Khảo sát môi trường nuôi cấy thích hợp cho việc sản xuất Ubiquinon Q10 từ vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh Rhodopseudomonas Palustris

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 216 KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO VIỆC SẢN XUẤT UBIQUINON Q10 TỪ VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHÔNG LƯU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS Lê Thị Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Thị Hồng Kim** TÓM TẮT Mục tiêu: Ubiquinon Q-10 (CoQ10) thuộc nhóm chất isoprenoid quinon hiện diện ở mọi tế bào sinh vật. CoQ10 tham gia vào chuỗi hô hấp tế bào và có vai trò như một chất chống oxy hóa. Hiện nay, CoQ10 được sử dụng bổ sung trong thực phẩm chức năng và mỹ phẩm. Ở những người lớn tuổi có tiền sử bệnh tim mạch, CoQ10 được bổ sung như một liệu pháp trị liệu hổ trợ. Và điều này làm cho nhu cầu sử dụng CoQ10 tăng lên đáng kể. CoQ10 có trong rất nhiều các tổ chức sinh hoc, từ vi sinh vật như vi khuẩn và nấm men, cho đến những các loài động vật và thực vật. Việc sản xuất CoQ10 từ vi khuẩn đang có khuynh hướng phát triển mạnh và trở thành nguồn cung cấp chủ yếu cho ngành công nghệ dược phẩm. Phương pháp:Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng như nguồn carbon, nguồn nito, vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch chiết cà chua đến sự tăng trưởng tế bào cũng như sản xuất CoQ10 của các chủng vi khuẩn R. Palustris PN16, PN21 và PN31 được phân lập tại Việt Nam. Kết quả: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy mannitol, pepton, cao nấm men và vitamin E sẽ làm tăng việc sản xuất CoQ10 từ các chủng vi khuẩn khảo sát. Chọn được phương pháp chiết Q10 từ tế bào vi khuẩn và chủng PN31 có hàm lượng Q10 là 399,8 µg/g sinh khối sau thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Từ khóa: Ubiquinon Q-10, môi trường nuôi cấy, Rhodopseudomonas palustris ABSTRACT STUDY ON CULTURE CONDITIONS FOR CoQ10 PRODUCTION FROM PSEUDOMONAS PALUSTRIS -A PRUPLE NON-SULFUR PHOTOTROPHIC BACTERIA Le Thi Thanh Thảo, Nguyen Van Thanh, Tran Thi Hong Kim * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 216 - 221 Objective: Coenzym Q10 (CoQ10) function in the mitochondrial respiratory chain and serves as a lipophic antioxidant. There is an increasing interest in the use of CoQ10 as a nutritional supplement and cosmetic ingredient. The use of coenzyme Q10 (CoQ10) as a complementary therapy in heart failure will increase in proportion to the growth of the ageing population and the expansion of statins consumption. It is known that CoQ10 is produced in a wide variety of organisms, from microorganisms such as bacteria and yeast, to higher animals and plant. Economical production of CoQ10 by microbes will become more important due to the growing demands of the pharmaceutical industry. The bacteria strains Rhodopeudomonas palustris PN16, PN21 and PN31 - purple non-sulfur phototrophic bacteria isolated in VietNam produced CoQ10. Method: Optimimization of cultural conditions such as carbon source, vitamins, carrot juice and tomato juice in order to improved the production of CoQ10 from the bacteria strains Rhodopeudomonas palustris PN16, PN21 and PN31 - purple non-sulfur phototrophic bacteria isolated in VietNam produced CoQ10. Results: Optimal the supplements in our experiment including mannitol, peptone, 0,75 g/l yeast extract and 5 µg/l vitamin E were added to the original culture to enhance production of Q10. The method selected for CoQ10 * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Lê