Kết luận
Chúng tôi đã thành công trong việc
thiết kế hai mẫu dò mới để dò hai vi
khuẩn Campylobacter jejuni (CJE), Yersinia
enterocolitica :8 (Y 8 , cũng như thiết kế
mới các mẫu dò chứng dương (P , chứng màu
(C và chứng âm (N . Các mẫu dò đều cho
thấy tính đặc hiệu cao cả trên lý thuyết lẫn
thực nghiệm. Quy trình PCR-RDB được công
ố ở đây đã cho phép phát hiện đồng thời 14
vi khuẩn gây ệnh đường ruột, ao gồm:
Bacillus cereus, Clostridium botulinum,
Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, Escherichia coli
O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp.,
Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,
Yersinia enterocolitica, Brucella spp, Yersinia
enterocolitica O:8 và Campylobacter jejuni,
với độ nhạy quy trình PCR-RDB đạt 102 ản
ao/ml. Quy trình được thử nghiệm trên 30
mẫu phân ghi nhận tính chính ác tuyệt đối
trong ét nghiệm 14 vi khuẩn v a nêu khi o
ánh với kít thương mại c a Hàn Quốc
(PowerCheckTM 20 Pathogen Multiplex Realtime PCR Kit). Quy trình vì vậy sẽ được tiếp
tục thử nghiệm trên cỡ mẫu lớn hơn và các
đơn v thử nghiệm rộng rãi hơn, trước khi
đăng ký giấy phép lưu hành ản phẩm
11 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Lượt xem: 19 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Hoàn thiện quy trình phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng kĩ thuật PCR - Reverse dot blot (PCR-RDB), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
54 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64
HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI 14
VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT BẰNG KĨ THUẬT
PCR - REVERSE DOT BLOT (PCR-RDB)
HỒ THỊ THANH THỦY, NGUYỄN VĂN TRƯỜNG
Công ty Cổ phần và Công nghệ Việt Á
NGUYỄN BẢO TOÀN
Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic, Thành phố Hồ Chí Minh
LAO ĐỨC THUẬN, TRƯƠNG KIM PHƯỢNG, LÊ HUYỀN ÁI THÚY
Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh - thuy.lha@ou.edu.vn
(Ngày nhận: 10/01/2018; Ngày nhận lại: 20/01/2018; Ngày duyệt đăng: 14/03/2018)
TÓM TẮT
Ngộ độc thực phẩm, với một trong những nguyên nhân chính do nhiễm khuẩn vẫn luôn là mối lo ngại, mang
tính toàn cầu, được Tổ chức Sức khỏe Thế giới rất quan tâm. Việc ác đ nh chính ác đối tượng vi khuẩn nhiễm vẫn
luôn là một nhu cầu cấp thiết c a các la o lâm àng. Nghiên cứu trước đây c a chúng tôi đã được công bố với việc
thành công ước đầu trong việc xây dựng một quy trình dựa trên kĩ thuật PCR-Reverse Dot Blot (PCR-RDB) nhằm
ác đ nh đồng thời 12 vi khuẩn gây bệnh đường ruột ch yếu, bao gồm Bacillus cereus, Clostridium botulinum,
Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella
spp., Shigella spp.., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella spp. Chúng tôi
tiếp tục phát triển nghiên cứu này nhằm hoàn thiện quy trình PCR-RDB ằng việc thiết kế ổ ung trên màng các
loại mẫu dò nhằm làm chứng dương, chứng âm, chứng màu và chứng kiểm tra tín hiệu nền. Bên cạnh đó, ét nhu
cầu lâm àng, việc ổ ung hai loại mẫu dò đề dò hai vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica O:8
gây ệnh đường ruột ch yếu ở trẻ em, là cần thiết. Quy trình PCR-RDB được hoàn thiện trong nghiên cứu này vì
vậy có khả năng phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây ệnh đường ruột, một cách đặc hiệu, với độ nhạy đạt 102 ản
ao/ml, đã được thử nghiệm trên 30 mẫu phân, ghi nhận kết quả hoàn toàn khớp với kít thương mại PowerCheckTM
20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit (Korea).
Từ khóa: Campylobacter jejuni; PCR-Reverse Dot Blot; Vi khuẩn gây bệnh đường ruột; Yersinia enterocolitica O:8.
