Khóa luận Công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Nghiên cứu cấu trúc tế bào, phát triển và phân hóa tế bào trong những điều kiện khác nhau. Thu nhận các chất trao đổi thứ cấp. 2.1.2.6. Nuôi cấy protoplast Tế bào trần là tế bào đã được tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay sử dụng enzyme. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ưu thế của kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần là tế bào không có màng cứng, ở trạng thái đơn bào, mật độ tế bào thu được trên 1 đơn vị thể tích môi trường có thể rất cao (đạt 106 tế bào/1ml môi trường). Ø Ứng dụng nuôi cấy protopast: Tạo ra cây lai soma. Chuyển các bào quan và chuyển gen. Quá trình dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài. Quá trình sinh tổng hợp màng tế bào. 2.1.3. Môi trường nuôi cấy Ø Thành phần môi trường nuôi cấy gồm năm thành phần cơ bản sau: Muối khoáng đa lượng. Muối khoáng vi lượng Vitamin. Nguồn carbon. Chất điều hòa sinh trưởng. Ngoài ra có thể bổ sung các thành phần không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men,…) và agar. Ø Môi trường nuôi cấy có thể chia thành ba loại: Môi trường nghèo dinh dưỡng: White, Knop. Môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: Gamborg. Môi trường giàu dinh dưỡng: MS. Cơ sở cho việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là xem xét các thành phần cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy. Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy. Tế bào mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy. Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy cần điều chỉnh độ pH môi trường thích hợp trước khi nuôi cấy. Thường sử dụng NaOH hay HCl loãng để điều chỉnh độ pH. 2.1.4. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 2.1.4.1. Auxin Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật. IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật, còn NAA, IBA, 2,4-D là các auxin nhân tạo, thường các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn. Chúng có mặt ở các bộ phận của cây như mô phân sinh đỉnh, các bộ phận non khác của cây. Ø Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu. Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy. Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy. Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh. Đặc tính của auxin. Ø Vai trò của các chất thuộc nhóm auxin: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào. Chồi đỉnh cung cấp auxin gây ra ức chế sinh trưởng của chồi bên. Kích thích sự phân hoá của các mô dẫn. Ảnh hưởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín của quả, sự ra hoa trong mối quan hệ với điều kiện môi trường. Tạo và nhân nhanh mô sẹo (callus). Kích thích tạo chồi bất định (ở nồng độ thấp). Tạo phôi soma (2,4-D). 2.1.4.2. Cytokinin Các cytokinin là dẫn xuất của adenine. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là BAP, Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo. Chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng. Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng đối với sự phát sinh hình thái trong các hệ thống nuôi cấy. Đối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), để tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/ cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn đến sự sinh sản chồi và chồi nách. Cytokinin có mặt trong mô phân sinh đỉnh rễ, quả non. Ø Chức năng chủ yếu của các cytokinin: Kích thích phân chia tế bào. Tạo và nhân callus. Kích thích phát sinh chồi trong nuôi cấy mô. Kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hưởng ưu thế của chồi đỉnh . Làm tăng diện tích phiến lá do kích thích sự lớn lên của tế bào. Có thể làm tăng sự mở của khí khổng ở một số loài. Tạo chồi bất định (ở nồng độ cao) . Ức chế sự hình thành rễ. Ức chế sự kéo dài chồi. Ức chế quá trình già (hoá vàng và rụng) ở lá, kích thích tạo diệp lục. 2.1.4.3. Gibberellin Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin, GA3 là chất được sử dụng nhiều hơn cả trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài chồi và nảy mầm của phôi vô tính.. GA3 có tính hoà tan trong nước. Gibberellin được tạo ra trong đỉnh rễ, chồi, lá non, hạt. Ø Gibberellin có các chức năng cơ bản sau: Kích thích kéo dài chồi do tăng cường phân bào và kéo dài tế bào. Phá ngủ hạt giống hoặc củ giống. Kiểm soát sự ra hoa của các cây 2 năm tuổi. Ức chế sự hình thành rễ bất định. Kích thích sinh tổng hợp của α-amylase ở hạt cây ngũ cốc nảy mầm. Các chất ức chế tổng hợp kích thích quá trình tạo củ (thân củ, thân hành và củ). Kích thích sự nảy mầm của phấn hoa và sinh trưởng của ống phấn. Có thể gây tạo quả không hạt hoặc làm tăng kích thước quả nho không hạt. Có thể làm chậm sự hoá già ở lá và quả cây có múi. 2.1.4.4. Abscisic acid (ABA) Abscisic acid là một chất điều hòa sinh trưởng thực vật tự nhiên được tạo ra trực tiếp từ acid mevalonic hoặc do sự phân giải carotenoid. Chúng được tạo ra trong lá, quả, mũ rễ, hạt. Ø Các tác dụng cơ bản của ABA là: Kích thích sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả ABA thường được sản sinh khi có các yếu tố ức chế cây trồng như mất nước và nhiệt độ thấp đóng băng. Kích thích sự ngủ nghỉ, kéo dài thời gian ngủ nghỉ và làm chậm sự nảy mầm của hạt. Ức chế sự kéo dài thân và được sử dụng để kiểm soát sự kéo dài thân cành. Gây ra sự đóng khí khổng. 