Hoàn thiện quy trình phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng kĩ thuật PCR - Reverse dot blot (PCR-RDB)

Kết luận Chúng tôi đã thành công trong việc thiết kế hai mẫu dò mới để dò hai vi khuẩn Campylobacter jejuni (CJE), Yersinia enterocolitica :8 (Y 8 , cũng như thiết kế mới các mẫu dò chứng dương (P , chứng màu (C và chứng âm (N . Các mẫu dò đều cho thấy tính đặc hiệu cao cả trên lý thuyết lẫn thực nghiệm. Quy trình PCR-RDB được công ố ở đây đã cho phép phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây ệnh đường ruột, ao gồm: Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, Brucella spp, Yersinia enterocolitica O:8 và Campylobacter jejuni, với độ nhạy quy trình PCR-RDB đạt 102 ản ao/ml. Quy trình được thử nghiệm trên 30 mẫu phân ghi nhận tính chính ác tuyệt đối trong ét nghiệm 14 vi khuẩn v a nêu khi o ánh với kít thương mại c a Hàn Quốc (PowerCheckTM 20 Pathogen Multiplex Realtime PCR Kit). Quy trình vì vậy sẽ được tiếp tục thử nghiệm trên cỡ mẫu lớn hơn và các đơn v thử nghiệm rộng rãi hơn, trước khi đăng ký giấy phép lưu hành ản phẩm

pdf11 trang | Chia sẻ: hachi492 | Lượt xem: 19 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Hoàn thiện quy trình phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng kĩ thuật PCR - Reverse dot blot (PCR-RDB), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
54 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI 14 VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT BẰNG KĨ THUẬT PCR - REVERSE DOT BLOT (PCR-RDB) HỒ THỊ THANH THỦY, NGUYỄN VĂN TRƯỜNG Công ty Cổ phần và Công nghệ Việt Á NGUYỄN BẢO TOÀN Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic, Thành phố Hồ Chí Minh LAO ĐỨC THUẬN, TRƯƠNG KIM PHƯỢNG, LÊ HUYỀN ÁI THÚY Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh - thuy.lha@ou.edu.vn (Ngày nhận: 10/01/2018; Ngày nhận lại: 20/01/2018; Ngày duyệt đăng: 14/03/2018) TÓM TẮT Ngộ độc thực phẩm, với một trong những nguyên nhân chính do nhiễm khuẩn vẫn luôn là mối lo ngại, mang tính toàn cầu, được Tổ chức Sức khỏe Thế giới rất quan tâm. Việc ác đ nh chính ác đối tượng vi khuẩn nhiễm vẫn luôn là một nhu cầu cấp thiết c a các la o lâm àng. Nghiên cứu trước đây c a chúng tôi đã được công bố với việc thành công ước đầu trong việc xây dựng một quy trình dựa trên kĩ thuật PCR-Reverse Dot Blot (PCR-RDB) nhằm ác đ nh đồng thời 12 vi khuẩn gây bệnh đường ruột ch yếu, bao gồm Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella spp. Chúng tôi tiếp tục phát triển nghiên cứu này nhằm hoàn thiện quy trình PCR-RDB ằng việc thiết kế ổ ung trên màng các loại mẫu dò nhằm làm chứng dương, chứng âm, chứng màu và chứng kiểm tra tín hiệu nền. Bên cạnh đó, ét nhu cầu lâm àng, việc ổ ung hai loại mẫu dò đề dò hai vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica O:8 gây ệnh đường ruột ch yếu ở trẻ em, là cần thiết. Quy trình PCR-RDB được hoàn thiện trong nghiên cứu này vì vậy có khả năng phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây ệnh đường ruột, một cách đặc hiệu, với độ nhạy đạt 102 ản ao/ml, đã được thử nghiệm trên 30 mẫu phân, ghi nhận kết quả hoàn toàn khớp với kít thương mại PowerCheckTM 20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit (Korea). Từ khóa: Campylobacter jejuni; PCR-Reverse Dot Blot; Vi khuẩn