Accomplishment of a protocol for simultaneous detection of 14 intestinal bacterial
pathogens based on PCR-Reverse Dot Blot
ABSTRACT
Food poisoning, caused by bacterial infection, consequently led to a wide range of infection and endanger to
public health, has been considered as a big concern in the world. Therefore, it is an urgent demand of the clinical
laboratory to exactly identify the infectious bacteria. In our previous study, we successfully published a
protocol based on the PCR-Reverse Dot Blot (PCR-RDB) to determine simultaneously 12 bacterial intestinal
pathogens, including Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157: H7, Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio cholerae, Vibrio
parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica and Brucella spp. In this study, we continuously developed our published
protocol by designing additional probes: positive control probe, negative control probe, color control probe and
background signal controller. Moreover, concerning the clinical demand, the supplement of two designed probes,
which detected Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica O:8 caused intestinal infected diseases mainly in
children, was necessary. As a result, this completed PCR-RDB protocol can simultaneously detect a total of 14
intestinal bacterial pathogens within high specificity and the sensitivity of 10
2
copies/ml. For the protocol
confirmation, it was tested by 30 fecal samples and the results completely match with the commercial kit
PowerCheckTM 20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit (Korea).
Keywords: Campylobacter jejuni; Intestinal bacteria; PCR-Reverse Dot Blot; Yersinia enterocolitica O:8.
Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 55
1. Mở đầu
Ngộ độc thực phẩm đã và đang là một
trong những vấn đề mang tính toàn cầu được
Tổ chức Sức khỏe Thế giới ( orld Health
rgani ation – H và Trung tâm Phòng và
iểm oát ệnh c a M ( S Center or
Disease Control and Prevention – CDC công
ố hằng năm với những con ố nhiễm khuẩn
và ngộ độc t thực phẩm rất lớn. Triệu chứng
lâm àng c a các đối tượng nhiễm thường là
nôn mửa và tiêu chảy, tuy nhiên đa ố trường
hợp là không phân iệt được nếu dựa trên triệu
chứng lâm àng ởi vi khuẩn nhiễm rất khác
nhau. Chính vì vậy, việc ác đ nh chính ác vi
khuẩn nhiễm là một nhu cầu cấp thiết c a các
la o lâm àng. Các k thuật hiện nay đang
được áp dụng tại các ệnh viện ch yếu dựa
trên nuôi cấy vi khuẩn. Mặc d đây là chuẩn
vàng c a ác đ nh vi khuẩn nhiễm, nhưng cả
quy trình đòi hỏi thời gian dài để thu nhận kết
quả. Chính yếu tố thời gian này đã làm ảnh
hưởng đến việc lựa chọn phương pháp điều tr
k p thời và thích hợp cho ệnh nhân. Vì vậy,
một phương pháp nhanh, nhạy và đặc hiệu để
ác đ nh chính ác các vi khuẩn gây ệnh thực
ự là một nhu cầu cấp ách.
Trong những năm v a qua, k thuật Sinh
học Phân tử đã có những ứng dụng hết ức cụ
thể và cần thiết trong lĩnh vực chẩn đoán vi
inh, như vi inh lâm àng, kiểm nghiệm thực
phẩm, , ch yếu là PCR và các cải iên t
PCR; trong số đó, PCR kết hợp với lai phân tử,
điển hình như PCR kết hợp lại ngược theo
t ng lỗ trên màng (Reverse Dot Blot
hybridization – RDB hybridization) với tính
chất đơn giản, dễ tự động hóa, nên việc triển
khai trong lâm sàng đã được thực hiện. Công
ố trước đây c a chúng tôi đã cung cấp thông
tin c a hai cặp mồi chung và 12 mẫu dò
đặc hiệu để dò 12 loại vi khuẩn gây ệnh
đường ruột phổ iến ao gồm Bacillus
cereus, Clostridium botulinum, Clostridium
perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli O157:H7,
Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia
enterocolitica và Brucella spp (Ho Thi Thanh
Thuy và cộng ự, 2016 . Tại Việt Nam,
Salmonella c ng với Campylobacter và
Shigella là a tác nhân vi khuẩn gây ệnh
quan trọng trong tiêu chảy trẻ em, trong đó,
Campylobacter jejuni là loài gây tiêu chảy rất
phổ iến ởi nguồn lây nhiễm ch yếu là t
gia cầm và các ản phẩm gia cầm (Tài liệu Bộ
Y tế, 2009; Ble mann và cộng ự, 2002;
H , 2005 , lợn và các gia úc khác
(Nguyen, 2006; Schroeder cộng ự, 2008;
