Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá chùm ngây (moringa oleifera lam) phòng ngừa tổn thương do rượu gây ra trên dòng tế bào HEPG2

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 359 KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO GAN CỦA LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM.) PHÒNG NGỪA TỔN THƢƠNG DO RƢỢU GÂY RA TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEPG2 Đỗ Thị Hồng Tươi*, Trần Nguyễn Thủy Tiên*, Nguyễn Hoàng Quân*,Dương Thị Mộng Ngọc* TÓM TẮT Mở đầu: Chùm ngây chứa nhiều chất có tác dụng chống oxy hóa, đặc biệt là isoquercitrin. Đề t|i n|y “Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thương do rượu gây ra trên dòng tế b|o HepG2”. Phương pháp: HepG2 nuôi cấy trong môi trường EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin. Xử lý tế bào với isoquercitrin (IQ), cao ethyl acetat (EC), cao cồn 70% (CC) từ lá Chùm ngây với h|m lượng isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml (ký hiệu NĐ1, NĐ2, NĐ3) có/không bổ sung ethanol 100 mM trong 24 giờ. Đ{nh gi{ t{c dụng bảo vệ gan phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế bào (test MTT), tích lũy lipid (nhuộm dầu đ O), hoại tử tế bào (test LDH), tình trạng stress oxy hóa qua lượng glutathion nội bào, hoạt hóa apoptosis (nhuộm AO/EB, định lượng ADN phân mảnh v| điện di ADN trên gel). Kết quả: Sau 24 giờ, so với mẫu sinh lý, ethanol 100 mM làm giảm 25,6% tỷ lệ sống của tế bào HepG2, 31,3% h|m lượng GSH v| l|m tăng 39,4% lượng lipid nội bào, 30% hoạt tính LDH ngoại b|o v| 65,2% lượng ADN phân mảnh. Cả 3 mẫu thử từ l{ Chùm ng}y đều thể hiện tác dụng phòng sự ức chế tăng trưởng ở 3 nồng độ khảo sát với hiệu quả khoảng 42 - 250%. Bổ sung IQ và EC ở NĐ2, NĐ3 giúp tăng lượng GSH trong tế bào HepG2 so với mẫu ethanol một mình với hiệu quả 100 - 173%. Tác dụng gây hoại tử tế bào của ethanol 100 mM giảm khoảng 77 - 170% khi bổ sung EC, CC ở 3 nồng độ và IQ ở NĐ2. Đối với apoptosis, tỷ lệ ADN phân mảnh giảm 70 - 100% khi bổ sung IQ ở 3 nồng độ, EC và CC ở NĐ3. Kết quả này phù hợp với hình ảnh nhuộm AO/EB v| điện di ADN trên gel agarose. Kết luận: Các mẫu thử từ l{ Chùm ng}y, đặc biệt là cao ethyl acetat có tác dụng phòng ngừa tổn thương tế bào gan HepG2 do ethanol 100 mM gây ra sau 24 giờ. Như vậy, có thể nghiên cứu phát triển thuốc từ lá Chùm ng}y để phòng và/hoặc điều trị bệnh gan nói chung v| do rượu nói riêng. Từ khóa: Chùm ngây, bảo vệ tế b|o gan, rượu, dòng tế bào HepG2. ABSTRACT STUDY ON HEPATOPROTECTIVE EFFECT OF MORINGA OLEIFERA LAM. TO PREVENT HEPATOCYTE ALCOHOL-INDUCED LESSON IN HEPG2 CELL LINE Do Thi Hong Tuoi, Tran Nguyen Thuy Tien, Nguyen Hoang Quan, Duong Thi Mong Ngoc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 359 - 367 Background: Moringa oleifera Lam. is rich of strong antioxidant reagents, especially isoquercitrin. This work has studied on effect of M. oleifera Lam. leaves to prevent alcohol-induced hepatotoxicity in HepG2 cell line. Methods: HepG2 cells were cultured in EMEM supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 IU/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Cells were treated with 3 different samples including isoquercitrin (IQ), ethyl acetate (EC) or 70% ethanolic extracts (CC) from M. oleifera Lam. leaves at concentrations *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Đỗ Thị Hồng Tƣơi ĐT: 0908683080 Email: hongtuoi@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 360 corresponding to that of isoquercitrin at 2.5, 5, 10 μg/ml (NĐ1, NĐ2 and NĐ3, respectively) alone or combined with 100 mM ethanol for 24h. Hepatoprotective effect was evaluated through several assays including cell proliferation (MTT test), lipid accumulation (O red oil staining), necrosis (LDH test), oxydant stress (cellular glutathione content) and apoptosis activation (AO/EB staining, DNA fragmentation). Results: After 24 