H₂O₂ production in lactobacillus strains isolated from the intestinal microbiome of healthy people

TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508 83 H2O2 PRODUCTION IN Lactobacillus STRAINS ISOLATED FROM THE INTESTINAL MICROBIOME OF HEALTHY PEOPLE Ha Thi Thu1, Hoang The Hung2, Tran Xuan Thach1, Nguyen Thi Hoa1, La Thi Lan Anh3, Vu Thi Hien1, Nguyen Dinh Duy1, Dong Van Quyen1, Nguyen Thi Tuyet Nhung1,* 1 Molecular Microbiology Department - Institute of Biotechnology (IBT) - Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) 2 Research Institute of Military Logistics Science - Military Academy of Logistics 3 Graduate University of Science and Technology - VAST Received 20 October 2019, accepted 6 January 2020 ABSTRACT Lactobacillus sp. in the digestive tract are capable of producing H2O2 to inhibit the growth of harmful bacteria and balance the gut microflora. In this study, we have isolated 115 strains of Lactobacillus spp. from stool samples of healthy people in Ha Noi. Of the 50 tested Lactobacillus strains, 9 strains were capable of producing H2O2, of which the Lac.VFE-14 strain produced highly H2O2 with a concentration of 2.183 mM, followed by Lac.VFE-08 strains (2.081 mM) and Lac.VFE-04 (2.067 mM). All three strains grew well in MRS medium supplemented with bile salts or adjusted to low pH value. With 0.3% of bile salt, the survival rates of these 3 strains were 99%, 95% and 97%, respectively. At pH 3.0, after 3 hours of cultivation, the survival rates of the three strains were 98.54%, 94.15% and 95.27%, respectively. In addition, each of the cell-free culture supernatants of these three strains that inhibit the growth of S. aureus ATCC-23235. The inhibition zone diameters of the three strains were 19.0±1.0 mm, 14.0±1.0 mm and 11.7±1.3 mm, respectively. The results of 16S rRNA gene analyses showed that Lac.VFE-14, Lac.VFE-08 and Lac.VFE-04 had high similarity scores with L. plantarum ZZU 23 (100%), L. rhamnosus JCM 1136 (99%) and L. plantarum S7 (98.65%), respectively. This study indicates that all three strains have the potential to be used as probiotics in the future. Keywords: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, bile salt, antimicrobial activity. Citation: Ha Thi Thu, Hoang The Hung, Tran Xuan Thach, Nguyen Thi Hoa, La Thi Lan Anh, Vu Thi Hien, Nguyen Dinh Duy, Dong Van Quyen, Nguyen Thi Tuyet Nhung, 2020. H2O2 production in Lactobacillus strains isolated from the intestinal microbiome of healthy people. Tap chi Sinh hoc, 42(1): 83–92. https://doi.org/10.15625/0866- 7160/v42n1.14508. *Corresponding author email: nttnhung@ibt.ac.vn ©2020 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) TAP CHI SINH HOC 2020, 42(1): 83–92 DOI: 10.15625/0866-7160/v42n1.14508 84 KHẢ NĂNG SINH H2O2 CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Lactobacillus PHÂN LẬP TỪ HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT CỦA NGƯỜI KHỎE MẠNH Hà Thị Thu1, Hoàng Thế Hưng2, Trần Xuân Thạch1, Nguyễn Thị Hoa1, Lã Thị Lan Anh3, Vũ Thị Hiền1, Nguyễn Đình Duy1, Đồng Văn Quyền1, Nguyễn Thị Tuyết Nhung1,* 1Phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2Viện Nghiên cứu Khoa học Hậu cần Quân sự, Học viện Hậu cần 3Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Ngày nhận bài 20-10-2019, ngày chấp nhận 6-1-2020 TÓM TẮT Vi khuẩn Lactobacillus sp. trong đường tiêu hóa, có khả năng sinh H2O2 ức chế sự sinh trưởng vi khuẩn gây hại và làm cân bằng hệ vi khuẩn có ích. