Khóa luận Đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai PB260 x RO44/268 bằng kỹ thuật RAPD

, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có quy trình thực hiện khó nhƣng kết quả có độ tin cậy không cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.2.3.3 Kỹ thuật STS (Sequence - Tagged Sites) Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, STS là đoạn ngắn DNA giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di (Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật này có nhƣợc điểm là phải biết trình tự gen của đối tƣợng nghiên cứu. 2.2.3.4 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) Nguyên lý của kỹ thuật này là giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides đƣợc lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là phải biết đƣợc những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu đƣợc dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền (Nguyễn Thị Lang, 2002). 2.2.3.5 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos phát minh năm 1993, sau đó đƣợc Vos và ctv (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt giới hạn từ bộ gen của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002). 14 2.2.3.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) RAPD là đoạn trình tự DNA ngắn, do sự tổng hợp một cách ngẫu nhiên, giúp phân tích bộ gen thông qua kỹ thuật phân tích di truyền phân tử là PCR. Kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999; Nguyễn Thị Lang, 2002). Kỹ thuật RAPD cho phép tiến hành nghiên cứu di truyền phân tử mà không cần biết trƣớc về trình tự của chuỗi mã di truyền cần nghiên cứu. Một số ƣu điểm khác của kỹ thuật RAPD là: cho kết qua nhanh,thời gian để thực hiện phản ứng RAPD chỉ khoảng 14 giờ, cần một số lƣợng DNA mẫu rất nhỏ (25 ng), Kỹ thuật RAPD có thể dùng để nghiên cứu những trình tự có kích thƣớc nhỏ (10 kb). Tuy nhiên kỹ thuật RAPD lại có nhƣợc điểm là độ chính xác không cao. 2.2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR do Kary Mullis và ctv phát minh năm 1990 đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phƣơng pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000) Kỹ thuật PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, 15 tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát hiện mầm bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000) Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000). Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2000). Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ hình 2.1. 16 Hình 2.1: Mô tả phản ứng PCR. - Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút. 17 - Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây. - Bƣớc 3 (kéo dài, elongation hay extension): dƣới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ phù hợp cho enzyme polymerase hoạt động là 72 C và thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tuỳ thuộc vào kích thƣớc của DNA cần khuếch đại và nồng độ Mg2+. Trong phản ứng PCR, một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 1012 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm). Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR bao gồm: – DNA khuôn: DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA đƣợc dùng trong phản ứng PCR là một lƣợng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lƣợng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không nhƣ mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể đƣợc thu nhận từ các mẫu không đƣợc bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần – Enzyme: Thông thƣờng, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay là Taq DNA 18 polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã đƣợc phát hiện và đƣa ra thị trƣờng với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn nhƣ enzyme Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động nhƣ một enzyme phiên mã ngƣợc thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khuôn và ion Mn2+, nhƣng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. – Primer và nhiệt độ lai: Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: + Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngƣợc, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer. + Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngƣợc không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần. + Các primer phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. + Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc quá lớn, phản ứng PCR tối ƣu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. – Các thành phần khác trong phản ứng PCR: + Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. 19 + Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ƣu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thƣờng nồng độ tối ƣu này phải đƣợc xác định riêng cho từng phản ứng. – Số lƣợng chu kỳ phản ứng: Số lƣợng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thƣờng không vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân nhƣ sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu. – Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR: Thiết bị cho phản ứng PCR nhƣ máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nƣớc trong quá trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2000). 