hours, ethanol 100 mM decreased 25.6% cell viability and 31.3% GSH content, on the other hand, increased 39.4% lipid accumulation, 30% extracellular LDH activity and 65.2% DNA fragmentation compared to control. All of 3 samples IQ, EC and CC from Moringa leaves have been shown prevention of antiproliferation at 3 tested concentrations with efficiency of 42-250%. The addition of IQ, EC at NĐ2, NĐ3 inscreased 100 - 173% of intracellular GSH level. Necrotic effect of 100 mM ethanol was decreased 77-170% in presence of EC, CC at 3 tested concentrations and IQ at NĐ2. For apoptosis, DNA fragmentation was decreased 70 - 100% in presence of IQ at 3 tested concentrations, EC and CC at NĐ3 compared to ethanol alone. This result corresponded to AO/EB staining and agarose gel electrophoresis. Conclusion: Three samples from M. oleifera Lam. Leaf, especially ethyl acetate extract were shown to prevent HepG2 cells injury induced by 100 mM ethanol treatment for 24h. Therefore, M. oleifera Lam. leaf could be studied to develop drugs for prevention and/or treatment of liver diseases in general and alcoholic liver diseases in particular. Key words: Moringa oleifera Lam, hepatoprotective effect, alcohol, HepG2 cell line. ĐẶT VẤN ĐỀ Gần đ}y, tỷ lệ ngƣời Việt Nam mắc bệnh gan nói chung và bệnh gan do rƣợu nói riêng ngày c|ng tăng. Một trong những nguyên nhân chính là do tình trạng lạm dụng rƣợu bia. Tỷ lệ lạm dụng và nghiện rƣợu tại thành phố là trên 10% và ở vùng núi khoảng 17%, đa số là nam giới ở độ tuổi 20-30 tuổi. Ƣớc tính khoảng 5% số dân nƣớc ta bị xơ gan, trong đó 65% trƣờng hợp xơ gan do rƣợu. Các nhóm thuốc hóa tổng hợp hoặc interferon để kiểm soát các bệnh về gan cho kết quả không ổn định, nguy cơ xảy ra tác dụng phụ v| gi{ th|nh tƣơng đối đắt. Do vậy, xu hƣớng hiện nay là phát triển và sử dụng thuốc từ dƣợc liệu giúp bảo vệ gan trong giai đoạn sớm, điều trị bệnh gan kịp thời nhằm cải thiện tiên lƣợng vì tính an toàn và có thể sử dụng thƣờng xuyên, lâu dài. Việt Nam có nguồn dƣợc liệu rất đa dạng, trong đó nhiều dƣợc liệu đƣợc dùng trị bệnh gan nhƣ củ Nghệ, Diệp hạ châu... và Chùm ngây với tác dụng bảo vệ gan đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. Gần đ}y, b{o c{o của Nguyễn Bảo Trân cho thấy cao cồn từ lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) có khả năng chống oxy hóa và bảo vệ gan trên chuột nhắt trắng(12). Tuy nhiên, chƣa có nghiên cứu sàng lọc một cách hệ thống ở cấp độ tế b|o để chứng minh cơ sở khoa học một cách đầy đủ về tác dụng của dƣợc liệu này. Gần đ}y, nhóm nghiên cứu của chúng tôi đã x}y dựng đƣợc mô hình in vitro sử dụng dòng tế bào gan HepG2 mô phỏng tình trạng tổn thƣơng tế ban gan do rƣợu(3). Đề tài này tiến h|nh “Khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) phòng ngừa tổn thƣơng do rƣợu gây ra trên dòng tế b|o HepG2” với mục tiêu sàng lọc tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây trên mô hình mô phỏng tình trạng tổn thƣơng tế b|o gan thƣờng gặp trên bệnh nhân bị bệnh gan do rƣợu. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dòng tế bào HepG2 (ATCC HB8065R) hoạt hóa tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Hóa chất Môi trƣờng EMEM, huyết thanh bào thai bê (FCS), trypsin-EDTA (Gibco, Mỹ); L-glutamin, penicilin-streptomycin, albumin huyết thanh bò Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 361 (BSA), đệm phosphat, trypan blue, ethanol, MTT, dầu đỏ O, Brilliant G250, L-lactic dehydrogenase, acid oleic, acid palmitic, quercetin, isoquercitrin (Sigma-Aldrich, Mỹ), kit LDH (Roche, Đức), diphenylamin, methanol (Merck, Đức). Tất cả hóa chất đạt tiêu chuẩn tinh khiết cấp độ 1. Mẫu thử Isoquercitrin (Sigma-Aldrich, Mỹ): ký hiệu là IQ, độ tinh khiết ≥ 98%. Cao cồn 70% (CC) và cao ethyl acetat (EC) từ lá Chùm ngây (Tri Tôn, An Giang) cung cấp bởi Trung t}m S}m & Dƣợc liệu Tp. HCM, đạt tiêu chuẩn cơ sở. Từ thí nghiệm sơ bộ, chọn 