Khóa luận Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chất chiết thô từ cây lô hội (Aloe vera) và cây hoa phấn (Mirabilis jalapa L.) nuôi cấy in vitro

thƣờng xuyên.  Trị bệnh Bệnh có thể đƣợc điều trị bằng các thuốc chống nấm đặc hiệu, tùy mức độ bệnh nặng hay nhẹ mà ngƣời ta có hƣớng điều trị thích hợp. 2.7. Một số nghiên cứu có liên quan  Cây lô hội Rosca-Casian O, Parvu M, Vlase L, Tamas M (2007) nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của lá cây lô hội. Họ cho rằng dịch chiết trong rƣợu của lá lô hội tƣơi có thể ngăn cản sự phát triển khuẩn ty thể của một số loại nấm nhƣ: Botrytis gladiolorum, Fusarium oxysporum f.sp. gladioli, Heterosporium pruneti và Penicillium gladioli trên môi trƣờng thạch Czapek. Nồng độ của chất diệt nấm tối thiểu từ 80 – 100 microl/ml tùy loài nấm. [16] Wang H, Li F, Wang T, Li J, Li J, Yang X, Li J (2004) nghiên cứu xác định hàm lƣợng aloin trong mô sẹo cây lô hội. Hàm lƣợng aloin trong mô sẹo đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sắc kí HPLC và TLC. Kết quả chỉ ra rằng trên môi trƣờng MS với NAA 1 mg/l + 6-BA 0,5 mg/l, độ biệt hóa của mô sẹo từ lá ở mức độ cao nhất so với mô sẹo từ thân và từ rễ , do đó nó chứa hàm lƣợng aloin cao nhất. Hàm lƣợng aloin thấp trong mô sẹo từ thân. Không có aloin trong mô sẹo từ rễ. Trên môi trƣờng MS với 2,4-D 1 mg/l + 6-BA 0,5 mg/l, sự biệt hóa mô sẹo ở mức thấp và không có aloin. [17] Tian B, Hua YJ, Ma XQ, Wang GL (2003) nghiên cứu mối liên hệ giữa hoạt tính kháng khuẩn của cây lô hội và các hợp chất anthraquinone của nó. Họ cho rằng các chất thuộc nhóm anthraquinone trong lô hội có hoạt tính kháng khuẩn và aloin là chất có hoạt tính chính. Hoạt tính kháng khuẩn của cây lô hội phụ thuộc vào liều lƣợng của anthraquinone, aloin (1mg/l) có hoạt tính cao hơn aloe-emodin (đƣờng kính vòng vô khuẩn tƣơng ứng: >7,1 +/- 0,15 mm và 5,0 mm). Aloin có thể làm thay đổi hình thái và phá hủy cấu trúc tế bào ngoài của E. coli. Aloin và aloe-emodin có thể kháng lại 3 vi khuẩn Gram âm và 2 vi khuẩn Gram dƣơng (đƣợc khảo sát bằng phƣơng pháp khuếch tán qua thạch). Glycoside giúp aloin dễ dàng xâm nhập vào tế bào và làm tăng hoạt tính của nó. [8]  Cây hoa phấn Cammue BP, De Bolle MF, Terras FR, Proost P, Van Damme J, Rees SB, Vanderleyden J, Broekaert WF (1992) đã cô lập từ hạt hoa phấn hai đoạn peptide kháng khuẩn, đƣợc đặt tên là Mj-AMP1 và Mj-AMP2. Các peptide này có tính kiềm cao và gồm có 37 nhóm (Mj-AMP1) hay 36 nhóm (Mj-AMP2). Theo khảo sát của họ thì: Mj-AMP1 và Mj-AMP2 đều biểu hiện hoạt tính kháng nấm phổ rộng (có thể kháng lại 13 loại nấm bệnh cây trồng đƣợc kiểm tra). Để ức chế sự phát triển của nấm khoảng 50% đòi hỏi nồng độ của Mj-AMP1 từ 6 - 300 micrograms/ml, của Mj-AMP2 từ 0,5 – 20 micrograms/ml. Hai peptide này cũng có tác động trên hai loại vi khuẩn Gram dƣơng đƣợc kiểm tra nhƣng không gây độc đối với vi khuẩn Gram âm và các tế bào ngƣời đƣợc nuôi cấy. [18] Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Địa điểm Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM. 3.1.2. Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: Tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ ấm, tủ sấy, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, nhiệt kế, ẩm kế, máy lắc… Dụng cụ: Pince, dao cấy, kéo, bình tam giác, đèn cồn, pipette, micropipette, que cấy… 3.2.2. Vật liệu nuôi cấy mô cây lô hội và cây hoa phấn - Cây lô hội in vitro cao 4 - 5 cm. - Hạt cây hoa phấn thu hái từ tự nhiên. 3.2.3. Vật liệu thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm - Các loại vi khuẩn: Staphylococcus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa. - Nấm men Candida albicans. - Dịch chiết của cây ngoài tự nhiên, mô sẹo, cây in vitro. 3.2.4. Thành phần môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu 3.2.4.1. Môi trƣờng dùng trong nuôi cấy mô Môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS của Murashige và Skoog (1962) Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng MS của Murashige và Skoog Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ (mg/l) Khoáng đa lƣợng NH4NO3 KNO3 KH2PO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O 1650 1900 170 370 440 Khoáng vi lƣợng H3BO4 MnSO4.4H2O CoCl2.6H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.4H2O Na2MoO4.4H2O KI 6,2 22,3 0,025 0,025 8,6 0,25 0,83 Fe-EDTA FeSO4.7H2O Na2EDTA.2H2O 27,8 37,3 Vitamin Myo – inositol Nicotinic acid Thiamine – HCl Pyridoxine – HCl Glycine 100 0,5 0,1 0,5 2,0 Các chất khác Đƣờng Agar 30g/l 7,5g/l Các chất kích thích tăng trƣởng BA 2,4-D NAA Tuỳ nghiệm thức pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 - 5,8 3.2.4.2. Hoá chất cho thử nghiệm vi sinh * Môi trƣờng dùng để nuôi cấy vi khuẩn: môi trƣờng cao thịt – pepton Cao thịt : 3 g/l Pepton : 10 g/l NaCl : 5 g/l Agar : 15 g/l Nƣớc cất : 1000 ml pH: 6,0 * Môi trƣờng dùng để nuôi cấy nấm men là môi trƣờng Sabouraud Glucose : 40 g/l Pepton : 20 g/l Agar : 20 g/l Nƣớc cất : 1000 ml pH: 5,5 khử trùng ở 0,5 atm/30 phút 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng lên sự hình thành mô sẹo cây hoa phấn * Mục đích thí nghiệm + Xác định nồng độ kích thích tố BA và 2,4-D thích hợp cho sự hình thành mô sẹo tối ƣu của cây hoa phấn. + Tạo nguồn nguyên liệu dùng cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm. * Vật liệu: Lá thật có kích thƣớc 0,5 x 0,5 cm của cây hoa phấn nảy mầm từ hạt in vitro. * Môi trƣờng: môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng MS với BA 4 mg/l và 2,4-D từ 1 – 4 mg/l, kí hiệu môi trƣờng: BD. * Cách thực hiện: Bảng 3.2. Nồng độ BA và 2,4-D sử dụng trong thí nghiệm 1 Kí hiệu môi trƣờng Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l) BD0 0 0 BD1 4 1 BD2 4 2 BD3 4 3 BD4 4 4 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design), 3 lần lặp lại. + Số nghiệm thức: 5 nghiệm thức + Tổng số bình môi trƣờng: 15 bình ( 1 bình/1 nghiệm thức) + Số mẫu cấy trên một bình: 3 mẫu + Thể tích môi trƣờng: 20 - 25ml/bình *Chỉ tiêu theo dõi: + Tỉ lệ mẫu cấy tạo sẹo (%), theo dõi sau 25 ngày nuôi cấy. + Tỉ lệ sống của mô sẹo (%), theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy. + Khả năng tạo phôi của mô sẹo: theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy (có hay không có khả năng tạo phôi). 3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của BA lên sự tạo cụm chồi từ cây lô hội và cây hoa phấn in vitro * Mục đích thí nghiệm + Xác định nồng độ kích thích tố BA thích hợp cho sự hình thành cụm chồi. + Tạo nguồn nguyên liệu dùng cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm. * Vật liệu: Chồi cây lô hội in vitro và chồi cây hoa phấn nảy mầm từ hạt. * Môi trƣờng: môi trƣờng MS với BA từ 1 - 4 mg/l * Cách thực hiện: Bảng 3.3. Nồng độ BA sử dụng trong thí nghiệm 2 Kí hiệu môi trƣờng Nồng độ BA (mg/l) BA0 0 BA1 1 BA2 2 BA3 3 BA4 4 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design), 3 lần lặp lại. + Số nghiệm thức: 5 nghiệm thức đối với mỗi loại cây + Tổng số bình môi trƣờng: 30 bình ( 1bình/1 nghiệm thức) + Số mẫu cấy trên một bình: 3 mẫu + Thể tích môi trƣờng: 50 - 55 ml/bình (cây lô hội). 20 - 25 ml/bình (cây hoa phấn). * Chỉ tiêu theo dõi sau 25 ngày nuôi cấy: + Tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi (%) + Số chồi trung bình/mẫu cấy (chồi) + Chiều cao trung bình của chồi (cm) 3.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cây lô hội và cây hoa phấn ngoài tự nhiên * Mục đích: kiểm định khả năng kháng sinh của cây ngoài tự nhiên * Vật liệu + Các chủng vi khuẩn: Staphylococcus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa. + Nấm men Candida albicans. + Lá cây lô hội + Thân, lá, rễ cây hoa phấn + Môi trƣờng cấy khuẩn + Môi trƣờng cấy nấm + Dung môi sử dụng để chiết suất hoạt chất là ethanol. *Cách thực hiện + Môi trƣờng khuẩn, môi trƣờng nấm Môi trƣờng sau khi đƣợc pha và hấp khử trùng, cho vào mỗi đĩa petri có đáy phẳng và đặt lên mặt thật phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng 4 mm. Thể tích môi trƣờng khoảng 15 - 20 ml/1đĩa. Để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, nếu chƣa sử dụng thì để trong tủ lạnh từ 4 - 80C. + Dịch vi khuẩn Trên mặt thạch phân lập vi khuẩn, lấy một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml nƣớc muối sinh lý đã đƣợc hấp khử trùng . Sau đó lắc đều và so độ đục với ống Mc. Farland (có độ đục tƣơng đƣơng 1x108 CFU/ml) trên giấy trắng có kẻ 3 vạch ngang. Thực hiện đến khi ống nghiệm chứa dịch khuẩn có cùng độ đục với ống Mc. Farland, ta đƣợc dịch khuẩn có nồng độ khoảng 1x108 CFU/ml. + Dịch nấm: thực hiện tƣơng tự dịch khuẩn + Trải vi khuẩn, nấm lên mặt thạch Dùng micropipette 40 - 200 l hút 200 l dịch vi khuẩn hoặc dịch nấm bơm vào đĩa môi trƣờng. Sau đó dùng que cấy trang vô khuẩn, trang đều trên mặt thạch sao cho vi khuẩn