Vinh và cộng ự, 2009; Vinh, 2010; WHO,
2014 . Một ố công ố cho thấy nhiễm
Campylobacter ở trẻ em Việt Nam dao động
t 2 – 4% ( atherine và cộng ự, 2015;
Thomp on và cộng ự, 2015 và dưới 1% ở
người lớn (Trang và cộng ự, 2007), trong đó
Campylo acter là nguồn nhiễm phổ iến nhất
ở trẻ em nông thôn, chiếm đến 31% các
trường hợp nhiễm khuẩn (Isenbarger và cộng
ự, 2001 . Có đến 15 – 30% các mẫu th t
được lấy t các v ng khác nhau, tại Việt Nam,
ghi nhận nhiễm Campylo acter (Huong và
cộng ự, 2006; Ha và cộng ự, 2006; Schwan,
2010; Garin và cộng ự, 2012; Carrique-Mas
và cộng ự, 2014 , th t v t và th t lợn nhiễm
Campylo acter tương ứng 23,9 và 53,7%
(Carrique-Ma và cộng ự, 2014 ; 35,1% các
mẫu th t gà thu tại quầy và các cơ ở giết
mỗ nhiễm Campylobacter jejuni (Bao và
cộng ự, 2006 . Chính vì vậy, việc ổ ung
Campylobacter jejuni vào trong ố 14 loài vi
khuẩn đích phát hiện c a nghiên cứu này là
rất cần thiết. Bên cạnh đó, vi khuẩn Yersinia
enterocolitica O:8 là serotype thuộc nhóm gây
độc mạnh (Fredrik on-Ahomala và Korkeala,
2003; Fuku hima và cộng ự, 2011; Houvinen
và cộng ự, 2010 , nhưng mẫu dò YER trong
công ố trước c a chúng tôi (Ho Thi Thanh
Thuy và cộng ự, 2016 , chưa dò đặc hiệu cho
erotype này. Vì thế việc thiết kế thêm một
mẫu dò nữa ắt cặp đặc hiệu riêng với
Yersinia enterocolitica :8, đã được đặt ra
thêm trong nghiên cứu này.
Ngoài ra, để hoàn thiện quy trình, cần
phải ổ ung trên màng các loại mẫu dò nhằm
làm chứng dương, chứng âm, chứng màu và
chứng kiểm tra tín hiệu nền là rất cần thiết.
56 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64
Nghiên cứu này vì vậy được đặt ra với mục
đích là thiết kế mới hai mẫu dò để dò hai
vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia
enterocolitica :8, nâng tổng ố vi khuẩn gây
ệnh đường ruột có thể phát hiện lên thành
14, ên cạnh việc hoàn thiện quy trình PCR-
RDB ằng việc ổ ung các loại mẫu dò
chứng dương, chứng âm, chứng màu và chứng
nền, trước khi thử nghiệm quy trình trên một
ố mẫu phân và o ánh với kít thương mại
nhập t Hàn Quốc.
2. Vật liệu - Phương pháp
2.1. Vi khuẩn chuẩn
14 loài vi khuẩn gây ệnh đường ruột
được thu thập t ngân hàng giống ATCC,
bao gồm: Salmonella spp., Shigella spp.,
Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus,
Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae,
Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,
Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,
Yersinia enterocolitica, Brucella spp, Yersinia
enterocolitica O:8 và Campylobacter jejuni.
2.2. Bệnh phẩm
30 mẫu phân thu thập t Trung tâm chẩn
đoán Y khoa Medic, TP. Hồ Chí Minh.
2.3. Mồi và mẫu dò
Các ộ mồi chung và 12 mẫu dò để dò 12
vi khuẩn Clostridium botulinum, Clostridium
perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Escherichia coli O157:H7,
Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia
enterocolitica và Brucella spp (Ho Thi Thanh
Thuy và cộng ự, 2016 ; c ng với các mẫu dò
để dò 2 vi khuẩn Campylobacter jejuni và
Yersinia enterocolitica :8, mẫu dò d ng làm
chứng dương, chứng âm, chứng màu (Bảng
1 , được đặt tổng hợp tại IDT, M .
2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm và mẫu tế
bào nuôi cấy
Mẫu phân được thu nhận và chuyển đến
phòng vi inh, Công ty Cổ phần & Công nghệ
Việt Á ở điều kiện nhiệt độ t 4 – 8oC. Lấy
100 mg phân rắn hoặc 200 µl phân lỏng đồng
nhất trong 1 ml TE 1X (Tris-EDTA); Ly tâm
2800 vòng trong 2 phút thu 200 µl d ch nổi
hoặc lấy 200 µl d ch tế bào vi khuẩn nuôi cấy,
thêm vào 900 µl dung d ch Tri ol, vorte 30 ,
để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; Thêm
vào 200 µl dung d ch Chloro orm, ly tâm
13000 vòng/phút trong 5 phút; Thu d ch nổi
và thêm vào 600 µl dung d ch I opropanol; Ly
tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn
màu anh; Thêm 900 µl dung d ch Ethanol 70
%, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, hòa
tan cặn trong 50 µl dung d ch TE 1X. Hóa
chất tách chiết này là ản phẩm kít c a đề tài
nghiên cứu khoa học cấp Bộ Giáo dục Đào
tạo (B2015-32-03): NAaDNA Extraction Kit P
(Việt Á .