gây bệnh đường ruột; Yersinia enterocolitica O:8. Accomplishment of a protocol for simultaneous detection of 14 intestinal bacterial pathogens based on PCR-Reverse Dot Blot ABSTRACT Food poisoning, caused by bacterial infection, consequently led to a wide range of infection and endanger to public health, has been considered as a big concern in the world. Therefore, it is an urgent demand of the clinical laboratory to exactly identify the infectious bacteria. In our previous study, we successfully published a protocol based on the PCR-Reverse Dot Blot (PCR-RDB) to determine simultaneously 12 bacterial intestinal pathogens, including Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157: H7, Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica and Brucella spp. In this study, we continuously developed our published protocol by designing additional probes: positive control probe, negative control probe, color control probe and background signal controller. Moreover, concerning the clinical demand, the supplement of two designed probes, which detected Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica O:8 caused intestinal infected diseases mainly in children, was necessary. As a result, this completed PCR-RDB protocol can simultaneously detect a total of 14 intestinal bacterial pathogens within high specificity and the sensitivity of 10 2 copies/ml. For the protocol confirmation, it was tested by 30 fecal samples and the results completely match with the commercial kit PowerCheckTM 20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit (Korea). Keywords: Campylobacter jejuni; Intestinal bacteria; PCR-Reverse Dot Blot; Yersinia enterocolitica O:8. Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 55 1. Mở đầu Ngộ độc thực phẩm đã và đang là một trong những vấn đề mang tính toàn cầu được Tổ chức Sức khỏe Thế giới ( orld Health rgani ation – H và Trung tâm Phòng và iểm oát ệnh c a M ( S Center or Disease Control and Prevention – CDC công ố hằng năm với những con ố nhiễm khuẩn và ngộ độc t thực phẩm rất lớn. Triệu chứng lâm àng c a các đối tượng nhiễm thường là nôn mửa và tiêu chảy, tuy nhiên đa ố trường hợp là không phân iệt được nếu dựa trên triệu chứng lâm àng ởi vi khuẩn nhiễm rất khác nhau. Chính vì vậy, việc ác đ nh chính ác vi khuẩn nhiễm là một nhu cầu cấp thiết c a các la o lâm àng. Các k thuật hiện nay đang được áp dụng tại các ệnh viện ch yếu dựa trên nuôi cấy vi khuẩn. Mặc d đây là chuẩn vàng c a ác đ nh vi khuẩn nhiễm, nhưng cả quy trình đòi hỏi thời gian dài để thu nhận kết quả. Chính yếu tố thời gian này đã làm ảnh hưởng đến việc lựa chọn phương pháp điều tr k p thời và thích hợp cho ệnh nhân. Vì vậy, một phương pháp nhanh, nhạy và đặc hiệu để ác đ nh chính ác các vi khuẩn gây ệnh thực ự là một nhu cầu cấp ách. Trong những năm v a qua, k thuật Sinh học Phân tử đã có những ứng dụng hết ức cụ thể và cần thiết trong lĩnh vực chẩn đoán vi inh, như vi inh lâm àng, kiểm nghiệm thực phẩm, , ch yếu là PCR và các cải iên t PCR; trong số đó, PCR kết hợp với lai phân tử, điển hình như PCR kết hợp lại ngược theo t ng lỗ trên màng (Reverse Dot Blot hybridization – RDB hybridization) với tính chất đơn giản, dễ tự động hóa, nên việc triển khai trong lâm sàng đã được thực hiện. Công ố trước đây c a chúng tôi đã