Khảo sát một số yếu tố tổng hợp Polymer đóng dấu phân tử Salbutamol - Định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết pha rắn có tính chọn lọc cao

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 210 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ TỔNG HỢP POLYMER ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ SALBUTAMOL - ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT CHIẾT PHA RẮN CÓ TÍNH CHỌN LỌC CAO Nguyễn Thanh Trà*, Phan Văn Hồ Nam* TÓM TẮT Mở đầu: C{c phương ph{p định lượng salbutamol trong thịt heo như HPLC-MS/MS thì đắt và phải sử dụng chất chuẩn đồng vị. Polymer đóng dấu phân tử salbutamol là một giải ph{p đơn giản hóa quy trình phân tích salbutamol trong những mẫu phức tạp. Do đó, đề tài: "Khảo sát một số yếu tố tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol định hướng ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật chiết tách pha rắn tách salbutamol có tính chọn lọc" được tiến hành nhằm góp phần phát triển thêm những phương ph{p kiểm nghiệm thực phẩm, mỹ phẩm rẻ tiền nhưng hiệu quả. Mục tiêu: Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (Salbutamol-MIP) theo phương ph{p kết tủa trong dung môi. Khảo sát khả năng lưu giữ thuận nghịch của salbutamol-MIP để tìm ra các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng t{ch salbutamol. Đối tượng: Salbutamol-MIP có khả năng lưu giữ salbutamol thuận nghịch. Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp các hạt Salbutamol-MIP bằng phương ph{p kết tủa trong lượng lớn dung môi. Nhồi cột SPE. Khảo sát khả năng lưu giữ salbutamol của Salbutamol-MISPE bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis và quang phổ huỳnh quang. Kết quả: Salbutamol-MIP được tổng hợp th|nh công có kích thước nano có khả năng lưu giữ salbutamol gấp 2,48 lần so với polymer không đóng dấu (81,00% so với 32,65%). Kết luận: Salbutamol-MIP kích thước nano với khả năng lưu trữ salbutamol thuận nghịch lần đầu tiên được tổng hợp bằng phương ph{p kết tủa trong lượng lớn dung môi, định hướng để ứng dụng làm vật liệu hấp phụ có tính chọn lọc trong kỹ thuật chiết pha rắn v| c{c thước pháp sắc ký khác ở Vietnam. Từ khóa: Polymer đóng dấu ph}n tử salbutamol, chiết pha rắn chọn lọc ABSTRACT INVESTIGATING SYNTHETIC FACTORS OF SALBUTAMOL-IMPRINTED POLYMER, DIRECTED TO APPLY AS THE SORBENT FOR SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION Nguyen Thanh Tra, Phan Van Ho Nam * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 210 - 215 Introduction: Determination of salbutamol in pork by HPLC-MS/MS is expensive and complex because of using isotopic standard. Salbutamol imprinted polymer could be applied for simplifying analysis procedures of salbutamol in complicated samples. Thus, the topic “Investigating synthetic factors of salbutamol-imprinted polymer, directed to apply as the sorbent for selective solid-phase extraction” was realized for contributing the development of cheap and effective quality control method of food and medicine. Objectives: Synthesis of salbutamol-imprinted polymer (salbutamol-MIP) particles by precipitation *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam ĐT: 0909615007 Email: phanvanhonam@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 211 polymerization