2.1.4.5. Ethylene Ethylene là một loại khí hiện diện trong bầu khí quyển với một nồng độ rất thấp. Ethylene được sinh ra bởi những mô thực vật còn sống và có vai trò điều hòa sự phát triển ở thực vật. Chúng được tạo ra ở các bộ phận như mô phân sinh đỉnh rễ, chồi, nốt lá, hoa hóa già, quả chín. Ø Các chức năng cơ bản của ethylene: Gây già hoá lá, kích thích sự rụng lá và quả. Làm chín quả. Sinh tổng hợp ethylene được tăng cường khi quả đang chín, cây đang bị úng, lão hoá, tổn thương cơ giới và bị nhiễm bệnh. Điều khiển sự chín của một số loại quả. Ethylene kìm hãm sự ra hoa của đa số cây. Tuy vậy, sự ra hoa của xoài, dứa, một số cây cảnh lại được kích thích bởi ethylene. Kích thích nở hoa, kích thích sự lão hoá của hoa và lá. 2.1.5. Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.5.1. Đảm bảo điều kiện vô trùng Môi trường nuôi cấy có chứa đường, muối khoáng,... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển và với tốc độ phát triển nhanh hơn rất nhiều lần so với tế bào thực vật. Dụng cụ thuỷ tinh: Rửa sạch, hấp trong nồi áp suất ở 121 oC/15 phút. Nút đậy: Sử dụng nút cao su. Nút được nhét bông gòn không thấm nước để bụi và không khí không được đi qua. Sau đó đem đi hấp trong nồi hấp 121 oC/15 phút. Mẫu nuôi cấy: Các mẫu lấy ngoài tự nhiên như cây, lá, hoa, cành cần rửa sạch bằng xà bông dưới vòi nước nhiều lần để hạn chế sự tạp nhiễm. Sử dụng các chất có hoạt tính diệt khuẩn như cồn chlorua, nước javen,... Vô trùng nơi thao tác và tủ cấy. Môi trường: Môi trường thuờng được hấp khử trùng ở 121 oC, 1atm trong 30 phút. Có một số chất trong môi trường nuôi cấy không bền nhiệt (vitamin, kháng sinh,..), những chất này được lọc vô trùng sau đó được thêm vào môi trường sau khi đã được hấp, làm nguội đến khi cầm trên tay được. 2.1.5.2. Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách Tuỳ vào mục đích nuôi cấy, thu nhận sản phẩm. Tuỳ thuộc vào từng loại nuôi cấy sẽ có một môi trường tối ưu. Thông thường ta phải trải qua quá trình thực nghiệm, từ đó mới tìm một loại môi trường thích hợp cho từng mục đích Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm, khi đó mô nuôi cấy sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi. Mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật đòi hỏi rất nghiêm ngặt, đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn trong các bioreactor. Nhiều loại protein, vitamin, amino axit, hormone,..không bền nhiệt vì vậy nên dùng phin lọc micropore để khử trùng. Ø Có 3 nguồn nhiễm tạp chính: Dụng cụ thủy tinh, môi trường và nút đậy không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt hoặc bên trong mô nuôi cấy. Trong quá trình thao tác. Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C. Thể tích môi trường (ml) Thời gian tối thiểu (phút) 20-25 24 50 26 100 28.5 250 31.5 500 35 1000 40 2000 48 3000 55 4000 63 2.1.5.3. Chọn mô cấy và xử lý đúng cách Tuỳ mục đích nuôi cấy để chọn loại mô cấy thích hợp. Thông thường các mô trong cơ thể thực vật đều có thể dùng làm mô cấy, trừ những mô đã hoá gỗ. Khi bắt đầu nghiên cứu nhân giống vô tính một cây nhất định thì trước tiên chú ý đến các chồi nách và mô phân sinh ngọn. Nguồn lấy mẫu, vị trí lấy mẫu cấy từ cây mẹ là những yếu tố quan trọng trong việc thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Lấy mẫu vào mùa xuân khi cây đâm lộc, các chồi mới nhú sạch hơn so với các chồi ngủ. Cây trồng ngoài ruộng dễ bị nhiễm hơn cây trồng trong nhà kính hoặc chậu trong phòng. Các phần như rễ, củ hoặc gần như nằm trên mặt đất như thân bò, dạng củ, protocom của lan thì khó làm sạch hơn các nguyên liệu thực vật khác. Có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rảnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm. Để loại bỏ sự tạp nhiễm bề mặt, có thể rửa sơ bộ mô cấy với nước xà phòng để loại bỏ bụi, đất và làm tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng. Để làm tăng sự khử trùng có thể dùng chất hỗ trợ làm tăng sự tiếp xúc như Tween - 20, xà phòng. Thường dùng 1 - 3 giọt Tween cho 100 ml dung dịch nước khử trùng là tốt nhất. Ngoài ra để tăng sự tiếp xúc bằng cách lắc hoặc khuấy đều mẫu cấy trong lúc đang khử trùng. Ø Qui trình khử trùng bề mặt: Rửa mẫu bằng chất tẩy nhẹ trước khi thao tác với dung dịnh khử trùng. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy từ 10-30 phút. Nhúng ngập mẫu vào dung dịch khử trùng trong điều kiện vô trùng. Đậy nắp lọ rồi lắc nhẹ trong thời gian khử trùng. Bỏ dung dịch khử trùng đi rồi rửa vài lần bằng nước cất vô trùng. Bảng 2.2: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật: Stt Chất khử trùng Nồng độ Thời gian khử trùng (phút) Hiệu quả 1 Hypochlorite calcium 9-10% 5-30 Rất tốt 2 Hypochlorite sodium 0,5-5% 5-30 Rất tốt 3 Nước bromine 1-2% 2-10 Rất tốt 4 Oxy già 3-12% 5-15 Tốt 5 Chlorua thủy ngân 0,1-1% 2-10 Tốt 6 Nitrate bạc 1% 5-30 Tốt 7 Kháng sinh 4-50mg/l 30-60 khá 2.2. Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh 2.2.1. Phân loại Ø Lịch sử phân loại: Việt Nam có nhiều cây thuốc được gọi là Sâm. Nhưng chỉ có bốn loài Sâm thuộc họ Nhân Sâm (Araliaceae). Chi Panax gần gũi với cây Nhân Sâm Panax gingseng C. A. Meyer là Sâm Ngọc Linh, Sâm Tam Thất, Sâm Nam và Sâm Vũ Diệp, đều là các cây thuốc quý. Năm 1968, KS. Vũ Đức Minh đã tìm thấy cây Sâm Ngọc Linh tại vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên nó là Sâm Khu 5. Năm 1973, đoàn điều tra cây thuốc của Ban dân y Khu 5 do DS. Đào Kim Long dẫn đầu đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m trên vùng núi Ngọc Linh và tạm đặt tên là Sâm Đốt Trúc với tên khoa học Panax articulatus, họ Nhân Sâm (Araliaceae) (Nguyễn Minh Đức, 2003). Tên khoa học của cây được công nhận là Panax vietnamensis Ha et Grush., họ Nhân Sâm Araliaceae, công bố tại Viện thực vật Kamarov (Liên Xô trước đây) nǎm 1985 do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên (internet 4). Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên Ø Phân loại: Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Bộ: Apiales Họ: Cam Tùng (Araliaceae) Chi: Panax Loài: Panax Loài: Panax vietnamensis Ha et Grush Tên khác: Sâm Việt Nam, Sâm Ngọc Linh, Sâm Khu Năm, Thuốc Dấu (Xê Đăng). Tên nước ngoài: Vietnamese ginseng. Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh 2.2.2. Đặc điểm hình thái Cây thảo, sống lâu năm nhờ thân rễ, cao khoảng 40 - 80 cm, đôi khi trên 1 m. Thân rễ nạc, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, mang nhiều rễ nhánh và củ, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối đuôi đôi khi có một củ hình cầu. Thân rễ còn mang nhiều rễ phụ, ở cây hoang dại, thân rễ là phần phát triển mạnh nhất chứa chất dự trữ, hoạt chất. Hình dạng rất thay đổi, rễ củ ở cây sâm hoang dại rất phát triển có dạng con quay, hình trụ, có màu vàng nhạt mang nhiều rễ con với những vàm ngang. Đối với sâm trồng, rễ củ rất phát triển, tăng trưởng hàng năm rất rõ rệt, chúng có ba dạng chính: dạng củ cà rốt, dạng con quay và dạng bó củ, đây là dạng rất phổ biến. Sâm Ngọc Linh trồng thường cao đến 1 m mang nhiều lá kép có khi đến 7 lá chét to hơn bình thường. Thân khí sinh mảnh, thẳng màu xanh hay hơi tím, mọc thẳng, mang 2 - 4 lá kép chân vịt mọc vòng, mỗi lá kép có 5 lá chét hình trứng ngược hoặc hình mác, dài 10 - 14 cm, rộng 3 - 5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía răng nhỏ. Hoa tự, cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có cuống dài 10 - 20 cm có thể kèm 1 - 4 tán phụ hay một hoa riêng lẻ ở phía dưới tán chính. Hoa nhiều màu lục vàng, hoa hình tán đơn mọc dưới các lá thẳng với thân. Mỗi tán 60 - 100 hoa, cuống hoa ngắn 1 - 1.5 cm, lá đài 5, cánh hoa 5, vàng nhạt, nhị 5, bầu 1 ô với 1 vòi nhụy. Đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu 1 ô với một vòi nhụy. Lá kép, chân vịt mọc vòng với 3-5 nhánh lá, cuống lá kép, mang 5 lá chét, lá chét phiến bầu dục, mép khía răng cưa, chóp nhọn, có lông ở cả hai mặt. Quả hạch, hình trứng, khi chín có màu đỏ hay vàng nhạt, sau đen, hạt hình thận màu trắng, bề mặt hạt có nhiều chỗ lồi lõm, có vân, quả mọc tập trung ở trung tâm của tán lá, dài độ 0,8 - 1cm và rộng khoảng 0,5 - 0,6 cm, mỗi quả chứa một hạt, một số quả chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân khoảng 10 đến 30 quả. Mùa hoa: tháng 4 – tháng 6, mùa quả: tháng 7 – tháng 9. Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh 2.2.3. Sinh thái và phân bố Ø Đặc điểm sinh thái: Sâm Ngọc Linh là loại cây thân thảo ưa ẩm và ưa bóng, sinh trưởng ở độ cao từ 1.200 – 2.100m so với mặt biển, mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng. Môi trường rừng nơi có Sâm mọc luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù, nhiệt độ khoảng 15-18 0C, lượng mưa khoảng 3000 mm/ năm. Đất rừng ở đây được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, có màu nâu đen, tơi xốp, hàm lượng mùn cao và chứa nhiều nước. Sâm Ngọc Linh sinh trưởng mạnh trong mùa xuân hè. Mùa hoa quả từ tháng 5- tháng 10, cây ra hoa quả tương đối đều hàng năm. Sau khi quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng và sẽ nảy mầm vào đầu mùa xuân năm sau, Sâm có khả năng tái sinh tự nhiên từ hạt khá tốt. Sâm có phần thân trên mặt đất lụi hàng năm, để lại các vết sẹo rõ. Mỗi năm từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) chỉ mọc lên một thân mang lá. Căn cứ vào vết sẹo trên thân rễ để tính tuổi của Sâm. Ø Đặc điểm phân bố: Trong số hơn mười loài và dưới loài đã biết của chi Nhân Sâm (Panax), ở Việt Nam có ba loài mọc tự nhiên và một loài là cây nhập trồng. Sâm Ngọc Linh được phát hiện sau cùng vào 1973. Đến 1985 nó mới được công bố là hoàn toàn mới đối với khoa học. Đến nay Sâm Ngọc Linh chỉ mới được phát hiện duy nhất ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Ngọc Linh là dãy núi cao thứ hai của Việt Nam, có tọa độ địa lý từ 107o50’ – 108o7’ kinh tuyến Đông và từ 15o0’ – 15o10’ vĩ tuyến Bắc, đỉnh cao nhất là Ngọc Linh cao 2598 m. Những điểm vốn trước đây có sâm Ngọc Linh mọc tự nhiên từ độ cao khoảng 1500 m đến 2200 m, chủ yếu tập trung ở 1800 – 2000 m, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam). Về giới hạn cũng như phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc Linh hiện nay đã có nhiều thay đổi. 2.2.4. Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh Cây có vùng phân bố rất hẹp và mọc rất rải rác. Do là loài Sâm quí hiếm nên số lượng cá thể giảm sút nhanh chóng, hiện đang nằm trong 250 loài quí hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác quá mức và buôn bán bất hợp pháp, hiện Sâm Ngọc Linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ. Để bảo vệ và phát triển cây dược liệu quí hiếm, hiện đã có những dự án để duy trì và bảo tồn giống tại hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum: Năm 1979: Uỷ Ban Nhân Dân Tỉnh Quảng Nam đã cho thành lập Trại dược liệu Trà Linh. Bằng cách nhân giống hữu tính và vô tính, Trại dược liệu đã có 223.000 cây con. Trại đã xây dựng quy trình trồng cây Sâm Ngọc Linh và phổ biến cho nhân dân trong vùng thực hiện. Năm 1995: Sở Khoa học, Công nghệ và Môi trường tỉnh Quảng Nam đã đầu tư nghiên cứu các biện pháp kỹ thuật nhằm bảo vệ và phát triển cây Sâm Ngọc Linh. Nhằm hình thành vùng nguyên liệu Sâm Ngọc Linh và đưa cây Sâm trở thành loại cây trồng mang lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân trong vùng dự án, Sở đã chủ trì thực hiện dự án “Ứng dụng kỹ thuật tiến bộ xây dựng mô hình phát triển vùng nguyên liệu sâm khu Năm tại xã Trà Linh”. Năm 2003: Viện Dược liệu Hà Nội phối hợp với Sở Khoa Học Công Nghệ và Môi Trường Kon Tum thực hiện dự án vùng trồng cây Sâm Ngọc Linh. Cây Sâm đã được nhân giống trong năm 2003 và trồng tập trung ở xã Ngọc Lay, huyện Đắk Tô. Năng suất hàng