có 2 viên nằm ngoài khoảng cho phép - kết luận gì đối với lô thuốc viên nén này ? 3. Viết cơ chế phản ứng để định lượng sulfaguanidin ? 4. Mục đích của việc vẽ đường đạo hàm bậc 1 E/ V theo V (ml) ? 5. Viết công thức khai triển của sulfaguanidin? 6. Điện cực đã dùng trong phép chuẩn độ thế là gì? 30 BÀI 7 KIỂM NGHIỆM THUỐC SIRÔ THÉRALENE MỤC TIÊU Thực hiện những yêu cầu kỹ thuật đã được học trong phần lý thuyết của bài KIỂM NGHIỆM THUỐC DẠNG SIRÔ. NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KIỂM NGHIỆM 1.1. Hình thức cảm quan: chất lỏng đặc sệt, trong, màu nâu nhạt, có ánh cam, mùi và vị đặc biệt 1.2. Thể tích: Chai 90 ml +10% so với thể tích trên nhãn (90 -99ml). Chai 125ml + 8% so với thể tích trên nhãn (125 – 135 ml). 1.3. Tỷ trọng: 1,250 – 1,300 (200C). (phụ lục 6.5 trang PL – 148) 1.4. pH: 2,3 -5,5 (phụ lục 6.2 DĐVN IV, trang PL 144.) 1.5. Định lượng: sirô Théralene phải chứa trong 100ml sản phẩm 46,5 – 53,5mg alimemazin bazơ (C18H22N2S) 0,090 – 0,110mg acid ascorbic (C6H8O6) . 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Hình thức cảm quan: chế phẩm phải đạt yêu cầu đã nêu trên 2.2. Chênh lệch thể tích: cho toàn bộ thể tích sirô chứa trong chai vào một ống lường có thể tích tương đương. Chênh lệch thể tích cho phép được đọc theo bảng sau: Bảng 9.1. Bảng ghi giới hạn cho phép về thể tích sirô Loại thuốc Thể tích ghi trên nhãn Giới hạn cho phép (% chênh lệch) Siro và cao thuốc (trừ cao động vật) Tới 100 ml +10% Trên 100 ml – 250 ml +8% Trên 250 ml +6% 3.3. Tỉ trọng Đo ở 200C bằng picnomet. Cân chính xác picnomet rổng, khô và sạch. Đổ vào picnomet mẫu thử đã chỉnh nhiệt độ thấp hơn 20 0C, chú ý đừng để bọt khí. Giữ picnomet ở 20 0C trong khoảng 30 phút, dùng giấy lọc để thấm hết chất lỏng thừa trên vạch mức, làm khô mặt ngoài của picnomet. Cân rồi tính khối lượng chất lỏng chứa trong picnomet. Tiếp đó, đổ mẫu thử đi, rửa sạch picnomet, làm khô bằng cách tráng EtOH, rồi tráng aceton, sau đó thổi không khí nén hoặc không khí nóng để đuổi hết hơi 31 aceton rồi xác định khối lượng nước chứa trong picnomet ở nhiệt độ 200C như trên. Tỉ số giữa khối lượng mẫu thử và khối lượng nước cất thu được là tỉ trọng D20 cần xác định (Phụ lục 6.5 – DĐVN PL – 148). 2.4. pH: lấy 10ml sirô cho vào cốc có mỏ 50 ml và thực hiện theo phụ lục 6.2 DĐVN, trang PL 144 2.5. Định tính 2.5.1. Định tính alimemazin tartrat Pha chế dung dịch thử T: lấy 10 ml chế phẩm cho vào bình lắng, thêm vào bình này 10 ml dung dịch acid hydroclorid 2N, thêm 20 ml cloroform, lắc đều. Chuyển lớp cloroform qua một bình lắng thứ 2 chứa 5 ml dung dịch NaOH 1N, lắc mạnh xoay vòng để tránh tạo nhũ, để yên. Lọc phần cloroform qua gòn rồi chia làm 2 phần, cho vào 2 bát sứ nhỏ. Để bay hơi đến cắn, làm các phản ứng định tính sau: a. Nhỏ từ từ vào cắn của chén I 3-4 giọt acid suluric đậm đặc, sẽ xuất hiện màu đỏ chuyển nhanh sang vàng . b. Nhỏ từ từ vào cắn của chén II 3-4 giọt acid sulfuric đậm đặc, sẽ xuất hiện màu đỏ bền vững. 2.5.2. Định tính acid ascorbic Lấy 5 ml chế phẩm cho vào một cốc có mỏ 50 ml, thêm 4 ml nước, lắc đều, thêm từng giọt dung dịch dicloro-2,6 phenol indophenol 0,05% trong nước: thuốc thử mất màu ngay. Thường thì phải điều chỉnh đến pH=4 bằng dung dịch NaOH 0,1N). 