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được 115 chủng vi khuẩn Lactobacillus từ mẫu phân của người khỏe mạnh tại Hà Nội. Trong số 50 chủng Lactobacillus được kiểm tra, có 9 chủng có khả năng sinh H2O2, trong đó chủng Lac.VFE-14 sinh H2O2 mạnh nhất với nồng độ thu được là 2,183 mM, tiếp theo là các chủng Lac.VFE-08 (2,081 mM) và Lac.VFE-04 (2,067 mM). Ba chủng này đều sinh trưởng tốt trong môi trường MRS có bổ sung muối mật hay môi trường có độ pH thấp. Với 0,3% muối mật, tỷ lệ tế bào sống sót của 3 chủng nêu trên ương ứng là 99%, 95% và 97%. Ở pH 3, sau 3 giờ nuôi cấy, tỷ lệ tế bào sống sót của 3 chủng ương ứng là 98,54%, 94,15% và 95,27%. Bên cạnh đó, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào của 3 chủng này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Staphylococcus aureus ATCC-23235. Hoạt tính ức chế thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn của 3 chủng ương ứng là 19,0±1,0 mm; 14,0±1,0 mm và 11,7±1,3 mm. So sánh trình tự 16S của 3 chủng với các trình tự đã được công bố trên ngân hàng gen cho thấy 3 chủng này có sự tương đồng cao lần lượt với L. plantarum ZZU 23; L. rhamnosus JCM 1136 và L. plantarum S7. Kết quả thu được cho thấy cả 3 chủng này đều có tiềm năng sử dụng làm probiotic trong tương lai. Từ khóa: Lactobacillus, Staphylococcus aureus, H2O2, muối mật, kháng khuẩn. *Địa chỉ liên hệ email: nttnhung@ibt.ac.vn MỞ ĐẦU Lactobacillus là một trong những vi khuẩn probiotic được sử dụng phổ biến, đem lại nhiều lợi ích cho sức khỏe con người. Sử dụng probiotic Lactobacillus làm cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa trong cơ thể vật chủ, điều chỉnh phản ứng miễn dịch và chống lại hoạt động của các vi sinh vật gây bệnh (Markowiak, 2017). Các chủng Lactobacillus spp. có khả năng ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh do sự cạnh tranh chất dinh dưỡng, khả năng sản sinh axit làm giảm pH môi trường, tạo biofilm và các chất kháng khuẩn trong đó có H2O2 (Bermudez et al., 2012). H2O2 là một một chất oxi hóa mạnh, có khả năng dễ dàng chuyển đổi thành gốc hydroxyl, đây là một chất oxi hóa mạnh có tác dụng gây độc cho tế bào, ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi khuẩn như Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus (Boateng et al., 2011). H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 85 Một số thành viên trong nhóm vi khuẩn Lactobacillus có khả năng sản sinh H2O2 như: L. johnsonii, L. acidophilus, L. fermentum và L. gasseri (Hertzberger et al., 2014). Tùy thuộc vào từng chủng, khả năng sản xuất H2O2 của chúng khác nhau với nồng độ dao động trong khoảng từ 0,8 đến 6,4 mM (Belicová et al., 2013). Khả năng tạo H2O2 của chủng L. fermentum CS 12-1 là 3,5 mM (Kang et al., 2005), chủng L. johnsonii NCC533 là 1 mM (Hertzberger et al., 2014) hay các chủng Lactobacillus từ 0,059 đến 0,176 mM (Zalán et al., 2005). Vi khuẩn Lactobacillus có khả năng ức chế sinh trưởng và tiết độc tố của vi khuẩn S. aureus (Eggers et al., 2018). Nghiên cứu của Misaghi et al. (2017) cho thấy, cả ba loài L. acidophilus, L. paracasei và L. fermentum đều có khả năng ức chế sinh trưởng của S. aureus. Ngoài ra, các chủng thuộc chi Lactobacillus này cũng ức chế biểu hiện gen Staphylococcal enterotoxin, một yếu tố gây độc chính của S. aureus. Bằng thử nghiệm lâm sàng, Eggers et al. (2018) cho thấy, những người sử dụng vi khuẩn probiotic L. rhamnosus HN001 có khả năng làm giảm từ 73 đến 83% số lượng vi khuẩn S. aureus đường ruột so với những người chỉ dùng giả dược. Hơn nữa, dịch nuôi đã loại bỏ tế bào Lactobacillus cũng ức chế sinh trưởng của S. aureus nhờ chúng có khả năng tiết ra môi trường những chất kháng khuẩn như ethanol, H2O2 và các bacteriocin (Chen et al., 2019). Từ những lý do nêu trên, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập, sàng lọc và đánh giá khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus và kiểm tra khả năng kháng S. aureus của các chủng vi khuẩn này. Kết quả thu được sẽ bổ sung nguồn dữ liệu cho các nghiên cứu về khả năng sinh H2O2 cũng như các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn Lactobacillus sp được phân lập ở Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguồn mẫu phân lập Các mẫu phân từ từ những người khỏe mạnh tình nguyện tham gia nghiên cứu sống ở khu vực Hà Nội tự thu thập và để trong hộp vô trùng. Mẫu sau đó được giữ lạnh ở 4oC và chuyển ngay đến phòng thí nghiệm để phân tích. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus Quá trình phân lập các chủng Lactobacillus từ mẫu phân thường gặp khó khăn vì sự hiện diện của các vi sinh vật cạnh tranh với số lượng lớn như: Bifidobacterium, Streptococcus và Enterococcus. Vì thế, chúng tôi đã lựa chọn môi trường MRS; pH 6,2 cho việc phân lập chủng Lactobacillus từ mẫu phân vì môi trường này cho số lượng khuẩn lạc tốt với kích thước và hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho Lactobacilli (Corry et al., 2003). Một gam mẫu phân sẽ được hòa trong 9 mL nước muối sinh lý vô trùng. Dung dịch sau đó sẽ được pha loãng 10 lần liên tiếp cho đến 10-7. Mỗi một nồng độ pha loãng từ 10-5 đến 10-7 sẽ được cấy gạt trên môi trường thạch MRS (de Man, Rogosa & Sharpe) và được nuôi cấy trong điều kiện kị khí ở 37oC trong 48 giờ. Các khuẩn lạc phát triển trên các đĩa MRS sẽ được lựa chọn và làm sạch bằng cách cấy ria trên đĩa MRS để thu nhận những khuẩn lạc riêng lẻ. Những khuẩn lạc này sẽ được giữ trên đĩa thạch MRS để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp và được lưu trữ lâu dài ở (-)80oC trong dịch MRS có bổ sung 20% glycerol. Các mẫu vi khuẩn sẽ được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi, hoạt tính catalase và nhuộm Gram. Chỉ những khuẩn lạc âm tính với hoạt tính catalase và là Gram dương sẽ được lựa chọn cho nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp định tính và định lượng H2O2 Phương pháp của Martín & Suárez (2010) được sử dụng để xác định sự có mặt của H2O2 trong dịch nuôi các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân lập (Martin & Suárez, 2010). Vi khuẩn được cấy chuyển sang 5 mL môi trường MRS nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 24 giờ. Tế bào vi khuẩn được loại bỏ bằng ly tâm, dịch nổi thu được bổ sung vào hỗn hợp có chứa enzyme HRP (horseradish peroxidase, Sigma, USA) và TMB (3,3’,5,5’- Tetramethylbezidine, Sigma) trong đệm phosphate (pH 6) với tổng thể tích 1 mL. Ban đầu TMB ở dạng khử, không màu, khi có mặt của HRP và H2O2, TMB bị oxi hóa và chuyển thành màu xanh. Ha Thi Thu et al. 86 Phương pháp trên cũng được sử dụng để định lượng nồng độ H2O2 do các chủng vi khuẩn sản xuất được. Tiến hành dựng đường chuẩn về mối tương quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang ở bước sóng 620 nm của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn H2O2 100 mM. Nồng độ H2O2 do các chủng vi khuẩn Lactobacillus sinh ra được tính toán dựa vào đường chuẩn khi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 620 nm. Mỗi một thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Phương pháp xác định khả năng chịu muối mật và axit Các chủng vi khuẩn đã sàng lọc có khả năng sinh H2O2 được nuôi cấy trong bình chứa môi trường MRS có bổ sung muối mật Oxgall (Sigma) với nồng độ 0,3% và bình đối chứng không bổ sung muối mật. Bình nuôi cấy được ủ ở nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ, sau đó kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng và cấy trên đĩa thạch, đếm số lượng khuẩn lạc. Sau 24 giờ nuôi cấy các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trường MRS, tiến hành thử nghiệm khả năng chịu axit bằng cách ủ ở pH 2 và pH 3 trong 3 giờ. Pha loãng và cấy trên đĩa thạch để xác định khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn. Phương pháp định danh các chủng Lactobacillus bằng giải trình tự gen 16S rRNA 16S rARN gồm các vùng bảo tồn và biến đổi cao, thường được sử dụng để