in large solvent. Investigating the ability of salbutamol-MIP in retaining salbutamol reversibly in order to find out the factors affecting their separation. Subjects: Salbutamol-MIP with ability of reversibly retaining salbutamol Study methods: Synthesis of salbutamol-imprinted polymer (salbutamol-MIP) particles by precipitation polymerization in large solvent. Packaging salbutamol-MIP into SPE column. Investigations were carried out to find out the polymer having the ability of retaining high Salbutamol content via UV-Vis and fluorescence spectroscopies. Results: Salbutamol-MIP in nano size was successfully synthesized with capable of storing salbutamol 2.48 times higher than non-imprinted polymer (81.00% compared to 32.65%). Conclusions: Salbutamol-MIP in nano size with reversibly holding caffeine effect was firstly synthesized by precipitation polymerization directed to apply to selective solid-phase extraction and other chromatography methods in Vietnam. Keywords: Salbutamol-imprinted polymer, selective solid-phase extraction ĐẶT VẤN ĐỀ Salbutamol là chất chủ vận beta (β – agonist) đƣợc dùng trong y kho để điều trị một số bệnh liên qu n đến co thắt đƣờng hô hấp. Ngoài ra, nó còn đƣợc sử dụng trong chăn nu i nhƣ l| một chất tạo nạc nhằm tăng lợi nhuận. Tuy nhiên, salbutamol tồn dƣ trong thực phẩm có khả năng tích lũy lại trong gan, thận, mỡ, võng mạc và gây suy giảm chức năng g n, ảnh hƣởng sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Chính vì vậy, nhu cầu về kiểm tra chất lƣợng thực phẩm hay kiểm nghiệm salbutamol trong thực phẩm là vô cùng thiết yếu(3). Những phƣơng ph{p đƣợc sử dụng để định lƣợng salbutamol trong thịt heo đƣợc sử dụng điển hình nhƣ HPLC-MS/MS thì đắt và cần phải có chất chuẩn đồng vị (theo TCCS: H.HD.QT.110 Ref: USDA CLG-AGON1.0 của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia)(1). Hình 1: Kỹ thuật đóng dấu phân thử Polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol-MIP) là một giải ph{p đơn giản hóa quy trình phân tích salbutamol trong những mẫu phức tạp(5). Kỹ thuật đóng dấu phân tử là một kỹ thuật đƣợc dùng để thiết kế nhân tạo một thụ thể có tính chọn lọc v| độ đặc đặc hiệu cao với một chất ph}n tích đƣợc chọn trƣớc đó MIP đƣợc tạo thành trong quá trình polymer hóa có sự hiện diện chất ph}n tích đƣợc chọn trƣớc đó v| s u đó chất ph}n tích n|y đƣợc rửa giải để loại bỏ khỏi polymer và bộc lộ những lỗ trống có khả năng t{i hấp phụ chất phân tích nhờ sự phù hợp về cấu trúc không gian và các liên kết hydro, van der waals, ion . (Hình 1). Bằng cách này Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 212 polymer sẽ sở hữu các yếu tố nhận biết phân tử mạnh mẽ nhƣ c{c thụ thể sinh học tự nhiên, ví dụ: kháng thể và thụ thể sinh học(2,4). MIP có các ƣu điểm bền về vật lý, ổn định hóa học, dễ tổng hợp và giá thành rẻ nên là một vật liệu đầy hứa hẹn ứng dụng trong kỹ thuật chiết pha rắn(5). Do đó, đề t|i n|y đƣợc tiến hành nhằm góp phần phát triển thêm những phƣơng ph{p kiểm soát chất kích thích tăng trọng trong chăn nu i, sản xuất rẻ tiền nhƣng hiệu quả - cụ thể là ứng dụng MIP trong chiết tách chọn lọc và làm giàu salbutamol. ĐỐI TƢỢNG – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Salbutamol-MIP tổng hợp bằng phƣơng pháp kết tủa trong dung