Thị Thanh Thảo ĐT: 0918634393 Email: thanhthaovn2002@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 217 extraction had been demonstrated that it is a highly effective protocol for extracting CoQ10 from bacteria Bacteria can produce CoQ10 reached 399,8 µg/g dry cell weight after 72 hours. Keywords: Ubiquinon Q-10, culture conditions, Rhodopseudomonas palustris ĐẶT VẤN ĐỀ Ubiquinon CoQ10 thuộc nhóm chất isoprenoid quinon hiện diện ở mọi tế bào sinh vật. Hợp chất Q-10 có bốn chức năng sinh lý chủ yếu: là thành phần của chuỗi truyền điện tử đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ATP; giữ hoạt lực oxy hoá khử của màng tế bào; chất chống oxy hoá nội sinh, ức chế quá trình peroxid hoá lipid – khử các gốc tự do; và tham gia duy trì tính bền vững và linh động của màng tế bào. Do vậy, hợp chất Q-10 đang được nghiên cứu như là một nguồn nguyên liệu mới trong lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm. Vi khuẩn quang dưỡng tía là nguồn vi sinh vật lý tưởng để thu nhận Q-10 vì chúng có khả năng tổng hợp, tích luỹ hàm lượng ubiquinon cao hơn các vi sinh vật khác, đặc biệt cho sản phẩm chủ yếu là Q-10. Bên cạnh đó, vi khuẩn tía quang dưỡng tía có thể nuôi cấy dễ dàng bằng môi trường đơn giản dưới ánh sáng mặt trời. Vì vậy đây có thể là nguồn tiềm năng thu nhận một lượng lớn các chấtcó tác dụng sinh học, đặc biệt là ubiquinon Q-10. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy phù hợp cho việc sản xuất Q-10 từ các chủng Rhodopseudomonas palustris phân lập tại Việt Nam. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31 được phân lập tại Việt Nam do Trung tâm Sinh học – Đại học Khoa học Tự Nhiên cung cấp. Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy vi khuẩn Môi trường nuôi cấy và tăng sinh các chủng Rhodopseudomonas palustris là môi trường SA (sodium acetate) do Imhoff và Truper thiết kế (1971) và được Kawasaki cải tiến(1). Môi trường SA: Natri acetate, Natri succinate, KH2PO4, K2HPO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, Na2S2O3.5H2O, Dung dịch vi lượng, thêm nước cất vửa đủ Khảo sát các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn Khảo sát một số thành phần của môi trường ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của vi khuẩn của nguồn carbon lên sự tăng trưởng bao gồm: carbon, nitơ, chất kích thích tăng trưởng, nguồn vitamin Khảo sát ảnh hưởng của nguồn vitamin và các tiền tố tự nhiên lên sự sinh tổng hợp Q-10 Sau khi chọn được vitamin cho hàm lượng Q10 cao nhất rồi thì tiến hành chọn nồng độ thích hợp như sau: 1 mg/100ml, 2 mg/100ml, 5 mg/100ml và 7,5 mg/100ml. Sử dụng môi trường SA lỏng tối ưu có bổ sung các tiền tố tự nhiên (dịch ép của cà chua và cà rốt) có nồng độ thay đổi 25%, 50%, 75%(2,4). Dịch chiết cà rốt và cà chua tự pha chế. Phương pháp xác định mật độ tế bào Dịch nuôi cấy được pha loãng trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng. Ở mỗi độ pha loãng, lấy 200 µl cho vào đĩa petri có chứa môi trường thạch SA, dùng que trải bằng thủy tinh vô trùng trải đều vi khuẩn, đem ủ ở 37oC, 72 giờ, chiếu sáng bằng đèn neon trong điều kiện kỵ khí. Đếm số khuẩn lạc trên các hộp có 30-300 khuẩn lạc. Số vi khuẩn /ml = Số khóm × 10số thứ tự hộp +1 Chiết xuất Q10 từ vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris Phương pháp Collins và cộng sự(3) Cho 200mg cắn tế bào vi khuẩn vào 100ml hỗn hợp cloroform-methanol (2:1), thêm 20g bi thủy tinh. Khuấy hỗn hợp trên máy khuấy từ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 218 trong 60 phút. Lọc hoặc ly tâm, thu nhận dịch chiết