nhận dạng loài và phân biệt loài (Tomas et al., 2013). Các chủng vi khuẩn được chọn lọc, sẽ được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử dựa theo kỹ thuật giải trình tự đoạn gen 16S rARN (Nanda et al., 2018). Xác định khả năng ức chế sinh trưởng trên vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus Một mL dịch tế bào vi khuẩn S. aureus ATCC-23235 được trải đều trên bề mặt đĩa petri chứa 15 mL môi trường thạch BHI (Brain Heart Infusion), sau đó hút bỏ dịch thừa. Để đĩa thạch vào tủ ấm 37oC trong 15 phút. Dịch nuôi vi khuẩn Lactobacillus 24 giờ được ly tâm loại bỏ tế bào. Nhỏ 20 µL dịch ly tâm các chủng vi khuẩn Lactobacillus gồm Lac.VFE-04, Lac.VFE-08, Lac.VFE-14 hoặc dung dịch muối sinh lý (làm đối chứng) thành từng điểm riêng trên đĩa petri đã trải vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. Ủ các đĩa petri đã được cấy vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí với nhiệt độ 37oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, quan sát hiện tượng và đo kích thước vòng kháng khuẩn quanh điểm nhỏ dịch ly tâm các chủng vi khuẩn Lactobacillus để xác định khả năng ức chế sinh trưởng của dịch nuôi đối với vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chúng tôi đã phân lập được trên môi trường MRS 115 chủng Lactobacillus. Các khuẩn lạc chủ yếu có dạng lồi, mịn (không nhăn), trắng đục, không màu, rìa trơn hoặc xẻ thùy. Trên môi trường MRS, các khuẩn lạc trên cùng một đường ria mọc đều nhau, phát triển đồng nhất về hình thái và màu sắc không lẫn khuẩn lạc lạ (hình 1). Các vi khuẩn này đồng nhất dưới kính hiển vi quang học, hình que, dương tính khi nhuộm Gram và âm tính với thử nghiệm catalase. Hình 1. Tế bào Lactobacillus (Lac.VFE-14) nhuộm gram quan sát dưới kính hiển vi điện tử Định tính và định lượng H2O2 Phương pháp đo màu dựa trên HRP/TMB được chúng tôi sử dụng để xác định sự có mặt của H2O2 trong dịch nuôi vi khuẩn có độ nhạy H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 87 cao và độc tính thấp (Xianyu et al., 2013). Các phản ứng màu với TMB có độ nhạy rất cao, phát hiện được nồng độ H2O2 từ lượng rất thấp từ nanomolar đến millimolar) (Martin et al., 2010). phản ứng màu với TMB có độ nhạy rất cao, phát hiện được nồng độ H2O2 từ lượng rất thấp từ nanomolar đến millimolar) (Martin et al., 2010). Lac. VFE-04 ĐC Lac. VFE-08 Lac. VFE-14 Hình 2. Khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng Sau khi bổ sung HRP và TMB vào dịch nuôi vi khuẩn Lactobacillus đã ly tâm, môi trường chuyển ngay từ màu vàng sang xanh ở hầu hết các mẫu với độ đậm nhạt khác nhau tùy thuộc vào lượng H2O2 có mặt trong dịch nuôi của từng chủng vi khuẩn (hình 2). Kết quả kiểm tra khả năng sinh H2O2 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã phân lập được thể hiện trên bảng 1. Trong đó, chủng có khả năng sinh ra lượng H2O2 lớn nhất là Lac.VFE-14 đạt 2,183 mM, tiếp theo là Lac.VFE-08 và Lac.VFE-04 với nồng độ H2O2 tương ứng đạt 2,081 mM và 2,067 mM sau 24 giờ nuôi cấy. Lượng H2O2 sinh ra của các chủng đã phân lập được tương đối cao so với với các chủng ở các nghiên cứu trước đó. Nghiên cứu cho thấy khả năng sinh H2O2 phụ thuộc vào từng loài cụ thể. Trong thí nghiệm của Hertzberger et al. (2014), khả năng sinh H2O2 của chủng L. johnsonni NCC 533 là 1 mM, trong khi khả năng sản sinh H2O2 của L. plantarum 2142 là 0,16 mM còn L. casei Shirota là 0,056 mM (Zalán et al., 2005). Nguồn cacbon cũng có ảnh hưởng nhất định đến nồng độ H2O2. Khi sử dụng nguồn carbon là galactose, L. bulgaricus sản xuất được lượng H2O2 cao nhất là 0,02 mM, nhưng khi sorbitol được sử dụng, lượng H2O2 được tạo ra là 0,0006 mM. Ngoài ra, nguồn nitơ hay yếu tố nhiệt độ cũng có khả năng tác động lên khả năng sinh H2O2 của vi khuẩn (Enitan et al., 2011). Như vậy, ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sự tổng hợp H2O2 là khác nhau. Lượng H2O2 sản xuất được cũng phụ thuộc vào khả năng của từng chủng vi sinh vật. Ngoài ra, phương pháp định lượng có ảnh hưởng lớn đến việc xác định nồng độ H2O2 mà vi sinh vật sản xuất được trong môi trường. Vì vậy cần tối ưu điều kiện nuôi cấy và chọn lọc các chủng vi sinh vật để thu được hàm lượng H2O2 cao nhất, đồng thời cần lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp để xác định hàm lượng H2O2 vi sinh vật tổng hợp được. Hình 3. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ H2O2 và mật độ quang của sản phẩm màu sau phản ứng với TMB Ha Thi Thu et al. 88 Bảng 1. Giá trị trung bình của 3 lần đo OD620nm và hàm lượng H2O2 có trong dịch nuôi Chủng vi khuẩn Giá trị OD620nm Nồng độ H2O2 (mM) Lac.VFE-04 0,976 ± 0,011 2,067 ± 0,008 Lac.VFE-08 0,981 ± 0,012 2,081 ± 0,003 Lac.VFE-09 0,621 ± 0,017 1,005 ± 0,012 Lac.VFE-14 1,015 ± 0,014 2,183 ± 0,006 Lac.VFE-16 0,557 ± 0,012 0,812 ± 0,012 Lac.VFE-17 0,454 ± 0,013 0,504 ± 0,001 Lac.VFE-48 0,560 ± 0,012 0,822 ± 0,002 Lac.VFE-72 0,327 ± 0,011 0,125 ± 0,005 Lac.VFE-76 0,294 ± 0,014 0,024 ± 0,001 Khả năng chịu pH axit và muối mật của các chủng được chọn lọc Để đến được ruột non và đại tràng ở người, thực hiện chức năng sinh học, vi sinh vật cần phải vượt qua dạ dày, nơi có pH rất thấp (pH < 3) (Derrien etal., 2015). Khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn được khảo sát bằng cách xác định số lượng khuẩn lạc sau khi ủ vi khuẩn ở pH 2 và 3 trong 3 giờ. Kết quả được thể hiện ở bảng 2. Sau 3 giờ ủ ở pH 3, tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn này khá cao, tương ứng 95,27%, 94,15% và 98,54%. Ở pH 2, lượng tế bào còn sống so với đối chứng vẫn tương đối cao, với tỷ lệ sống của Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 tương ứng 85,12%, 84,51% và 88,22%. Sau khi di chuyển qua dạ dày, vi sinh vật lại phải đối mặt với dịch mật. Sự tiếp xúc với mật là một thử thách cho các vi khuẩn xâm nhập vào đường tiêu hóa. Muối mật hoạt động như một chất tẩy rửa sinh học, làm phá hủy màng tế bào vi khuẩn, muốn tồn tại được vi khuẩn phải có khả năng chịu muối mật (Urdaneta et al., 2017). Vì thế khả năng chịu axit và muối mật là đặc tính quan trọng cần có của hệ vi khuẩn đường ruột. Bảng 2. Tỷ lệ sống sót sau khi ủ của các chủng vi khuẩn đã chọn lọc so với đối chứng Chủng Tỷ lệ sống sót sau khi ủ (%) 0,3% muối mật pH 2 pH 3 Lac.VFE-04 97,02 ± 1,12 85,12 ± 5,44 95,27 ± 3,21 Lac.VFE-08 95,15 ± 1,14 84,51 ± 8,01 94,15 ± 5,69 Lac.VFE-14 99,08 ± 1,02 88,22 ± 5,14 98,54 ± 6,68 Nồng độ muối mật 0,3% được xem là nồng độ quan trọng để xác định khả năng chịu muối mật của các chủng vi khuẩn probiotic LAB (Belicová et al., 2013). Hầu hết các chủng được chúng tôi thử nghiệm đều duy trì khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường MRS có bổ sung muối mật 0,3%. So với đối chứng không có muối mật, tỷ lệ sinh trưởng của các chủng này dao động từ 90 đến 99%. Chủng Lac.VFE-14 có khả năng sinh trưởng tốt nhất với tỷ lệ 99,08%, gần như không có sự khác biệt so với đối chứng. Các chủng Lac.VFE-04 và Lac.VFE-08 có tỷ lệ sống sót tương ứng là 97,02% và 95,15% (bảng 2). Kết quả trên cho thấy, các chủng vi khuẩn trong nghiên cứu này có khả năng chịu axit và muối mật tốt so với với các chủng vi khuẩn lactic ở các nghiên cứu trước. Trong nghiên của Nguyễn Văn Thanh và nnk. (2007) cũng đã chỉ ra trong môi trường pH 3 và 4, tỷ lệ sống của các chủng L. acidophilus và L. casei là 41 và 65%. Trong điều kiện pH 2, tỷ lệ sống sót của 2 chủng vi khuẩn lactic L. casei VTCC186 và L. pentosus D3 trong sản phẩm kefir chanh dây là 39,36 và 52,01%. Các chủng này cũng có khả năng sinh trưởng trên môi trường có sự hiện diện của muối mật với nồng độ 0,3% (Quách Đức Tính và