năm ước tính khoảng 50.000 cây. Mục đích của dự án là quy hoạch vùng có điều kiện thích hợp cho cây sâm Ngọc Linh phát triển và tìm ra phương pháp canh tác thích hợp nhất nhằm bảo tồn loài cây đặc hữu của vùng và giúp xóa đói giảm nghèo ở Kon Tum. Sâm Ngọc Linh là một dược liệu quý và có giá trị kinh tế cao, cần thiết ứng dụng những kỹ thuật mới trong sản xuất để nâng cao giá trị thương mại, xây dựng thương hiệu sâm Ngọc Linh trên thị trường thế giới. Trong đó bước đầu tiên là hiện đại hóa việc canh tác. Trong nhiều biện pháp, nuôi cấy mô là một kỹ thuật tiên tiến có thể ứng dụng tốt cho sản xuất sản phẩm Sâm Ngọc Linh. 2.2.5. Thành phần hóa học 2.2.5.1. Hợp chất saponin: Tên gọi saponin hay saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Hợp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu của cây Sâm Việt Nam cũng như của các loài Sâm khác trên thế giới. Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học. Phần dưới mặt đất (thân rễ và rễ củ) chứa 49 hợp chất saponin, gồm 25 saponin đã biết và 24 saponin có cấu trúc mới được đặt tên là vina-ginsenosid-R1-R24. Phần trên mặt đất có 19 saponin damaran đã được phân lập, gồm 11 saponin đã biết và 8 saponin có cấu trúc mới đặt tên là vinaginsenosid-L1-L8. Bảng 2.3: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm ( Đã trừ độ ẩm): Nguyên liệu Hàm lượng saponin chính (%) G-Rb1 GRd G-Ry1 R2 Tổng cộng Đầu mầm 0.943 0.898 1.359 2.859 6.059 Sâm 2 tuổi 0.979 0.426 1.235 1.868 4.236 Sâm 3 tuổi 0.846 0.678 1.419 2.409 5.352 Rễ củ 4 tuổi 0.818 0.396 1.696 3.141 6.051 Rễ củ 5 tuổi 1.721 0.518 2.219 3.816 8.674 Rễ củ 6 tuổi 1.824 0.632 2.285 4.166 9.474 Thân rễ 4 tuổi 1.518 1.778 2.432 2.946 8.674 Thân rễ 5 tuổi 1.565 0.981 1.652 4.276 8.494 Thân rễ 6 tuổi 2.716 0.840 3.648 5.342 12.546 Bảng 2.4: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp. trồng trọt: Loại aglycon Panax ginseng Panax notoginseng Panax quinquefolius Panax vietnamensis 20(S)–ppd 2.9 2.1 2.7 3.1 20(S)–ppt 0.6 2.4 1.2 2.0 Ocotillol – – 0.04 5.6 Oleanolic acid 0.02 – 0.07 0.09 Hiệu suất toàn phần (%) 3.5 4.5 4.0 10.8 ( Ghi chú: 20(S)-ppd: 20(S)-protopanaxadiol; 20(S)-ppt: 20(S)-protopanaxatriol) Bảng 2.5: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol: Tên Kiểu R1 R2 R3 Hiệu suất (%) G-ReI (I) -H- -Glc2-Rha -Glc- 0.17 20-glc-G-Rf (I) -H- -Glc2-Glc -Glc- 0.01 G-Rg1* (I) -H- -Glc2-Glc -Glc- 1.37 G-Rh1 (I) -H- -Glc- -H- 0.008 N-R1* (I) -H- -Glc2-Xyl -Glc- 0.36 N-R6 (I) -H- -Glc- -Glc6- 0.01 G-R4 (I) -Glc2-Glc -H- -Glc- 0.004 G-R12 (K) -H- -Glc- -H- 0.005 G-R15 (J) -H- -Glc- -Glc- 0.003 G-R17 (K) -H- -Glc- -Glc- 0.002 G-R18 (K) -H- -Glc- -Glc- 0.002 G-R19 (L) -Glc2-Glc -H- -Glc- 0.006 Bảng 2.6: Acid Oleanolic: Tên Kiểu R1 R2 Hiệu suất (%) G-R0 (O) -Glc2-Glc -Glc- 0.038 H-Ma (O) -Glc2-Glc-Ara(p) -Glc- 0.05 Bảng 2.7: Ocotillol: Tên Kiểu R1 R2 Hiệu suất (%) PG-RT4 (M) -Glc- -CH3 0.065 24(s)-PG-F11 (M) -Glc2-Rha -CH3 0.005 M-R1* (M) -Glc2-Glc -CH3 0.14 M-R2* (M) -Glc2-Xyl -CH3 5.29 G-R1 (M) -Glc2-Rha-Ac6 -CH3 0.033 G-R2 (M) -Glc2-Xyl-Ac4 -CH3 0.014 G-R6 (M) Glc -CH3 0.006 G-R14 (M) -Glc2-Xyl -CH2OH 0.02 G-R10 (N) -Glc- -CH3 0.007 2.2.5.2. Hợp chất polyacetylen Có 7 hợp chất đã được phân lập, 5 hợp chất đã được xác định cấu trúc với panaxynol và heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol là 2 polyacetylen chính yếu. Hai hợp chất mới là 10 acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol và heptadeca-1,8(E),10(E)-trien-4-6-diyn-3,10-diol. 2.2.5.3. Thành phần acid béo Bảng 2.8: Các axid béo được tìm thấy: STT Số Carbon của hợp chất % Tên 1 8 C Vết 2 10 C Vết 3 11 C Vết 4 12 C 0.22 5 13 C 0.31 6 14 C 1.33 7 15 C 0.40 8 15 C1= 0.31 9 16 C 29.12 Acid palmitic 10 16 C1= Vết 11 17 C 1.13 12 17 C1= Vết 13 18 C 4.48 Acid stearic 14 18 C1= 13.26 Acid oleic 15 18 C2= 40.04 Acid linoleic 16 18 C3= 2.61 Acid linolenic 17 20 C 1.51 2.2.5.4. Thành phần acid amin Bảng 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu: STT Acid amin Acid amin (%) Acid amin thủy giải (%) 1 Tryptophan 10.20 - 2 Lysin 17.90 5.29 3 Histidin 1.02 2.59 4 Arginin 46.66 12.90 5 Acic aspartic 7.60 10.38 6 Threonin 1.20 5.19 7 Serin 5.12 5.19 8 Acid glutamic 2.05 6.49 9 Prolin 3.07 15.58 10 Glycin 4.10 5.19 11 Alanin - 5.19 12 Cystin 1.53 Vết 13 Valin 0.51 1.29 14 Methionin 0.51 Vết 15 Isoleucin 1.02 2.59 16 Leucin 1.02 5.19 17 Tyrosin 0.51 6.49 18 Phenylanin 0.51 6.49 2.2.5.5. Các nguyên tố vi lượng Bảng 2.10: Các nguyên tố vi lượng: STT Nguyên tố vi lượng Hàm lượng (ppm) 1 K 9349.19 2 Ca 2844.74 3 Mg 1950.19 4 Fe 491.21 5 Sr 169.87 6 Ti 120.65 7 B 140.00 8 Rb 91.62 9 Mn 68.10 10 Zn 26.11 11 Br 17.27 12 Ni 10.61 13 Cu 6.23 14 Cr 4.10 15 Y 1.51 16 I 0.24 17 Co 0.15 18 As 0.10 19 Se 0.05 20 Hg 0.04 2.2.5.6. Các thành phần khác Hợp chất Sterol: β-Sitosterol và daucosterin (β- Sitosteryl-3-o- β-D-glucopyranosid). Hợp chất glucid: Đường tự do: 6.19% Đường toàn phần: 26.77% Tinh dầu: 0.05- 0.10% Sinh tố C: 0.059% 2.2.5.7. Tác dụng dược lý- Lâm sàng Sâm Ngọc Linh được các dân tộc thiểu số cũng như giới khoa học biết đến với nhiều công dụng hữu ích đối với sức khỏe. Tác dụng trên hệ thần kinh: làm gia tăng sự vận động tự nhiên, trí thông minh và sự nhanh nhẹn khéo léo. Tăng sinh lực: cải thiện tình trạng suy nhược của cơ thể chống mệt mỏi. Chống trầm cảm. Chống oxy hóa. Tác dụng trên hệ miễn dịch: kháng viêm, giảm đau. Hồi phục máu. Các dược lý khác: tăng cường nội tiết tố, hạ đường huyết, điều hòa hoạt động của tim, bảo vệ gan, ức chế vi khuẩn phát triển,… Ø Về tác động lâm sàng: Các kết quả cho biết các bệnh nhân đều có sự tăng trọng, các chế phẩm đều giúp bệnh nhân ăn ngon, ngủ tốt, tăng cường thể trạng, giảm mệt mỏi, không thể hiện độc tính trong suốt thời gian sử dụng. CHƯƠNG III. CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 3.1. Nuôi cấy mô sẹo (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.1.1. Nguyên liệu: Các mẫu lá và cuống lá. 3.1.