cung cấp thông tin c a hai cặp mồi chung và 12 mẫu dò đặc hiệu để dò 12 loại vi khuẩn gây ệnh đường ruột phổ iến ao gồm Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella spp (Ho Thi Thanh Thuy và cộng ự, 2016 . Tại Việt Nam, Salmonella c ng với Campylobacter và Shigella là a tác nhân vi khuẩn gây ệnh quan trọng trong tiêu chảy trẻ em, trong đó, Campylobacter jejuni là loài gây tiêu chảy rất phổ iến ởi nguồn lây nhiễm ch yếu là t gia cầm và các ản phẩm gia cầm (Tài liệu Bộ Y tế, 2009; Ble mann và cộng ự, 2002; H , 2005 , lợn và các gia úc khác (Nguyen, 2006; Schroeder cộng ự, 2008; Vinh và cộng ự, 2009; Vinh, 2010; WHO, 2014 . Một ố công ố cho thấy nhiễm Campylobacter ở trẻ em Việt Nam dao động t 2 – 4% ( atherine và cộng ự, 2015; Thomp on và cộng ự, 2015 và dưới 1% ở người lớn (Trang và cộng ự, 2007), trong đó Campylo acter là nguồn nhiễm phổ iến nhất ở trẻ em nông thôn, chiếm đến 31% các trường hợp nhiễm khuẩn (Isenbarger và cộng ự, 2001 . Có đến 15 – 30% các mẫu th t được lấy t các v ng khác nhau, tại Việt Nam, ghi nhận nhiễm Campylo acter (Huong và cộng ự, 2006; Ha và cộng ự, 2006; Schwan, 2010; Garin và cộng ự, 2012; Carrique-Mas và cộng ự, 2014 , th t v t và th t lợn nhiễm Campylo acter tương ứng 23,9 và 53,7% (Carrique-Ma và cộng ự, 2014 ; 35,1% các mẫu th t gà thu tại quầy và các cơ ở giết mỗ nhiễm Campylobacter jejuni (Bao và cộng ự, 2006 . Chính vì vậy, việc ổ ung Campylobacter jejuni vào trong ố 14 loài vi khuẩn đích phát hiện c a nghiên cứu này là rất cần thiết. Bên cạnh đó, vi khuẩn Yersinia enterocolitica O:8 là serotype thuộc nhóm gây độc mạnh (Fredrik on-Ahomala và Korkeala, 2003; Fuku hima và cộng ự, 2011; Houvinen và cộng ự, 2010 , nhưng mẫu dò YER trong công ố trước c a chúng tôi (Ho Thi Thanh Thuy và cộng ự, 2016 , chưa dò đặc hiệu cho erotype này. Vì thế việc thiết kế thêm một mẫu dò nữa ắt cặp đặc hiệu riêng với Yersinia enterocolitica :8, đã được đặt ra thêm trong nghiên cứu này. Ngoài ra, để hoàn thiện quy trình, cần phải ổ ung trên màng các loại mẫu dò nhằm làm chứng dương, chứng âm, chứng màu và chứng kiểm tra tín hiệu nền là rất cần thiết. 56 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 Nghiên cứu này vì vậy được đặt ra với mục đích là thiết kế mới hai mẫu dò để dò hai vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica :8, nâng tổng ố vi khuẩn gây ệnh đường ruột có thể phát hiện lên thành 14, ên cạnh việc hoàn thiện quy trình PCR- RDB ằng việc ổ ung các loại mẫu dò chứng dương, chứng âm, chứng màu và chứng nền, trước khi thử nghiệm quy trình trên một ố mẫu phân và o ánh với kít thương mại nhập t Hàn Quốc. 2. Vật liệu - Phương pháp 2.1. Vi khuẩn chuẩn 14 loài vi khuẩn gây ệnh đường ruột được thu thập t ngân hàng giống ATCC, bao gồm: Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Yersinia enterocolitica, Brucella spp, Yersinia enterocolitica O:8 và Campylobacter jejuni. 2.2. Bệnh phẩm 30 mẫu phân thu thập t Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic, TP. Hồ Chí Minh. 2.3. Mồi và mẫu dò Các ộ mồi chung và 12 mẫu dò để dò 12 vi khuẩn Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella spp (Ho Thi Thanh Thuy và cộng ự, 2016 ; c ng với các mẫu dò để dò 2 vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica :8, mẫu dò d ng làm chứng dương, chứng âm, chứng màu (Bảng 1 , được đặt tổng hợp tại IDT, M . 