2.5. PCR-RDB
PCR được thực hiện với máy
M proM 3005P (Stratagene , thành phần như
sau: 2 µl 16S/23S qPCR Mix 10X [10X Hot
Start PCR Buffer, Maxima Hot Start Taq
DNA Polymerase (5 U/µL), 25 mM MgCl2,
dNTP mi 200µM, hỗn hợp 4 mồi 0,5µM ,
20 ng DNA và nước cất đ thể tích 20 µl.
Chương trình nhiệt ao gồm: 1 chu kỳ: 95oC-
5 phút; 40 chu kỳ: 94oC-30 giây, 55oC-45 giây
(chọn đọc kết quả tại ước này), 72oC-45
giây; 1 chu kỳ: 72oC-6 phút; 1 chu kỳ: 72oC-
30 giây (chọn đọc kết quả tại ước này ; 1 chu
kỳ: 95oC-30 giây.
Việc chuẩn màng lai, gắn các mẫu dò
oligonucleotide lên màng được thực hiện như
sau: Màng được rửa nhanh với HCl (0.1mol/l),
au đó được ử lý với 20% EDC (1-ethyl-3-[3-
dimethylaminopropyl] trong nước khử ion,
tiếp theo đó rửa với nước khử ion một lần nữa.
Mẫu dò iến đổi có gắn thêm nhóm amino
acid ở đầu 5‘ được hòa trong 0.5mol/l odium
icar onate u er (pH 8.4 , au đó chấm vào
những v trí đã ghi đ nh v ẵn trên màng.
Nhóm amino c a mẫu dò ẽ gắn với nhóm
car o yl trên màng. Những điểm chấm trên
màng được rửa với Tri -bufferes saline/0.1%
Tween-20. Cuối c ng màng ẽ được rửa với
nước khử ion và làm khô để ảo quản hoặc là
ử dụng ngay.
RDB được thực hiện với các điều kiện cơ
ản như au: iến tính 10 µl ản phẩm PCR
trong 30 phút, nhiệt độ phòng, với dung d ch
Na H 0,5N; lai trong 3 giờ ở 40oC, au đó
Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 57
rửa màng lai trong 20 phút và phát hiện tín
hiệu lai au 30 – 45 phút với dung dich phát
hiện (NBT/BCIP , trong tối.
Hóa chất PCR-RDB này là các ản phẩm
kít c a đề tài nghiên cứu khoa học cấp
Bộ Giáo dục Đào tạo (B2015-32-03): RDB
16S/23SFR – rPCR kit và RDB Hybridization
– Solution kit (Việt Á .
Bảng 1
Thông tin về các mồi và mẫu dò
STT
Mồi/
Mẫu dò
Trình tự (5’→3’) Vi khuẩn dò
Chiều
dài
1 16SF CTGGCGGCAGGCCTAACACAT
Chung
21
2 16SR GGCTGCTGGCACGGAGTTAG 20
3 23SR ACCGATAGTGAACCAGTACCGTGAG
Chung
25
4 23SF TTAAATGATGGCTGCTTCTAAGCC 24
5 BAC TGCTAGTTGCTGGGAATAACACCTTGACG B. cereus 29
6 BRU
CGTAGAATAACTCAGGGCCATTTGCTACGAAAC
TTGTG
Brucella spp. 38
7 CBO
TATAAGAGATTTTCTTATGAATCGCATCCAAAGA
TTTAT
C. botulinum 39
8 CPF
ATGGCATCATAAAGGAGCAATCCGCCATTCAAC
CTATGAGATGGACCC
C. perfringens 48
9 LIS
TGTTGTTAAAGGATAAGAGGAGAAGAACTAACT
GCT
L. monocytogenes 36
10 SAL GGTGTTGTCGCAGCAAGGTTAATAACTTGA Salmonella spp. 30
11 SHI GGGAGTAACTTTGCTCAGTTAATACATTGA Shigella spp. 30
12 SAU
ACATATGTTGTGCACAGTAAGTAACTCTTGACGG
TA
S. aureus 36
13 VPA
AAACGACTTCGGGGAAGTTATCTGAACCGATAA
CGG
V. parahaemolyticus 36
14 VCH CAGCACACTTGGGTGAGGAACTTGTTCGGCGAG V. cholerae 33
15 YER CATAAATTTGTGATTGGTTAATAACCGACGT Y. enterocolitica 24
16 ECO AGACAGCCATTAGAAGGGATGTTGGCCAGCCA E. coli O157:H7 28
17 YO8 CCAATAATTGGATTGACCTTAATACGTTGGT Y. enterocolitica O:8 31
18 CJE AAGTGGGCGTTTCATCCTCCACGCGCTGCG C. jejuni 30
19 P TTTGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG Chứng dương 28 bp