2.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RAPD TRONG NGHIÊN CỨU CÂY CAO SU Marker phân tử dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đã đƣợc sử dụng rộng rãi trên cây cao su gồm có RAPD (Varghese và ctv, 1997; Venkatachalam và ctv, 2002), AFLP (Safiah, 2004) và microsatellites (Seguin và ctv, 2001; Lekawipat và ctv, 2003). Trong đó khả năng nhận dạng di truyền của microsatellites là mạnh nhất (Seguin và ctv, 2001). Tuy nhiên, chi phí cho phân tích microsatellites hiện nay còn khá đắt nên trong giai đoạn đầu nghiên cứu, ngƣời ta thƣờng sử dụng RAPD trong phân tích đa dạng di truyền và việc sử dụng nhiều primer đƣợc khuyến khích để tăng độ tin cậy khi phân tích RAPD. Do tính chất đồng trội nên các marker phân tử có thể sử dụng để kiểm tra phả hệ của con lai và thiết lập bản đồ gen cây cao su (Seguin và ctv, 2001). Bên cạnh đó, các marker phân tử còn là công cụ hỗ trợ thiết yếu trong việc phân tích QTL cho một số tính trạng nông sinh học trên cây cao su nhƣ: tính trạng kháng bệnh SALB 20 do nấm Microcyclus ulei (Lespinasse và ctv, 2000), tính trạng kháng bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Sumarmadji and Darmono, 2004), tính trạng kháng bệnh rụng lá do nấm Phytophthora và tính trạng thấp cây (Venkatachalam và ctv, 2001 và 2004). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) là các đoạn DNA đƣợc khuyếch đại bằng kỹ thuật PCR nhờ sử dụng các mồi (primer) ngẫu nhiên (Williams và ctv, 1990). Các giống của cùng một loài, nếu có kiểu gen hoàn toàn giống nhau sẽ đƣợc khuếch đại những đoạn DNA có kích thƣớc giống nhau khi sử dụng bất kỳ mồi ngẫu nhiên nào để chạy PCR. Ngƣợc lại, nếu có sự khác nhau về kiểu gen thì các đoạn DNA đƣợc khuếch đại sẽ cho kích thƣớc hoàn toàn khác nhau thể hiện trên các băng DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose. Marker RAPD có thể sử dụng rất hiệu quả trong nhận dạng di truyền cây cao su (Varghese và ctv, 1997; Venkatachalam và ctv, 2002) Năm 2001, Venkatachalam và ctv đã sử dụng thành công marker RAPD trong việc nhận dạng tính trạng lùn cây ở các con lai của RRII118 với các dòng vô tính mang tính trạng lùn tự nhiên (Venkatachalam và ctv, 2001). Năm 2005, An Zewei và ctv đã sử dụng marker RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền và nhận dạng 34 dòng vô tính cao su tại Trung Quốc (An Zewei và ctv, 2005). Năm 2006, Lại Văn Lâm và công sự cũng đã sử dụng marker RAPD để nghiên cứu đa dạng di truyền của 69 kiểu di truyền cao su trong quỹ gen tại Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam (Lại Văn Lâm và ctv, 2006). Viện Nghiên Cứu Cao su Indonesia (IRRI) cũng đang tiến hành thử nghiệm một số marker RAPD cho tính trạng kháng bệnh rụng lá Corynespora, đƣợc qui định bởi sự tƣơng tác át chế giữa 2 gen lặn (Sumarmadji và Darmono, 2004). Ngoài ra, các marker phân tử còn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu sự biểu hiện gen và chức năng của bộ gen cây cao su. 21 22 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1.1 Vật liệu di truyền DNA của 20 con lai giữa nguồn di truyền Wickham truyền thống và Amazon hoang dại (PB260 x RO44/268) trên vƣờn TNLK 04 đã đƣợc đánh giá phân nhóm thành tích sinh trƣởng (vanh thân) và sản lƣợng tuyển non năm 2006 (sau 28 tháng tuổi) theo bảng phân cấp của Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam. (Bảng 4.7). 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm 3.1.2.1 Hoá chất ly trích DNA RNase (Invitrogen). Ethanol 70% và Ethanol 90% (Invitrogen). Sodium Acetate 3M (Invitrogen). TE 1X (Tris-HCl 1M + EDTA 0,5M). DNA extraction buffer. Phenol:chloroform:isoamyl ancohol (25:24:1) (Invitrogen). Isopropanol lạnh (Invitrogen). 3.1.2.2 Hóa chất sử dụng trong kỹ thuật RAPD 10X PCR buffer (Invitrogen). 50mM MgCl (Invitrogen). 10mM dNTP’s (Invitrogen). 23 9μM Primer (A18 và OPB12) (Invitrogen). Agarose (Invitrogen). TAE 0,5X (20mM Tris-HCl, 10mM Acetate, 1mM EDTA) (Invitrogen). Loading dye 6X (Promega). Ethidium bromide (Invitrogen). 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm Chày và cối nghiền mẫu. (Đức) Cân điện tử. Eppendorf các loại. Pipette các loại. Đầu típ các loại. Máy ly tâm lạnh. Tủ sấy. Tủ ủ mẫu. Tủ lạnh sâu. Tủ hút khí độc. Tủ cấy vô trùng. Máy điện di nằm. Máy vortex. Nồi hấp khử trùng. Máy đo mật độ quang. Máy khuếch đại DNA. Máy chụp ảnh kỹ thuật số. 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 7/2007. 3.2.2 Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam, xã Lai Hƣng, huyện Bến Cát, tỉnh Bình Dƣơng. 24 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phƣơng pháp lấy mẫu và ly trích DNA - DNA của các con lai đƣợc tách chiết từ mẫu lá tƣơi (lá còn non, ở giai đoạn có màu xanh nhạt). Các mẫu lá đƣợc lấy trên vƣờn TNLK 04, ghi chú cẩn thận tên giống, ngày lấy mẫu và đƣợc lƣu giữ trong điều kiện lạnh. Quy trình tách chiết DNA tổng số từ lá tƣơi cây cao su dựa trên phƣơng pháp CTAB của Doyle và Doyle (1987) đã đƣợc Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam sửa đổi cho phù hợp với cây cao su đƣợc trồng trong điều kiện ở Việt Nam. 3.3.2 Phƣơng pháp kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA mẫu Sau khi ly trích DNA các con lai, tiến hành định tính và định lƣợng DNA mẫu để đánh giá hàm lƣợng cũng nhƣ độ tinh sạch của DNA mẫu nhằm đảm bảo cho việc thực hiện thành công phản ứng PCR. - Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose: nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm nên dƣới tác động của dòng điện một chiều, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Bên cạnh đó, tính linh động của phân tử còn phụ thuộc vào khối lƣợng phân tử và nồng độ chất cấu thành gel. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hoá chất có tên là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Mặt khác, để ƣớc lƣợng khối lƣợng phân tử nucleic acid trong gel agarose, ngƣời ta sử dụng Molecular Weight Ladder (MWL), là một tập hợp các trình tự DNA có khích thƣớc đã biết nên còn gọi là thang DNA (DNA Ladder). - Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang: phƣơng pháp này không thật chính xác nhƣng cho phép ƣớc lƣợng tƣơng đối nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi đã ly trích. Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: optical density) ở bƣớc sóng 260 nm cho phép xác định 25 nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tƣơng quan: một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 g/ml cho dung dịch DNA sợi đôi, 40 g/ml cho dung dịch DNA sợi đơn. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid có độ tinh sạch cao. Vì vậy, để kiểm tra độ tinh sạch ngƣời ta đo thêm giá trị OD ở bƣớc sóng 280 nm. Ở bƣớc sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất. Tuy nhiên, các protein cũng sẽ hấp thụ một phần ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các nucleic acid và do đó sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid. Thông thƣờng, một dung dịch nucleic acid đƣợc xem là sạch (không tạp nhiễm nhiều protein) khi tỷ số OD260nm/OD280nm = 1,7 – 2,0. Khi đó ta cũng có thể tính nồng độ nucleic acid trong mẫu bằng công thức: DNA (ng/µl) = [(62,9*OD260) – (36,0*OD280) ]* độ pha loãng. 3.3.3 Phƣơng pháp khuếch đại DNA DNA của các con lai và bố mẹ chúng sau khi đƣợc ly trích và kiểm ta độ tinh sạch sẽ đƣợc khuếch đại bằng máy khuếch đại DNA theo tỷ lệ, nồng độ các hóa chất và chu trình nhiệt của Venkatachalam và ctv (2001) Đã đƣợc Bộ Môn Giống - Viện Nghiên Cứu Cao su Việt Nam sửa đổi. 3.3.4 Phƣơng pháp điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại DNA các con lai sau khi đƣợc khuếch đại sẽ đƣợc điện di trên gel agarose bằng máy điện di nằm. Các băng DNA xuất hiện sau khi điện di sẽ đƣợc chụp lại bằng máy chụp gel, các băng DNA sẽ đƣợc ghi nhận, mã hóa sang hệ nhị phân (có mặt hay không có mặt băng DNA) và đƣợc phân tích đánh giá bằng các phần mềm chuyên dụng. 3.3.5 Phƣơng pháp phân tích kết quả Kết quả phân tích RAPD của các kiểu di truyền đƣợc chuyển đổi sang cơ sở dữ liệu dạng nhị phân (1 hoặc 0 tƣơng ứng với sự có mặt hoặc không có mặt đoạn DNA đƣợc khuếch đại). Các số liệu đƣợc phân tích bằng phần mêm NTSYSpc 2.1 (Numerical Taxonomy System). Biểu đồ ƣớc lƣợng khoảng cách di truyền và phân 26 nhóm di truyền đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp phân nhóm đa biến (Cluster analysis) dựa trên khoảng cách di truyền của Nei (1972) (Nei and Li, 1972) theo phƣơng pháp UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean). Chƣơng 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 LY TRÍCH DNA Nhằm xem xét đánh giá hàm lƣợng cũng nhƣ độ tinh sạch của DNA mẫu, sau khi ly trích, các mẫu DNA đƣợc kiểm tra định tính và định lƣợng để đảm bảo cho việc thực hiện thành công phản ứng PCR. Nhìn chung, các mẫu DNA ly trích đều có độ tinh sạch tƣơng đối cao, đạt yêu cầu cho việc khuếch đại bằng phƣơng pháp RAPD. 4.1.1 Định tính DNA mẫu bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA trên gel agarose 1% cho thấy phần lớn các mẫu DNA ly trích đều có lƣợng DNA tổng số cao. Điều này đƣợc thể hiện qua hình ảnh so sánh những vạch sáng DNA giữa DNA chuẩn (nồng độ 50 µg/µl) và DNA ly trích từ các con lai xuất hiện trên gel sau khi điện di (Hình 4.1). Hình 4.1: Định tính DNA tổng số sau khi ly trích bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. M 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 229 27 4.1.2 Định lƣợng DNA mẫu bằng phƣơng pháp đo mật độ quang (Optical Density) Các mẫu DNA sau khi ly trích đƣợc pha loãng trong dịch pha loãng DNA (TE) với hệ số pha loãng là 101. Kết quả kiểm tra hàm lƣợng DNA của bố mẹ và các con lai cho thấy các mẫu DNA ly trích có độ tinh sạch tƣơng đối cao, đảm bảo cho việc phân tích RAPD bằng kỹ thuật PCR với giá trị OD260/OD280 biến thiên từ 1,52 đến 1,81 (ngoại trừ một mẫu có giá trị OD = 1,43), giá trị OD260/OD280 trung bình là 1,71. Nồng độ DNA của các mẫu dao động từ 255,7 ng/µl (ở con lai LH03/0222) đến 3.546,85 ng/µl (ở con lai LH03/0752). 