2.6. Định lượng Phương pháp quang phổ UV-Vis Lấy chính xác 1 thể tích siro Théralène tương ứng với khoảng 1 mg alimemazin base cho vào bình lắng 125 ml, thêm 50 ml nước và 10 ml NaOH 2,5 N, trộn lẫn và chiết với cyclohexan 3 lần , mỗi lần 10 ml. Rửa toàn bộ dịch chiết cyclohexan thu được với 10 ml nước cất, loại bỏ nước rửa. Chiết xuất dịch cyclohexan với acid hydrocloric 0,1 N 3 lần, mỗi lần 20 ml. Tập hợp toàn bộ dịch chiết acid cho vào bình định mức 100 ml, thêm acid hydrocloric 0,1 N đến vạch. Hút chính xác 25 ml (hoặc 50 ml) dịch từ bình này và cho vào bình định mức 50 ml (hoặc 100 ml), thêm dung dịch acid hydrocloric 0,1 N vừa đủ đến vạch, lắc đều. Xác định độ hấp thu ở bước sóng 251 nm, 276 nm của dung dịch cần đo cùng lúc với 32 dung dịch chuẩn alimemazin tartrat chuẩn trong cùng một môi trường có nồng độ được biết khoảng 5 mcg/ml. Dùng acid hydrocloric 0,1 N làm mẫu trắng. Tính toán hàm lượng C18H22N2S (mg) trong 100 ml siro theo công thức: At251; At276: độ hấp thu của mẫu thử Ac251; Ac276: độ hấp thu của mẫu chuẩn 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ: theo phiếu kiểm nghiệm. CÂU HỎI 1.Viết công thức của hoạt chất chính có trong sirô Theralene ở 2 dạng? 2. Trong khi thực hiện phần định tính, giai đoạn lắc CHCl3 với NaOH hay gặp hiện tượng tạo nhũ, làm cách nào để phá nhũ? Có bao nhiêu cách? giải thích? 3. Nhận xét gì về quy trình định tính và quy trình định lượng. Có mâu thuẫn nhau không? Từ đó rút ra kết luận gì? 4. Tại sao trong quy trình định lượng không dùng dung môi chiết là cloroform mà dùng cyclohexan? Giải thích? 5. Tại sao trong quy trình định lượng dùng 2 bước sóng, dùng một bướcc sóng có được không? 6. Giải thích công thức tính kết quả? 2 276251 276251 10250005,0 (    cc tt AA AA 33 Bài 8 KIỂM NGHIỆM VIÊN NÉN ASPIRIN (TC DĐVN IV) MỤC TIÊU 1. Thực hiện những yêu cầu kỹ thuật đã được học trong bài “Kiểm nghiệm viên nén” 2. Thực hiện phương pháp chuẩn độ acid base. NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1. Hình thức: Viên màu trắng, mặt viên nhẵn, cạnh và thành viên nguyên vẹn, 1 mặt có chữ aspirin, 1 mặt có rãnh ở giữa 1.2. Độ đồng đều khối lượng:  5% so với khối lượng trung bình viên. 1.3. Định tính: phải có phản ứng của acid acetylsalicylic. 1.4. Định lượng: hàm lượng acid acetylsalicylic C9H8O4 phải chứa từ 90,0% đến 110,0% hàm lượng ghi trên nhãn. 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Hình thức: Nhận xét bằng cảm quan, viên phải đạt yêu cầu đã nêu. 2.2. Độ đồng đều khối lượng (phụ lục 11.3) Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên (KLTB). Cân riêng từng viên, so sánh với KLTB viên. Không được có quá 02 đơn vị có khối lượng nằm ngoài giới hạn chênh lệch so với KLTB qui định và không được có đơn vị nào có khối lượng vượt gấp đôi giới hạn đó. 2.3. Định tính Đun sôi khoảng 0,3g bột viên trong 2-3 phút với 10 ml dung dịch NaOH 10% (TT). Để nguội, thêm dung dịch H2SO4 10% (TT) cho đến khi thừa acid, sẽ có tủa kết tinh và mùi của acid acetic. Lọc lấy tủa, hòa tan tủa trong vài ml nước, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 0,5% (TT) sẽ có màu tím. 2.4. Định lượng Cân 20 viên, loại bỏ lớp bao, xác định khối lượng trung bình viên nhân, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 0,25g acid acetylsalicylic, thêm chính xác 15 ml dung dịch NaOH 0,5N (CĐ), đun sôi nhẹ trong 10 phút, rồi chuẩn độ 34 lượng NaOH thửa bằng dung dịch HCl 0,5N (CĐ), dùng dung dịch đỏ phenol (TT) làm chỉ thị. Song song làm mẫu trắng. 