có chứa Q-10. Cô quay với tốc độ 100 vòng/phút ở nhiệt độ 40 oC. Hỗn hợp này dùng một lượng nhỏ hoà tan trong n-hexan để định tính. Phân tích sản phẩm thu được Định tính bằng sắc ký lớp mỏng Hòa mẫu vào trong một thể tích nhỏ n- hexan. Chấm 10µl mẫu Q-10 chuẩn và mẫu dịch chiết có chứa Q-10 lên bản TLC Merck 60 F254 Bản mỏng Merck 60 F254, Dung môi triển khai n-hexan:etyl acetat (4: 1) hoặc n-hexan:etyl ether (4: 1). Phát hiện dưới đèn UV 254 nm (3,5). Q10 chuẩn của hãng Sigma Định tính bằng phương pháp quang phổ Quét phổ hấp thụ trên vùng quang phổ tử ngoại 200-380 nm bằng máy quang phổ tử ngoại. Định lượng Q-10 bằng phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại Pha dung dịch Q-10 chuẩn theo các giai nồng độ xác định, đo mật độ quang của các dung dịch này tại độ dài sóng hấp thu cực đại vừa xác định được). Sau đó thiết lập đường cong chuẩn nồng độ Q-10. Tiếp theo xác định mật độ quang của dung dịch cần định lượng, từ đồ thị suy ra nồng độ của dung dịch cần định lượng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường SA A B C Hình 1: Vi khuẩn R. palustris quan sát dưới kính hiển vi Chủng PN16, (b) Chủng PN21, (c) Chủng PN31 Trên môi trường lỏng SA, các chủng vi khuẩn khảo sát cho màu sắc khác nhau chủng PN16 màu vàng nâu, chủng PN21 nâu đậm và chủng PN31 màu đỏ tía phù hợp với đặc điểm chung của chủng vi khuẩn R. palustris. Nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi: các chủng vi khuẩn khảo sát là trực khuẩn Gram (-), có kiểu sắp xếp tế bào đặc trưng riêng lẻ hoặc xếp như hình hoa. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy Ảnh hưởng của nguồn cung cấp carbon lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn PN16, PN21 và PN31 được trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Ảnh hưởng của nguồn cung cấp carbon lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn PN16, PN21 và PN31 Lô Nguồn carbon Tổng số tế bào trong 1ml Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 1 Chứng (SA) 1,01.108 7,3.108 6,6.107 2 Glucose 3,2.107 5,6.107 3.107 3 Xylose 3,5.107 3,6.107 3,5.107 4 Mannitol 1,51.108 1,04.109 1,01.108 5 Natri citrat 3. 106 2,7.106 3,5.105 6 Na benzoate 3,8.106 4,5.106 3.106 Cả 03 chủng có khả năng sử dụng rất nhiều loại carbon hữu cơ khác nhau và phát triển tốt nhất trên nguồn carbon là mannitol. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên sự tăng trưởng được trình bày ở Bảng 2 c c Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 219 Bảng 2: Ảnh hưởng của các nguồn nitơ lên sự tăng trưởng của các chủng PN16, PN21 và PN31 Lô TN Nguồn nitơ Tổng số tế bào trong 1ml Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 1 Chứng 1,55.108 4,2. 108 7,8. 107 2 KNO3 3,1.10 6 1,02. 107 2,06. 106 3 (NH4)2HPO4 3,5.10 7 5,6. 107 2,13. 107 4 Bổ sung Pepton 2,25.108 6,6. 108 1,01. 108 5 Ca(NO3)2 2,4. 10 7 3,2. 107 2,12. 107 6 CO(NH2)2 3,6. 10 5 5,2. 105 3,0. 105 Kết quả đánh giá ở Bảng 2 cho thấy môi trường có nguồn nito là ammonium và bổ sung peptone ở cả ba chủng vi khuẩn R. palustris PN16, PN21 và PN31 đều thu nhận cao nhất. Ảnh hưởng của nồng độ chất tăng trưởng lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 3 Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ chất tăng trưởng lên sự tăng trưởng của các chủng PN16, PN21 và PN31 Lô chất Tổng số tế bào trong 1ml sau 72 giờ PN16 PN21 PN31 1 Chứng 7,6.107 1,05.108 6,2.107 2 0,25 g YE 8,7.107 1,17.108 6,8.107 3 0, 5 g YE 1,04.108 1,35.108 7, 2.107 4 0,75 g YE 1,15.108 1,41.108 1,01.108 5 1 g YE 1,56.107 1,78.107 4,8.107 Ở nồng độ cao nấm men 0,75 