2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm và mẫu tế bào nuôi cấy Mẫu phân được thu nhận và chuyển đến phòng vi inh, Công ty Cổ phần & Công nghệ Việt Á ở điều kiện nhiệt độ t 4 – 8oC. Lấy 100 mg phân rắn hoặc 200 µl phân lỏng đồng nhất trong 1 ml TE 1X (Tris-EDTA); Ly tâm 2800 vòng trong 2 phút thu 200 µl d ch nổi hoặc lấy 200 µl d ch tế bào vi khuẩn nuôi cấy, thêm vào 900 µl dung d ch Tri ol, vorte 30 , để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút; Thêm vào 200 µl dung d ch Chloro orm, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút; Thu d ch nổi và thêm vào 600 µl dung d ch I opropanol; Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu cặn màu anh; Thêm 900 µl dung d ch Ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, hòa tan cặn trong 50 µl dung d ch TE 1X. Hóa chất tách chiết này là ản phẩm kít c a đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ Giáo dục Đào tạo (B2015-32-03): NAaDNA Extraction Kit P (Việt Á . 2.5. PCR-RDB PCR được thực hiện với máy M proM 3005P (Stratagene , thành phần như sau: 2 µl 16S/23S qPCR Mix 10X [10X Hot Start PCR Buffer, Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase (5 U/µL), 25 mM MgCl2, dNTP mi 200µM, hỗn hợp 4 mồi 0,5µM , 20 ng DNA và nước cất đ thể tích 20 µl. Chương trình nhiệt ao gồm: 1 chu kỳ: 95oC- 5 phút; 40 chu kỳ: 94oC-30 giây, 55oC-45 giây (chọn đọc kết quả tại ước này), 72oC-45 giây; 1 chu kỳ: 72oC-6 phút; 1 chu kỳ: 72oC- 30 giây (chọn đọc kết quả tại ước này ; 1 chu kỳ: 95oC-30 giây. Việc chuẩn màng lai, gắn các mẫu dò oligonucleotide lên màng được thực hiện như sau: Màng được rửa nhanh với HCl (0.1mol/l), au đó được ử lý với 20% EDC (1-ethyl-3-[3- dimethylaminopropyl] trong nước khử ion, tiếp theo đó rửa với nước khử ion một lần nữa. Mẫu dò iến đổi có gắn thêm nhóm amino acid ở đầu 5‘ được hòa trong 0.5mol/l odium icar onate u er (pH 8.4 , au đó chấm vào những v trí đã ghi đ nh v ẵn trên màng. Nhóm amino c a mẫu dò ẽ gắn với nhóm car o yl trên màng. Những điểm chấm trên màng được rửa với Tri -bufferes saline/0.1% Tween-20. Cuối c ng màng ẽ được rửa với nước khử ion và làm khô để ảo quản hoặc là ử dụng ngay. RDB được thực hiện với các điều kiện cơ ản như au: iến tính 10 µl ản phẩm PCR trong 30 phút, nhiệt độ phòng, với dung d ch Na H 0,5N; lai trong 3 giờ ở 40oC, au đó Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 57 rửa màng lai trong 20 phút và phát hiện tín hiệu lai au 30 – 45 phút với dung dich phát hiện (NBT/BCIP , trong tối. Hóa chất PCR-RDB này là các ản phẩm kít c a đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ Giáo dục Đào tạo (B2015-32-03): RDB 16S/23SFR – rPCR kit và RDB Hybridization – Solution kit (Việt Á . Bảng 1 Thông tin về các mồi và mẫu dò STT Mồi/ Mẫu dò Trình tự (5’→3’) Vi khuẩn dò Chiều dài 1 16SF CTGGCGGCAGGCCTAACACAT Chung 21 2 16SR GGCTGCTGGCACGGAGTTAG 20 3 23SR ACCGATAGTGAACCAGTACCGTGAG Chung 25 4 23SF TTAAATGATGGCTGCTTCTAAGCC 24 5 BAC TGCTAGTTGCTGGGAATAACACCTTGACG B. cereus 29 6 BRU CGTAGAATAACTCAGGGCCATTTGCTACGAAAC TTGTG Brucella spp. 38 7 CBO TATAAGAGATTTTCTTATGAATCGCATCCAAAGA TTTAT C. botulinum 39 8 CPF ATGGCATCATAAAGGAGCAATCCGCCATTCAAC CTATGAGATGGACCC C. perfringens 48 9 LIS TGTTGTTAAAGGATAAGAGGAGAAGAACTAACT GCT