hoặc nấm khuếch tán đầy và đều lên mặt thạch. Trang cho đến khi mặt thạch khô. + Dịch chiết cây lô hội và cây hoa phấn Các bộ phận đƣợc sử dụng để chiết tách đƣợc rửa sạch. Sử dụng lá lô hội, thân lá và rễ cây hoa phấn. Cân 15 g mỗi loại, giã nát, thêm 5 ml ethanol vào. Chờ khoảng 30 - 40 phút để hiệu quả chiết suất cao. Dùng pince gấp giấy lọc hình tròn, đƣờng kính cỡ 0,5 cm (đƣợc gọi là đĩa kháng sinh) đã đƣợc khử trùng lên trên mặt đĩa petri đã trải khuẩn. Đĩa kháng sinh không đặt sát nhau quá, cách thành đĩa khoảng 1 cm. Nhỏ trực tiếp dịch chiết lên đĩa kháng sinh. Thể tích dịch chiết nhỏ lên mỗi đĩa kháng sinh là 100 l. Đem ủ ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ lấy ra theo dõi. Số nghiệm thức: 4 nghiệm thức (cây lô hội) 4 nghiệm thức (thân, lá hoa phấn) 4 nghiệm thức (rễ hoa phấn) Số lần lặp lại: 3 lần (mỗi chủng vi khuẩn, nấm làm 3 đĩa petri) Tổng số đĩa petri: 36 đĩa Số mẫu trên 1 đĩa: 3 mẫu (1 mẫu đối chứng: dung môi; 2 mẫu thí nghiệm) * Chỉ tiêu theo dõi: đo đƣờng kính vòng kháng sinh sau 1 ngày ủ. 3.3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của mô sẹo cây hoa phấn * Mục đích + Kiểm định khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của mô sẹo. + So sánh đƣợc khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của mô sẹo, cây in vitro với cây ngoài tự nhiên. * Vật liệu + Mô sẹo cây lấy từ thí nghiệm 1 + Các chủng vi khuẩn: Staphylococcus, E. coli, Pseudomonas aeruginosa. + Nấm men Candida albicans. + Môi trƣờng cấy khuẩn + Môi trƣờng cấy nấm + Dung môi : ethanol * Cách thực hiện: giống thí nghiệm 3 * Chỉ tiêu theo dõi: đo đƣờng kính vòng kháng sinh sau 1 ngày ủ. 3.3.5.Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của cây lô hội và cây hoa phấn in vitro * Mục đích + Kiểm định khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của cây in vitro + So sánh đƣợc khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của mô sẹo, cây in vitro với cây ngoài tự nhiên. * Vật liệu + Cây lô hội và cây hoa phấn lấy từ thí nghiệm 2 + Các chủng vi khuẩn + Các chủng nấm + Môi trƣờng cấy khuẩn + Môi trƣờng cấy nấm + Dung môi: ethanol *Cách thực hiện: tƣơng tự thí nghiệm 3 * Chỉ tiêu theo dõi: đo đƣờng kính vòng kháng sinh sau 1 ngày ủ.  Ghi chú: Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm STATGRAPHICS (2000) Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng lên sự hình thành mô sẹo cây hoa phấn Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của BA và 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo cây hoa phấn in vitro sau 25 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ 2,4-D (mg/l) Tỉ lệ mẫu cấy tạo sẹo (%) Tỷ lệ sống của mô sẹo (%) BD0 0 0 0,00 a 0,00 a BD1 4 1 77,78 b 100,00 c BD2 4 2 66,67 b 100,00 c BD3 4 3 100,00 c 88,89 c BD4 4 4 100,00 c 66,67 b CV% 14,7% 14,22% Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Hình 4.1. Mô sẹo từ lá hoa phấn trên môi trƣờng MS có bổ sung BA và 2,4-D sau 25 ngày nuôi cấy. * Nhận xét Môi trƣờng MS với BA 4 mg/l và 2,4-D nồng độ từ 1 – 4 mg/l đều thích hợp để tạo mô sẹo từ lá hoa phấn. Tốt nhất là môi trƣờng MS với BA 4 mg/l và 2,4-D 3 mg/l (nghiệm thức BD3). Đối với môi trƣờng này tỷ lệ tạo sẹo cao (100%), tỷ lệ sống của mô sẹo cũng tƣơng đối BD3 BD1 BD4 BD0 BD2 cao (88,89%) so với các môi trƣờng nghiệm thức còn lại. Mô sẹo trên môi trƣờng này có khả năng tạo phôi. Đối với môi trƣờng đối chứng là môi trƣờng MS không bổ sung BA và 2,4-D (nghiệm thức BD0) thì mô lá hoa phấn không hình thành sẹo. Điều này chứng tỏ trong mô lá hoa phấn có thể không chứa hoặc chứa rất ít cytokinin và auxin, không đủ để kích thích sự phản phân hóa của các tế bào ở mô lá, do đó không hình thành mô sẹo đƣợc. Ở môi trƣờng MS với BA 4 mg/l và 2,4-D 1 mg/l (nghiệm thức BD1), hay BA 4 mg/l và 2,4-D 2 mg/l (nghiệm thức BD2) thì tỉ lệ tạo sẹo thấp, thời gian ra sẹo lâu hơn nghiệm thức BD3 , tuy nhiên tỷ lệ sống cao (100%), có khả năng tạo phôi. Môi trƣờng MS với BA 4 mg/l và 2,4-D 4 mg/l (nghiệm thức BD4) có tỉ lệ tạo mô sẹo cao nhƣng có thể nồng độ auxin cao quá làm mô sẹo khô và làm giảm khả năng sống của mô sẹo, hầu nhƣ không có khả năng tạo phôi. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của BA lên sự tạo cụm chồi từ cây lô hội và cây hoa phấn in vitro 4.