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra còn bổ sung: 1.0 mg/l 2,4-D và 0.2 mg/l TDZ. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm. 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.1.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. Dung dịch xà phòng loãng. 3.1.5. Qui trình thực hiện Chọn mẫu. Cắt mẫu lá có kích thước khoảng 1.0*1.0 cm. Cuống lá bổ dọc và cắt đoạn khoảng 1.0 cm. Rửa nhẹ mẫu bằng bông tẩm nước Javel. Rửa sạch sơ bộ mẫu bằng nước. Lắc mẫu trong cồn 700/ 30 giây. Rửa bằng nước cất 4-5 lần. Lắc mẫu trong dung dịch HgCl2 0.1 % có nhỏ vài giọt Tween-20 trong 5 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. Khử trùng dụng cụ. Đặt mẫu vào môi trường Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi. 3.1.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75 - 80 %. Hình 3.1: Mô sẹo Sâm Ngọc Linh 3.2. Tái sinh chồi từ mô sẹo (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.2.1. Nguyên liệu: Các mô sẹo đã hình thành. 3.2.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra còn bổ sung: 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA và 50 g/l sucrose và 5.0 g/l than hoạt tính. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm. 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.2.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel 3.2.5. Qui trình thực hiện Khử trùng dụng cụ. Cắt nhỏ mô sẹo khoảng 0.5*0.5 cm đặt vào môi trường. Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi. 3.2.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Hình 3.2: Chồi Sâm Ngọc Linh 3.3. Nuôi cấy rễ (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.3.1. Nguyên liệu: Sử dụng các mô sẹo đã hình thành. 3.3.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra còn bổ sung: 3.0 mg/l NNA. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5.8. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm. 3.3.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.3.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. 3.3.5. Qui trình thực hiện Khử trùng dụng cụ. Cắt nhỏ mô sẹo khoảng 0.5*0.5 cm đặt vào môi trường. Đậy nắp, bao gói ghi tên môi trường, mẫu cấy, ngày tháng, đem vào phòng nuôi. 3.3.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2500- 3000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh 3.4. Nuôi cấy sinh khối (Dương Tấn Nhựt và cs) 3.4.1. Nguyên liệu: Các mô sẹo đã hình thành 3.4.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra bổ sung 1.0 mg/l 2.4 D và 0.2 mg/l TDZ. 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lắc để nuôi cấy gồm hệ thống bình tam giác 250 – 300 ml, hay các hệ thống nuôi cấy bioreactor, máy lắc, máy lạnh, đèn chiếu sáng. Phòng thu, tách chiết hoạt chất. 3.4.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. 3.4.5. Qui trình thực hiện: Cắt nhỏ các mô sẹo Cho vào môi trường. Đậy nắp chai, bao giấy. Ghi ngày tháng, tên môi trường, giống. Đem đi lắc lỏng (3 tháng). Sau thời gian này ta thấy khối lượng tế bào được nhân lên rất nhiều và có thể đem đi lọc để lấy tế bào nhằm thu sinh khối hay nhân sinh khối. 3.4.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500- 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Thời gian lắc lỏng: 3 tháng. Số vòng: 100 – 120 vòng/ phút. Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor 3.5. Tái sinh cây qua con đường tạo phôi soma (Nguyễn Ngọc Dung) 3.5.1. Nguyên liệu: Các mẫu lá non hay đầu mẫu thân, rễ. 3.5.2. Môi trường: Sử dụng môi trường nền MS. Ngoài ra bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp với từng giai đoạn phát triển. 3.5.3. Thiết bị và dụng cụ: Phòng chuẩn bị môi trường, khử trùng môi trường nuôi cấy, bảo quản dung dịch mẹ. Gồm có nồi hấp môi trường, tủ lạnh, bếp điện, cân phân tích, ống đong, pipet, máy đo pH. Phòng cấy vô trùng gồm tủ cây, đèn UV, các dụng cụ đã hấp vô trùng. Phòng lạnh để nuôi cấy gồm kệ sắt, đèn chiếu sáng, nhiệt kế, máy điều hòa. Các dụng cụ gồm đèn cồn, đĩa, dao cắt mẫu, kéo, bông gòn, chai ống nghiệm vô trùng loại 250 ml, 500 ml, giấy vô trùng, giây thun. 3.5.4. Hóa chất: Cồn 960, 700. Nước cất vô trùng. Dung dịch javel. 3.5.5. Qui trình thực hiện: Xử lý mẫu sơ bộ. Cắt mẫu. Vô trùng mẫu. Đặt mẫu vào môi trường cảm ứng mô sẹo có bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D và 0.2 mg/l TDZ. Chuyển sang môi trường có mặt 2 ppm 2iP và 1.5 ppm NAA. Để phôi tiếp tục phát triển, cấy chuyển qua môi trường chứa 0.2-1 ppm gibberellin và BA. Tạo cây con hoàn chỉnh có rễ trên môi trường có mặt 2 ppm IBA và 0.5 ppm kinetin ở nồng độ thấp. 3.5.6. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 25 ± 20C. Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux. Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ ngày. Độ ẩm: 75- 80 %. Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh 3.6. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất khử trùng: Đối với Sâm Ngọc Linh bộ phận thí nghiệm là đầu (mầm, thân, rễ). Chọn chồi mọc thẳng hay chồi bên làm nguyên liệu nuôi cấy có chiều dài 2-3 cm, cắt bỏ hết lá, xử lý bằng cồn 70 % trong 1 phút ở tủ cấy vô trùng, sau đó tráng lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó xử lý mẫu bằng dung dịch hypoclorid canxi hay HgCl2 sau đó tráng bằng nước cất vô trùng nhiều lần cho sạch hết chất khử trùng. Sau khi khử trùng xong cắt phần đầu có màu xanh, chiều dài 0.4 cm đặt vào môi trường. Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các loại nồng độ khử trùng: Mẫu Số mẫu HgCl2 Sâm Ngọc Linh (Mầm, thân, rễ) 10 0.2% 0.3% 0.4% Thời gian (phút) 5 10 15 20 5 5 15 20 5 100% 100% 100% 20% 40% 40% Chết Chết Chết Mẫu Số mẫu Ca(OCl)2 Sâm Ngọc Linh (mầm, thân, rễ) 10 5% 10% 15% Thời gian (phút) 10 15 20 5 10 15 5 10 100% 100% 100% 40% Chết Chết Chết Chết Ø Kết quả: Sâm Ngọc Linh xử lý bằng HgCl2 với nồng độ 0.2 % trong thời gian 20 phút thì tỷ lệ nhiễm thấp (20%) và tỷ lệ nhiễm không cao (80%). Còn đối với xử lý bằng Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian 5 phút thì tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) và tỷ lệ không nhiễm cao (90%). (Bảng 3.1). 3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái: Sử dụng các mẫu mầm, thân, rễ Sâm Ngọc Linh. Nuôi cấy phối hợp trên các tổ hợp môi trường khác nhau để đánh giá sự phát sinh hình thái. Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái của Sâm Ngọc Linh cấy mô: Đối tượng Bộ phận cấy Hoccmon Kết quả phát sinh hình thái Sâm Ngọc Linh Mầm, thân, rễ IBA IAA NAA K 2ip G 0.2 0.2 Chết 0.5 0.5 Chết 0.5 1 Callus 0.2 0.5 Callus 0.5 0.25 Rễ 0.5 1 1 Phôi soma 0.5 3 0.5 Phôi chồi 8 0.5 Rễ 1 3 Chồi Ø Kết quả: Với tổ hợp hoocmon IBA 0.5 + 2ip 1 thì Sâm Ngọc Linh phát sinh phôi soma. Với tổ hợp hoocmon NAA 1 + G 3 thì phát sinh phôi chồi. Với tổ hợp hoocmon NAA 8 + 2ip 0.5 thì phát sinh rễ. 3.6.3. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo. Đối với mẫu lá, đa số trường hợp thì sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng. Tuy nhiên, một số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt hơn trong điều kiện sáng. Môi trường tốt nhất cho sự tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu lá và cuống lá được dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng. Mẫu được đặt trong hai điều kiện tối hoàn toàn và chiếu sáng (16 giờ/ ngày). Bảng 3.3: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: 2,4-D (mg/l) Bộ phận Phần trăm tạo mô sẹo (%) Chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Tối hoàn toàn 0.5 Lá 20 30 1.0 90 80 2.0 90 90 3.0 80 80 0.5 Cuống lá 100 100 1.0 100 100 2.0 100 100 3.0 100 100 Ø Kết quả: Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo trên các mẫu lá và cuống lá gần như tương đương giữa hai điều kiện chiếu sáng và tối, nhưng lượng mô sẹo trong điều kiện tối ít hơn và chất lượng mô sẹo cũng kém hơn do có hiện tượng thủy tinh thể, nhất là môi trường có 3.0 mg/l 2,4-D. 3.6.4. Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo: Mô sẹo được cắt theo ba kích thước: KT1, KT2, KT3. Mẫu mô sẹo với kích thước xác định được cấy vào môi trường nhân nhanh. Mô sẹo sau quá trình tăng sinh được sử dụng cho quá trình tái sinh chồi và rễ bất định. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo: Chỉ tiêu quan sát KT1 (0.5*0.5) KT2 (0.7*0.7) KT3 (1.0*1.0) Trọng lượng tươi ban đầu (mg) 147 6 267 ± 18 576 ± 24 Sinh khối sau 4 tuần nuôi cấy Kích thước (cm) 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2 Trọng lượng tươi (mg) 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66 Trọng lượng khô (mg) 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 Tỷ lệ chất khô ( %) 8.08 7.19 6.83 Tỷ lệ tăng sinh khối khô 5.46 3.22 2.65 Ø Kết quả: Kích thước mẫu cấy là một yếu tố quan trọng trong nhân giống invitro. Khi khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ nhất (KT1) cho hiệu quả tốt nhất về tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, trong khi đó không có sự khác biệt nhiều về khả năng tăng sinh giữa KT2 và KT3 (Bảng 3.4). Sự tương quan này có thể bắt nguồn từ tương quan giữa kích thước mẫu cấy - khả năng thu nhận dinh dưỡng từ môi trường và do ảnh hưởng của các chất thải nội sinh của mô sẹo trong quá trình nuôi cấy. 3.6.5. Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: Những nghiên cứu đã có trên các đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có sự kết hợp giữa cytokinin và auxin. Mẫu lá và cuống lá sau khi được khử trùng được cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ và các loại auxin 2,4-D, IBA, NAA, với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0 và 3.0 mg/l. Mẫu lá được đặt ngửa trên mặt môi trường và cuống lá cũng được đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên). Bảng 3.5: Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: Auxin Nồng độ auxin ( mg/l) Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Cuống lá Lá 2,4-D 0.5 100 20 1.0 100 90 2.0 100 90 3.0 100 80 IBA 0.5 0 0 1.0 0 0 2.0 0 0 3.0 0 0 NAA 0.5 0 0 1.0 0 0 2.0 0 0 3.0 0 0 Ø Kết quả: Kết quả thu được sau 8 tuần nuôi cấy được ghi nhận trong bảng 3.5. Trong ba loại auxin được bổ sung vào môi trường thì chỉ có 2,4-D có khả năng kích thích lá và cuống lá tạo mô sẹo. Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D, các mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất (Đạt 90 % đối với lá và 100 % đối với cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc chắc và có màu vàng sáng. Ở nồng độ 3.0 mg/l 2,4-D, mô sẹo bắt đầu có hiện tượng thủy tinh thể. Do đó, ở nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên không phù hợp cho sự phát sinh mô sẹo. 3.6.6. Ảnh hưởng của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Các mẩu mô sẹo được tạo từ giai đoạn khởi tạo được cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ và các loại auxin 2,4-D, IBA và NAA với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; 3.0 và 5.0 mg/l trong điều kiện chiếu sang 16 giờ/ ngày. Bảng 3.6: Ảnh hường của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Auxin Nồng độ (mg/l) Trọng lượng tươi ban đầu (mg) Sinh khối sau 4 tuần nuôi cấy Tỷ lệ tăng sinh khối khô Trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg/l) Tỷ lệ chất khô (%) 2,4-D 0.5 203 ± 16 584 ± 34 43.3 ± 2.5 7.42 3.18 1.0 212 ± 14 809± 37 66.2 ± 3.0 8.18 4.56 2.0 204 ± 17 711 ± 32 52.4 ± 2.4 7.37 3.73 3.0 205 ± 9 508 ± 24 36.6 ± 2.2 7.21 2.65 5.0 201 ± 13 493 ± 38 34.6 ± 1.7 7.01 2.50 IBA 0.5 197 ± 18 474 ± 23 45.6 ± 2.2 9.62 3.45 1.0 203 ± 19 532 ± 29 48.6 ± 2.7 9.14 3.56 2.0 207 ± 13 631 ± 32 49.5 ± 2.5 7.84 3.63 3.0 203 ± 15 552± 26 41.1 ± 1.9 7.45 3.10 5.0 209 ± 12 531 ± 23 35.3 ± 1.5 6.66 2.53 NAA 0.5 218 ± 8 485 ± 13 41.2 ± 1.1 8.49 2.81 1.0 212 ± 14 548 ± 21 45.0 ± 1.8 8.22 3.33 2.0 206 ± 15 588 ± 18 46.6 ± 1.4 7.92 3.37 3.0 199 ± 7 602 ± 32 45.7 ± 2.4 7.60 3.38 5.0 205 ± 14 720 ± 48 51.6 ± 3.4 7.20 3.77 Ø Kết quả: Bảng 3.6 cho thấy sau quá trình tăng sinh, mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có 0.5 mg/l IBA có tỷ lệ chất khô cao nhất 9.62 % nhưng tỷ lệ tăng sinh khối khô cao nhất là 4.56 lần lại thu được ở mô sẹo trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 1.0 mg/l. Có thể sự kết hợp giữa auxin và cytokinin đã làm tăng khả năng thu nhận đường và các chất dinh dưỡng khác từ môi trường của mô sẹo và kéo theo sự tăng sinh của mô sẹo, đặc biệt là tăng tỷ lệ chất khô. IBA có thể là auxin kích thích sự thu nhận dinh dưỡng từ môi trường khi kết hợp với TDZ tốt hơn so với NAA và 2,4-D. Kết quả là tỷ lệ chất khô của mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có IBA cao nhất trong ba loại auxin sử dụng. Tuy IBA cho tỷ lệ mô sẹo có tỷ lệ chất khô cao nhất nhưng 2,4-D có tỷ lệ tăng sinh khối khô cao nhất (Gấp 4.56 lần) và có tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18 %). Mặt khác, mô sẹo trên môi trường 2,4-D có hình thái tốt nhất, là dạng mô sẹo có khả năng tái sinh cao. 3.6.7. Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo: Các mô sẹo thu được trong thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo được tách và chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung BA và NAA với các nồng độ trong bảng 3.6. Ø Kết quả: Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy sự hình thành chồi và quá trình này thường được kích thích khi bổ sung auxin với nồng độ thấp. Trong thử nghiệm, khi sử dụng BA kết hợp với NAA kết quả nhận thấy các tổ hợp NAA và BA khác nhau, sự kết hợp giữa 1.0 mg/l BA và 1.0 mg/l NAA cho số chồi đạt cao nhất là 6.3 chồi/ mẫu và trọng lượng trung bình là 0.185 g (Bảng 3.7). Bảng 3.7: Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung BA và NAA: BA (mg/l) NAA (mg/l) Số lượng chồi/ mẫu Trọng lượng chồi (g) 0.5 0.5 5.0 0.106 1.0 6.1 0.141 1.5 4.6 0.193 2.0 3.3 0.197 2.5 3.0 0.094 1.0 0.5 5.5 0.163 1.0 6.3 0.185 1.5 5.9 0.158 2.0 3.9 0.148 2.5 3.7 0.157 2.0 0.5 4.2 0.152 1.0 5.5 0.141 1.5 2.9 0.144 2.0 2.8 0.112 2.5 2.7 0.108 4.0 0.5 3.3 0.154 1.0 3.0 0.122 1.5 2.6 0.122 2.0 0.8 0.108 2.5 0 0 3.6.8. Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: Những chồi tốt nhất sau khi thu nhận được thì được tách và chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung 1.0 g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, 0.5 mg/l NAA và BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l). Bảng 3.8: Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: BA (mg/l) Trọng lượng tươi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.5 0.61 5.66 3.0 1.0 0.87 6.16 3.3 2.0 0.72 4.11 4.0 4.0 0.71 4.33 3.9 Ø Kết quả: Trong các nồng độ BA đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l BA kết hợp với 0.5 mg/l NAA cho kết quả tăng trưởng chồi chốt nhất với trọng lượng tươi của chồi là 0.87 g và chiều cao chồi là 6.16 cm (Bảng 3.8). Vậy môi trường nuôi cấy có bổ sung 1.0 mg/l BA và 0.5 mg/l tốt nhất cho quá trình tăng trưởng chồi. 3.6.9. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tăng trưởng chồi: Những chồi tốt nhất trong thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 và đường với các nồng độ đường là 10; 20; 30; 40; 50; 60 g/l. Ø Kết quả: Qua các kết quả thử nghiệm cho thấy sucrose là carbohydrate hào tan chiếm ưu thế và nồng độ thường dùng nằm trong khoảng 30 - 120 g/l sucrose. Nghiên cứu ảnh hưởng của sucrose lên sự tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực lên sự sinh trưởng chồi. Sự gia tăng nồng độ sucrose trong môi trường không những kích thích sinh trưởng chồi Sâm Ngọc Linh mà còn có tác dụng mạnh đến sự biến đổi khối lượng của chúng. Nồng độ 50 g/l sucrose cho kết quả tốt nhất về trọng lượng, chiều cao và số lượng lá (Bảng 3.9). Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tăng trưởng chồi: Sucrose (g/l) Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 10 0.49 4.4 2.2 20 0.55 5.4 2.5 30 0.68 5.7 2.6 40 1.06 5.8 3.2 50 1.46 6.1 3.5 60 1.28 6.1 3.2 3.6.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro: Những chồi tốt nhất trong thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 với các nồng độ than hoạt tính lần lượt là 1.0; 2.0; 3.0 và 4.0 g /l. Bảng 3.10: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro: Than hoạt tính (g/l) Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0 0.53 3.3 3.6 1.0 0.61 4.6 3.7 2.0 1.01 5.3 3.3 3.0 0.97 6.8 2.7 4.0 0.94 8.5 3.1 Ø Kết quả: Than hoạt tính không phải là một chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, nhưng nó có khả năng thay đổi thành phần môi trường. Than hoạt tính điều chỉnh pH môi trường, hấp thụ các chất làm cản trở sự phát triển của mô. Kết quả thu được cho thấy khi nồng độ than hoạt tính tăng thì có sự thay đổi rõ rệt về trọng lượng cũng như chiều cao của chồi, nhưng số lượng lá không có sự thay đổi đáng kể. Trọng lượng chồi đạt cao nhất trên môi trường chứa 2.0 g/l than hoạt tính là khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10). Vậy nồng độ 2.0 g/l than hoạt tính là phù hợp nhất cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm Ngọc Linh. 3.6.11. Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo: Mô sẹo được cấy vào môi trường ra rễ có chứa các auxin (NAA, IBA, IAA) ở các nồng độ lần lượt là 1.0; 3.0; 5.0; 7.0 mg/l. Bảng 3.11: Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo: Auxin Nồng độ ( mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số lượng rễ / mẫu Tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu (%) Chiều dài tối đa của rễ (mm) NAA 1.0 30 3.0 ± 0.3 5.98 18 3.0 100 8.7 ± 0.1 21.88 13 5.0 70 2.6 ± 0.1 6.23 9 7.0 50 2.1 ± 0.1 12.21 8 IAA 1.0 0 3.0 0 5.0 10 0.2 ± 0.2 7.0 0 IBA 1.0 70 1.6 ± 0.1 7.83 16 3.0 80 4.0 ± 0.3 5.21 21 5.0 100 4.8 ± 0.3 15.81 18 7.0 60 3.5 ± 0.1 8.06 1.7 Ø Kết quả: Quá trình khảo sát ảnh hưởng của ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA không thích hợp cho quá trình ra rễ Sâm Ngọc Linh từ mô sẹo vì auxin này hầu như không kích thích mô sẹo ra rễ bất định. NAA và IBA thì ngược lại. Nồng độ 3.0 mg/l NAA cho kết quả tố nhất với tỷ lệ ra rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn nhất (8.7 rễ/ mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn nhất (21.88 %), chiều dài tối đa của rễ là 13 mm (Bảng 3.11). IBA ở nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ ra rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu 4.8 mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % và chiều dài tối đa của rễ là 18 mm. Kết quả này có thể được giải thích do auxin tổng hợp có hoạt tính cao hơn dạng tự nhiên. Vậy hai môi trường kích thích ra rễ tốt là môi trường Ms ½ bổ sung 3.0 mg/l NAA và môi trường MS ½ bổ sung 5 mg/l IBA. 3.6.12. Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ bất định: Rễ bất định sau khi được tạo ra ở các thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường nhân rễ có bổ sung các auxin NAA, IBA ở các nồng độ lần lượt là 1.0; 3.0; 5.0 mg/l. Ø Kết quả: Từ kết quả ở bảng 3.12 và bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả nhân rễ. Mẫu rễ trong bảng 3.12 có khả năng nhân rễ tốt hơn, cả 6 nghiệm thức đều ra rễ, tỷ lệ ra rễ cao nhất là 60 %, số rễ thứ cấp cao nhất là 9 rễ/ mẫu. Mẫu rễ trong bảng 3.13 có tỷ lệ ra rễ cao nhất là 40 %, số rễ thứ cấp cao nhất là 3 rễ/ mẫu, có 3 trên 6 nghiệm thức ra rễ nhưng những mẫu này lại được cấy trên môi trường chứa NAA. Khi xét đến ảnh hưởng của loại auxin, ta thấy rằng NAA phù hợp hơn với quá trình nhân rễ bất định của Sâm Ngọc Linh. Ở nồng độ 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt nhất (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều nhất (9 rễ/ mẫu) và mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình là 390 ± 20 mg/l, tăng 3.5 lần so với ban đầu). Hơn nữa, có tới 5/6 nghiệm thức bổ sung NAA cho kết quả ra rễ so với IBA chỉ có 4/6 nghiệm thức. Vậy giữa IBA và NAA, NAA ở nồng độ 3.0 mg/l phù hợp cho việc khơi tạo rễ từ mô sẹo và NAA ở nồng độ 5.0 mg/l phù hợp hơn cho quá trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh. Bảng 3.12: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA: NAA (mg/l) IBA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ thứ cấp Trọng lượng tươi trung bình (mg/l) 1 - 20 1 140 ± 10 3 - 30 4 290 ± 10 5 - 60 9 390 ± 20 - 1 10 1 450 ± 50 - 3 20 2 330 ± 20 - 5 30 1 280 ± 30 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA: NAA (mg/l) IBA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số rễ thứ cấp Trọng lượng tươi trung bình (mg/l) 1 - 40 3 350 ± 10 3 - 20 1 180 ± 30 5 - 0 0 - 1 10 1 270 ± 10 - 3 0 0 - 5 0 0 CHƯƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Sâm Ngọc Linh được công nhận là một trong những cây Sâm có hàm lượng saponin cao và với số lượng nhiều nhất, so với các loài Panax khác trên thế giới. Do đó việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn trong việc bảo tồn nguồn dược liệu quý giá. Quá trình khảo sát ảnh hưởng của loại và nồng độ auxin lên khả năng tạo mô sẹo ban đầu của lá và cuống lá cho thấy nồng độ 3.0 mg/l 2.4-D trở lên không phù hợp cho sự phát sinh mô sẹo từ lá Sâm Ngọc Linh. Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường ½ MS bổ sung 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA, 50 g/l sucrose. Đối với quá trình ra rễ từ mô sẹo, các mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung 3.0 mg/l NAA cho tỷ lệt ra rễ cao nhất, số lượng rễ nhiều nhất và tỷ lệ trọng lượng tươi của rễ/ mẫu cao nhất. Môi trường ½ MS có bổ sung 5.0 mg/l NAA kích thích sự nhân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ ra rễ cao nhất và rễ phân nhánh nhiều nhất. 4.2. Kiến nghị: Được thế giới ghi nhận là loài Sâm quý hiếm bậc nhất, nhưng đến nay Sâm Ngọc Linh vẫn chưa được biết đến nhiều như các loài Sâm Hàn Quốc hay Sâm Triều Tiên. Việc nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu của các loài Sâm trên thế giới đã được nhiều tác giả tiến hành trong nhiều năm, và tại Việt Nam cũng đã khẳng định tính hiện thực của khả năng tạo nguồn Sâm bằng con đường nuôi cấy mô tế bào. Nhưng cần nhiều hơn các nghiên cứu đối với loài Sâm Ngọc Linh của Việt Nam để Việt Nam có thể chủ động nguồn nguyên dược liệu quý, đồng thời đưa thương hiệu Sâm Việt Nam mang tầm quốc tế. Là một loài Sâm đặc hữu được tìm thấy với số lượng ít và phạm vi phân bố hẹp, rất nhạy cảm với môi trường sống, nguồn cung cấp còn hạn chế, thời gian từ lúc trồng từ hạt cho đến khi thu được củ lên đến 5-6 năm. Do đó, nguồn Sâm Ngọc Linh đang cạn kiệt dần và nguy cơ tuyệt chủng cao, nên cần có nhiều biện pháp cấp bách để bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quốc gia.