20 C BIOTIN-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACCTTT Chứng màu 28 bp
21 N TTTCCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC Chứng âm 28 bp
22 B 0.5 mol/L sodium bicarbonate buffer Tín hiệu nền No
58 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Khảo sát độ đặc hiệu của các mẫu
dò trên máy tính
Trình tự 16S rRNA gen c a các vi
khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia
enterocolitica :8 được thu nhận t Gen ank,
o ánh để ghi nhận v ng tương đồng; t đó
v ng tương đồng thuộc trình tự được khuếch
đại ởi các mồi chung (Bảng 1 được nhận
diện. Trình tự các mẫu dò để dò các vi
khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia
enterocolitica :8 được cân nhắc chọn (Bảng
1 . Ngoài ra, trình tự ảo tồn chung cho cả 14
vi khuẩn khảo át cũng được chọn làm mẫu dò
chứng dương, chứng nền; v ng khác iệt
được chọn làm mẫu dò chứng âm được trình
ày như ở Bảng 1.
Phần mềm Bla t tích hợp trên cơ ở dữ
liệu NCBI được ử dụng để đánh giá độ đặc
hiệu c a các mẫu dò mới được thiết kế trong
nghiên cứu này, ghi nhận tính đặc hiệu
tuyệt đối c a hai mẫu dò để dò hai vi
khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia
enterocolitica O:8, cũng như các mẫu dò d ng
làm chứng dương, chứng âm, chứng màu (dữ
liệu không trình ày . Thêm vào đó, các tính
chất vật lý c a các mẫu dò được kiểm tra ằng
công cụ “Analy er” tích hợp trên trang we
c a IDT:
Applications/OligoAnalyzer. ết quả cho thấy
các giá tr ΔG c a các mẫu dò để dò vi
khuẩn Campylobacter jejuni (CJE), Yersinia
enterocolitica O:8 (Y 8 , chứng dương (P),
chứng màu (C và chứng âm (N) đều đạt, một
ố giá tr nhỏ hơn < - 9 kcal.mole-1 nhưng
không nhỏ hơn nhiều (Bảng 2 , vì thế cũng ẽ
không ảnh hưởng đến các thí nghiệm về au,
đăc iệt là phản ứng lai.
Bảng 2
Các thông ố vật lý c a các mẫu dò
STT
Ký hiệu
mẫu dò
Trình tự (5’ – 3’)
Chiều dài
(bp)
%GC Tm (
o
C) 1 2
1 CJE
AAGTGGGCGTTTCATCCT
CCACGCGCTGCG
30 63,3 70,2 -2,49 -10,36
2 YO8
CCAATAATTGGATTGACC
TTAATACGTTGGT
31 35,5 57,4 -2,24 -8,44
3 P
TTTGGCTAACTCCGTGCC
AGCAGCCGCG
28 64,3 69,7 -2,36 -10,36
4 C
CCGCTGTATCACAAGGG
CTGGTACCTTT
28 53,6 63,7 -0,96 -9,78
5 N
TTTCCGCTGTATCACAAG
GGCTGGTACC
28 53,6 63,7 0,04 -9,78
(1): Năng lượng ΔG (kcal.mole-1) hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin) của mẫu dò
(2): Năng lượng ΔG (kcal.mole-1) hình thành cấu trúc tự bắt cặp (self-dimer) của mẫu dò
Nhiệt độ nóng chảy c a 5 mẫu dò tổng
hợp mới trong nghiên cứu này thay đổi trong
khoảng t 57,4 đến 70,2o, cũng như không
quá khác iệt o với 12 mẫu dò đã công ố
trước đây (Ho Thi Thanh Thuy và cộng ự,
2016 , thay đổi trong khoảng t 56,9 đến
68,6
oC. Sự thay đổi này hoàn toàn có thể đáp
ứng được điều kiện thực nghiệm c a phản
Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 59
ứng lai.