L. monocytogenes 36 10 SAL GGTGTTGTCGCAGCAAGGTTAATAACTTGA Salmonella spp. 30 11 SHI GGGAGTAACTTTGCTCAGTTAATACATTGA Shigella spp. 30 12 SAU ACATATGTTGTGCACAGTAAGTAACTCTTGACGG TA S. aureus 36 13 VPA AAACGACTTCGGGGAAGTTATCTGAACCGATAA CGG V. parahaemolyticus 36 14 VCH CAGCACACTTGGGTGAGGAACTTGTTCGGCGAG V. cholerae 33 15 YER CATAAATTTGTGATTGGTTAATAACCGACGT Y. enterocolitica 24 16 ECO AGACAGCCATTAGAAGGGATGTTGGCCAGCCA E. coli O157:H7 28 17 YO8 CCAATAATTGGATTGACCTTAATACGTTGGT Y. enterocolitica O:8 31 18 CJE AAGTGGGCGTTTCATCCTCCACGCGCTGCG C. jejuni 30 19 P TTTGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG Chứng dương 28 bp 20 C BIOTIN-CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACCTTT Chứng màu 28 bp 21 N TTTCCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC Chứng âm 28 bp 22 B 0.5 mol/L sodium bicarbonate buffer Tín hiệu nền No 58 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Khảo sát độ đặc hiệu của các mẫu dò trên máy tính Trình tự 16S rRNA gen c a các vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica :8 được thu nhận t Gen ank, o ánh để ghi nhận v ng tương đồng; t đó v ng tương đồng thuộc trình tự được khuếch đại ởi các mồi chung (Bảng 1 được nhận diện. Trình tự các mẫu dò để dò các vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica :8 được cân nhắc chọn (Bảng 1 . Ngoài ra, trình tự ảo tồn chung cho cả 14 vi khuẩn khảo át cũng được chọn làm mẫu dò chứng dương, chứng nền; v ng khác iệt được chọn làm mẫu dò chứng âm được trình ày như ở Bảng 1. Phần mềm Bla t tích hợp trên cơ ở dữ liệu NCBI được ử dụng để đánh giá độ đặc hiệu c a các mẫu dò mới được thiết kế trong nghiên cứu này, ghi nhận tính đặc hiệu tuyệt đối c a hai mẫu dò để dò hai vi khuẩn Campylobacter jejuni và Yersinia enterocolitica O:8, cũng như các mẫu dò d ng làm chứng dương, chứng âm, chứng màu (dữ liệu không trình ày . Thêm vào đó, các tính chất vật lý c a các mẫu dò được kiểm tra ằng công cụ “Analy er” tích hợp trên trang we c a IDT: Applications/OligoAnalyzer. ết quả cho thấy các giá tr ΔG c a các mẫu dò để dò vi khuẩn Campylobacter jejuni (CJE), Yersinia enterocolitica O:8 (Y 8 , chứng dương (P), chứng màu (C và chứng âm (N) đều đạt, một ố giá tr nhỏ hơn < - 9 kcal.mole-1 nhưng không nhỏ hơn nhiều (Bảng 2 , vì thế cũng ẽ không ảnh hưởng đến các thí nghiệm về au, đăc iệt là phản ứng lai. Bảng 2 Các thông ố vật lý c a các mẫu dò STT Ký hiệu mẫu dò Trình tự (5’ – 3’) Chiều dài (bp) %GC Tm ( o C) 1 2 1 CJE AAGTGGGCGTTTCATCCT CCACGCGCTGCG 30 63,3 70,2 -2,49 -10,36 2 YO8 CCAATAATTGGATTGACC TTAATACGTTGGT 31 35,5 57,4 -2,24 -8,44 3 P TTTGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCG 28 64,3 69,7 -2,36 -10,36 4 C CCGCTGTATCACAAGGG CTGGTACCTTT 28 53,6 63,7 -0,96 -9,78 5 N TTTCCGCTGTATCACAAG GGCTGGTACC 28 53,6 63,7 0,04 -9,78 (1): Năng lượng ΔG (kcal.mole-1) hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin) của mẫu dò (2): Năng lượng ΔG (kcal.mole-1) hình thành cấu trúc tự bắt cặp (self-dimer) của mẫu dò Nhiệt độ nóng chảy c a 5 mẫu dò tổng hợp mới trong nghiên cứu này thay đổi trong khoảng t 57,4 đến 70,2o, cũng như không quá khác iệt o với 12 mẫu dò đã công ố trước đây (Ho Thi Thanh Thuy và cộng ự, 2016 , thay đổi trong khoảng t 56,9 đến 68,6 oC. Sự thay đổi này hoàn toàn có thể đáp ứng được điều kiện thực nghiệm