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của BA lên sự tạo cụm chồi từ cây lô hội in vitro Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của BA lên sự tạo cụm chồi cây lô hội sau 25 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi (%) Số chồi trung bình/mẫu cấy Chiều cao trung bình của chồi (cm) B0 33,33 a 2,11 a 4,02 d B1 88,89 b 10,00 b 2,35 c B2 88,89 b 17,00 e 2,41 c B3 88,89 b 15,50 d 1,03 b B4 66,67 ab 11,70 c 0,83 a CV% 23,8% 5,45% 3,48% Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Hình 4.2. Cụm chồi cây lô hội trên môi trƣờng MS có bổ sung BA sau 25 ngày nuôi cấy. * Nhận xét Môi trƣờng thích hợp cho sự tạo cụm chồi cây lô hội là môi trƣờng MS với BA nồng độ từ 1 - 4 mg/l. Môi trƣờng tốt nhất cho sự tạo cụm chồi cây lô hội là môi trƣờng MS với BA 2 mg/l. Ở môi trƣờng này số chồi trung bình/mẫu cấy là lớn nhất, tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm Nồng độ BA = 2 mg/l Nồng độ BA = 3 mg/l Nồng độ BA = 4 mg/l Nồng độ BA = 0 mg/l Nồng độ BA = 1 mg/l chồi cũng tƣơng đối cao (88,89%), thời gian tạo cụm chồi ngắn hơn môi trƣờng MS với BA 3 mg/l và 4 mg/l (thể hiện ở chiều cao trung bình của chồi). Ở môi trƣờng MS với BA 1 mg/l, mặc dù tỉ lệ tạo cụm chồi và chiều cao trung bình tƣơng đƣơng môi trƣờng MS với BA 2 mg/l nhƣng số chồi trung bình/mẫu cấy thấp hơn. Tuy nhiên điều đó cũng chƣa khẳng định đƣợc nồng độ BA càng cao thì sự tạo cụm chồi càng tốt vì với môi trƣờng MS với BA 3 mg/l và 4 mg/l thì số chồi trung bình/mẫu cấy tƣơng đối cao nhƣng thời gian tạo cụm chồi lại rất dài. Cũng có thể chồi bị ức chế do nồng độ BA cao. Ở môi trƣờng đối chứng là môi trƣờng MS không bổ sung BA thì tỉ lệ tạo cụm chồi rất thấp (33,33%), chiều cao chồi cao nhất. Có thể do không có một lƣợng cytokinin cần thiết để ức chế ƣu thế ngọn và tạo điều kiện cho các chồi bên phát triển. 4.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của BA lên sự tạo cụm chồi từ cây hoa phấn Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của BA lên sự tạo cụm chồi cây hoa phấn sau 25 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi (%) Số chồi trung bình/mẫu cấy Chiều cao trung bình của chồi (cm) B0 0,00 a 1,00 a 0,50 a B1 77,78 b 2,20 b 1,60 d B2 77,78 b 3,17 c 1,14 c B3 77,78 b 2,20 b 1,13 c B4 77,78 b 2,40 b 0,81 b CV% 33,33% 9,8% 5,14% Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Hình 4.3. Cụm chồi hoa phấn dƣới tác dụng của BA sau 25 ngày nuôi cấy. * Nhận xét Môi trƣờng MS với BA nồng độ từ 1 – 4 mg/l có thể cảm ứng tạo cụm chồi cây hoa phấn. Qua bảng 4.3: trừ môi trƣờng đối chứng, các môi trƣờng nghiệm thức còn lại đều cho tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi bằng nhau. Nghiệm thức B2 là nghiệm thức tốt nhất vì có số chồi trung bình/mẫu cấy cao nhất và thời gian tạo cụm chồi chỉ dài hơn nghiệm thức B1. Trong môi trƣờng đối chứng (môi trƣờng MS), cây hoa phấn không tạo đƣợc cụm chồi mà chỉ phát triển đƣợc một chồi ở hầu hết các mẫu cấy và thời gian phát triển rất chậm. Nồng độ BA = 0 mg/l Nồng độ BA = 2 mg/l Nồng độ BA = 3 mg/l Nồng độ BA = 1 mg/l Nồng độ BA = 4 mg/l 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cây lô hội và cây hoa phấn ngoài tự nhiên 4.3.1. Thí nghiệm 3a: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cây lô hội ngoài tự nhiên Bảng 4.4. Kết quả hoạt tính kháng sinh và đƣờng kính vòng kháng sinh của các chất chiết thô lá cây lô hội ngoài tự nhiên Dịch chiết Loại vi sinh vật Họat tính kháng sinh Đƣờng kính vòng kháng sinh (cm) Lá lô hội ngoài tự nhiên trong ethanol E. coli (+) 0,80 Staphylococcus (-) 0,00 Pseudomonas aeruginosa (+) 1,06 Candida albicans (-) 0,00 Hình 4.4. Vòng kháng sinh của các chất chiết thô lá lô hội đối với các chủng vi sinh E. coli Staphylococcus Pseudomonas aeruginosa Candida albicans ĐC ĐC ĐC ĐC * Ghi chú: : Vòng kháng sinh * Nhận xét Các chất chiết thô lá lô hội ngoài tự nhiên trong dung môi ethanol chỉ có hoạt tính kháng sinh đối với các chủng E. coli, Pseudomonas aeruginosa. Tuy nhiên, vòng kháng sinh này rất nhỏ và rất mờ (chỉ có thể thấy bằng mắt thƣờng, khó phân biệt khi chụp lên ảnh). Vòng kháng sinh đối với Pseudomonas aeruginosa lớn hơn đối với E. coli chứng tỏ các chất chiết thô lá lô hội ngoài tự nhiên kháng Pseudomonas aeruginosa mạnh hơn E. coli. 4.3.2. Thí nghiệm 3b: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cây hoa phấn ngoài tự nhiên. Bảng 4.5. Kết quả hoạt tính kháng sinh và vòng kháng sinh của các chất chiết thô thân, lá, rễ cây hoa phấn ngoài tự nhiên Dịch chiết Thân, lá