nnk., H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 89 2013). Một nghiên cứu khác (Shehata et al., 2016) cho thấy, trong môi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật, tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn lactic dao động trong khoảng 69,8 đến 85%. Các chủng này cũng có tỷ lệ sống sót từ 68 đến 88,3% sau 3 giờ ủ trong môi trường dịch dạ dày nhân tạo ở pH 2. Như vậy, có thể thấy, so với những chủng đã được nghiên cứu trước đây, 3 chủng Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 có khả năng chịu pH axit và muối mật vượt trội hơn hẳn. Kết quả định danh vi khuẩn theo phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA Sau khi so sánh trình tự 16S rRNA của 3 chủng chọn lọc được với các trình tự 16S rRNA đã được công bố trên ngân hàng gen (NCBI), cho thấy Lac.VFE-14 và Lac.VFE-04 có mức độ tương đồng là 100% và 99% tương ứng so với chủng L. plantarum ZZU 23 và L. plantarum S7. Trong khi đó, Lac.VFE-08 có độ tương đồng lên tới 98,65% so với L. rhamnosus JCM 1136 (bảng 3). Bảng 3. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã được công bố trên ngân hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14 Kí hiệu chủng phân lập Tên chủng Mã số đăng ký trên NCBI Identify (Tương đồng) Lac.VFE -04 L. plantarum S7 GU195646.1 99% L. plantarum T3R1C1 JX193637.1 99% L. plantarum ST-III CP002222.1 99% Lac.VFE -08 L. rhamnosus JCM 1136 NR_113332.1 98,65% L. rhamnosus NBRC 3425 NR_043408.1 98,38% L. rhamnosus JCM 1136 NR_043408.1 98,38% Lac.VFE -14 L.plantarum ZZU 23 AB830324.1 100% L. plantarum C KM507561.1 100% L. plantarum KLB 416 KM670024.1 100% Nhóm 1 Nhóm 2 Hình 4. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập Lac. VFE-04, Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree Với kết quả này, khi xây dựng cây phát sinh chủng loại để đánh giá mối quan hệ di truyền của các chủng phân lập với một số chủng thuộc chi Lactobacillus. Kết quả thu được cho thấy, các chủng được khảo sát chia thành 2 nhóm rõ rệt. Trong đó, nhóm 1 cho thấy chủng phân lập Lac. VFE-08 có mối quan hệ di truyền gần nhất với chủng L. rhamnosus JCM 1136 và các chủng thuộc chi Lactobacillus như L. paracasei, L. casei và L. zeae (hình 4). Nhóm 2, các chủng phân lập Lac. VFE-04, Lac. VFE-14 thể hiện mối quan hệ di truyền cao nhất với các chủng thuộc loài L. plantarum. Dựa trên kết quả cây phát sinh loài, 2 dòng Lac.VFE-04 và Lac.VFE-14 có quan hệ gần với L. plantarum và Lac.VFE-08 là L. rhamnosus. Khả năng ức chế sinh trưởng trên vi khuẩn gây bệnh S. aureus S. aureus là một trong những tác nhân chính gây nhiễm trùng ở người cũng như động vật (Johansson et al., 2016; Ren et al., 2017). Việc sử dụng kháng sinh liều cao để tiêu diệt vi khuẩn này có nguy cơ gây kháng kháng sinh. Vì vậy, hiện nay sản phẩm probiotics đang được sử dụng như một liệu pháp thay thế Ha Thi Thu et al. 90 kháng sinh để chống lại vi khuẩn này (Eggers et al., 2018). Lactobacillus đã được biết đến từ lâu với khả năng sinh chất kháng khuẩn bao gồm H2O2, kháng sinh, các axit hữu cơ. Trong nghiên cứu này, dịch nuôi vi khuẩn đã loại bỏ tế bào của các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 đều thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn S. aureus ATCC-23235, khả năng ức chế của mỗi chủng là khác nhau được thể hiện trên hình 5. Hoạt tính ức chế sự sinh trưởng của S. aureus ATCC-23235 của các chủng vi khuẩn này được xác định bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn trên đĩa petri. Chủng Lac.VFE-14 có đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất là 19,0 ± 1,0 mm, tiếp theo là các chủng Lac.VFE-08 với đường kính là 14,0 ± 1,0 mm vàLac.VFE-04 là 11,7 ± 1,3 mm. Hình 5. Khả năng ức chế sự sinh trưởng trên S. aureus của các chủng Lactobacillus Trong nghiên cứu về L. rhamnosus, Fornitano et