c a phản Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 59 ứng lai. 3.2. Khảo sát độ đặc hiệu và độ nhạy của các mẫu dò trên thực nghiệm Với điều kiện lai như đã được nêu trong phần vật liệu và phương pháp, ản phẩm PCR t DNA c a 14 vi khuẩn chuẩn được lai thử nghiệm trên giả mẫu (với mẫu phân , theo các dãy nồng độ vi khuẩn t 100 đến 106, ghi nhận độ nhạy c a quy trình PCR-RDB đạt ở mức 10 2 ản ao/ml (Hình 1 . Để dễ theo dõi, ảng au (Bảng 3 ghi chú lại ơ đồ v trí các mẫu dò được cố đ nh trên mỗi màng lai. Bảng 3 Sơ đồ v trí các mẫu dò được cố đ nh trên màng lai 1 2 3 4 5 A Chứng dương Chứng nền Chứng âm Chứng màu BAC B BRU CBO CPF LIS SAL C SHI SAU VPA VCH YER D ECO YO8 CJE 60 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 Hình 1. ết quả PCR-RDB cho độ nhạy 102 ản ao/ml tương ứng với 14 mẫu phân nhiễm 14 vi khuẩn ết quả trên (Hình 1 cũng đồng thời khẳng đ nh tính đặc hiệu c a các mẫu dò: 14 ản phẩm lai hoàn toàn đặc hiệu tương ứng với 14 ch ng vi khuẩn đích, không ghi nhận ất kỳ dấu hiệu nào cho thấy có ự ắt chéo giữa các mẫu dò và vi khuẩn. Các tín hiệu tương ứng với các v trí c a chứng dương và chứng màu đều rõ ràng, chứng âm và chứng nền đều không uất hiện ất cứ tín hiệu nào. Hơn nữa, 14 ản phẩm PCR được thực hiện t DNA tách t 14 vi khuẩn chuẩn đều được giải trình tự, ghi nhận tính đặc hiệu hoàn toàn c a ản phẩm giải được (dữ liệu không trình ày , cho phép chúng tôi khẳng đ nh tính khuếch đại đặc hiệu c a hai cặp mồi chung (Ho Thi Thanh Thuy và cộng ự, 2016 . 3.3. Thử nghiệm quy trình PCR-RDB trên mẫu lâm sàng Thử nghiệm quy trình PCR-RDB phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây ệnh đường ruột trên 30 mẫu phân thu nhận tại Trung tâm Chẩn đoán Y khoa medic, TP. Hồ Chí Minh, kết quả ghi nhận 10 mẫu dương, trong đó các mẫu 1 và 20 nhiễm đồng thời hai vi khuẩn: mẫu 1 đồng nhiễm Salmonella spp và Bacillus aureus; mẫu 20 đồng nhiễm Shigella spp và Staphylococcus aureus (Bảng 4; Hình 2 . ết quả thử nghiệm này cũng được chúng tôi kiểm tra ằng ộ kít thương mại PowerCheck TM 20 Pathogen Multiplex Real- time PCR Kit (Korea), ghi nhận tính tương đồng tuyệt đối trong cả 30 mẫu (Bảng 4). Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 61 Bảng 4 ết quả thử nghiệm trên 30 mẫu phân Mẫu PCR-RDB PowerCheck TM 20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit Multiplex 1 Set Multiplex 2 Set Multiplex 3 Set Multiplex 4 Set Multiplex 5 Set Multiplex 6 Set Mẫu 1 Salmonella B. cereus IC (Ct 26) Salmonella (Ct 26) B.cereus (Ct 38) Mẫu 2 C. jejuni C. jejuni (Ct 25) IC (Ct 26) Mẫu 3 Shigella IC (Ct 26) EIEC (ipaH) (Ct 19) Mẫu 4 Salmonella IC (Ct 26) Salmonella (Ct 26) Mẫu 5 S. aureus IC (Ct 26) S. aureus (Ct 35) Mẫu 6 Salmonella IC (Ct 26) Salmonella (Ct 29) Mẫu 7 - IC (Ct 26) Mẫu 8 - IC (Ct 26) Mẫu 9 - IC (Ct 26) Mẫu 10 - IC (Ct 26) Mẫu 11 - IC (Ct 26) Mẫu 12 - IC (Ct 25) Mẫu 13 - IC (Ct 26) Mẫu 14 L.monocyto genes IC (Ct 25) L.monocytogenes (Ct 31) Mẫu 15 E. coli O157:H7 IC (Ct 26) EAEC (aggR) (Ct 31) Mẫu 16 - IC (Ct 26) Mẫu 17 - IC (Ct 26) Mẫu 18 - IC (Ct 25) 62 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 Mẫu PCR-RDB PowerCheck TM 20 Pathogen Multiplex Real-time PCR Kit Multiplex 1 Set Multiplex 2 Set Multiplex 3 Set Multiplex 4 Set Multiplex 5 Set Multiplex 6 Set Mẫu 19 - IC (Ct 25) Mẫu 