3.2. Khảo sát độ đặc hiệu và độ nhạy
của các mẫu dò trên thực nghiệm
Với điều kiện lai như đã được nêu trong
phần vật liệu và phương pháp, ản phẩm PCR
t DNA c a 14 vi khuẩn chuẩn được lai thử
nghiệm trên giả mẫu (với mẫu phân , theo các
dãy nồng độ vi khuẩn t 100 đến 106, ghi nhận
độ nhạy c a quy trình PCR-RDB đạt ở mức
10
2
ản ao/ml (Hình 1 . Để dễ theo dõi, ảng
au (Bảng 3 ghi chú lại ơ đồ v trí các mẫu
dò được cố đ nh trên mỗi màng lai.
Bảng 3
Sơ đồ v trí các mẫu dò được cố đ nh trên màng lai
1 2 3 4 5
A Chứng dương Chứng nền Chứng âm Chứng màu BAC
B BRU CBO CPF LIS SAL
C SHI SAU VPA VCH YER
D ECO YO8 CJE
60 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64
Hình 1. ết quả PCR-RDB cho độ nhạy 102 ản ao/ml tương ứng với 14 mẫu phân nhiễm 14 vi khuẩn
ết quả trên (Hình 1 cũng đồng thời
khẳng đ nh tính đặc hiệu c a các mẫu dò: 14
ản phẩm lai hoàn toàn đặc hiệu tương ứng
với 14 ch ng vi khuẩn đích, không ghi nhận
ất kỳ dấu hiệu nào cho thấy có ự ắt chéo
giữa các mẫu dò và vi khuẩn. Các tín hiệu
tương ứng với các v trí c a chứng dương và
chứng màu đều rõ ràng, chứng âm và chứng
nền đều không uất hiện ất cứ tín hiệu nào.
Hơn nữa, 14 ản phẩm PCR được thực hiện t
DNA tách t 14 vi khuẩn chuẩn đều được giải
trình tự, ghi nhận tính đặc hiệu hoàn toàn c a
ản phẩm giải được (dữ liệu không trình ày ,
cho phép chúng tôi khẳng đ nh tính khuếch
đại đặc hiệu c a hai cặp mồi chung (Ho Thi
Thanh Thuy và cộng ự, 2016 .
3.3. Thử nghiệm quy trình PCR-RDB
trên mẫu lâm sàng
Thử nghiệm quy trình PCR-RDB phát
hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây ệnh đường
ruột trên 30 mẫu phân thu nhận tại Trung tâm
Chẩn đoán Y khoa medic, TP. Hồ Chí Minh,
kết quả ghi nhận 10 mẫu dương, trong đó các
mẫu 1 và 20 nhiễm đồng thời hai vi khuẩn:
mẫu 1 đồng nhiễm Salmonella spp và Bacillus
aureus; mẫu 20 đồng nhiễm Shigella spp và
Staphylococcus aureus (Bảng 4; Hình 2 .
ết quả thử nghiệm này cũng được chúng
tôi kiểm tra ằng ộ kít thương mại
PowerCheck
TM
20 Pathogen Multiplex Real-
time PCR Kit (Korea), ghi nhận tính tương
đồng tuyệt đối trong cả 30 mẫu (Bảng 4).
Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 61
Bảng 4
ết quả thử nghiệm trên 30 mẫu phân
Mẫu
PCR-RDB
PowerCheck
TM
20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit
Multiplex
1 Set
Multiplex
2 Set
Multiplex
3 Set
Multiplex
4 Set
Multiplex
5 Set
Multiplex
6 Set
Mẫu 1
Salmonella
B. cereus
IC (Ct 26)
Salmonella
(Ct 26)
B.cereus
(Ct 38)
Mẫu 2 C. jejuni
C. jejuni
(Ct 25)
IC (Ct 26)
Mẫu 3 Shigella IC (Ct 26)
EIEC
(ipaH)
(Ct 19)
Mẫu 4
Salmonella
IC (Ct 26)
Salmonella
(Ct 26)
Mẫu 5 S. aureus IC (Ct 26)
S. aureus
(Ct 35)
Mẫu 6
Salmonella
IC (Ct 26)
Salmonella
(Ct 29)
Mẫu 7 - IC (Ct 26)
Mẫu 8 - IC (Ct 26)
Mẫu 9 - IC (Ct 26)
Mẫu 10 - IC (Ct 26)
Mẫu 11 - IC (Ct 26)
Mẫu 12 - IC (Ct 25)
Mẫu 13 - IC (Ct 26)
Mẫu 14
L.monocyto
genes
IC (Ct 25)
L.monocytogenes
(Ct 31)
Mẫu 15
E. coli
O157:H7
IC (Ct 26)
EAEC
(aggR)
(Ct 31)
Mẫu 16 - IC (Ct 26)
Mẫu 17 - IC (Ct 26)
Mẫu 18 - IC (Ct 25)
62 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64
Mẫu
PCR-RDB
PowerCheck
TM
20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit
Multiplex
1 Set
Multiplex
2 Set
Multiplex
3 Set
Multiplex
4 Set
Multiplex
5 Set
Multiplex
6 Set
Mẫu 19 - IC (Ct 25)
Mẫu 20
Shigella
S. aureus
IC (Ct 26)
S.aureus
(Ct 32)
EIEC
(ipaH)
(Ct 28)
Mẫu 21 - IC (Ct 25)
Mẫu 22 - IC (Ct 25)
Mẫu 23 - IC (Ct 26)
Mẫu 24 - IC (Ct 26)
Mẫu 25 Salmonella
IC (Ct 25)
Salmonella
(Ct 21)
Mẫu 26 - IC (Ct 26)
Mẫu 27 - IC (Ct 25)
Mẫu 28 - IC (Ct 26)
Mẫu 29 - IC (Ct 25)
Mẫu 30 - IC (Ct 25)
Chỉ ố chu kỳ ngưỡng (thre hold cycle –
Ct trên 30 mẫu thử nghiệm c a ộ kít
PowerCheck
TM
20 Pathogen Multiplex Real-
time PCR it ( orea đều xuất hiện ở chu kỳ
thứ 25 hoặc 26, ghi nhận tính ổn đ nh c a kít
thương mại này. Có hai mẫu (mẫu 3 và 20),
kết quả real-time PCR xuất hiện tín hiệu
dương với EIEC (ipaH), PCR-RDB ghi nhận
dương tính với mẫu dò dò vi khuẩn Shigella.
Các mẫu này cũng đã được nuôi cấy ghi nhận
vi khuẩn mọc là Shigella (dữ liệu không trình
bày), nên chúng tôi có thể khẳng đ nh về kết
quả phát hiện là Shigella trong mẫu. Kết quả
này cũng cho phép chúng tôi uy luận, real-
time PCR c a bộ kít PowerCheckTM 20
Pathogen Multiplex Real-time PCR bắt được
với gen quy đ nh độc tố (ipaH) ở cả E. coli và
Shigella.
Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 63
Hình 2. ết quả PCR-RDB trên các mẫu phân 1 – 6
4. Kết luận
Chúng tôi đã thành công trong việc
thiết kế hai mẫu dò mới để dò hai vi
khuẩn Campylobacter jejuni (CJE), Yersinia
enterocolitica :8 (Y 8 , cũng như thiết kế
mới các mẫu dò chứng dương (P , chứng màu
(C và chứng âm (N . Các mẫu dò đều cho
thấy tính đặc hiệu cao cả trên lý thuyết lẫn
thực nghiệm. Quy trình PCR-RDB được công
ố ở đây đã cho phép phát hiện đồng thời 14
vi khuẩn gây ệnh đường ruột, ao gồm:
Bacillus cereus, Clostridium botulinum,
Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, Escherichia coli
O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp..,
Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,
Yersinia enterocolitica, Brucella spp, Yersinia
enterocolitica O:8 và Campylobacter jejuni,
với độ nhạy quy trình PCR-RDB đạt 102 ản
ao/ml. Quy trình được thử nghiệm trên 30
mẫu phân ghi nhận tính chính ác tuyệt đối
trong ét nghiệm 14 vi khuẩn v a nêu khi o
ánh với kít thương mại c a Hàn Quốc
(PowerCheck
TM
20 Pathogen Multiplex Real-
time PCR Kit). Quy trình vì vậy sẽ được tiếp
tục thử nghiệm trên cỡ mẫu lớn hơn và các
đơn v thử nghiệm rộng rãi hơn, trước khi
đăng ký giấy phép lưu hành ản phẩm
Lời cảm ơn
Nghiên cứu được thực hiện bởi sự đồng tài trợ kinh phí c a Bộ Giáo dục và Đào tạo, Việt Nam (B2015-32-03) và
Công ty Cổ phần và Công nghệ Việt Á.
Tài liệu tham khảo
Bao, V. N., Fries R., Zessin K. H., Kyule M. N., Pinthong R., Baumann M. P. O. (2006). Salmonella and Campylobacter
in broiler carcasses in Vietnam, In: Proceedings of the 11th International Symposium Veterinary Epidemiology
and Economics.
