Hiệu quả sinh thiết phôi túi và chuyển một phôi túi đông lạnh trong chẩn đoán bệnh di truyền Thalassemia

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 45 HIỆU QUẢ SINH THIẾT PHÔI TÚI VÀ CHUYỂN MỘT PHÔI TÚI ĐÔNG LẠNH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DI TRUYỀN THALASSEMIA Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Đình Tảo* Quản Hoàng Lâm*; Trần Văn Khoa*; Triệu Tiến Sang* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá khả năng chẩn đoán di truyền bệnh thalassemia trên phôi túi và kết quả lâm sàng sau chuyển 1 phôi túi đông lạnh. Đối tượng và phương pháp: 19 cặp vợ chồng được chẩn đoán mang gen mắc bệnh α và β-thalassemia. Tiến hành thụ tinh ống nghiệm bằng kỹ thuật ICSI và sinh thiết phôi túi để chẩn đoán di truyền tiền làm tổ. Các phôi trong thời gian chờ kết quả di truyền đều được đông lạnh bằng kỹ thuật thủy tinh hóa. Bệnh nhân chỉ chuyển một phôi túi khi được chẩn đoán là khỏe mạnh ở các chu kỳ sau đó, trong đó 15 phôi bình thường, 4 phôi mang gen dị hợp. Kết quả: trong 19 chu kỳ đầu tiên chuyển một phôi túi, kết quả 12 bệnh nhân có thai sinh hóa đạt tỷ lệ 63,15%; 10 bệnh nhân có thai lâm sàng đạt 52,63%, 10 trẻ sinh ra khỏe mạnh. Kết luận: chẩn đoán di truyền bệnh thalassemia trên phôi túi đạt hiệu quả cao, chuyển 1 phôi túi đông lạnh tránh được đa thai, tỷ lệ có thai cao, các bé sinh ra khỏe mạnh. * Từ khóa: Bệnh thalassemia; Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ; Nested-PCR; Stripassay. Effect of Blastocyst Biopsy and Frozen Single Blastocyst Transfer for Pre-implantation Genetic Diagnosis of Thalassemia Summary Objectives: To evalutate ability of the genetic diagnosis of thalassemia on blastocysts and clinical results after transferring one frozen blastocyst. Subjects and methods: 19 couples in whom both partners were α- or β-thalassemia carriers. All couples underwent fertilization following ICSI (intracytoplasmic sperm injection) and biopsy blastocyst for preimplantation genetic diagnosis. During diagnosing thalassaemia, all blastocysts were frozen by vitrification. The patients were transffered only one blastocyst with 15 normal blastocysts and 4 heterozygous blastocysts on the next cycle. Results: There were 12 patients succeding with chemical pregnancy rate (63.15%), 10 clinical pregnancies (52.63%) with 10 healthy babies born. Conclusions: Preimplantation genetic diagnosis is effective on blastocysts for the thalassemia. Transferring one frozen blastocyst avoids multiple pregnancies, and maintains pregnant rate with healthy babies born. * Keywords: Thalassemia; Preimplantation genetic diagnosis; Nested-PCR; Stripassay. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Tùng (tung_ttcnp@yahoo.com) Ngày nhận bài: 02/05/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 13/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 28/06/2018 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 46 ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia là một trong những bệnh huyết học di truyền đơn gen phổ biến nhất trên thế giới. Ước tính trên thế giới hiện có khoảng 7% dân số mang gen bệnh; 1,1% các cặp vợ chồng có nguy cơ sinh con bị bệnh; 0,27% trường hợp có thai sinh ra con bị bệnh huyết sắc tố [2]. Ở Việt Nam, có khoảng 5 triệu người mang gen và bị bệnh, ước tính khoảng 20.000 người bị thalassemia thể nặng, mỗi năm khoảng 2.000 trẻ được sinh ra mắc bệnh thalassemia [1]. Bệnh sinh do thiếu hụt tổng hợp globin trong huyết sắc tố (hemoglobin) của hồng cầu, chất lượng hồng cầu suy giảm làm hồng cầu dễ bị vỡ, dẫn đến thiếu máu mạn tính. Nguyên nhân di truyền là do đột biến gen sản xuất β-globin nằm trên nhiễm sắc thể 11 và mất gen sản xuất α-globulin nằm trên nhiễm sắc thể 16. Điều trị cho những bệnh nhân (BN) này tạo ra một gánh nặng cả về kinh tế cũng như tinh thần cho gia đình và toàn xã hội. Ứng dụng chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation genetic diagnosis - PGD) là phương pháp sàng lọc phôi bất thường về mặt di truyền được thực hiện trước khi cấy phôi vào tử cung người mẹ. Handyside đã ứng dụng kỹ thuật này trên một tế bào phôi từ năm 1990, kể từ đó kỹ thuật này được ứng dụng ngày càng phổ biến để thay thế cho chẩn đoán trước sinh, tránh mang thai có nguy cơ cao mắc các bệnh di truyền [3]. Có hai giai đoạn sinh thiết phôi để cung cấp vật liệu di truyền cho chẩn đoán là giai đoạn phôi phân chia và giai đoạn phôi túi. Mỗi giai đoạn sinh thiết có thuận lợi và hạn chế nhất định. Sinh thiết phôi túi có nhiều thuận lợi, ngoài việc loại bỏ các phôi không phát triển ở giai đoạn phân chia, tế bào lấy ra khỏi phôi ít ảnh hưởng đến phôi phát triển sau này, đặc biệt là cung cấp vật liệu di truyền nhiều hơn giúp cho chẩn đoán di truyền chính xác. Mục tiêu của nghiên cứu: Đánh giá khả năng chẩn đoán di truyền bệnh thalassemia trên phôi túi và kết quả lâm sàng sau chuyển 1 phôi túi đông lạnh. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. * Tiêu chuẩn lựa chọn: 19 cặp vợ chồng được chẩn đoán mang gen bị bệnh thalassemia, đều được tư vấn về quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm và chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi tại Viện Mô phôi Lâm sàng Quân đội và Khoa Di truyền, Học viện Quân y. * Tiêu chuẩn loại trừ: suy buồng trứng, bất thường tử cung, tinh trùng kém. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Thiết kế nghiên cứu: mô tả hồi cứu. * Phác đồ kích thích buồng trứng: Kích thích buồng trứng có kiểm soát sử dụng phác đồ GnRH đối đồng vận. BN được kích trứng vào ngày 2 của chu kỳ bằng liều FSH phù hợp với đáp ứng của từng BN. GnRH đối đồng vận 0,25 mg (orgalutran hoặc cetrotide) bắt đầu vào ngày thứ 6 của FSH. Khi có ít nhất 3 nang > 17 mm sẽ gây trưởng thành noãn bằng GnRH đồng vận 0,2 mg (dipherelin). Chọc hút noãn qua ngả âm đạo sau 35 giờ dùng GnRH đồng vận. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 47 * Nuôi cấy và sinh thiết phôi: Sau 16 - 18 giờ thực hiện kỹ thuật (tiêm tinh trùng vào bào tương noãn - ICSI), noãn được đánh giá thụ tinh, nuôi cấy noãn thụ tinh bình thường đến giai đoạn phôi túi. Phân loại phôi túi dựa trên đánh giá đồng thuận alpha của Hiệp hội ESHRE 2011 [4]. Sáng ngày 5, khi phôi túi đã phân biệt rõ nụ phôi và tế bào lá nuôi, đục lỗ thủng màng trong suốt kích thước 7 µm đối diện với nụ phôi. Chờ khoảng 4 giờ khi các tế bào lá nuôi thoát qua lỗ thủng màng trong suốt có số lượng 6 - 7 tế bào, tiến hành sinh thiết phôi. Các tế bào lá nuôi sau sinh thiết được rửa bằng môi trường PBS1X + 1% PVP và cho vào ống PCR, gửi đến labo di truyền. * Chẩn đoán di truyền đột biến trên phôi sinh thiết: Tách ADN từ mẫu máu nghiên cứu (mẫu bố, mẫu máu của mẹ, mẫu máu của con) bằng bộ kít Qiagen. Mẫu phôi được tách ADN và khuếch đại bằng bộ kít RepliG (Hãng Qiagen). Sản phẩm khuếch đại được pha loãng 100 lần, dung dịch ADN pha loãng sẽ dùng để nhân gen gây bệnh α, β-thalassemia. Tiến hành phản ứng nested-PCR theo quy trình của Wang và CS (2003) có cải biên [5]: - PCR vòng 1: nhân gen β-globin với thể tích 50 μl chứa dịch ly giải 1 tế bào; 0,2 μM mỗi primer vòng 1; 0,2 mM mỗi loại deoxyribonucleotide triphosphate (dNTP) và 2,5 đơn vị HotStarTaq ADN polymerase (Qiagen) trong 1X PCR buffer chứa 1,5 mM MgCl2. - PCR vòng 2: nhân gen β-globin, sử dụng 3 μl sản phẩm PCR vòng 1. Thành phần phản ứng tương tự như vòng 1, ngoại trừ ADN polymerase giảm còn 1 đơn vị. Chu trình nhiệt tương tự như PCR vòng 1. Minisequencing tiến hành với SNaPshotTM multiplex ready reaction mix (Applied Biosystems) và 0,2 μM mỗi minisequencing primer theo quy trình của nhà sản xuất. * Trình tự mồi gen β-globin vòng 1: β-F1* ACGGCTGTCATCACTTAGAC β-R1* AAGAGGTATGAACATGATTAGC * Chu trình nhiệt phản ứng nested PCR: - 1 chu kỳ: 950C trong 15 phút. - 30 chu kỳ: 950C trong 45 giây. - 30 chu kỳ: 560C trong 45 giây. - 30 chu kỳ: 720C trong 2 phút. - 1 chu kỳ: 720C trong 5 phút. * Trình tự mồi gen β-globin vòng 2: BGLO-2F GTCATCACTTAGACCTCACC BGLO-2R CAGAATAATCCAGCCTTATCC Sản phẩm nhân vòng 2 được tinh sạch, chạy multiplex minisequensing, sử dụng kít SNaPshot multiplex theo quy trình với các mồi minisequencing. Sản phẩm minisequencing được điện di tự động trên máy 3130xl Genetic analyzer, phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID v 3.2. Kết quả này được kiểm chứng lại bằng bộ kít tripassay để xác định 22 đột biến của gen β-thalassemia và 21 đột biến gen α-thalassemia. * Quy trình đông lạnh và rã đông phôi túi bằng kỹ thuật thuỷ tinh hoá theo phương pháp Cryotop của Massashige Kuwayama (2005) [6]: - Chuẩn bị niêm mạc tử cung để chuyển phôi túi đông lạnh: T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 48 + Thuốc sử dụng: estrogen (valiera 2 mg, progynova 2 mg) 4 - 6 mg/ngày từ ngày thứ 2 của chu kỳ kinh. Siêu âm đo niêm mạc tử cung vào ngày thứ 10 của chu kỳ kinh, chỉnh liều progynova. + Ngày 12 - 14: siêu âm đo niêm mạc tử cung: nếu niêm mạc tử cung ≥ 8 mm thì bổ sung utrogestan 800 mg/ngày (đặt âm đạo) trước 5 ngày chuyển phôi. * Phương pháp đánh giá kết quả lâm sàng: - Đánh giá có thai sinh hóa: sau 2 tuần chuyển phôi, định lượng nồng độ β-hCG > 30 mIU/ml. - Đánh giá có thai lâm sàng: sau 5 - 6 tuần chuyển phôi, siêu âm kiểm tra thấy có túi ối, có tim thai. - Tỷ lệ làm tổ: tỷ lệ phần trăm của tổng số thai có được trên tổng số phôi chuyển. - Tỷ lệ thai sinh sống: trẻ sinh ra khỏe mạnh. * Phương pháp xử lý số liệu: Phân tích số liệu thống kê bằng phần mềm SPSS 13.0 (Statistical products for the social services). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 1: Một số đặc điểm bệnh di truyền lặn của 19 cặp vợ chồng BN mang gen bệnh thalassemia. Phân loại β-thalassemia α-thalassemia Số lượng (38 BN) 16 BN (42,11%) 22 BN (57,89%) Đột biến gen Cd17: 8 BN (50%) Cd26: 4 BN (25%) Cd41/42: 4 BN (25%) Mất gen SEA: 22 BN (100%) Bảng 2: Đặc điểm lâm sàng của BN thalassemia. Chỉ tiêu X ± SD Tuổi trung bình 29,68 ± 3,03 AMH (ng) 3,82 ± 0,46 AFC (nang thứ cấp siêu âm ngày 2 chu kỳ) 12,89 ± 1,25 Liều FSH (IU)/ngày 172,36 ± 20,15 E2 (pg) ngày cho thuốc rụng noãn bằng GnRH đồng vận 3744,21 ± 428,17 Số nang noãn ≥ 17 mm ngày cho thuốc rụng noãn bằng GnRH đồng vận 12,26 ± 1,64 Số noãn trưởng thành (M2) 10,36 ± 1,31 Tỷ lệ quá kích buồng trứng Không có trường hợp nào BN ở độ tuổi 30, chỉ số AMH và AFC thể hiện khả năng dự trữ buồng trứng bình thường. Liều trung bình FSH kích thích buồng trứng ở liều nhẹ, GnRH đồng vận 3744,21 ± 428,17 pg. * Kết quả tạo phôi túi của BN thalassemia: Số noãn thụ tinh trung bình: 7,31 ± 1,02; tỷ lệ thụ tinh: 70,75 ± 7,47%; số phôi túi trung bình: 4,42 ± 0,96; tỷ lệ phôi túi tạo được 60,62 ± 10,41%. Chất lượng phôi túi: 84 phôi túi, trong đó phôi tốt: 70 phôi (83,3%); phôi trung bình: 10 phôi (11,9%); phôi kém: 4 phôi (4,8%). * Kết quả chẩn đoán di truyền phôi túi của BN thalassemia: Nhóm α-thalassemia: 19/51 phôi (37,2%) được chẩn đoán di truyền bình thường không mất gen SEA, 21/51 phôi (41,2%) dị hợp bị mất hai gen SEA và 11/51 phôi (21,6%) bị bệnh mất cả 4 gen SEA. Đối với nhóm β-thalassemia, 7/29 phôi (24,1%) được chẩn đoán bình thường, 14/29 phôi T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 49 (48,3%) dị hợp bị đột biến một gen, 8/29 phôi (27,6%) bị bệnh đột biến cả 2 gen. * Kết quả rã đông và chuyển phôi túi của 19 BN thalassemia: Tỷ lệ phôi túi sống sau rã đông: 19/19 BN (100%), trong đó 15 phôi bình thường và 4 phôi dị hợp. Số phôi chuyển: 1 phôi. Tỷ lệ phôi làm tổ: 10/19 BN (52,63%); tỷ lệ thai sinh hóa: 12/19 BN (63,15%); tỷ lệ thai lâm sàng: 10/19 BN (52,63%), do 2 túi ối không có mầm thai và không có tim thai; tỷ lệ thai sinh sống: 10/19 BN (52,63%) không có biểu hiện bệnh lý thalassemia, trong đó 8 trẻ không mang gen bệnh và chỉ có 2 trẻ mang gen dị hợp. Đơn thai: 10 BN; đa thai: 0 BN. BÀN LUẬN Thành công chung của PGD là trẻ sinh ra khỏe mạnh, do đó cần kết hợp tốt giữa chẩn đoán di truyền chính xác và kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, phụ thuộc vào tuổi, dự trữ buồng trứng, chất lượng tinh trùng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tuổi trung bình 29,68 ± 3,03; AMH 3,82 ± 0,46 ng; AFC 12,89 ± 1,25, cho thấy BN có dự trữ bình thường sẽ hạn chế việc đáp ứng kém cũng như đáp ứng quá mức. Toàn bộ BN sử dụng phác đồ GnRH đồng vận trong kích thích buồng trứng với liều FSH trung bình, số noãn trưởng thành trung bình thu được 10,36 ± 1,31. Theo nghiên cứu tổng hợp của Sunkara (2011) phân tích trên 450.135 chu kỳ IVF thấy có mối liên quan giữa số noãn, tỷ lệ sinh sống và tuổi người phụ nữ. Tỷ lệ sinh sống đạt cao nhất khi có số noãn xấp xỉ 15 ở nhóm tuổi 18 - 34 là 40% [7]. BN trong nghiên cứu của chúng tôi tương ứng với nhóm có khả năng sinh sống cao nhất của Sunkara. Sinh thiết phôi túi là kỹ thuật xâm lấn nhằm hạn chế ảnh hưởng phát triển phôi sau sinh thiết, điều này phụ thuộc vào kỹ năng của kỹ thuật viên. Một yêu cầu của kỹ thuật là cần tạo lỗ thủng màng trong suốt để tạo thuận lợi cho tế bào lá nuôi chui ra. Chúng tôi chọn thời điểm đục lỗ màng trong suốt vào ngày 5 tại vị trí đối diện với nụ phôi để hạn chế sự tác động đến nụ phôi. Chẩn đoán di truyền sau sinh thiết cần có thời gian, chúng tôi lựa chọn đông phôi toàn bộ sau sinh thiết và chờ kết quả xét nghiệm di truyền. Nhờ sự phát triển của kỹ thuật đông lạnh thủy tinh hóa, kết quả lâm sàng giữa chuyển phôi đông lạnh không thấp hơn so với chuyển phôi tươi [8]. Ngoài ra, không chuyển phôi tươi sẽ làm giảm đáng kể hội chứng quá kích buồng trứng - là một trong các biến chứng hay gặp trong hỗ trợ sinh sản. Chúng tôi không gặp trường hợp nào quá kích buồng trứng do sử dụng phôi đông lạnh toàn bộ và GnRH đồng vận gây trưởng thành noãn thay cho hCG, đây là yếu tố chính gây quá kích buồng trứng trên BN có nguy cơ cao. Ở các chu kỳ sau đó, 10/19 trường hợp (52,63%) đầu tiên chuyển phôi có thai lâm sàng. Tỷ lệ có thai của chúng tôi thấp hơn, nghiên cứu của Kokkali chuyển trung bình 3 phôi/người, 6 trường hợp có thai thì 2 trường hợp có thai đôi [9]. Chúng tôi chỉ chuyển 1 phôi duy nhất nên không có trường hợp nào đa thai. Các nghiên cứu gần đây cho thấy sinh thiết tế bào lá nuôi của phôi túi dùng cho xét nghiệm di truyền có nhiều thuận lợi. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 50 Thứ nhất: cung cấp vật liệu di truyền nhiều hơn do sinh thiết từ 5 - 10 tế bào lá nuôi giúp tăng thành công trong khuếch đại gen thay vì sinh thiết 1 - 2 tế bào của phôi giai đoạn phân chia, bằng thực tế kỹ thuật PGD thực hiện khó khăn khi lượng ADN cung cấp hạn chế, sẽ dẫn đến thất bại khuếch đại gen hoặc mất alen [10]. Thứ hai: phôi túi có tiềm năng phát triển cao hơn so với phôi giai đoạn phân chia, thực tế các nghiên cứu cho thấy sinh thiết phôi giai đoạn phân chia làm giảm đáng kể tỷ lệ làm tổ của phôi, còn sinh thiết phôi túi không bị ảnh hưởng [11]. Trong 80 phôi được lựa chọn sinh thiết chẩn đoán di truyền đã thành công cả 80 phôi trong khuếch đại toàn bộ gen và chẩn đoán chính xác đột biến gen bệnh α, β-thalassemia. Nghiên cứu PGD về β-thalassemia của Li Fan và CS (2017) thực hiện trên 86 phôi túi, khuếch đại thành công 82 phôi (95,4%), chẩn đoán xác định được 80 phôi [12]. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật minisequencing có cải biên và kỹ thuật stripassay (Kít của Vienlab, Áo) để chẩn đoán các đột biến thalassemia trên phôi và trên mẫu bố mẹ của phôi. Nghiên cứu của Wang và CS (2003) chẩn đoán cho 89 mẫu, trong đó chủ yếu là BN mang đột biến IVS2-654 và IVS1-5, với 27 BN và 8 BN cd17, 5 BN cd41/42, còn lại là đột biến khác [5]. Trong nghiên cứu mặc dù số lượng gia đình bị bệnh β-thalassemia nghiên cứu còn hạn chế, nhưng thống kê cho thấy các đột biến chủ yếu là cd17, cd26, cd41/41. Đối với các gia đình có α-thalassemia tham gia nghiên cứu đột biến đều là đứt đoạn gen SEA. Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật stripassay để chẩn đoán phôi của gia đình mang đứt đoạn gen SEA và đã chẩn đoán được 51 phôi của gia đình bị α-thalassemia và 29 phôi có β-thalassemia. KẾT LUẬN Chẩn đoán di truyền trên phôi túi đạt hiệu quả cao, chuyển 1 phôi túi sau khi đông lạnh tránh được đa thai, tỷ lệ có thai cao, các bé sinh ra khỏe mạnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đình Tảo và CS. Báo cáo tổng kết đề tài cấp nhà nước: Nghiên cứu quy trình chẩn đoán một số bệnh di truyền trước chuyển phôi để sàng lọc phôi thụ tinh trong ống nghiệm. 2015. 2. David Weatherall, Olu Akinyaju. Inherited disorders of hemoglobin. Disease Control Priorities in Developing Countries. 2005, pp.663-660. 3. Handyside A.H, Kontogianni E.H, Hardy K, Winston R.M. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature. 1990, 344, pp.768-770. 4. Alpha scientists in reproductive medicine and ESHRE special interest group of embryo. The Istabul consensus workshop on embryo assessment proceedings of an expert meeting. Human Reproduction. 2011, 26 (6), pp.1270-1283. 5. Wang Wen, Shirley, Samuel. Multiplex minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian β-thalassemia mutation. Clinical Chemistry. 2003, 49 (2), pp.209-218. 6. Kuwayama M, Vajta G, Ieda S, Kato O. Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 6-2018 51 elimination of potential contamination. Report Biomed Online. 2005, 11, pp.608- 614. 7. Sunkara S.K, Rittenberg V, Raine- Fenning N, Bhattacharya S, Zamora J, Coomarasamy A. Association between the number of eggs and live birth in IVF treatment: an analysis of 400135 treatment cycles. Human Reprod. 2011, 7, pp.1768-1774. 8. Roque M, Lattes K, Serra S, Sola I, Geber S, Carreras R, Checa M.A. Fresh embryo transfer versus frozen embryo transfer in in vitro fertilization cycles: a systematic review and meta-analysis. Fertil Steril. 2013, 99, pp.156-162. 9. Kokkali G, Synodinos J.T, Vrettou C, Stavrou D, Jones G.M, Cram D.S, Makrakis E, Trounson A.O, Kanavakis E, Pantos K. Blastocyst biopsy versus cleavage stage biopsy and blastocyst transfer for preimplantation genetic diagnosis of β-thalassemia: a pilot study. Human reproduction. 2007, 22 (5), pp.1443-1449. 10. Chang L.J, Huang C.C, Tsai Y.Y, Hung C.C, Fang M.Y, Lin Y.C, Su Y.N, Yang. Blastocyst biopsy and vitrification are effective for preimplantation genetic diagnosis of monogentic diseases. Hum Repro. 2013, 28, pp.1435-1444. 11. Scott R.T Jr, Upham K.M, Forman Ẹ, Zhao T, Treff N.R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 2013, 100, pp.624-630. 12. Li F, Aiping Q, Wugao L, Xinlin L, Lihong W, Ren Cai, Yufu J. Genetic diagnosis of β-thalassemia preimplantation using short tandem repeats in human cryopreserved blastocysts. J Clin Exp Pathol 2. 2017, 10 (7), pp.7586-7595.