cây hoa phấn ngoài tự nhiên trong ethanol Rễ cây hoa phấn ngoài tự nhiên trong ethanol Các loại vi sinh vật Hoạt tính kháng sinh Đƣờng kính vòng kháng sinh (cm) Hoạt tính kháng sinh Đƣờng kính vòng kháng sinh (cm) E. coli (+) 0,80 (-) 0,00 Staphylococcus (-) 0,00 (+) 1,40 Pseudomonas aeruginosa (+) 1,03 (-) 0,00 Candida albicans (-) 0,00 (-) 0,00 Hình 4.5. Vòng kháng sinh của các chất chiết thô thân, lá cây hoa phấn đối với các chủng vi sinh. Hình 4.6. Vòng kháng sinh của các chất chiết thô rễ cây hoa phấn đối với các chủng vi sinh E. coli Staphylococcus Pseudomonas aeruginosa Candida albicans ĐC ĐC ĐC ĐC E. coli Staphylococcus Pseudomonas aeruginosa Candida albicans ĐC ĐC ĐC ĐC * Nhận xét Các chất chiết thô thân, lá cây hoa phấn ngoài tự nhiên trong ethanol có hoạt tính kháng sinh đối với các chủng: E. coli, Pseudomonas aeruginosa; kháng Pseudomonas aeruginosa mạnh hơn E. coli. Đƣờng kính các vòng kháng sinh này tuy không có sự khác biệt nhiều so với đƣờng kính vòng kháng sinh của các chất chiết thô từ lá lô hội ngoài tự nhiên nhƣng vòng kháng sinh rõ hơn rất nhiều. Điều đó chứng tỏ dịch chiết thân, lá hoa phấn ngoài tự nhiên kháng các chủng E. coli và Pseudomonas aeruginosa mạnh hơn hẳn dịch chiết lá lô hội ngoài tự nhiên. Các chất chiết thô rễ cây hoa phấn ngoài tự nhiên trong ethanol có hoạt tính kháng sinh với chủng Staphylococcus. Đƣờng kính vòng kháng sinh tƣơng đối lớn (1,4 cm) và rõ. 4.4.Thí nghiệm 4: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của mô sẹo cây hoa phấn Bảng 4.6. Kết quả hoạt tính kháng sinh và vòng kháng sinh của các chất chiết mô sẹo cây hoa phấn in vitro Dịch chiết Loại vi sinh vật Hoạt tính kháng sinh Đƣờng kính vòng kháng sinh (cm) Mô sẹo cây hoa phấn trong dung môi ethanol E. coli (+) 1,00 Staphylococcus (+) 0,80 Pseudomonas aeruginosa (+) 0,83 Candida albicans (-) 0,00 Hình 4.7. Vòng kháng sinh của các chất chiết thô mô sẹo cây hoa phấn đối với các chủng vi sinh. * Nhận xét Các chất chiết thô mô sẹo hoa phấn trong ethanol có hoạt tính kháng sinh đối với các chủng E. coli, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa; kháng E. coli mạnh hơn Staphylococcus và Pseudomonas aeruginosa. Vòng kháng sinh tƣơng đối rõ. So với các chất chiết thô của thân, lá cây hoa phấn ngoài tự nhiên thì đƣờng kính vòng kháng sinh của dịch chiết mô sẹo đối với chủng E. coli lớn hơn nhƣng đối với chủng Pseudomonas aeruginosa nhỏ hơn. Vòng kháng sinh của các chất chiết thô mô sẹo rõ hơn rất nhiều. Điều đó có thể chứng tỏ khả năng kháng của dịch chiết mô sẹo cao hơn của dịch chiết thân, lá cây hoa phấn ngoài tự nhiên đối với 2 chủng này. Dịch chiết mô sẹo hoa phấn và dịch chiết rễ hoa phấn kháng đƣợc chủng Staphylococcus, còn dịch chiết thân, lá cây hoa phấn ngoài tự nhiên thì không. Do vậy, ta có thể thay thế dịch chiết của thân, lá, rễ hoa phấn ngoài tự nhiên bằng dịch chiết mô sẹo hoa phấn để kháng lại 3 chủng vi khuẩn trên với hiệu quả có thể cao hơn. ĐC ĐC Staphylococcus Pseudomonas aeruginosa Candida albicans E. coli ĐC ĐC 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của cây lô hội và cây hoa phấn in vitro Bảng 4.7. Kết quả hoạt tính kháng sinh và vòng kháng sinh của chất chiết thô cây lô hội và cây hoa phấn in vitro Dịch chiết Loại vi sinh vật Cây lô hội invitro trong ethanol Cây hoa phấn in vitro trong ethanol Hoạt tính kháng sinh Đƣờng kính vòng kháng sinh (cm) Hoạt tính kháng sinh Đƣờng kính vòng kháng sinh (cm) E. coli (+) 0,85 (+) 0,90 Staphylococcus (+) 0,90 (+) 0,95 Pseudomonas aeruginosa (+) 0,80 (+) 1,05 Candida albicans (-) 0,00 (-) 0,00 Hình 4.8. Vòng kháng sinh của các chất chiết thô cây lô hội in vitro đối với các chủng vi sinh. E. coli Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Staphylococcus ĐC ĐC ĐC ĐC Hình 4.9. Vòng kháng sinh của các chất chiết thô cây hoa phấn in vitro đối với các chủng vi sinh. * Nhận xét Các chất chiết thô cây lô hội in vitro và cây hoa phấn in vitro trong ethanol có hoạt tính kháng sinh đối với các chủng E. coli, Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa. Vòng kháng sinh tƣơng đối rõ và lớn. So với các chất chiết thô cây lô hội ngoài tự nhiên thì các chất chiết thô cây lô hội in vitro có vòng kháng sinh rõ hơn rất nhiều mặc dù đƣờng kính nhỏ hơn đối với chủng Pseudomonas aeruginosa và dịch chiết này còn kháng đƣợc với chủng Staphylococcus. Chứng tỏ cây lô hội in vitro