môi. Chất đối chiếu Salbutamol sulfat chuẩn, số lô: QT105 070317. H|m lƣợng 99,7%. Viện Kiểm nghiệm TP.HCM Hóa chất – dung môi Vinyl pyrrolidon (VP), acid methacrylic (MAA), acid acrylic (AA), ethylene glycol dimethacrylate (EDMA), azobisisobutyronitrile AI N đƣợc sản xuất bởi Sigma-Aldrich. Methanol, acid acetic, cloroform xuất xứ Trung Quốc. Methanol, acid acetic dành cho sắc ký lỏng do Merck sản xuất. Trang thiết bị Máy cô quay chân không R-210S Bucchi - Thụy Sĩ, bếp cách thủy Memmert WB-14 - Đức, tủ sấy Memmert WM 500 CO - Đức, bể siêu âm Elma T840 DH - Đức, c}n điện tử phân tích HR- 200 A&D - Nhật, Máy quang phổ Shimadzu UV- 2450 - Nhật, máy quang phổ huỳnh quang F- 7000 Flourescence Spectrophotometry Hitachi - Nhật, máy khuấy từ gia nhiệt IKA - Đức, kính hiển vi Olympus CH2 - Nhật, SPE Manifold Waters - Mỹ. Phƣơng pháp nghiên cứu Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol-imprinted polymer - salbtamol-MIP) và polymer trắng (non- imprinted polymer - NIP) Quy trình tổng hợp salbutamol-MIP bằng phƣơng ph{p kết tủa: Cho monomer, cross – linker, chất mồi và phân tử mẫu hòa tan hoàn toàn trong dung môi. Tạo hỗn hợp tiền polymer hóa bằng cách ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ. Tiến hành polymer hóa bằng c{ch đun v| khuấy từ ở 60 oC trong vòng 8 giờ. Tiến hành tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol theo những công thức đƣợc trình bày ở Bảng 1. Tổng hợp polymer trắng (non-imprinted polymer – NIP tƣơng tự nhƣ MIP, tuy nhiên trong công thức tổng hợp không có thành phần phân tử mẫu, đƣợc dùng để so s{nh đối chiếu với MIP. Bảng 1: Thành phần các công thức salbutamol-MIP STT Tên công thức Monomer(mg) Cross linke (mg) Chất mồi (µl) Phân tử mẫu (mg) Dung môi polymer hóa (ml) AA MAA VP EGDMA AIBN 12% Salbutamol sulfat Salbutamol Methanol Chloroform Acetonitril I AA 100 - - 1135 50 90 123 II MAA - 126 - 1135 50 90 123 III VP - - 160 1135 50 90 123 IV VP-AA 50 - 80 1135 50 90 123 V AA-MAA 50 65 - 1135 50 90 123 VI MAA-chlor - 126 - 1135 50 108 123 VII VP-chlor - - 160 1135 50 108 123 VIII MAA-ace 126 1135 50 90 123 IX VP-ace 90 123 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 213 Khảo sát sự lưu giữ salbutamol của Salbutamol-MIP Các polymer sau khi tổng hợp ở dạng hạt n no đƣợc kiểm tr kích thƣớc bằng cách quan s{t dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần. S u đó hạt đƣợc rửa sạch salbutamol, nhồi cột SPE, tiến hành tái hấp thu salbutamol và rửa giải để kiểm tr đặc tính lƣu giữ salbutamol. Dịch thu đƣợc sau khi rửa giải đƣợc định lƣợng bằng phƣơng ph{p qu ng phổ UV – Vis tại bƣớc sóng 278 nm v| phƣơng ph{p qu ng phổ huỳnh quang với bƣớc sóng kích thích 230 nm - bƣớc sóng phát xạ 305 nm. Nhồi hạt vào cột SPE: hạt tạo r đƣợc đem nhồi ƣớt dƣới áp suất giảm vào vỏ một xy lanh nhự PE đã đệm sẵn miếng xốp PTFE 10 µm và giấy lọc RC 0,45 µm. Rửa cột với dung môi: cho dung môi qua cột. Kiểm tra sự tồn dƣ của monomer và salbutamol trong dịch rửa bằng phƣơng ph{p qu ng phổ UV-Vis: thu mỗi 10 ml đem quét phổ UV trong vùng 250 nm đến 400 nm đến khi dịch rửa không còn hấp thu trong vùng này nữa Quá trình tái hấp thu gồm 3 gi i đoạn. Thứ nhất là nạp mẫu: cho 1 ml dung dịch phân tử mẫu (1 mg/ml) qua cột, hứng dịch thừa qua cột v|o bình định mức 10 ml, điền