3 nồng độ ứng với h|m lƣợng isoquercitrin 2,5; 5 v| 10 µg/ml không g}y độc tế b|o để khảo sát tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 (Bảng 1). Bảng 1: Nồng độ khảo sát của các mẫu thử Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) Hàm lượng isoquercitrin (% kl/kl) trong cao 14,09 2,41 Độ ẩm của cao (%) 16,18 19,50 Nồng độ cuối cùng trong môi trường nuôi cấy (µg/ml) Ký hiệu Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) NĐ1 2,5 (IQ1) 21,2 (EC1) 128,9 (CC1) NĐ2 5,0 (IQ2) 42,3 (EC2) 257,7 (CC2) NĐ3 10,0 (IQ3) 84,7 (EC3) 515,5 (CC3) Phƣơng pháp nghiên cứu Nuôi cấy và xử lý tế bào Tế bào HepG2 nuôi cấy trong môi trƣờng EMEM, bổ sung 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin và ủ ở 37oC, 5% CO2 đến độ phủ 70-80%. Thu v| đếm tế bào sống với trypan blue, chia v|o đĩa nuôi cấy 6 hoặc 96 giếng với mật độ 2,5 × 104 tế bào/cm2. Ủ 24 giờ ở 37oC, 5% CO2, xử lý tế bào với IQ, EC, CC tƣơng ứng với isoquercetin 2,5; 5; 10 µg/ml (ký hiệu: NĐ1, NĐ2, NĐ3) hoặc quercetin 10 µM có hoặc không bổ sung ethanol 100 mM trong 24 giờ. Nồng độ DMSO cuối cùng trong môi trƣờng là 0,25% (v/v) không ảnh hƣởng đến tế bào(7). Mẫu chứng bổ sung DMSO với nồng độ tƣơng đƣơng. Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng test MTT Tỷ lệ tế bào sống x{c định qua hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) của ty thể có trong tế bào sống. SDH chuyển MTT [3-(4,5- dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] thành formazan tan trong isopropanol tạo dung dịch tím, OD đo ở 570 nm phản ánh số lƣợng tế bào sống. Đánh giá tình trạng tích lũy lipid bằng phương pháp nhuộm dầu đỏ O Dầu đỏ O là thuốc nhuộm lipid, di chuyển từ dung môi vào các hạt mỡ trong tế bào gan làm chúng có m|u đỏ quan s{t đƣợc dƣới kính hiển vi quang học. Các hạt mỡ nhuộm dầu đỏ O đƣợc hòa tan trong isopropanol tạo dung dịch m|u đỏ. OD đo ở 500 nm phản {nh lƣợng lipid trong tế bào ở mỗi giếng. Định lượng glutathion (GSH) nội bào Sự tăng sinh gốc oxy hóa làm giảm GSH nội bào. Bổ sung acid tricloroacetic vào dịch ly giải tế bào, ly tâm lấy dịch trong, thêm EDTA- phosphat, ủ 5 phút với thuốc thử Ellman [5,5- dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)]. Đo OD ở 412 nm. Lƣợng GSH (µM/mg protein) đƣợc tính dựa theo đƣờng cong chuẩn độ của GSH chuẩn (0 - 200 µM). Protein toàn phần đƣợc x{c định bằng phƣơng ph{p Bradford với thuốc nhuộm Coomassie và mẫu chuẩn albumin huyết thanh cừu (0 - 4 mg/ml). Đánh giá tình trạng hoại tử tế bào gan Tình trạng hoại tử đ{nh gi{ qua hoạt tính lactat dehydrogenase (LDH) phóng thích vào môi trƣờng nuôi cấy bằng kit “Cytotoxicity Detection LDH”. LDH xúc t{c phản ứng kép chuyển pyruvat thành lactat, tetrazolium màu v|ng th|nh formazan m|u đỏ, đo OD ở 492 nm. X{c định hoạt tính LDH dựa v|o đƣờng cong chuẩn độ (0-1000 mU/ml) của LDH chuẩn. Đánh giá quá trình apoptosis Quan sát tế b|o apoptosis dƣới kính hiển vi huỳnh quang sau khi nhuộm acridin orange/ethidium bromid. ADN phân mảnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 362 đƣợc định lƣợng bằng diphenylamin tạo dung dịch có m|u đo OD ở 600 nm v| điện di trên gel agarose 2%. Hiệu quả phòng ngừa tổn thương tế bào gan Hiệu quả bảo vệ tế bào gan HepG2 của mẫu thử phòng ngừa tổn thƣơng do ethanol 100 mM đƣợc tính theo công thức: HQ (%) = [(kết quảethanol - kết quảethanol bổ sung mẫu thử)/(kết quảethanol - kết quảsinh lý)] x 100 Phân tích kết quả và xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 hoặc 3 lần. Kết quả trình b|y dƣới dạng trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM) của 6 mẫu cho một điều kiện nuôi cấy trong một thí nghiệm đại diện. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 với phép kiểm Kruskal-Wallis và Mann-Whitney trên phần mềm SPSS 20.0. KẾT QUẢ Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trƣởng tế bào Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trƣởng tế bào do rƣợu gây ra của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ng}y đ{nh gi{ bằng thử nghiệm MTT đƣợc trình bày trong Bảng 2. Bảng 2: Tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ của cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây và isoquercitrin OD570 trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Ký hiệu (Nồng độ IQ) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) NĐ1 (2,5 µg/ml) 0,356 ± 0,018* 0,390 ± 0,010** 0,342 ± 0,021* 0,370 ± 0,016 ## ** 0,411 ± 0,023 ## ** 0,326 ± 0,020 ## NĐ2 (5 µg/ml) 0,373 ± 0,017** 0,371 ± 0,018** 0,386 ± 0,010** 0,304 ± 0,022 # 0,355 ± 0,013 ## ** 0,273 ± 0,010 ## * NĐ3 (10 µg/ml) 0,375 ± 0,021** 0,387 ± 0,009** 0,362 ± 0,017* 0,343 ± 0,021 ## ** 0,382 ± 0,013 ## ** 0,253 ± 0,019 Chứng 0,297 ± 0,005 0,221 ± 0,019** Quercetin 0,311 ± 0,007 0,261 ± 0,007 # % phòng ngừa so với mẫu chứng NĐ1 196,1 249,6 137,7 NĐ2 109,0 176,5 68,9 NĐ3 160,1 211,4 41,9 Quercetin 53,1 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Các mẫu thử riêng lẻ không độc tế bào, 3 nồng độ NĐ1, NĐ2, NĐ3 của các mẫu thử không thay đổi tỷ lệ tế bào sống có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng sinh lý (p > 0,05). Ethanol 100 mM ức chế sự tăng trƣởng của tế bào HepG2, làm giảm tế bào sống 25,6% so với mẫu chứng (p < 0,05). Sự ức chế tăng trƣởng này đƣợc phòng ngừa khi bổ sung v|o môi trƣờng nuôi cấy quercetin 10 µM (p < 0,05). Bổ sung isoquercitrin, cao ethyl acetat và cao cồn 70% v|o môi trƣờng ở cả 3 nồng độ ứng với h|m lƣợng isoquercitrin 2,5; 5 và 10 µg/ml làm tăng tỷ lệ tế bào sống có ý nghĩa thống kê so với mẫu chứng bệnh xử lý với ethanol 100 mM trong 24 giờ (p < 0,05). Tác dụng phòng ngừa sự tích lũy lipid Kết quả tác dụng bảo vệ tế bào gan phòng ngừa sự tích lũy lipid do rƣợu gây ra của cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây và isoquercitrin đƣợc trình bày ở Bảng 3. Đa số nồng độ khảo sát của mẫu thử riêng lẻ l|m tăng tích lũy lipid nội bào không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), chỉ NĐ1 cao ethyl acetat, NĐ2 isoquercitrin tăng lần lƣợt 10% và 25% so với mẫu sinh lý, NĐ3 cao cồn giảm 16,3% lƣợng lipid (p < 0,05). Ở mẫu ethanol 100 mM, sau 24 giờ, tế bào HepG2 tăng tích lũy lipid 39,4% so với chứng sinh lý (p < 0,05). Quercetin 10 µM giảm tích lũy lipid nội b|o gan do rƣợu (p < 0,05). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 363 Bảng 3: Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây phòng ngừa sự tích lũy lipid trong tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ OD500 trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Ký hiệu (Nồng độ IQ) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) NĐ1 (2,5 µg/ml) 0,147 ± 0,013 0,169 ± 0,010** 0,143 ± 0,007 0,194 ± 0,009** 0,160 ± 0,009* 0,249 ± 0,025** NĐ2 (5 µg/ml) 0,149 ± 0,006* 0,143 ± 0,009 0,159 ± 0,012 0,183 ± 0,006** 0,159 ± 0,006 # ** 0,203 ± 0,012** NĐ3 (10 µg/ml) 0,149 ± 0,014 0,135 ± 0,005 0,113 ± 0,004** 0,155 ± 0,006 # * 0,160 ± 0,006* 0,165 ± 0,009** Chứng 0,135 ± 0,003 0,188 ± 0,010** Quercetin 0,129 ± 0,004 0,144 ± 0,004 ## % phòng ngừa so với mẫu chứng NĐ1 -11,9 53,1 -115,4 NĐ2 8,8 53,5 -28,9 NĐ3 62,3 52,2 43,4 Quercetin 82,4 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Khi bổ sung cao cồn 70%, cao ethyl acetat, isoquercitrin từ l{ Chùm ng}y v|o môi trƣờng chứa ethanol 100 mM, chỉ có isoquercitrin 10 µg/ml và cao ethyl acetat 42,3 µg/ml bảo vệ tế bào gan làm giảm tình trạng tích lũy lipid so với mẫu tế bào chỉ đƣợc xử lý với ethanol 100 mM (p < 0,05). Tuy nhiên, lƣợng lipid trong tế bào gan đƣợc xử lý đồng thời với ethanol 100 mM và mẫu thử chƣa trở về mức bình thƣờng của mẫu sinh lý. Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây thấp hơn quercetin 10 µM. Tác dụng giảm tích lũy lipid nội bào khác biệt không có ý nghĩa giữa 3 nồng độ của cùng mẫu thử và giữa 3 mẫu cùng hàm lƣợng isoquercitrin (p > 0,05). Tác dụng phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc tự do Trong tế bào gan, glutathion tự do hiện diện ở dạng khử có nhóm -SH (ký hiệu GSH) là một chất đóng vai trò chống oxy hóa. Các tác nhân gây tổn thƣơng tế bào gan nhƣ rƣợu l|m tăng sinh gốc tự do dẫn đến làm giảm lƣợng GSH nội b|o. H|m lƣợng GSH trong tế bào gan càng cao chứng tỏ khả năng bảo vệ tế bào của mẫu thử phòng ngừa tác hại của tác nhân gây oxy hóa càng cao. Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây giúp phòng ngừa tình trạng tăng sinh gốc oxy tự do gây ra bởi rƣợu đƣợc trình bày trong Bảng 4. Cả 3 nồng độ isoquercitrin v| NĐ1 cao cồn 70% giảm lƣợng GSH nội b|o có ý nghĩa thống kê so với chứng sinh lý (p < 0,05). NĐ2, NĐ3 cao cồn 70% v| NĐ3 cao ethyl acetat từ lá Chùm ng}y tăng lƣợng GSH nội bào so với chứng sinh lý (p < 0,05). Xử lý tế bào với ethanol 100 mM trong 24 giờ làm giảm 31,3% lƣợng GSH nội bào so với sinh lý (p < 0,01). Quercetin 10 µM giúp lƣợng GSH tăng so với ethanol 100 mM (p < 0,01) v| cao hơn mẫu sinh lý (p < 0,01). So với ethanol 100 mM, nồng độ NĐ2, NĐ3 isoquercitrin v| cao ethyl acetat có tác dụng chống oxy hóa, l|m tăng lƣợng GSH nội bào (p < 0,05) về mức tƣơng đƣơng ở mẫu chứng sinh lý (p > 0,05). Tác dụng phòng ngừa tình trạng stress oxy hóa, tăng lƣợng GSH thấp hơn quercetin 10 µM (p < 0,05). Cả 3 nồng độ khảo sát của cao cồn từ lá Chùm ng}y đều l|m tăng lƣợng GSH nhƣng không có ý nghĩa thống kê so với mẫu ethanol 100 mM (p > 0,05). Nhìn chung, chỉ isoquercitrin và cao ethyl acetat thể hiện tác dụng phòng ngừa tình trạng oxy hóa do rƣợu g}y ra, tăng lƣợng GSH nội bào, tác dụng tốt ở mẫu có h|m lƣợng isoquercitrin 10 µg/ml; không khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 mẫu thử có cùng hàm lƣợng isoquercitrin (p > 0,05). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 364 Bảng 4: Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây chống oxy hóa, giảm sự tăng sinh gốc tự do trong tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra Hàm lượng GSH (µM/mg protein) trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Ký hiệu (Nồng độ IQ) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) NĐ1 (2,5µg/ml) 30,6 ± 2,6** 64,8 ± 5,8 38,8 ± 3,6** 45,1 ± 1,1** 54,9 ± 3,7* 50,3 ± 2,5** NĐ2 (5 µg/ml) 36,8 ± 1,9** 67,5 ± 6,3 75,7 ± 4,0* 67,6 ± 2,1 ## 63,7 ± 6,1 ## 49,9 ± 1,7** NĐ3 (10µg/ml) 51,2 ± 2,8** 122,5 ± 1,8** 149,1 ± 15,1** 63,8 ± 5,8 # 77,8 ± 2,6 ## ** 57,5 ± 4,6 Chứng 63,3 ± 1,0 43,5 ± 2,1** Quercetin 70,9 ± 3,0 145,6 ± 14,6** ## % phòng ngừa so với mẫu chứng bệnh NĐ1 8,4 57,5 34,7 NĐ2 122,0 102,3 32,7 NĐ3 102,9 173,4 70,8 Quercetin 515,6 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Tác dụng phòng ngừa tình trạng hoại tử Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoại tử do rƣợu g}y ra đƣợc trình bày trong Bảng 5. Bảng 5: Tác dụng của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoại tử tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ Hoạt tính LDH (mU/ml) trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Ký hiệu (Nồng độ IQ) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn (CC) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn (CC) NĐ1 (2,5µg/ml) 99,5 ± 3,4** 99,0 ± 3,7** 109,8 ± 3,7 121,1 ± 5,3 123,8 ± 2,7 # 100,5 ± 4,7* ## NĐ2 (5 µg/ml) 96,3 ± 2,9** 101,0 ± 2,8** 102,0 ± 2,4** 112,0 ± 3,2 ## 125,6 ± 5,5 # 110,5 ± 7,4 # NĐ3 (10µg/ml) 94,7 ± 1,2** 125,8 ± 3,3 134,9 ± 8,9 128,4 ± 5,6 121,3 ± 3,6 # 104,7 ± 2,4** ## Chứng 119,5 ± 1,5 145,8 ± 8,4* Quercetin 129,2 ± 6,4 127,0 ± 6,5 % phòng ngừa so với mẫu chứng bệnh (ethanol 100 mM) NĐ1 94,0 83,8 172,4 NĐ2 128,6 76,9 134,2 NĐ3 66,4 93,1 156,4 Quercetin 71,5 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với mẫu chứng sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) So với mẫu sinh lý, isoquercitrin, cao ethyl acetat, cao cồn 70% từ lá Chùm ngây