4.2 KHUẾCH ĐẠI DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD Xác định nồng độ các hóa chất, chu trình nhiệt, tỷ lệ tối ƣu giữa primer và DNA mẫu là một trong những yếu tố quyết định sự thành công cho một phản ứng PCR. Nếu tỷ lệ primer/DNA mẫu quá cao sẽ dẫn đến hiện tƣợng các primer tự bắt cặp với nhau tạo ra những băng không mong muốn ở kết quả điện di, nếu tỷ lệ này quá thấp thì sản phẩm PCR tạo ra sẽ không nhiều. Bên cạnh đó, hiện tƣợng bắt cặp (annealing) giả sẽ xuất hiện nếu dƣ thừa lƣợng Mg2+ hoặc Taq DNA polymerase quá dƣ thừa. Số chu kỳ và chế độ nhiệt cho một phản ứng PCR là rất quan trọng. Nhìn chung, số chu kỳ tùy thuộc vào phƣơng pháp và đối tƣợng nghiên cứu. Nếu thêm nhiều chu kỳ thì phản ứng PCR sẽ kéo dài và sản phẩm thu nhận đƣợc sẽ dễ bị lẫn tạp, không rõ ràng. Ngƣợc lại, nếu quá ít chu kỳ thì sản phẩm DNA đƣợc khuếch đại sẽ không nhiều. Bên cạnh đó, tùy thuộc vào cấu trúc mã di truyền của primer sử dụng mà xây dựng chu trình nhiệt phù hợp. Ở đây, chúng tôi sử dụng nồng độ các hóa chất, chu trình nhiệt và số chu kỳ cho phản ứng RAPD theo quy trình đƣợc thiết lập bởi Venkatachalam và ctv (2001) đƣợc Bộ Môn Giống - Viện Nghiên Cứu Cao su Việt Nam sửa đổi, đã cho kết quả rất tốt ngay trong lần chạy PCR đầu tiên (Bảng 4.1 và 4.2). 28 Bảng 4.1: Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD. Thành phần hóa chất Thể tích ( l) cho 1 mẫu Nƣớc cất 18,7 10X PCR buffer 2,5 50 mM MgCl2 1,0 10 mM dNTP’s 0,5 5 U Taq DNA polymerase 0,3 9 M Primer 1,0 DNA mẫu 1,0 Tổng 25,0 X: số lần pha loãng Bảng 4.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD Bƣớc Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ 1 Biến tính 940C 1 phút 35 2 Bắt cặp 300C 1 phút 3 Kéo dài 720C 2 phút 4 Giữ mẫu 40C 4.3 ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE Tạo gel agarose với nồng độ 1%, sau khi gel nguội và khô cứng, đặt gel vào bể máy điện di có chứa dung dịch TAE 0,5X sao cho gel ngập trong TAE khoảng 1 - 1,5 cm. Trộn 8 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên giấy parafin và cho vào các giếng trên gel. Sử dụng thang DNA 100 bp chuẩn có kích thƣớc 1,5 Kbp. Vận hành máy điện di ở hiệu điện thế 54V trong khoảng 1,5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau khi điện di, nhuộm gel bằng ethidium bromide (nồng độ 0,5 g/ml) trong 30 phút (đặt trong tối). Rửa sạch gel bằng nƣớc và chụp ảnh gel dƣới ánh sáng tử ngoại. Hình ảnh các băng DNA sau khi nhuộm đƣợc thể hiện ở hình 4.2-A,B,C. 29 Hình 4.2-A: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại bằng primer A18. M là DNA thang chuẩn 1.5 Kbp. Hình 4.2-B: Băng DNA của các con lai đƣợc khuếch đại với primer OPB12 M L H 0 3 /0 6 9 5 L H 0 3 /0 1 1 5 L H 0 3 /0 1 8 1 L H 0 3 /0 1 1 4 L H 0 3 /0 3 3 8 L H 0 3 /0 7 5 2 L H 0 3 /0 5 4 9 L H 0 3 /0 3 7 0 L H 0 3 /0 1 1 3 L H 0 3 /0 7 2 3 L H 0 3 /0 3 7 1 L H 0 3 /0 1 7 9 L H 0 3 /0 2 2 5 L H 0 3 /0 5 4 8 L H 0 3 /0 2 2 6 L H 0 3 /0 5 1 5 L H 0 3 /0 4 4 6 L H 0 3 /0 2 2 2 L H 0 3 /0 5 3 1 L H 0 3 /0 5 1 4 M Băng 1000 bp Băng 700 bp M L H 0 3 /0 6 9 5 L H 0 3 /0 1 1 5 L H 0 3 /0 1 8 1 L H 0 3 /0 1 1 4 L H 0 3 /0 3 3 8 L H 0 3 /0 7 5 2 L H 0 3 /0 5 4 9 L H 0 3 /0 3 7 0 L H 0 3 /0 3 6 9 L H 0 3 /0 1 1 3 L H 0 3 /0 7 2 3 L H 0 3 /0 3 7 1 L H 0 3 /0 1 7 9 L H 0 3 /0 2 2 5 L H 0 3 /0 5 4 8 L H 0 3 /0 2 2 6 L H 0 3 /0 5 1 5 L H 0 3 /0 4 4 6 L H 0 3 /0 2 2 2 L H 0 3 /0 5 3 1 M Băng 600 bp Band 1700 bp Băng 300 bp Băng 900 bp Băng đồng hình Băng đa hình Băng đồng hình Băng đa hình 30 Hình 4.2-C: Băng DNA của các con lai còn lại đƣợc khuếch đại với cả 2 primer 4.4 ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA HÌNH CỦA CÁC PRIMER Kết quả điện di sản phẩm DNA sau khi khuếch đại cho thấy primer A18 và OPB12 đều cho kết quả tốt, điều này đƣợc thể hiện qua tổng số băng khuếch đại và số băng đa hình đƣợc phát hiện. Primer A18 khuếch đại đƣợc 12 băng, trong đó có 10 băng đa hình (chiếm 83,33%), primer OPB12 khuếch đại đƣợc 12 băng trong đó có 11 băng đa hình (chiếm 91,67%) (Bảng 4.3). Bảng 4.3: Số băng DNA đƣợc khuếch đại ở các primer. Primer Trình tự mã di truyền Số băng đồng hình Số băng đa hình Tổng số băng A18 5' AGGTGACCGT 3' 2 10 12 OPB12 5' CCTTGACGCA 3' 1 11 12 4.5 ĐÁNH GIÁ BIẾN LƢỢNG DI TRUYỀN CỦA CÁC CON LAI Kết quả phân tích RAPD cho thấy số băng DNA đƣợc phát hiện ở các con lai dao động từ 11 băng (LH03/0338) đến 22 băng (LH03/0514) trên tổng số 24 kiểu băng đƣợc khuếch đại bởi cả hai primer (Bảng 4.4). Kết quả này đã phần nào thể hiện nguồn biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 là khá rộng, khá đa dạng và phong phú. M L H 0 3 /0 2 2 8 L H 0 3 /0 2 2 7 P B 2 6 0 R O 4 4 /2 6 8 L H 0 3 /0 5 1 4 L H 0 3 /0 2 2 8 L H 0 3 /0 2 2 7 P B 2 6 0 R O 4 4 /2 6 8 M Băng đồng hình Băng đa hình Băng đồng hình Băng đa hình 31 Bảng 4.4: Số băng DNA đƣợc khuếch đại của các con lai nghiên cứu. Ký hiệu Con lai Số băng phát hiện bằng primer A18 Số băng phát hiện bằng primer OPB12 Tổng số băng phát hiện 149 LH03/0115 6 8 14 150 LH03/0181 7 8 15 151 LH03/0114 8 7 15 152 LH03/0338 6 5 11 153 LH03/0752 8 6 14 155 LH03/0370 6 6 12 158 LH03/0723 10 9 19 159 LH03/0371 9 10 19 160 LH03/0179 9 7 16 161 LH03/0225 10 10 20 162 LH03/0548 10 9 19 163 LH03/0226 9 9 18 164 LH03/0515 10 10 20 165 LH03/0446 11 7 18 166 LH03/0222 10 9 19 167 LH03/0531 10 8 18 168 LH03/0514 11 11 22 169 LH03/0228 11 9 20 170 LH03/0227 11 10 21 171 PB260 10 10 20 229 RO44/268 9 8 17 Kết quả phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền dựa trên chỉ số DICE của 20 con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 có giá trị từ 0,522 đến 0,976. Trong đó, hệ số tƣơng đồng di truyền giữa hai con lai LH03/0227 và LH03/0228 là lớn nhất, giữa LH03/0338 và LH03/0370 là nhỏ nhất (Bảng 4.5). Giá trị này cũng có nghĩa là khoảng cách di truyền giữa các con lai trong quần thể biến thiên