20 Shigella S. aureus IC (Ct 26) S.aureus (Ct 32) EIEC (ipaH) (Ct 28) Mẫu 21 - IC (Ct 25) Mẫu 22 - IC (Ct 25) Mẫu 23 - IC (Ct 26) Mẫu 24 - IC (Ct 26) Mẫu 25 Salmonella IC (Ct 25) Salmonella (Ct 21) Mẫu 26 - IC (Ct 26) Mẫu 27 - IC (Ct 25) Mẫu 28 - IC (Ct 26) Mẫu 29 - IC (Ct 25) Mẫu 30 - IC (Ct 25) Chỉ ố chu kỳ ngưỡng (thre hold cycle – Ct trên 30 mẫu thử nghiệm c a ộ kít PowerCheck TM 20 Pathogen Multiplex Real- time PCR it ( orea đều xuất hiện ở chu kỳ thứ 25 hoặc 26, ghi nhận tính ổn đ nh c a kít thương mại này. Có hai mẫu (mẫu 3 và 20), kết quả real-time PCR xuất hiện tín hiệu dương với EIEC (ipaH), PCR-RDB ghi nhận dương tính với mẫu dò dò vi khuẩn Shigella. Các mẫu này cũng đã được nuôi cấy ghi nhận vi khuẩn mọc là Shigella (dữ liệu không trình bày), nên chúng tôi có thể khẳng đ nh về kết quả phát hiện là Shigella trong mẫu. Kết quả này cũng cho phép chúng tôi uy luận, real- time PCR c a bộ kít PowerCheckTM 20 Pathogen Multiplex Real-time PCR bắt được với gen quy đ nh độc tố (ipaH) ở cả E. coli và Shigella. Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 63 Hình 2. ết quả PCR-RDB trên các mẫu phân 1 – 6 4. Kết luận Chúng tôi đã thành công trong việc thiết kế hai mẫu dò mới để dò hai vi khuẩn Campylobacter jejuni (CJE), Yersinia enterocolitica :8 (Y 8 , cũng như thiết kế mới các mẫu dò chứng dương (P , chứng màu (C và chứng âm (N . Các mẫu dò đều cho thấy tính đặc hiệu cao cả trên lý thuyết lẫn thực nghiệm. Quy trình PCR-RDB được công ố ở đây đã cho phép phát hiện đồng thời 14 vi khuẩn gây ệnh đường ruột, ao gồm: Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringen, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp.., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, Brucella spp, Yersinia enterocolitica O:8 và Campylobacter jejuni, với độ nhạy quy trình PCR-RDB đạt 102 ản ao/ml. Quy trình được thử nghiệm trên 30 mẫu phân ghi nhận tính chính ác tuyệt đối trong ét nghiệm 14 vi khuẩn v a nêu khi o ánh với kít thương mại c a Hàn Quốc (PowerCheck TM 20 Pathogen Multiplex Real- time PCR Kit). Quy trình vì vậy sẽ được tiếp tục thử nghiệm trên cỡ mẫu lớn hơn và các đơn v thử nghiệm rộng rãi hơn, trước khi đăng ký giấy phép lưu hành ản phẩm Lời cảm ơn Nghiên cứu được thực hiện bởi sự đồng tài trợ kinh phí c a Bộ Giáo dục và Đào tạo, Việt Nam (B2015-32-03) và Công ty Cổ phần và Công nghệ Việt Á. Tài liệu tham khảo Bao, V. N., Fries R., Zessin K. H., Kyule M. N., Pinthong R., Baumann M. P. O. (2006). Salmonella and Campylobacter in broiler carcasses in Vietnam, In: Proceedings of the 11th International Symposium Veterinary Epidemiology and Economics. Blessmann, J., et al. (2002). Epidemiology of amebiasis in a region of high incidence of amebic liver abscess in central Vietnam. Am J Trop Med Hyg, 66(5), 578-583. Bộ Y tế (2009 . Hướng dẫn xử trí tiêu chảy nhiễm trùng ở Trẻ em, Hà Nội. Carrique-Mas, J. J., Bryant J. E., Cuong N. V., Hoang N. V., Campbell J., Hoang N. V., et al. (2014). An epidemiological investigation of Campylobacter in pig and poultry farms in the Mekong delta of Vietnam. Epidemiol Infect, 142, 1425–1436. 64 Hồ Thị Thanh Thủy và cộng sự. Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 59(2), 54-64 Fredriksson-Ahomaa Maria and orkeala Hannu, Lơ occurrence ò pathogenic (2003 . Yersinia enterocolitica in clinical, food and environmental samples: a methodological problem. Clinical Microbiology Review, 220-229. Fukushima, H., Shimizu S. and Inatsu Y. (2011). Yersinia enterolotica and Yersinia pseudotuberculosis detection in foods. Journal of Pathogens, 735308-735317. Garin, B., Gouali M., Wouafo M., Perchec A. M., Tham M. T., Ravaonindrina N., et al. (2012). Prevalence, quantification and antimicrobial resistance of Campylobacter spp. on chicken neck-skins at points of slaughter in 5 major cities located on 4 continents. Int J Food Microbiol, 157, 102–107. Ha, T. A., Pham T. (2006). Study of Salmonella, Campylobacter, and Escherichia coli contamination in raw food available in factories, schools, and hospital canteens in Hanoi, Vietnam. Ann N Y Acad Sci, 1081, 262–265. Huong, L. Q., Hanh T. T., Cam P. D., Be N. T. (2006). Study on the prevalence of Campylobacter spp. from chicken meat in Hanoi, Vietnam. Ann N Y Acad, 1081, 273–275. Huovinen Elisa, Sihvonen M Leila et al. (2010). Symptoms and sources of Yersinia enterolitica-infection: a case- control study. BMC Infectious Diseases, 10, 122. Isenbarger, D. W., Hien B. T., Ha H. T., Ha T. T., Bodhidatta L., Pang L. W., et al. (2001). Prospective study of the incidence of diarrhoea and prevalence of bacterial pathogens in a cohort of Vietnamese children along the Red River. Epidemiol Infect, 127, 229–236. Katherine, L. A. et al. (2015). The epidemiology and aetiology of diarrhoeal disease in infancy in southern Vietnam: a birth cohort study. Int J Infect Dis, 15, 00074-0. Nguyen, T. V., et al. (2006). Etiology and epidemiology of diarrhea in children in Hanoi, Viet Nam. Int J Infect Dis, 10(4), 298-308. Schroeder, G. N. and Hilbi H. (2008). Molecular pathogenesis of Shigella spp.: controlling host cell signaling, invasion, and death by type III secretion. Clin Microbiol Rev, 21(1), 134-56. Schwan, P. (2010). Prevalence and antibiotic resistance of Campylobacter spp. in poultry and raw meat in the Can Tho Province, Vietnam. Examensarbete, 49. Thompson, C. N. et al. (2015). A prospective multi-center observational study of children hospitalized with diarrhea in Ho Chi Minh City, Vietnam. Am J Trop Med Hyg. Thuy, H. T. T., Thuan L. D., Phuong T. K., Thuy L. H. A. (2016). Identification of bacterial intestinal pathogens by a PCR-Reverse Dot Blot procedure. Journal of Science Ho Chi Minh city Open University, 1(17), 11-22. Trang, D. T., Hien B. T. T., Molbak K., Cam P. D., Dalsgaard A. (2007). Epidemiology and aetiology of diarrhoeal diseases in adults engaged in wastewater-fed agriculture and agriculture in Hanoi, Vietnam. Trop Med Int Health, 12, 23–33. Vinh, H. (2010 . “Chapter 3: Acute Childhood Diarrhoea: Shigella ver u Rotaviru ” trong “The changing epidemiology, clinical yndrome and anti iotic re i tance pattern o higello i in Vietname e children”, PhD thesis, The Open University, UK. World Health Organization (2005). The Treatment of diarrhoea: a manual for physicians and other senior health workers. - 4th rev. Geneva. World Health Organization, Diarrheal diseases, Fact sheet No.330, April 2013, actsheets/fs330/en/.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfhoan_thien_quy_trinh_phat_hien_dong_thoi_14_vi_khuan_gay_ben.pdf
Tài liệu liên quan