làm giảm hoạt tính LDH ngoại bào ở các nồng độ khảo sát, trừ nồng độ NĐ3 của cao ethyl acetat và cao cồn 70% (p < 0,05). Sau 24 giờ, rƣợu 100 mM gây hoại tử tế b|o gan, tăng hoạt tính LDH ngoại bào 30% so với mẫu sinh lý (p < 0,05). Quercetin 10 µM làm giảm LDH ngoại b|o không có ý nghĩa thống kê so với ethanol 100 mM (p > 0,05). Ethanol 100 mM bổ sung mẫu thử isoquercitrin, cao ethyl acetat, cao cồn 70% từ lá Chùm ngây có hoạt tính LDH ngoại bào giảm so với ethanol 100 mM (p < 0,05) về mức tƣơng đƣơng với mẫu sinh lý (p > 0,05), giảm nhiều nhất ở nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml. Tác dụng phòng ngừa tình trạng hoạt hóa quá trình apoptosis Nhuộm huỳnh quang AO/EB cho thấy ethanol 100 mM gây hoạt hóa apoptosis tế bào gan HepG2 sau 24 giờ (Hình 1). Xử lý tế bào đồng thời với ethanol 100 mM và cao cồn, cao ethyl acetat Chùm ng}y, isoquercitrin l|m tăng mật độ tế bào, giảm hiện tƣợng bóng màng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 365 (bledding) v| cô đặc nhiễm sắc thể so với chứng bệnh ethanol 100 mM (Hình 1). Tác dụng phòng ngừa tình trạng phân mảnh ADN gây ra bởi rƣợu của cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ l{ Chùm ng}y v| isoquercitrin đƣợc trình bày trong Bảng 6. Chứng sinh lý Ethanol 100 mM Ethanol + isoquercitrin 10 µg/ml Hình 1: Tác dụng của lá Chùm ngây phòng ngừa tình trạng hoạt hóa quá trình apoptosis tế bào gan HepG2 do rượu gây ra (BM: bóng màng, NST: nhiễm sắc thể cô đặc) Bảng 6: Tác dụng của cao cồn, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ lá Chùm ngây phòng ngừa tình trạng phân mảnh ADN trong tế b|o gan HepG2 do rượu gây ra sau 24 giờ %ADN phân mảnh trung bình ± SEM Ethanol 100 mM (-) Ethanol 100 mM (+) Ký hiệu (Nồng độ IQ) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) NĐ1 (2,5 µg/ml) 31,7 ± 0,3** 29,1 ± 3,6 35,6 ± 0,2** 32,5 ± 0,9** ## 41,9 ± 3,0** 38,7 ±1,0** NĐ2 (5 µg/ml) 27,5 ± 0,9 32,1 ± 0,8** 30,0 ± 1,3 29,6 ± 0,3* ## 44,8 ± 1,4** 40,8 ± 1,2** NĐ3 (10 µg/ml) 30,4 ± 3,8 31,4 ± 0,1** 30,7 ± 2,0 27,3 ± 0,4 ## 33,0 ± 1,1** ## 28,6 ± 1,5 ## Chứng 27,6 ± 0,8 45,4 ± 3,2** Quercetin 43,3 ± 0,3 43,5 ± 1,6** % phòng ngừa so với mẫu chứng bệnh (ethanol 100 mM) NĐ1 72,2 19,6 37,8 NĐ2 88,5 3,5 26,0 NĐ3 101,5 69,6 93,9 Quercetin 10,6 *: p < 0,05; **: p < 0,01: so với chứng sinh lý, ##: p < 0,01: so với chứng bệnh lý (ethanol 100 mM) Hình 2: Kết quả điện di ADN phân mảnh thu được trong dịch nổi tế bào A: mẫu thử riêng lẻ; B: cao thử + ethanol; IQ1, IQ2, IQ3; EC1, EC2, EC3; CC1, CC2, CC3: lần lượt là isoquercitrin, cao ethyl acetat và cao cồn 70% từ lá Chùm ng}y h|m lượng isoquercitrin là 2,5 µg/ml; 5 µg/ml; 10 µg/ml; Q: quercetin 10 µM Xử lý tế bào với cao cồn, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây, isoquercitrin riêng lẻ trong 24 giờ l|m tăng % ADN ph}n mảnh không đ{ng kể so với mẫu sinh lý (p > 0,05). BM NST Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 366 Sau 24 giờ, ethanol 100 mM l|m tăng mạnh tỷ lệ ADN phân mảnh (45,6% so với 27,6% của mẫu sinh lý, p < 0,01). Quercetin 10 µM kết hợp với ethanol 100 mM không l|m thay đổi tình trạng apoptosis so với mẫu quercetin hoặc ethanol một mình (p > 0,05). Isoquercitrin 2,5; 5 v| 10 µg/ml đều làm giảm sự phân mảnh ADN trong tế bào HepG gây ra do ethanol 100 mM (p < 0,01), sự khác biệt giữa 3 nồng độ không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Đối với cao cồn 70% và cao ethyl acetat, chỉ có nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml làm giảm tỷ lệ ADN phân mảnh so với ethanol 100 mM (p < 0,01). Ở cùng nồng độ, isoquercitrin ngăn ngừa tình trạng phân mảnh ADN tốt hơn cao cồn và cao ethyl acetat. Kết quả định lƣợng ADN phân mảnh bằng thuốc thử diphenylamin hoàn toàn phù hợp với quan sát ADN phân mảnh trên gel agarose 2% bằng kỹ thuật điện di (Hình 2). Kết quả tổng hợp về tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 của cao