al. (2019) cho thấy khả năng ức chế sự sinh trưởng của S. aureus cũng như làm giảm khả năng sản xuất enzyme gây độc coagulase (giảm từ 20,45 đến 22,73%). Đối với probiotic L. rhamnosus HN001, sau 4 tuần thử nghiệm trên các đối tượng binh sĩ dương tính với nhiễm S. aureus, số lượng S. aureus giảm 73 đến 83% so với nhóm dùng giả dược (Eggers et al., 2018). Nghiên cứu của Misaghi et al. (2017) cho thấy các vi khuẩn Lactobacillus gồm L. acidophilus, L. fermentum và L. paracasei ức chế sự sản xuất các Staphylococcal enterotoxin (SE) bao gồm SEA, SEC và SEE của vi khuẩn S. aureus. Như vậy, có thể thấy các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 trong nghiên cứu này có khả năng ức chế sự sinh trưởng của S. aureus ATCC-23235, có tiềm năng trong tương lai để hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm trùng do S. aureus. KẾT LUẬN Chúng tôi đã phân lập được 115 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS từ các mẫu phân của những người khỏe mạnh. Trong đó, ba chủng biểu hiện hoạt tính sinh H2O2 mạnh nhất lần lượt là Lac.VFE-14 (2,183 mM), Lac.VFE-08 (2,081 mM) và Lac.VFE-04 (2,067 mM). Kết quả trình tự 16S rARN của 3 chủng cho thấy Lac.VFE-14 có độ tương đồng 100% với L. plantarum ZZU 23; Lac.VFE-04 có độ tương đồng 99% với L. plantarum S7 và Lac.VFE-08 có độ tương đồng 98,65% với L. rhamnosus JCM 1136. Sản phẩm tiết của các chủng này có tác dụng ức chế vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. Các chủng này có tiềm năng dùng cho sản xuất probiotic nhờ khả năng chịu được môi trường pH axit và muối mật cũng như khả năng ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. Lời cảm ơn: Công trình này được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số CT0000.03/18-19 do TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung làm chủ nhiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Belicová A., Mikulášová M., Dušinský R., 2013. Probiotic potential and safety properties of Lactobacillus plantarum from Slovak Bryndza cheese. BioMed research international, 2013(ID 760298): 8 pp. Bermudez-Brito M., Plaza-Díaz J., Muñoz- Quezada S., Gómez-Llorente C., Gil A., 2012. "Probiotic mechanisms of action." H2O2 production in Lactobacillus strains isolated 91 Annals of Nutrition and Metabolism, 61(2): 160–174. Boateng, M., S. Price, K. Huddersman and S. E. Walsh ., 2011. Antimicrobial activities of hydrogen peroxide and its activation by a novel heterogeneous Fenton’s‐like modified PAN catalyst. Journal of applied microbiology, 111(6): 1533–1543. Chen C., Lai C., Huang L., Huang Y., Toh S., Weng C., Chuang C., Lu C., H.-J. Tang ., 2019. Antimicrobial activity of Lactobacillus species against carbapenem- resistant Enterobacteriaceae. Frontiers in microbiology, 10: 789. Corry J.E.L., Curtis G.D.W., Baird R. M., 2003. Handbook of Culture Media for Food Microbiology. Elsevier Science, 37. Davoodabadi A., Dallal M. M. S., Foroushani A. R., Douraghi M., Harati F. A., 2015. Antibacterial activity of Lactobacillus spp. isolated from the feces of healthy infants against enteropathogenic bacteria. Anaerobe, 34: 53–58. Derrien M., van Hylckama Vlieg J. E., 2015. Fate, activity, and impact of ingested bacteria within the human gut microbiota. Trends in microbiology, 23(6): 354–366. Thi Bich Thuy Do, Thi Diem Huong Nguyen, 2018. Determination of salt intolerance and probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from gut of Decapterus lajang. HUAF journal of agricultural science & technology, Hue University - University of Agriculture and Forestry, 2(2): 799–806 [in Vietnamese]. Eggers S., Barker A. K., Valentine S., Hess T., Duster M., Safdar N., 2018. Effect of Lactobacillus rhamnosus HN001 on carriage of Staphylococcus aureus: results of the impact of probiotics