đầy đến vạch bằng meth nol để thu đƣợc dịch thừa (1). Thứ 2 là rửa cột: cho dung môi rửa qua cột, hứng mỗi 10 ml dịch rửa riêng rẽ, quét phổ UV trong vùng 250 đến 400 nm, đến khi dịch hứng không còn hấp thu nữa. Gộp các dịch có hấp thu lại với nh u để thu đƣợc dịch rửa (2). Thứ 3 là rửa giải salbutamol sulfat: rửa giải salbutamol sulfat bằng 10 ml methanol – acid acetic (8:2), thu dịch rửa giải (3). Tiến h|nh tính to{n lƣợng phân tử mẫu thu đƣợc trong dịch thừa (1), dịch rửa (2) và dịch rửa giải 3 Lƣợng phân tử mẫu lƣu giữ lại cột đƣợc tính bằng phần trăm lƣợng phân tử mẫu trong dịch rửa giải thu đƣợc so với lƣợng phân tử mẫu đƣợc nạp vào cột lúc b n đầu. KẾT QUẢ Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol-imprinted polymer - salbtamol-MIP) và polymer trắng (non- imprinted polymer - NIP) Hạt polymer thu đƣợc hình 2 có kích thƣớc khoảng 800-1000nm khi qu n s{t dƣới kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần. Hình 2: Hạt polymer thu được quan sát bằng kính hiển vi có độ phóng đại 100x Khảo sát sự lƣu giữ salbutamol của Sa lbutamol-MIP: Lƣợng salbutamol trong dịch dƣ (1), dịch rửa (2), dịch rửa giải (3) v| % lƣu giữ salbutamol của cột đƣợc trình bày trong Bảng 2 Kết quả là không có sự khác nhau về sự lƣu giữ ở các cặp MIP v| NIP Nhƣ vậy tất cả các cột đều kh ng lƣu giữ salbutamol. Dự đo{n khi sử dụng salbutamol ở dạng sulf t để tổng hợp, trong phân tử salbutamol sulfat có H+ đã ngăn cản sự hình thành liên kết hydro giữa salbutamol và monomer nên không có lỗ liên kết đặc hiệu đƣợc tạo ra. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 214 Bảng 2: Lượng salbutamol trong dịch thừa (1), dịch rửa (2), dịch rửa giải (3) v| % lưu giữ salbutamol của cột (S: salbutamol; SS: salbutamol sulfat) Công thức Lượng mẫu nạp cột 1mg Dịch thừa (1) Dịch rửa (2) Dịch rửa giải (3) Tổng lượng thu hồi (g) Thu hồi (%) Lưu giữ (%) Phương pháp định lượng MeOH aceton MeOH – acid acetic (8:2) I MIP SS 637,85 300,31 0,00 938,15 93,82 0,00 UV NIP SS 727,08 263,39 0,00 990,46 99,05 0,00 II MIP SS 702,46 352,62 0,00 1055,08 105,51 0,00 NIP SS 767,08 558,77 0,00 1325,85 132,59 0,00 III MIP SS 837,85 131,08 0,00 968,92 96,89 0,00 NIP SS 808,62 164,92 0,00 973,54 97,35 0,00 IV MIP SS 764,00 137,23 0,00 901,23 90,12 0,00 NIP SS 764,00 164,92 0,00 928,92 92,89 0,00 VI MIP SS 0,00 1054,73 0,00 1054,73 105,47 0,00 NIP SS 0,00 1094,29 0,00 1094,29 109,43 0,00 VI MIP S 0,00 1216,48 0,00 1216,48 121,65 0,00 NIP S 0,00 948,35 0,00 948,35 94,84 0,00 VI MIP S 0,36 983,15 1969,00 1008,86 101,00 3,00 Huỳnh quang NIP S 209,14 715,66 1758,00 947,33 95,00 2,00 VI MIP S 0,00 103,24 440,02 543,26 54,33 81,00 NIP S 0,00 371,29 180,01 551,30 55,13 32,65 BÀN LUẬN Để loại bỏ ảnh hƣởng của H+, tiến hành tổng hợp polymer MAA sử dụng salbutamol dạng tự do - công thức VI (MAA-chlor , đem t{i hấp thu với salbutamol và salbutamol sulfat, kết quả vẫn chƣ có sự lƣu giữ salbutamol sulfat hay salbutamol ở cả hai loại polymer MIP và NIP lƣu giữ 0% ở cả hai loại Tuy nhiên, lƣợng dung m i để rửa và rửa giải thì có sự khác biệt Lƣợng dung môi dùng rửa salbutamol liên kết không đặc hiệu ra khỏi cột nhiều hơn so với khi tái hấp thu salbutamol sulfat (7,5 lần). Từ đó, có thể thấy H+ trong salbutamol sulfat có ảnh hƣởng đến sự tạo liên kết đặc