cồn 70%, cao ethyl acetat và isoquercitrin từ l{ Chùm ng}y đƣợc trình bày trong Bảng 7. Bảng 7: Mức độ bảo vệ tế bào gan của cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây và isoquercitrin qua % phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng (TT), tích lũy lipid nội b|o (LP), tăng sinh gốc oxy hóa (OX), hoại tử (HT) và hoạt hóa apoptosis (AP) do ethanol 100 mM Nồng độ Isoquercitrin (IQ) Cao ethyl acetat (EC) Cao cồn 70% (CC) TT LP OX HT AP TT LP OX HT AP TT LP OX HT AP NĐ1 196 -12 8 94 72 250 53 58 84 20 138 -115 35 172 38 NĐ2 109 9 122 129 89 177 54 102 77 4 69 -29 33 134 26 NĐ3 160 62 103 66 102 211 52 173 93 70 42 43 71 156 94 Quercetin 53 82 516 71 11 NĐ1, NĐ2, NĐ3: nồng độ của 3 mẫu thử tương ứng với isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml BÀN LUẬN Sau 24 giờ, ethanol 100 mM gây tổn thƣơng tế bào gan HepG2: giảm 25,6% tỷ lệ tế bào sống, 31,3% lƣợng GSH nội bào; tăng 39,3% lƣợng lipid nội bào; 22% hoạt tính LDH ngoại bào và gây hoạt hóa apoptosis tăng 64,5% ADN ph}n mảnh. Tình trạng tổn thƣơng tế bào gan do ethanol 100 mM giảm nhờ quercetin 10 µM, chất đã đƣợc chứng minh tác dụng bảo vệ tế bào gan(1,5,6,17,19), trừ quá trình apoptosis vì quercetin đã đƣợc Zhang (2012) báo cáo gây apoptosis(20). Kết quả tác dụng bảo vệ tế bào gan của cao cồn 70%, cao ethyl acetat ở 3 nồng độ ứng với isoquercitrin 2,5; 5; 10 µg/ml cho thấy lá Chùm ngây có khả năng phòng ngừa sự ức chế tăng trƣởng tế bào, giảm tích lũy lipid nội bào, chống oxy hóa, giảm hoại tử và apoptosis tế bào gan HepG2 do ethanol 100 mM gây ra phù hợp với b{o c{o trƣớc đ}y về tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của lá Chùm ngây(8-10,2,13,15,16,18). Một số đề tài báo cáo thành phần flavonoid, phenol quyết định hoạt tính chống oxy hóa của lá Chùm ngây(15,18). H|m lƣợng flavonoid càng cao, t{c động dọn dẹp, trung hòa gốc tự do càng rõ, giúp tế bào gan giảm nhạy cảm với yếu tố g}y độc, giảm kích hoạt quá trình apoptosis. Theo Sreelatha (2011), Vellosa (2011), dịch chiết l{ Chùm ng}y tăng hoạt động của enzym chống oxy hóa superoxid dismutase và catalase, giảm lƣợng gốc tự do, ức chế peroxyd hóa lipid và giảm ADN phân mảnh(4). Isoquercitrin và quercetin trong l{ Chùm ng}y điều hòa biểu hiện của các gen tham gia sinh tổng hợp GSH(11). Ngoài ra, isoquercitrin và các flavonoid có liên kết đôi C2=C3 ở vòng C, nhóm 4-oxo, nhóm OH ở vị trí A5, A7 v| B4’quyết định tác dụng ức chế TNF-α, giảm hoại tử gây bởi rƣợu(18). Tác dụng bảo vệ tế bào gan HepG2 giảm dần theo thứ tự: cao ethyl acetat > isoquercitrin > cao cồn 70% và thể hiện rõ ở nồng độ ứng với isoquercitrin 10 µg/ml của cả 3 mẫu thử. Theo Salihah (2012), tỷ lệ phenolic trong cao ethyl acetat lớn hơn cao cồn 96% (22,2% vs 8,6%) và isoquercitrin có hoạt tính chống oxy hóa cao, phân lập từ ph}n đoạn ethyl acetat với hàm lƣợng lớn(14). Điều này gợi ý isoquercitrin là một Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 367 trong những chất quyết định tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của Chùm ngây. KẾT LUẬN Cao cồn 70%, cao ethyl acetat từ lá Chùm ngây và isoquercitrin có tác dụng phòng ngừa sự ức chế tăng trƣởng, hoại tử và hoạt hóa apoptosis do ethanol 100 mM gây ra sau 24 giờ có thể do làm tăng lƣợng GSH nội b|o nhƣng chƣa thể hiện rõ tác dụng làm giảm tích lũy lipid. Nhƣ vậy, l{ Chùm ng}y, đặc biệt là cao ethyl acetat có tác dụng bảo vệ tế bào gan tốt giúp phòng ngừa tổn thƣơng do rƣợu, tác dụng rõ nhất ở nồng độ 84,7 µg/ml ứng với isoquercitrin 10 µg/ml. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alia M, Mateos R, Ramos S, Lecumberri E, Bravo L, Goya L (2006). Influence of quercetin and rutin on growth and antioxidant defense system of a human hepatoma cell line (HepG2). Eur J Nutr, 45(1): 19-28. 2. Das N, Sikder K, Ghosh S, Fromenty B, Dey S (2012). Moringa oleifera Lam. leaf extract prevents early liver injury and restores antioxidant status in mice fed with high-fat diet. Indian Journal of Experimental Biology, 50(6): 404-412. 