có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn cây lô hội ngoài tự nhiên. Có thể do hàm lƣợng các chất có hoạt tính kháng sinh trong cây lô hội in vitro cao hơn trong cây lô hội ngoài tự nhiên. So với các chất chiết thô cây hoa phấn ngoài tự nhiên thì vòng kháng sinh của các chất chiết thô cây hoa phấn in vitro rõ hơn và có đƣờng kính lớn hơn ( đối với chủng E. coli), còn kháng đƣợc với chủng Staphylococcus. E. coli Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Staphylococcus ĐC ĐC ĐC ĐC So với các chất chiết thô mô sẹo hoa phấn thì các chất chiết thô cây hoa phấn in vitro kháng E. coli yếu hơn, nhƣng kháng Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa mạnh hơn hẳn.  Nhìn chung các chất chiết thô mô sẹo và cây in vitro trong ethanol có khả năng kháng khuẩn tốt hơn các chất chiết thô cây ngoài tự nhiên. Có thể do các chất có hoạt tính kháng khuẩn trong cây in vitro có hàm lƣợng cao hơn cây ngoài tự nhiên. Các chất chiết thô trong ethanol của cây lô hội, cây hoa phấn ngoài tự nhiên và in vitro, mô sẹo hoa phấn in vitro không có khả năng kháng lại nấm C. albicans. Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Môi trƣờng thích hợp nhất cho sự tạo sẹo cây hoa phấn là môi trƣờng MS với BA 4 mg/l và 2,4-D 3 mg/l. - Môi trƣờng thích hợp nhất cho sự tạo chồi của cây lô hội và cây hoa phấn là môi trƣờng MS với BA 2 mg/l. - Dịch chiết trong ethanol của cây lô hội ngoài tự nhiên có khả năng kháng các chủng vi khuẩn: E. coli, Pseudomonas aeruginosa và không kháng đƣợc chủng vi khuẩn Staphylococcus, nấm Candida albicans. Tuy nhiên khả năng kháng rất yếu, vòng kháng sinh rất mờ và nhỏ. - Dịch chiết trong ethanol của cây lô hội in vitro: có khả năng kháng các chủng vi khuẩn: E. coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus. Khả năng kháng cao, vòng kháng sinh tƣơng đối rõ. - Dịch chiết trong ethanol của: + Thân, lá cây hoa phấn ngoài tự nhiên: có khả năng kháng các chủng vi khuẩn: E. coli, Pseudomonas aeruginosa và không kháng đƣợc chủng vi khuẩn Staphylococcus, nấm Candida albicans. Khả năng kháng tƣơng đối cao + Rễ cây hoa phấn ngoài tự nhiên: có khả năng kháng khuẩn Staphylococcus tƣơng đối cao. - Dịch chiết trong ethanol của mô sẹo cây hoa phấn và cây hoa phấn in vitro: có khả năng kháng các chủng vi khuẩn: E. coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus. Khả năng kháng cao, vòng kháng sinh tƣơng đối rõ. 5.2. Đề nghị Trong thời gian ngắn làm khóa luận tốt nghiệp này, những kết quả thu đƣợc chỉ là những kết quả bƣớc đầu. Nếu có thời gian, xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học cũng nhƣ môi trƣờng nuôi cấy cây lô hội và cây hoa phấn in vitro. Chẳng hạn nhƣ: - Khảo sát khả năng kháng sinh của các chất chiết thô cây lô hội, cây hoa phấn ngoài tự nhiên, cây lô hội, cây hoa phấn in vitro, mô sẹo trong các dung môi khác nhƣ: n – hexan, ether ethylic, diclometan, ethylaxetat, butanol… - Thử nghiệm khả năng kháng sinh của các chất chiết thô từ cây lô hội và cây hoa phấn trên các chủng vi sinh khác nhƣ liên cầu khuẩn Streptococcus, nấm mốc Aspergillus niger, Fusarium oxysporum… - Tìm hiểu qui trình chiết tinh các chất có hoạt tính sinh học (nhƣ aloin trong cây lô hội, acid ursolic trong cây hoa phấn). - Tìm hiểu cơ chế tác dụng của các chất có hoạt tính sinh học lên các chủng vi sinh gây bệnh để từ đó có thể tạo ra các chế phẩm sinh học thay thế thuốc kháng sinh. - Các môi trƣờng tối ƣu để nuôi cấy cây lô hội và cây hoa phấn in vitro. TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ Y tế, Vụ Khoa học – Đào tạo, 2001. Vi sinh vật y học. NXB Y Học Hà Nội. 2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng…, 2004. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, tập II. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật Hà Nội. 3. Nguyễn Đại Hải, 2006. Nuôi cấy mô cây bắt ruồi Drosera burmanniI Vahl và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết thô Plumbagin. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 4. Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công nghệ tế bào. NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 5. Phạm Thiệp, Lê Văn Thuần, Bùi Xuân Chƣơng, 2000. Cây thuốc, bài thuốc và biệt dược. NXB Y học. 6.Trần Linh Thƣớc, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo Dục. 7. Nguyễn Ngọc Trì, 2005. Sinh lý thực vật. Tài liệu lƣu hành nội bộ. * Tài liệu từ internet 8. Tian B, Hua YJ, Ma XQ, Wang GL. Relationship between antibacterial activity of aloe and its anthraquinone compounds, Department of Applied Bioscience, Institute of Nuclear-Agricultural Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029, Zhejiang, China, 2003. <URI: ve&dopt=AbstractPlus&list_uids=15615409&tool=iconabstr&query_hl=8&itool=pub med_docsum> ` 9. 