từ 0,024 đến 0,478. Mặc dù là thế hệ con lai của cùng một tổ hợp nhƣng quần thể con lai này có biến lƣợng di truyền khá rộng, phong phú về mặt di truyền. Có những cá thể rất giống nhau về mặt di truyền (thể hiện qua hệ số tƣơng đồng giữa chúng cao), cũng có những cá thể rất khác biệt nhau (thể hiện qua hệ số tƣơng đồng thấp) mặc dù mới chỉ đƣợc phân tích bằng 2 primer. Nhƣ vậy nếu sử dụng nhiều primer hơn có thể sẽ phát hiện đƣợc nhiều biến dị di truyền hơn nữa trong quần thể con lai. 32 Bảng 4.5: Hệ số tƣơng đồng di truyền của các con lai nghiên cứu. C O N L A I L H 0 3 /0 6 9 5 L H 0 3 /0 1 1 5 L H 0 3 /0 1 8 1 L H 0 3 /0 1 1 4 L H 0 3 /0 3 3 8 L H 0 3 /0 7 5 2 L H 0 3 /0 3 7 0 L H 0 3 /0 7 2 3 L H 0 3 /0 3 7 1 L H 0 3 /0 1 7 9 L H 0 3 /0 2 2 5 L H 0 3 /0 5 4 8 L H 0 3 /0 2 2 6 L H 0 3 /0 5 1 5 L H 0 3 /0 4 4 6 L H 0 3 /0 2 2 2 L H 0 3 /0 5 3 1 L H 0 3 /0 5 1 4 L H 0 3 /0 2 2 8 L H 0 3 /0 2 2 7 LH03/0695 0.667 0.720 0.720 0.667 0.667 0.727 0.552 0.621 0.615 0.600 0.621 0.571 0.533 0.571 0.552 0.571 0.563 0.533 0.581 LH03/0115 0.667 0.828 0.690 0.640 0.714 0.692 0.727 0.727 0.667 0.765 0.727 0.688 0.706 0.750 0.727 0.688 0.778 0.765 0.743 LH03/0181 0.720 0.828 0.733 0.769 0.828 0.667 0.765 0.765 0.710 0.800 0.765 0.667 0.743 0.788 0.765 0.727 0.811 0.800 0.778 LH03/0114 0.720 0.690 0.733 0.769 0.828 0.741 0.706 0.824 0.774 0.743 0.765 0.667 0.629 0.788 0.706 0.667 0.757 0.743 0.722 LH03/0338 0.667 0.640 0.769 0.769 0.880 0.522 0.600 0.667 0.593 0.645 0.600 0.621 0.581 0.621 0.667 0.621 0.606 0.581 0.563 LH03/0752 0.667 0.714 0.828 0.828 0.880 0.692 0.727 0.727 0.667 0.765 0.727 0.688 0.706 0.750 0.788 0.750 0.722 0.706 0.686 LH03/0370 0.727 0.692 0.667 0.741 0.522 0.692 0.581 0.645 0.714 0.625 0.774 0.667 0.625 0.733 0.645 0.733 0.647 0.688 0.727 LH03/0723 0.552 0.727 0.765 0.706 0.600 0.727 0.581 0.895 0.743 0.974 0.842 0.865 0.872 0.865 0.895 0.811 0.927 0.872 0.850 LH03/0371 0.621 0.727 0.765 0.824 0.667 0.727 0.645 0.895 0.857 0.923 0.895 0.811 0.821 0.865 0.895 0.811 0.927 0.872 0.850 LH03/0179 0.615 0.667 0.710 0.774 0.593 0.667 0.714 0.743 0.857 0.778 0.914 0.765 0.778 0.824 0.743 0.824 0.789 0.833 0.865 LH03/0225 0.600 0.765 0.800 0.743 0.645 0.765 0.625 0.974 0.923 0.778 0.872 0.895 0.900 0.895 0.923 0.842 0.952 0.900 0.878 LH03/0548 0.621 0.727 0.765 0.765 0.600 0.727 0.774 0.842 0.895 0.914 0.872 0.865 0.872 0.865 0.842 0.919 0.878 0.923 0.950 LH03/0226 0.571 0.688 0.667 0.667 0.621 0.688 0.667 0.865 0.811 0.765 0.895 0.865 0.895 0.778 0.811 0.833 0.850 0.842 0.872 LH03/0515 0.533 0.706 0.743 0.629 0.581 0.706 0.625 0.872 0.821 0.778 0.900 0.872 0.895 0.789 0.872 0.895 0.905 0.900 0.927 LH03/0446 0.571 0.750 0.788 0.788 0.621 0.750 0.733 0.865 0.865 0.824 0.895 0.865 0.778 0.789 0.865 0.833 0.900 0.895 0.872 LH03/0222 0.552 0.727 0.765 0.706 0.667 0.788 0.645 0.895 0.895 0.743 0.923 0.842 0.811 0.872 0.865 0.919 0.927 0.872 0.850 LH03/0531 0.571 0.688 0.727 0.667 0.621 0.750 0.733 0.811 0.811 0.824 0.842 0.919 0.833 0.895 0.833 0.919 0.850 0.895 0.923 LH03/0514 0.563 0.778 0.811 0.757 0.606 0.722 0.647 0.927 0.927 0.789 0.952 0.878 0.850 0.905 0.900 0.927 0.850 0.952 0.930 LH03/0228 0.533 0.765 0.800 0.743 0.581 0.706 0.688 0.872 0.872 0.833 0.900 0.923 0.842 0.900 0.895 0.872 0.895 0.952 0.976 LH03/0227 0.581 0.743 0.778 0.722 0.563 0.686 0.727 0.850 0.850 0.865 0.878 0.950 0.872 0.927 0.872 0.850 0.923 0.930 0.976 33 Sự biến thiên lớn trong quần thể con lai cũng ngụ ý cần tăng cƣờng tạo số con lai đủ lớn cho từng tổ hợp lai giữa nguồn Wickham và Amazone để khai thác tốt hơn tiềm năng biến thiên lớn về mặt di truyền của tổ hợp lai này. Trong tổ hợp lai PB260 x RO44/268, PB260 thuộc bộ sƣu tập Wickham, một bộ sƣu tập đƣợc đánh giá là hạn hẹp về mặt di truyền do số lƣợng kiểu gen của bộ sƣu tập này tƣơng đối hạn chế. Trong nỗ lực cải tiến nguồn di truyền Wickham, trong nhiều năm qua, Viện Nghiên Cứu Cao Việt Nam đã cố gắng đƣa một số kiểu di truyền thuộc quỹ gen IRRDB 1981 vào các chƣơng trình lai tạo giống. Theo bảng 4.6, hệ số tƣơng đồng về mặt di truyền của các con lai với bố mẹ biến thiên trong khoảng từ 0.483 đến 0.952. Ngoài ra còn có sự xuất hiện của một số băng DNA không có mặt ở bố mẹ nhƣng có mặt ở thế hệ con lai. Đồng thời, một số băng DNA có mặt ở cả bố mẹ nhƣng không xuất hiện ở một số con lai mặc dù marker RAPD đƣợc xem là marker trội. Bảng 4.6: Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa các con lai với mẹ (PB260) và bố (RO44/268) của chúng. L H 0 3 /0 6 9 5 L H 0 3 /0 1 1 5 L H 0 3 /0 1 8 1 L H 0 3 /0 1 1 4 L H 0 3 /0 3 3 8 L H 0 3 /0 7 5 2 L H 0 3 /0 3 7 0 L H 0 3 /0 7 2 3 L H 0 3 /0 3 7 1 L H 0 3 /0 1 7 9 L H 0 3 /0 2 2 5 PB260 0.533 0.706 0.743 0.743 0.581 0.706 0.688 0.872 0.872 0.778 0.900 RO44/268 0.519 0.710 0.688 0.625 0.643 0.710 0.483 0.889 0.833 0.667 0.919 L H 0 3 /0 5 4 8 L H 0 3 /0 2 2 6 L H 0 3 /0 5 1 5 L H 0 3 /0 4 4 6 L H 0 3 /0 2 2 2 L H 0 3 /0 5 3 1 L H 0 3 /0 5 1 4 L H 0 3 /0 2 2 8 L H 0 3 /0 2 2 7 P B 2 6 0 R O 4 4 /2 6 8 PB260 0.872 0.895 0.900 0.842 0.872 0.842 0.952 0.950 0.927 1.000 RO44/268 0.778 0.857 0.865 0.800 0.889 0.800 0.872 0.811 0.789 0.811 1.000 Nhƣ vậy qua phân tích RAPD – PCR các con lai đã phần nào chứng tỏ công tác lai tạo giống giữa nguồn di truyền hoang dại Amazon và nguồn di truyền 34 Wickham truyền thống đã cải thiện nguồn biến lƣợng di truyền (làm xuất hiện nguồn biến dị mới) của các con lai, nguồn biến dị này có giá trị rất lớn trong công tác nghiên cứu, cải thiện sự hạn hẹp di truyền của nguồn di truyền Wickham. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa mẹ (PB260) và các con lai biến thiên trong khoảng 0,533 đến 0,952. Trong khi đó, hệ số tƣơng đồng di truyền giữa bố (RO44/268) và các con lai biến thiên trong khoảng 0,483 đến 0,919. Mặt khác, dựa vào các băng DNA đƣợc khuếch đại nhận thấy đối với primer A18, băng DNA có kích thƣớc 1000 bp không xuất hiện ở cả bố và mẹ nhƣng lại xuất hiện ở 3 con lai (LH03/0114, LH03/0782, LH03/0338). Tƣơng tự ở primer OPB12, băng có kích thƣớc 600 bp có ở 8 con lai (LH03/0227, LH03/0531, LH03/0515, LH03/0226, LH03/0548, LH03/0179, LH03/0370, LH03/0695) trong khi bố và mẹ không có băng này. Những kết quả ban đầu này cho thấy tổ hợp PB260 x RO44/268 đã cho thế hệ con lai có mang một số biến dị di truyền và khá khác biệt so với bố mẹ. Những biến dị này sẽ là nguồn nguyên liệu quí giá cho công tác chọn giống cao su ở Việt Nam. Kết quả PCR cũng cho thấy có một số băng DNA chỉ xuất hiện ở bố và một số con lai, ngƣợc lại một số băng chỉ thấy ở mẹ và một số con lai. Kết quả khảo sát cụ thể đƣợc thể hiện trong bảng 4.7 và bảng 4.8. Bảng 4.7: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở bố và các con lai Primer Kích thƣớc băng DNA(bp) Số con lai Tỷ lệ A18 300 14 70% OPB12 500 12 60% Bảng 4.8: Các băng DNA chỉ xuất hiện ở mẹ và các con lai. Primer Kích thƣớc băng DNA(bp) Số con lai Tỷ lệ A18 700 11 55% 1700 19 95% OPB12 900 16 75% 1500 17 30% 1800 18 85% 35 Trong công tác lai tạo giống cao su, cây cao su đƣợc xem là cây di truyền theo dòng mẹ. Do vậy việc chọn lọc cây mẹ đóng vai trò rất quan trọng. Cây mẹ phải là dòng vô tính mang những đặc tính mong muốn nhƣ sản lƣợng cao, tăng trƣởng nhanh, kháng bệnh, kháng gió… Số liệu thống kê của hai bảng trên đã cho thấy, các con lai có thể đƣợc thừa hƣởng nguồn di truyền từ bố và/hoặc mẹ, nhƣng nguồn gen của mẹ chiếm ƣu thế hơn trong việc di truyền cho các con lai. Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD với việc sử dụng hai primer A18 và OPB12 đã phần nào chứng minh điều này. 4.6 PHÂN NHÓM DI TRUYỀN CÁC CON LAI Qua kết quả phân tích phân nhóm (cluster analysis) dựa trên cơ sở dữ liệu RAPD, ta thấy các nhóm con lai có thành tích sinh trƣởng (từ cấp 2 đến cấp 7) và sản lƣợng (từ cấp 2 đến cấp 6) khác nhau (Bảng 4.9) đều phân bố ngẫu nhiên trên cây di truyền (Hình 4.3). 36 Bảng 4.9: Phân nhóm thành tích sinh trƣởng và sản lƣợng các con lai nghiên cứu. Con lai Ký hiệu Trung bình sinh trƣởng Trung bình sản lƣợng cm % ĐC Phân cấp Gam % ĐC Phân cấp LH03/069 5 148 11 115.24 4 0.021 5.59 3 LH03/011 5 149 12.2 127.7 6 0.056 14.49 3 LH03/018 1 150 9.9 102.99 2 0.313 81.64 4 LH03/011 4 151 10.6 110.82 3 1.302 340.03 6 LH03/033 8 152 12.7 132.39 6 0.005 1.26 3 LH03/075 2 153 10.1 105.22 3 0.35 91.38 4 LH03/037 0 155 12.7 132.57 6 0.001 0.26 2 LH03/072 3 158 11.3 118.37 4 0.001 0.26 2 LH0 /037 1 159 12.2 127.35 5 0.028 7.4 3 LH03/017 9 160 11.5 120.39 5 1.402 366.01 6 LH03/022 5 161 10.7 111.34 4 0.019 4.96 3 LH03/054 8 162 10.7 112.04 4 0.421 109.97 5 LH03/022 6 163 12.4 129.09 6 0.001 0.26 2 LH03/051 5 164 11.3 118.37 4 0.001 0.26 2 LH03/044 6 165 13.5 140.92 7 0.046 11.92 3 LH03/022 2 166 11.6 121.26 5 0.003 0.87 3 LH03/053 1 167 10.9 114.13 4 0.014 3.57 3 LH03/051 4 168 12 125.68 5 0.001 0.26 2 LH03/022 8 169 11.8 123.59 5 0.002 0.47 2 LH03/022 7 170 11.9 124.43 5 0.151 39.32 4 Nguồn: Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam. 37 Similarity coefficient 0.64 0.72 0.81 0.89 0.98 LH03/0695 LH03/0695 LH03/0370 LH03/0115 LH03/0181 LH03/0723 LH03/0225 LH03/0371 LH03/0222 LH03/0548 LH03/0531 LH03/0515 LH03/0514 LH03/0228 LH03/0227 LH03/0446 LH03/0226 LH03/0179 LH03/0114 LH03/0338 LH03/0752 Hình 4.3: Phân nhóm di truyền của các con lai đƣợc thiết lập dựa trên cơ sở dữ liệu phân tích RAPD, sử dụng phƣơng pháp phân tích cluster UPGMA. Kết quả phân nhóm này cho thấy chƣa có mối liên hệ nào đƣợc phát hiện giữa các đặc tính nông học (sinh trƣởng hoặc sản lƣợng) và marker RAPD thông qua 2 primer A18 và OPB12. Điều này cũng nói lên rằng với việc sử dụng 2 primer A18 và OPB12, marker RAPD chƣa thể nhận diện đƣợc các đặc tính sinh trƣởng và sản lƣợng của cây cao su ở giai đoạn tuyển non. Với chỉ 2 primer đƣợc sử dụng trong phân tích RAPD không thể phủ hết toàn bộ bộ gen của đối tƣợng nghiên cứu. Việc sử dụng nhiều primer hơn sẽ có thể khuếch đại đƣợc nhiều vùng trình tự trên bộ gen hơn, nhƣ vậy sẽ cho phép tìm đƣợc marker đặc hiệu liên kết với các tính trạng số lƣợng. 