3. Đỗ Thị Hồng Tƣơi, Huỳnh Quang Mỹ Khánh, Huỳnh Thị Kim Loan. Xây dựng mô hình in vitro mô phỏng tình trạng tổn thƣơng tế b|o gan do rƣợu trên dòng tế bào HepG2. Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 18(1): 332-339 (2014). 4. Henryk D (2010). Nonalcoholic Fatty Liver Disease, Clinical Hepatology Principles and Practice of Hepatobiliary Disease Volume 2, Henryk Dancygierb, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, German, pp.1153 – 1179. 5. Kim GN, Jang HD (2009). Protective mechanism of quercetin and rutin using glutathione metabolism on HO-induced oxidative stress in HepG2 cells. Ann NY Acad Sci, 1171: 530-537. 6. Kim GN, Kwon YI, Jang HD (2011). Protective mechanism of quercetin and rutin on 2,2'-azobis(2- amidinopropane)dihydrochloride or Cu2+-induced oxidative stress in HepG2 cells. Toxicol In Vitro, 25(1): 138-144. 7. Kim KT et al. (2008). Inhibitory effects of naringenin, kaempherol, and apigenin on cholesterol biosynthesis in HepG2 and MCF-7 cells. Food Science and Biotechnology, 17(6), 1361-1364. 8. Kumar PS, Debasis M, Goutam G, Chandra SP (2010). Hepatoprotective Activity of Leaves and Roots Extracts of Moringa oleifera Lam. Int J Med Res.; 1(2): 90-93. 9. Kumar PS, Debasis M, Goutam G, Chandra SP (2010). Medicinal uses and pharmacological properties of Moringa oleifera. International Journal of Phytomedicine, 2: 210 – 216. 10. Magalingam KB, Radhakrishnan A, Haleagrahara N (2014). Protective effects of flavonol isoquercitrin, against 6-hydroxy dopamine (6-OHDA) - induced toxicity in PC12 cells, BMC Research Notes, 7(49): 125-131. 11. Mai Đình Trị, Lê Tiến Dũng, Trần Quang Vinh, Lâm Quốc Trung (2011). Thành phần hóa học từ lá Chùm ngây Moringa oleifera Lam, Tạp chí hóa học: 49(6A): 96-101. 12. Nguyễn Bảo Trân (2010), Khảo s{t t{c động chống oxy hóa của lá chùm ngây Moringa oleifera Lam. Moringaceae, Luận văn thạc sĩ Dƣợc học, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, tr.3-7. 13. Ruckmani K, Kavimani S, Anandan R, Jaykar B (1998). Effect of Moringa oliefera Lam on Paracetamol – induced hepatotoxicity. Indian J. Pharm Sci, 60(1): 33-35. 14. Salihah, Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận (2012). Ph}n lập c{c th|nh phần có t{c dụng chống oxi hóa trong l{ Chùm ng}y (Moringa oleifera Lam.). Tạp chí Y học TP.HCM: 16(1): 163-168. 15. Siddhuraju P, Becker K (2003). Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three different agro-climatic origin of drumstick tree Moringa oleifera Lam, J. Agric Food Chem, 51(8): 2144-2155. 16. Sreelatha S, Padma PR (2011). Modulatory effects of Moringa oleifera extracts against hydrogen peroxide-induced cytotoxicity and oxidative damage. Human and Experimental Toxicology, 30(9): 1359-1368. 17. Ueda H, Yamazaki C, Yamazaki M (2004). A hydroxyl group of flavonoids affects oral anti-inflammatory activity and inhibition of systemic tumor necrosis factor- R production”, Biosci. Biotech-nol. Biochem, 68(1): 119-125. 18. Vongsak B, Sithisarn P, Mangmoolb S, Thongpraditchote S, Wongkrajaangc Y, Gritsanapana W (2013). Maximizing total phenolics, total flavonoids contents and antioxidant activity of Moringa oleifera leaf extract by the appropriate extraction method. Industrial Crops and Products, 44: 566-571. 19. Weng CJ, Chen MJ, Yeh CT, Yen GC (2011). Hepatoprotection of quercetin against oxidative stress by induction of metallothionein expression through activating MAPK and PI3K pathways and enhancing Nrf2 DNA-binding activity. N Biotechnol, 28(6): 767-777. 20. Younossi ZM, Gramlich T, Bacon BR, Matteoni CA, Boparai N, O'Neill R, McCullough AJ (1999). Hepatic iron and nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology, 30(4): 847 - 850. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018