10. _jalapa 11. Nguyễn Bá Huy Cƣờng. Cây nha đam, dược liệu quý. <URI: hold=-1&mode=flat&order=0&sid=746> 12. Yu Pan, Guo-Ping Chen, Yang Liu, Xio-Yun Wang, Xu-Quing Chen. Callus Induction of Aloe vera L var chinensis (Haw) Berg, 2007. <URI: =3&jnltype=472&jnliid=1561&issueiid=51279&atliid=833568> 13. Zhihua Liao, Min Chen, Feng Tan, Xiaofen Sun and Kexuan Tang. Microprogagation of endangered Chinese aloe, 2004. 14. X. Xu, D. Hunter, M.S. Reid. An efficient regeneration system for four o'clocks (Mirabilis jalapa). 15. 16. Rosca-Casian O, Parvu M, Vlase L, Tamas M. Antifungal activity of Aloe vera leaves, Department of Biology, Faculty of Biology and Geology, Babeş-Bolyai University, 42 Republicii Street, 400015 Cluj-Napoca, Romania, 2007. <URI: lView&TermToSearch=17336466&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubm ed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum> 17. Wang H, Li F, Wang T, Li J, Li J, Yang X, Li J. Determination of aloin content in callus of Aloe vera var. chinensis, College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453002, 2004. <URI: lView&TermToSearch=15704580&ordinalpos=1&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubm ed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus> 18. Cammue BP, De Bolle MF, Terras FR, Proost P, Van Damme J, Rees SB, Vanderleyden J, Broekaert WF. Isolation and characterization of a novel class of plant antimicrobial peptides form Mirabilis jalapa L. seeds, F. A. Janssens Laboratory of Genetics, Catholic University of Leuven, Heverlee, Belgium, 1992. <URI: lView&TermToSearch=1733929&ordinalpos=4&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubme d.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum> PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1  Bảng giá trị đã đƣợc biến đổi dùng phƣơng pháp arcsin của tỉ lệ tạo sẹo cây hoa phấn Nghiệm thức Số liệu thực (%) Số liệu biến đổi BD0 0,00 0,00 0,00 0,95 0,95 0,95 BD1 100,00 66,67 66,67 89,04 54,74 54,74 BD2 66,67 66,67 66,67 54,74 54,74 54,74 BD3 100,00 100,00 100,00 89,04 89,04 89,04 BD4 100,00 100,00 100,00 89,04 89,04 89,04  Bảng phân tích thống kê tỉ lệ tạo sẹo cây hoa phấn One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: SEOHOAPH.tlts Level codes: SEOHOAPH.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 15717.968 4 3929.4920 50.100 .0000 Within groups 784.327 10 78.4327 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 16502.295 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for SEOHOAPH.tlts by SEOHOAPH.nt -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 0 3 .950000 .000000 5.1131421 -7.108068 9.008068 1 3 66.173333 11.433333 5.1131421 58.115265 74.231401 2 3 54.740000 .000000 5.1131421 46.681932 62.798068 3 3 89.040000 .000000 5.1131421 80.981932 97.098068 4 3 89.040000 .000000 5.1131421 80.981932 97.098068 -------------------------------------------------------------------------------- Total 15 59.988667 2.286667 2.2866667 56.384989 63.592344 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 1 P = 0 Bartlett's test: B = 0 P(0) = 0 Hartley's test: 0 Multiple range analysis for SEOHOAPH.tlts by SEOHOAPH.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 3 .950000 X 2 3 54.740000 X 1 3 66.173333 X 3 3 89.040000 X 4 3 89.040000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 0 - 1 -65.2233 16.1161 * 0 - 2 -53.7900 16.1161 * 0 - 3 -88.0900 16.1161 * 0 - 4 -88.0900 16.1161 * 1 - 2 11.4333 16.1161 1 - 3 -22.8667 16.1161 * 1 - 4 -22.8667 16.1161 * 2 - 3 -34.3000 16.1161 * * denotes a statistically significant difference. 2. Phụ lục 2  Bảng giá trị đã đƣợc biến đổi dùng phƣơng pháp arcsin của tỉ lệ sống của mô sẹo cây hoa phấn Nghiệm thức Số liệu thực (%) Số liệu biến đổi BD0 0,00 0,00 0,00 0,95 0,95 0,95 BD1 100,00 100,00 100,00 89,04 89,04 89,04 BD2 100,00 100,00 100,00 89,04 89,04 89,04 BD3 100,00 100,00 66,67 89,04 89,04 54,74 BD4 66,67 66,67 66,67 54,74 54,74 54,74  Bảng phân tích thống kê tỉ lệ sống của mô sẹo cây hoa phấn One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: SEOHPN.tls Level codes: SEOHPN.