g/lit: chủng PN16 có sinh khối cao gấp 1,5 lần môi trường chứng; chủng PN21 có tốc độ tăng trưởng cao hơn môi trường SA là 1,4 lần và chủng PN31 cao hơn mẫu chứng 1,6 lần Ảnh hưởng của vitamin lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Bảng 4: Ảnh hưởng của vitamin lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn R. palustris PN16, PN21 và PN31 Lô TN Vitamin Tổng số tế bào trong 1ml sau 72 giờ Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 1 Chứng 1,01.108 1,2.108 4,7.107 2 Vitamin A 3,06.107 4,8.107 2,15.107 3 Vitamin C 1,14.108 1,35.108 6,3.107 4 Vitamin E 1,35.108 1,55.108 1,04.108 Kết quả đếm mật độ tế bào cho thấy, môi trường bổ sung vitamin E thu được sinh khối cao nhất, tiếp đến là môi trường bổ sung vitamin C, môi trường SA và môi trường bổ sung vitamin A cho sinh khối thấp nhất. Chiết xuất và phân tích hợp chất Q10 Chiết xuất và định tính Q10 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Chiết tách Q-10 từ dịch chiết vi khuẩn bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng pha thường 1 2 3 C Hình 2. Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp Collins dưới UV 254 của (1) chủng PN16; (2) PN21, (3) PN31 và (C) dung dịch Q-10 chuẩn. Sắc ký lớp mỏng với pha động là n-henan: ethyl ether (4v: 1v) dung dịch Q-10 chuẩn sẽ cho một vạch màu nâu đậm ở UV254 trên sắc ký đồ với Rf = 0,40. Chấm 1, 2 và 3 xuất hiện 1 vạch màu hồng tím và có Rf bằng với Rf của vạch Q-10 chuẩn (Rf = 0,4). Thu nhận vạch của dịch chiết ở vị trí có Rf tương đương với vạch của dung dịch Q- 10 chuẩn hòa tan lại trong n-hexan để phân tích tiếp. Vết Q-10 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 220 Định tính Q10 bằng phương pháp quang phổ Q-10 chuẩn có hai đỉnh hấp thu cực đại nằm trong vùng quang phổ tử ngoại gần tại các bước sóng: λ1 = 215,4 nm và λ2 = 275,2 nm. Bảng 5: Quang phổ hấp thu cực đại của các mẫu Q- 10 Mẫu Q-10 Bước sóng hấp thu cực đại Đỉnh hấp thu 1 (215,4 nm) Đỉnh hấp thu 2 (275,2 nm) Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB PN16 215,6 214,2 214 214,6 275,6 275,2 275,8 275,5 PN21 214,2 213,7 214 214 274,8 274,4 274,2 274,8 PN31 215 215,2 214,8 215 276,4 276 275,8 276,1 Kết quả định lượng Q10 bằng phương pháp quang phổ Phương trình hồi quy biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang và hàm lượng Q10 có dạng: yâ = 0,0171x + 0,0611 Với các hệ số hồi quy bo (0,017) và b (0,0611) Hệ số tương quan: R2 = 0,996 Hàm lượng Q-10 trong của các chủng vi khuẩn được chiết xuất từ các phương pháp Collins được trình bày ở Bảng 6. Bảng 6: Hàm lượng Q-10 trong của các chủng vi khuẩn được chiết xuất từ các phương pháp Collins PN16 PN21 PN31 Lần TN 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Sinh khối (g) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Cắn sau chiết (mg) 30,2 30,5 31 29 28,5 29,1 28 28,5 27,6 Hàm lượng Q10 (µg/ml) 46 46,5 47 50 51,7 52,5 53,5 52,4 54 Hàm lượng Q10 (µg/g sinh khối) 345 348,8 352,5 375 387,8 393 401,3 393 405 348,8 385,3 399,8 Ảnh hưởng của nồng độ vitamin và tiền tố lên sự tổng hợp Q10 Ảnh hưởng của nồng độ vitamin E lên tổng hợp Q10 trình bày ở Bảng 7 Nồng độ Vitamin E là 5 µg/ml cho sự tổng hợp CoQ10 là cao nhất Ở đây chỉ chọn khảo sát vitamin E do ở thí nghiệm khảo sát sự tăng trưởng của tế bào cho kết quả vitamin E cho sinh khối cao nhất Bảng 7: Ảnh hưởng của nồng độ vitamin E lên sự tổng hợp Q10 Lô TN Nồng độ vitamin E (µg/ml) Hàm lượng Q-10 (µg/g SKT) Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 1 Chứng 348 383 337 2 1 350 385,6 340,2 3 2,5 368 397,5 358 4 5 397,8 432,4 