for reducing infections in veterans (IMPROVE) study. BMC infectious diseases, 18(1): 129. Enitan A., Adeyemo J., Ogunbanwo S., 2011. Influence of growth conditions and nutritional requirements on the production of hydrogen peroxide by lactic acid bacteria. African journal of microbiology research, 5(15): 2059–2066. Fornitano A., Amêndola I., Santos S., 2019. Lactobacillus rhamnosus versus Staphylococcus aureus: influence on growth and expression of virulence factors. J Dent Maxillofacial Res, 2(2): 29–33. Hertzberger R., Arents J., Dekker H. L., Pridmore R. D., Gysler C., Kleerebezem M., de Mattos M. J. T., 2014. H2O2 production in species of the Lactobacillus acidophilus group: a central role for a novel NADH- dependent flavin reductase. Appl. Environ. Microbiol., 80(7): 2229–2239. Johansson M. A., Björkander S., Mata Forsberg M., Qazi K. R., Salvany Celades M., Bittmann J., Eberl M., Sverremark- Ekström E., 2016. Probiotic lactobacilli modulate Staphylococcus aureus-induced activation of conventional and unconventional T cells and NK cells. Frontiers in immunology, 7: 273. Kang D.-K., Oh H., Ham J.-S., Kim J., Yoon C., Ahn Y., Kim H., 2005. Identification and characterization of hydrogen peroxide-generating Lactobacillus fermentum CS12-1. Asian-australasian journal of animal sciences, 18(1): 90–95. Nanda., Chaudhary., Kumar., 2018. Molecular Approaches for Identification of Lactobacilli from Traditional Dairy. Advances in Animal Biotechnology and its Applications, 181–196. Van Thanh Nguyen, Thu Hoa Tran, Vu Tuong Vy Nguyen, 2007. Investigation of acid, bile salt and antibiotic tolerance of some oral probiotics. Pharmaceutical journal, 378: 255–263 [in Vietnamese]. Markowiak P., Śliżewska K., 2017. Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health. Nutrients, 9(9): 1021. Martín R., Suárez J. E., 2010. Biosynthesis and degradation of H2O2 by vaginal lactobacilli. Appl. Environ. Microbiol., 76(2): 400–405. Ha Thi Thu et al. 92 Misaghi A., Parsaeimehr M., Akhondzadeh A., Gandomi H., Azizkhani M., 2017. The inhibitory effects of Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus paracasei isolated from yoghurt on the growth and enterotoxin A gene expression of S. aureus. Iranian Journal of Veterinary Medicine, 11(2): 191–201. Tomas Vetrovsky, Petr Baldrian ., 2013. The Variability of The 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. Plos One 8: (2). Duc Tinh Quach, Thanh Trung Tong, Ngoc Duy Nguyen, Thuy Huong Nguyen, 2013. Investigation of some probiotic properties of traditional and Lactobacillus casei VTCC186-supplemented Kefir. Science & Technology Development, 16(3): 40–47 [in Vietnamese]. Ren D., Gong S., Shu J., Zhu J., Rong F., Zhang Z., Wang D., Gao L., Qu T., Liu H., 2017. Mixed Lactobacillus plantarum strains inhibit Staphylococcus aureus induced inflammation and ameliorate intestinal microflora in mice. BioMed research international., 2017(ID 7476467): 7 pages. Shehata M., El Sohaimy S., El-Sahn M. A., Youssef M.,2016. Screening of isolated potential probiotic lactic acid bacteria for cholesterol lowering property and bile salt hydrolase activity. Annals of Agricultural Sciences, 61(1): 65–75. Urdaneta V., Casadesús J., 2017. Interactions between bacteria and bile salts in the gastrointestinal and hepatobiliary tracts. Frontiers in medicine, 4: 163. Xianyu Y., Zhu K., Chen W., Wang X., Zhao H., Sun J., Wang Z., Jiang X., 2013. Enzymatic assay for Cu (II) with horseradish peroxidase and its application in colorimetric logic gate. Analytical chemistry, 85(15): 7029–7032. Zalán Z., Németh E., Baráth Á., Halász A., 2005. Influence of growth medium on hydrogen peroxide and bacteriocin production of Lactobacillus strains. Food Technology and Biotechnology, 43(3): 219–225.