hiệu giữa polymer và phân tử mẫu. Cụ thể H+ ngăn cản sự tạo thành liên kết đặc hiệu giữa phân tử mẫu và polymer. Giải thích cho việc dù đã loại H+ trong quá trình tổng hợp, tức đã phải có liên kết đặc hiệu đƣợc tạo r nhƣng vẫn không có sự lƣu giữ salbutamol lại trong cột (dịch rửa giải không có salbutamol), có hai giả thuyết: Thứ 1: Số liên kết đặc hiệu tạo ra quá ít. Thứ 2: Dung môi methanol (dung môi rử đã đủ mạnh để bẻ gãy hết tất cả liên kết đặc hiệu đƣợc tạo ra. Do đó, tiến hành tái hấp thu salbutamol với cột đƣợc nhồi polymer công thức VI (MAA- chlor). Khi tiến hành tái hấp thu với salbutamol, sử dụng hệ dung môi rửa và rửa giải vẫn là methanol và methanol – acid acetic (8:2), phát hiện bằng huỳnh quang, kết quả là có sự khác biệt giữa VI (MAA-chlor)-MIP và VI (MAA- chlor)-NIP, nhƣng kh ng nhiều, sự lƣu giữ lần lƣợt là 3,00% và 2,00%. Khi tiến hành tái hấp thu với salbutamol, sử dụng hệ dung môi rửa và rửa giải là aceton và methanol - acid acetic (8:2), phát hiện bằng huỳnh quang. Kết quả là có sự khác biệt rõ về sự lƣu giữ của VI (MAA-chlor)-MIP (81,00%) và VI (MAA-chlor)-NIP (32,65%). Nhƣ vậy, polymer đóng dấu phân tử tổng hợp từ công thức IV (MAA-chlor đã tạo đƣợc liên kết đặc hiệu với salbutamol. Và cặp dung môi rửa giải là aceton và methanol – acid acetic (8:2) giúp phân biệt đƣợc mức độ lƣu giữ salbutamol của công thức này. Salbutamol-MIP của công thức VI này có khả năng lƣu giữ salbutamol gấp 2,48 lần so với NIP (81,00% so với 32,65%). Công thức VI cũng có khả năng lƣu giữ gấp khoảng 2 lần so với các công thức khác, vì hệ dung môi methanol - acid acetic Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 215 (8:2) chỉ rửa giải đƣợc lần lƣợt 54,33% và 55,13% lƣợng salbutamol tái hấp thu đối với MIP và NIP khi so với các công thức khác luôn bị rửa giải trên dƣới 100%. KẾT LUẬN Đề t|i đã tổng hợp đƣợc salbutamol-MIP có khả năng lƣu giữ salbutamol, bên cạnh đó cũng lần đầu tiên tổng hợp thành công vật liệu ph tĩnh cho SPE với kích thƣớc hạt hàng n no Đ}y l| bƣớc đầu tiên cơ sở cho sự nghiên cứu và phát triển củ phƣơng ph{p đóng dấu phân tử để ứng dụng vào các phƣơng ph{p ph}n tích nhƣ chiết pha rắn hay sắc ký, một lĩnh vực mà hiện nay Việt Nam chƣ đƣợc nghiên cứu và phát triển. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cục Quản lý Chất lƣợng Nông lâm sản và thủy sản (2014). Thực Phẩm - X{c Định Dƣ Lƣợng β – Agonist Trong Thịt Gia Súc – Phƣơng Ph{p Sắc Ký Lỏng Ghép Hai Lần Khối Phổ. Hà Nội, Bộ Khoa học và Công nghệ. 2014. 1 - 13. 2. Lieberzeit PA, Findeisen A, Mähner J, Samardzic R, Pitkänen J, Anttalainen O, Dickert FL (2010). Artificial receptor layers for detecting chemical and biological threats. Procedia Engineering. 5(Supplement C):381-384. 3. Nguyễn Thị Thu Thủy (2011). Khảo s{t dƣ lƣợng bê ta-Agonist (Clenbuterol và salbutamol) trong thịt gà và thịt heo trên thị trƣờng thành phố Cần Thơ Luận án tiến sĩ Đại học Y Dƣợc Cần Thơ TP Cần Thơ 4. Phan N, Sussitz H, Lieberzeit . (2014). Polymerization Parameters Influencing the QCM Response Characteristics of BSA MIP. Biosensors. 4(2):161-171. 5. Qiao F, Sun H, Yan H, Row KH (2006). Molecularly Imprinted Polymers for Solid Phase Extraction. Chromatographia. 64(11- 12):625-634. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018