38 Chƣơng 5 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Quy trình ly trích DNA và chu trình nhiệt thực hiện phản ứng RAPD của Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam đã đáp ứng đƣợc các yêu cầu về hàm lƣợng DNA cũng nhƣ thực hiện thành công phản ứng khuếch đại DNA bằng marker RAPD. Kỹ thuật RAPD đã bƣớc đầu cho phép đánh giá biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268. Trong tổng số 24 băng DNA đƣợc phát hiện trên cả hai primer thì có đến 21 băng đa hình (chiếm tỷ lệ 87,5%), trong đó ở primer A18 có 10/12 băng đa hình với tỉ lệ là 83,33%, primer OPB12 có 11/12 băng đa hình chiếm tỉ lệ 91,67%. Biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268 là khá rộng. Tổng số băng DNA đƣợc phát hiện trên các con lai dao động từ 11 đến 22 băng trên tổng số 24 băng phát hiện. Khoảng cách di truyền trong quần thể con lai biến thiên từ 0,024 (đƣợc tìm thấy giữa con lai LH03/0227 và LH03/0228) đến 0,478 (đƣợc tìm thấy giữa con lai LH03/0338 và LH03/0370). Marker RAPD với hai primer A18 và OPB12 đã phản ánh đƣợc biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai của tổ hợp PB260 x RO44/268. Qua kết quả phân tích phân nhóm (cluster analysis) nhận thấy rằng: sử dụng marker RAPD với hai primer A18 và OPB12 không nhận diện đƣợc sự khác biệt di truyền giữa các con lai có thành tích sinh trƣởng hoặc sản lƣợng khác. 39 5.2 ĐỀ NGHỊ Sử dụng marker RAPD trong công tác kiểm tra biến lƣợng di truyền quần thể con lai trong các chƣơng trình lai tạo giống cao su của Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam. Bên cạnh 2 primer A18 và OPB12, cần mở rộng phân tích RAPD trên nhiều primer khác nữa, nhằm đánh giá biến lƣợng di truyền một cách chính xác hơn. Tăng số lƣợng con lai trong mỗi tổ hợp lai giữa nguồn di truyền Wickham và Amazone để khai thác tốt hơn biến lƣợng di truyền trong quần thể con lai. Cần mở rộng thêm các tổ hợp lai giữa nguồn di truyền cao su hoang dại Amazon và nguồn di truyền Wickham truyền thống, nhằm từng bƣớc cải thiện sự gi ới h ạn của nguồn di truyền Wickham cũng nhƣ từng bƣớc khắc phục hiện tƣợng xói mòn gen trong công tác lai tạo giống cao su. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 2. Lê Thị Thanh Tuyền, 2005. Nghiên cứu đa dạng nguồn gen dứa Cayenne bằng phương pháp marker phân tử. Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành công nghệ sinh học. Đại học Nông lâm Tp. HCM. 3. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng.1997. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo dục. 5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng. 2000. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia. 6. Nguyễn Hoàng Luân, 2002. Phân nhóm di truyền theo isozyme cho tập đoàn giống cao su trên vườn Lai hoa Lai Khê 2002. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học. Trƣờng Đại học mở - Bán Công Tp.HCM. 7. Nguyễn Quỳnh Anh, 2005. Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sƣ Công nghệ sinh học. Trƣờng Đại học Nông lâm Tp.HCM. 8. Nguyễn Thị Huệ, 1997. Cây cao su kiến thức tổng quát và kỹ thuật nông nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 9. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 10. Phạm Hải Dƣơng, 2002. Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp. Trƣờng Đại Học Huế. 41 11. Trần Thanh, Lại Văn Lâm, Vũ Thị Quỳnh Chi và Lê Mậu Túy. 2006. Báo cáo kết quả năm 2006 đề tài Nghiên cứu đa dạng di truyền quỹ gen cây cao su bằng kỹ thuật RAPD – PCR. Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam. 12. Trần Thanh và Lê Thị Thùy Trang, 2004. Báo cáo kết quả khóa tập huấn về kỹ thuật sinh học phân tử tại trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam. 13. Trần Thị Thuý Hoa, 1998. Luận án Tiến sỹ khoa học nông nghiệp. Trƣờng Đại học Nông lâm TP.HCM. 14. Võ Thị Thu Hà, 1996. Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học. Trƣờng Đại học Tổng hợp TP.HCM. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 15. An Zewei, Cheng Han, Sin Aihua, Fang Jialin and Huang Huasun. Identification of rubber clones by RAPD markers. International Natural Rubber Conference in India, 2005. Preprints papers, pp 88-92. 16. Lai Van Lam et al., 2006. Potential of the IRRDB’81 germplasm in Hevea breeding program. International Rubber Conference, 349-362, November 2006, Ho Chi Minh City, Vietnam. 17. Lai Van Lam, Vu Van Truong, Le Mau Tuy and Tran Thanh, 2005. Wood potentials of the IRRDB’81 Hevea Germplasm. Second workshop on Rubber wood, Croping and Research, 25-27 May 2005 - RWCR - Bangkok, Thai Lan. 18. Lekawipat N., Teerawatanasuk K., Rodier-Goud M., Seguin M., Vanavichit A., Toojinda T. and Tragoonrung S. (2003). Genetic Diversity Analysis of Wild Germplasm and Cultivated Clones of Hevea brasiliensis Muell. Arg. by Using Microsatellite Markers. Journal of rubber research 6: 36-47. 19. Lespinasse D, Rodier-Goud M, Grivet L, Leconte A, Legnate and Seguin M (2000a) A saturated genetic linkage map of rubber tree (Hevea spp.) 42 based on RFLP, AFLP, microsatellite, and isozyme markers.Theoretical and applied genetic 100:975-984 20. Nei M. & Li W.H. (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of retriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 5269-5273. 21. Seguin M., Gay C., Xiong T.C., Rodier-Goud M. (2001). Microsatellite markers for genome analysis of rubber tree (Hevea spp.). Proceedings IRRDB Symposium 2001 – Biotechnology & Rubber Tree – Montpelier, France. 22. Sumarmadji & Darmono T.W. (2004). Country report, Indonesia. In: Chow K.S. and Yeang H.Y. (eds) Report on the International Rubber Research and Development Board, Biotechnology Workshop, Sungei Buloh, Malaysia, 9-11 Feb 2004, pp. 22-30. 23. Tran Thi Thuy Hoa, 2006. Supports of the Vietnam Rubber Association for Rubber Industry. International Rubber Conference, 515-521, November 2006, Ho Chi Minh City, Vietnam. 