354,2 5 7,5 390,6 427 340,7 Ảnh hưởng của tiền tố tự nhiên lên sự tổng hợp Q10 trình bày ở Bảng 8 Bảng 8: Ảnh hưởng của tiền tố tự nhiên lên sự tổng hợp Q10 Lô TN Tiền tố bổ sung Hàm lượng Q-10 (µg/g SKT) Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 1 SA 355 380 335 2 SA + Cà chua 25% 350 379 336 3 SA + Cà chua 50% 373 400 351 4 SA + Cà chua 75% 365 385 342 5 SA + Cà rốt 25% 355 382 340 6 SA + Cà rốt 50% 392 435 350,5 7 SA + Cà rốt 75% 395 435,7 352,1 Kết quả thí nghiệm phù hợp với công bố của Bule và Singhal (2009) về các tiền tố tự nhiên có trong cà rốt và cà chua làm tăng 56-87% hàm lượng CoQ10 ở Pseudomonas diminuta so với môi trường tối ưu không bổ sung tiền tố(2). So sánh việc bổ sung tiền tố vào môi trường và bổ sung vitamin E, nhận thấy việc bổ sung vitamin E vào môi trường nuôi cấy cho kết quả gần như kết quả nuôi cấy trên dịch ép cà rốt, vì Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 221 vậy chọn Vitamin E là chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy để thu nhận CoQ10. Hình 3: Ảnh hưởng của tiền tố tự nhiên lên quá trình tổng hợp Q-10 của các chủng R. Palustris KẾT LUẬN Khảo sát các yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng lên sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31từ đó có thể đề nghị công thức bổ sung vào môi trường SA như sau: Hỗn hợp natri acetate và mannitol là nguồn carbon (2 g) Nguồn nitơ thích hợp là ammonium có bổ sung thêm pepton 0,5g/lit. Nồng độ cao nấm men 0,75 g/lit. Vitamin E (5 µg/ml) và dịch chiết cà rốt 50% là yếu tố kích thích sự tăng trưởng của tế bào cũng như sinh tổng hợp Q-10 của các chủng PN16, PN21 và PN31. Chiết xuất thành công Q-10 từ ba chủng vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 và PN31. Hợp chất Q-10 đã được kiểm nghiệm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và phổ hấp thu tử ngoại. Hàm lượng Q-10 ở các chủng vi khuẩn khảo sát đã được xác định bằng phương pháp đo quang phổ tử ngoại. Chủng PN16 có 348,8 µg/g sinh khối tươi, chủng PN21 có 385,3 µg /g sinh khối tươi và chủng PN31 có 399,8 µg/g sinh khối tươi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Thị Thúy Ái (2002), “Phân lập, định danh và khảo sát khả năng biến dưỡng hợp chất dị vòng chứa nitơ của vi khuẩn quang dưỡng tía không lưu huỳnh”. Luận văn thạc sĩ Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. 2. Blue MV, Singhal RS (2009), “Use of carrot juice and tomato juiceas natural preccursors for enhanced production of ubiquinon-10 by P.diminuta NICM 2865, Food chem 116: 302- 305. 3. Collins MD, Jones D (1981) “Distribution of isoprenoid quinonestructural types in bacteria and their taxonomic implication”, Microbiol rev 45: 316-354. 4. Yoshida H, Kotani Y, Ochaiai K, and Araki K, (1998) “Production of ubiquinone 10 using bacteria”, J. Gen. Appl. Microbiol, Vol. 44: 19-26. 5. Lê Quang Huấn, Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, (1999) “Phương pháp thu nhận carotenoid và ubiquinon từ một số vi khuẩn quang hợp thuộc chi Rhodobacter phân lập ở Việt Nam”, Hội nghị khoa học toàn quốc “Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc” – Hà Nội, 526-530. 6. Kalen A, Norling B, Appelkvist EL, Dallner G (1987), “Uboquinone biosynthesis by the microsomal fraction of the rat liver”, Biochim Biophys Acta 926:70-79. 7. Wu Z, Du G, Chen J, (2003) “Effects of dissolved oxygen concentration and DO-stat feeding strategy on COQ10 production with Rhizobium radiobacter.World J Microbiol Biotechnol 19: 925-928. Ngày nhận bài báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014