Blessmann, J., et al. (2002). Epidemiology of amebiasis in a region of high incidence of amebic liver abscess in
central Vietnam. Am J Trop Med Hyg, 66(5), 578-583.
Bộ Y tế (2009 . Hướng dẫn xử trí tiêu chảy nhiễm trùng ở Trẻ em, Hà Nội.
Carrique-Mas, J. J., Bryant J. E., Cuong N. V., Hoang N. V., Campbell J., Hoang N. V., et al. (2014). An
epidemiological investigation of Campylobacter in pig and poultry farms in the Mekong delta of
Vietnam. Epidemiol Infect, 142, 1425–1436.
64 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64
Fredriksson-Ahomaa Maria and orkeala Hannu, Lơ occurrence ò pathogenic (2003 . Yersinia enterocolitica in
clinical, food and environmental samples: a methodological problem. Clinical Microbiology Review, 220-229.
Fukushima, H., Shimizu S. and Inatsu Y. (2011). Yersinia enterolotica and Yersinia pseudotuberculosis detection in
foods. Journal of Pathogens, 735308-735317.
Garin, B., Gouali M., Wouafo M., Perchec A. M., Tham M. T., Ravaonindrina N., et al. (2012). Prevalence,
quantification and antimicrobial resistance of Campylobacter spp. on chicken neck-skins at points of
slaughter in 5 major cities located on 4 continents. Int J Food Microbiol, 157, 102–107.
Ha, T. A., Pham T. (2006). Study of Salmonella, Campylobacter, and Escherichia coli contamination in raw food
available in factories, schools, and hospital canteens in Hanoi, Vietnam. Ann N Y Acad Sci, 1081, 262–265.
Huong, L. Q., Hanh T. T., Cam P. D., Be N. T. (2006). Study on the prevalence of Campylobacter spp. from
chicken meat in Hanoi, Vietnam. Ann N Y Acad, 1081, 273–275.
Huovinen Elisa, Sihvonen M Leila et al. (2010). Symptoms and sources of Yersinia enterolitica-infection: a case-
control study. BMC Infectious Diseases, 10, 122.
Isenbarger, D. W., Hien B. T., Ha H. T., Ha T. T., Bodhidatta L., Pang L. W., et al. (2001). Prospective study of the
incidence of diarrhoea and prevalence of bacterial pathogens in a cohort of Vietnamese children along the
Red River. Epidemiol Infect, 127, 229–236.
Katherine, L. A. et al. (2015). The epidemiology and aetiology of diarrhoeal disease in infancy in southern Vietnam:
a birth cohort study. Int J Infect Dis, 15, 00074-0.
Nguyen, T. V., et al. (2006). Etiology and epidemiology of diarrhea in children in Hanoi, Viet Nam. Int J Infect
Dis, 10(4), 298-308.
Schroeder, G. N. and Hilbi H. (2008). Molecular pathogenesis of Shigella spp.: controlling host cell signaling,
invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev, 21(1), 134-56.
Schwan, P. (2010). Prevalence and antibiotic resistance of Campylobacter spp. in poultry and raw meat in the Can
Tho Province, Vietnam. Examensarbete, 49.
Thompson, C. N. et al. (2015). A prospective multi-center observational study of children hospitalized with diarrhea
in Ho Chi Minh City, Vietnam. Am J Trop Med Hyg.
Thuy, H. T. T., Thuan L. D., Phuong T. K., Thuy L. H. A. (2016). Identification of bacterial intestinal pathogens by
a PCR-Reverse Dot Blot procedure. Journal of Science Ho Chi Minh city Open University, 1(17), 11-22.
Trang, D. T., Hien B. T. T., Molbak K., Cam P. D., Dalsgaard A. (2007). Epidemiology and aetiology of diarrhoeal
diseases in adults engaged in wastewater-fed agriculture and agriculture in Hanoi, Vietnam. Trop Med Int
Health, 12, 23–33.
Vinh, H. (2010 . “Chapter 3: Acute Childhood Diarrhoea: Shigella ver u Rotaviru ” trong “The changing
epidemiology, clinical yndrome and anti iotic re i tance pattern o higello i in Vietname e children”,
PhD thesis, The Open University, UK.
World Health Organization (2005). The Treatment of diarrhoea: a manual for physicians and other senior health
workers. - 4th rev. Geneva.
World Health Organization, Diarrheal diseases, Fact sheet No.330, April 2013,
actsheets/fs330/en/.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
hoan_thien_quy_trinh_phat_hien_dong_thoi_14_vi_khuan_gay_ben.pdf