1 ml dung dịch NaOH 0,5N (CĐ) tương đương với 45,04 mg C9H8O4. Hàm lượng % acid acetylsalicylic so với lượng ghi trên nhãn tính theo KLTB viên tính theo công thức: 81 100 .. 04,45.).( (%) TBV thu HClthutrang m m KVV X   Với: K : hệ số hiệu chuẩn của dung dịch HCl 0,5N Vtrắng : thể tích dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu trắng (ml) Vthử : thể tích dung dịch HCl 0,5N dùng cho mẫu thử (ml) mthử : khối lượng mẫu cân (g) mTBV : khối lượng trung bình viên (g) 3. BÁO CÁO KẾT QUẢ Theo phiếu kiểm nghiệm và phiếu phân tích. Trả lời câu hỏi. CÂU HỎI 1. Giải thích cơ chế định tính acid acetylsalicylic. Viết phương trình phản ứng. 2. Giải thích cơ chế định lượng acid acetylsalicylic. Viết phương trình phản ứng. 3. Tại sao HCl lại có hệ số K? Nếu pha từ hóa chất gốc có hệ số K không? 4. Nêu những phương pháp khác định lượng acid acetylsalicylic. 5. Vẽ công thức cấu tạo của aspirin. Tên IUPAC của chất này là gì? 6. Kể tên một số thuốc có chứa hoạt chất là aspirin. 7. Kỹ thuật chuẩn độ trong bài là gì? (trực tiếp/ thừa trừ/ thế). Trình bày nguyên tắc của kỹ thuật đó. 8. Tại sao khi định lượng aspirin phải cho chính xác 15ml dung dịch NaOH 0,5N? 9. Chứng minh công thức tính hàm lượng % của aspirin. Tại sao khi định lượng phải loại bỏ lớp bao? 35 Bài 9 KIỂM NGHIỆM THUỐC VIÊN HOÀN Viên hoàn mật ong nghệ MỤC TIÊU 1. Trình bày được các chỉ tiêu khi kiểm nghiệm thuốc viên hoàn 2. Thực hiện được phương pháp thử các chỉ tiêu trong kiểm nghiệm thuốc viên hoàn nghệ NỘI DUNG 1. YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1. Tính chất: Viên hoàn phải tròn, đều, đồng nhất về hình dạng, màu sắc khi bảo quản, có mùi đặc trưng của dược liệu. 1.2. Độ đồng đều khối lượng: Quy định theo bảng sau: 1.3. Độ rã: Không quá 1 giờ 1.4. Định tính: Chế phẩm phải cho phản ứng đặc trưng của nghệ 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Tính chất: Bằng cảm quan chế phẩm phải đạt yêu cầu đã nêu: hoàn phải tròn đều, đồng nhất về hình dạng, màu sắc, có mùi đặc trưng của dược liệu. 2.2. Độ đồng đều khối lượng: Cân 10 viên, xác định khối lượng trung bình. Cân riêng rẽ từng viên và so sánh khối lượng từng viên với khoảng chênh lệch so với khối lượng trung bình. Trong đó không được có quá 2 viên vượt quá giới hạn cho phép và không có viên nào gấp đôi giới hạn cho phép. 2.4. Độ rã: áp dụng cho viên hoàn cứng - Tiến hành thử trên 6 viên hoàn trên máy thử độ rã - Nhiệt độ thử: 360C ± 10C Khối lượng trung bình của một hoàn Giới hạn sai số cho phép Từ 0,05g đến 1,5g ± 12% Trên 1,5g đến 5,0g ± 10% Trên 5,0g đến 9,0g ± 7% Trên 9,0g ± 5% 36 - Môi trường thử: nước, nếu không đạt thử lại lần 2 trong môi trường HCl 0,1N - Thời gian rã của viên: không quá 1 giờ. 2.5. Định tính: Nghệ Nghiền 5 viên hoàn thành bột, cho vào cốc, thêm 20ml ethanol 96%, lọc qua giấy lọc. Nhỏ 3-4 giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc. Để khô, trên giấy lọc còn lại vết màu vàng. Tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch acid boric 5% (TT) rồi dung dịch acid hydrochloric loãng (TT), hơ nóng nhẹ cho khô, vết vàng sẽ chuyển thành màu đỏ. Sau đó thêm 3 giọt dung dịch aminiac (TT), sẽ tiếp tục chuyển sang màu xanh đen. 37 Tài liệu tham khảo 1. Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2014), Kiểm Nghiệm thuốc, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam. 2. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội 3. Giáo trình “Thực hành Kiểm nghiệm thuốc” (2014), Bộ môn HPT-KN, Đại Học Y Dược Cần Thơ.