24. Varghese Y.A., Knaak C., Sethuraj M.R and Ecke W. (1997). Evaluation of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in Hevea brasiliensis. Plant Breeding 116:47-52. 25. Venkatachalam P., Thomas S., Priya P., Thanseem I., Saraswathyamma C.K and Thulaseedharan A. (2002). Identification of DNA polymorphism among clones of Hevea Brasiliensis Muell. Agr. Using RAPD analysis. Indian Journal of Natural Rubber Research 15: 172-181. 26. Venkatachlam, P., Sailasree, R., Priya, P., Saraswathyamma, C. K. and Thulaseedaran, A., (2001). Identification of a DNA marker associated with drawf trait in Hevea brasiliensis (Muell.) Arg. through random 43 amplified polymorphic DNA analysis. Proceedings IRRDB Symposium 2001-Biotechnology & Rubber tree-Montpellier, France. 27. Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, Van de Lee T, Horners M, Frijter A, pot A, Peleman J, Kuiper M, and Jabeau M (1995) AFLP: A new technique for DNA Fingerprinting. Nucleic Acid Research 23: 4407 - 4414 28. William JGK, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA and Tingey SV (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids research 18: 6531 – 6535 44 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Quy trình tách chiết DNA cây cao su ở điều kiện Việt Nam             Cân 0,2 g lá tƣơi đã rửa sạch, cho vào cối, nghiền mẫu với 1,3 ml dịch trích DNA (DNA extraction buffer, pH = 8). Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 0,8 µl RNase (nồng độ: 10mg/ml), ủ ở 37oC trong 1 giờ. Thêm vào 500 µl Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), vortex 1.400 vòng trong 10 phút, ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 10oC. Thêm vào 250µl dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở -20oC qua đêm. Chuyển lấy dịch trong ở bên trên. Thêm vào 500 µl Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), vortex 1.400 vòng trong 10 phút, ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 10 o C. Lấy phần dịch nghiền cho vào eppendorf (loại 1,5ml), vortex kỹ, đem ủ ở 65oC trong 45 phút. Ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 10oC. Đổ bỏ dịch trong. Thêm vào 300 µl TE 1X, ủ ở 37 oC trong 1 giờ. Thêm vào 20 µl Sodium acetate 3M và 640 µl Ethanol 96%, trộn đều và đặt ở nhiệt độ -20oC trong 30 phút. Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở 10oC, đổ bỏ phần dịch trong. Rửa kết tủa với 400 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 10.000 vòng trong 2 phút ở 10oC, đổ bỏ phần dịch trong. Rửa kết tủa một lần nữa với 400 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 10.000 vòng trong 2 phút ở 10oC, đổ bỏ phần dịch trong, để khô kết tủa và hòa tan kết tủa trong 100 µl TE 1X (tùy theo hàm lƣợng DNA thu đƣợc), ủ ở 37oC trong 30 phút. Bảo quản mẫu DNA thu đƣợc ở điều kiện 4oC. 45 Phụ lục 2: Kết quả kiểm giá trị OD của các mẫu DNA ly trích. Ký hiệu Con lai OD260 OD280 OD260/OD280 DNA Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 (ng/µl) 148 LH03/0695 0.277 0.277 0.277 0.156 0.156 0.156 1.78 1192.54 149 LH03/0115 0.659 0.66 0.66 0.369 0.37 0.37 1.78 2846.69 150 LH03/0181 0.348 0.348 0.348 0.205 0.205 0.204 1.7 1466.64 151 LH03/0114 0.844 0.844 0.844 0.591 0.59 0.591 1.43 3214.18 152 LH03/0338 0.539 0.539 0.539 0.297 0.297 0.297 1.81 2344.32 153 LH03/0752 0.817 0.817 0.817 0.452 0.452 0.452 1.81 3546.85 155 LH03/0370 0.246 0.246 0.247 0.148 0.148 0.149 1.66 1025.59 158 LH03/0723 0.533 0.534 0.534 0.3 0.301 0.301 1.77 2297.11 159 LH03/0371 0.559 0.561 0.561 0.326 0.327 0.327 1.72 2371.98 160 LH03/0179 0.204 0.204 0.204 0.126 0.125 0.126 1.62 839.07 161 LH03/0225 0.529 0.529 0.529 0.296 0.297 0.297 1.78 2282 162 LH03/0548 0.09 0.092 0.091 0.057 0.059 0.058 1.57 367.23 163 LH03/0226 0.312 0.313 0.314 0.174 0.175 0.175 1.79 1353.37 164 LH03/0515 0.489 0.489 0.489 0.274 0.274 0.274 1.78 2110.3 165 LH03/0446 0.13 0.131 0.131 0.081 0.081 0.081 1.61 535.6 166 LH03/0222 0.063 0.063 0.064 0.04 0.04 0.041 1.57 255.7 167 LH03/0531 0.645 0.645 0.646 0.359 0.359 0.359 1.8 2794.41 168 LH03/0514 0.357 0.357 0.358 0.207 0.207 0.208 1.72 1516.24 169 LH03/0228 0.065 0.066 0.066 0.043 0.043 0.044 1.52 259.61 170 LH03/0227 0.315 0.316 0.316 0.184 0.184 0.185 1.71 1335.16 171 PB260 0.356 0.356 0.357 0.208 0.208 0.209 1.71 1506.25 229 RO44/268 0.784 0.784 0.784 0.432 0.432 0.433 1.81 3408.71 46 Phụ lục 3: Bảng mã hoá băng DNA của các con lai L H 0 3 /0 6 9 5 L H 0 3 /0 1 1 5 L H 0 3 /0 1 8 1 L H 0 3 /0 1 1 4 L H 0 3 /0 3 3 8 L H 0 3 /0 7 5 2 L H 0 3 /0 3 7 0 L H 0 3 /0 7 2 3 L H 0 3 /0 3 7 1 L H 0 3 /0 1 7 9 L H 0 3 /0 2 2 5 L H 0 3 /0 5 4 8 L H 0 3 /0 2 2 6 L H 0 3 /0 5 1 5 L H 0 3 /0 4 4 6 L H 0 3 /0 2 2 2 L H 0 3 /0 5 3 1 L H 0 3 /0 5 1 4 L H 0 3 /0 2 2 8 L H 0 3 /0 2 2 7 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 47 Phụ lục 4: Giao diện của phần mềm NTYSYSpc 2.1 48 Phụ lục 5: phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền trên phần mềm NTSYSpc 49 Phụ lục 6: Phân nhóm di truyền các con lai và vẽ cây phân loài bằng SAHN 50 Natural distribution of Hevea brasiliensis Extension of the Hevea genus AC/B AC/F MT/A Wickham AC/T AC/S AC/X RO/CM MT/VB RO/J RO/C RO/A MT/C MT/IT RO/PB Phụ lục 7: Bản đồ vùng phân bố giống cao su Wickham và giống cao su Amazone.