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 16455.967 4 4113.9917 52.453 .0000 Within groups 784.327 10 78.4327 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 17240.294 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for SEOHPN.tls by SEOHPN.nt -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- 0 3 .950000 .000000 5.1131421 -7.108068 9.008068 1 3 89.040000 .000000 5.1131421 80.981932 97.098068 2 3 89.040000 .000000 5.1131421 80.981932 97.098068 3 3 77.606667 11.433333 5.1131421 69.548599 85.664735 4 3 54.740000 .000000 5.1131421 46.681932 62.798068 -------------------------------------------------------------------------------- Total 15 62.275333 2.286667 2.2866667 58.671656 65.879011 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 1 P = 0 Bartlett's test: B = 0 P(0) = 0 Hartley's test: 0 Multiple range analysis for SEOHPN.tls by SEOHPN.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 3 .950000 X 4 3 54.740000 X 3 3 77.606667 X 1 3 89.040000 X 2 3 89.040000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 0 - 1 -88.0900 16.1161 * 0 - 2 -88.0900 16.1161 * 0 - 3 -76.6567 16.1161 * 0 - 4 -53.7900 16.1161 * 1 - 2 0.00000 16.1161 1 - 3 11.4333 16.1161 1 - 4 34.3000 16.1161 * 2 - 3 11.4333 16.1161 * denotes a statistically significant difference. 3. Phụ lục 3  Bảng giá trị đã đƣợc biến đổi dùng phƣơng pháp arcsin của tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi cây lô hội Nghiệm thức Số liệu thực (%) Số liệu biến đổi B0 33,33 33,33 33,33 35,26 35,26 35,26 B1 100,00 100,00 66,67 89,04 89,04 54,74 B2 100,00 100,00 66,67 89,04 89,04 54,74 B3 100,00 100,00 66,67 89,04 89,04 54,74 B4 66,67 66,67 66,67 54,74 54,74 54,74  Bảng phân tích thống kê tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi cây lô hội One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------ Data: CNHADAM.tlmctc Level codes: CNHADAM.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 4396.7066 4 1099.1766 4.671 .0219 Within groups 2352.9800 10 235.2980 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 6749.6866 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for CNHADAM.tlmctc by CNHADAM.nt ------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- 0 3 35.260000 .000000 8.8562219 21.303017 49.216983 1 3 77.606667 11.433333 8.8562219 63.649683 91.563650 2 3 77.606667 11.433333 8.8562219 63.649683 91.563650 3 3 77.606667 11.433333 8.8562219 63.649683 91.563650 4 3 54.740000 .000000 8.8562219 40.783017 68.696983 ------------------------------------------------------------------------- Total 15 64.564000 3.960623 3.9606228 58.322247 70.805753 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.333333 P = 0.987654 Bartlett's test: B = 1.10379E6 P(115.153) = 0 Hartley's test: 5.1784E30 Multiple range analysis for CNHADAM.tlmctc by CNHADAM.nt ------------------------------------------------------------------------ Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------ 0 3 35.260000 X 4 3 54.740000 XX 1 3 77.606667 X 2 3 77.606667 X 3 3 77.606667 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 0 - 1 -42.3467 27.9140 * 0 - 2 -42.3467 27.9140 * 0 - 3 -42.3467 27.9140 * 0 - 4 -19.4800 27.9140 1 - 2 0.00000 27.9140 1 - 3 0.00000 27.9140 1 - 4 22.8667 27.9140 2 - 3 0.00000 27.9140 * denotes a statistically significant difference. 4. Phụ lục 4: Bảng phân tích thống kê số chồi trung bình/mẫu cấy cây lô hội One-Way Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------- Data: CHOINDAM.sctbtmc Level codes: CHOINDAM.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------ Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------ Between groups 409.28664 4 102.32166 272.089 .0000 Within groups 3.76060 10 .37606 ------------------------------------------------------------------------ Total (corrected) 413.04724 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for CHOINDAM.sctbtmc by CHOINDAM.nt ------------------------------------------------------------------------ Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------- 0 3 2.110000 .0585947 .3540527 1.552030 2.667970 1 3 10.000000 .2886751 .3540527 9.442030 10.557970 2 3 17.000000 .5773503 .3540527 16.442030 17.557970 3 3 15.500000 .2886751 .3540527 14.942030 16.057970 4 3 11.700000 .3511885 .3540527 11.142030 12.257970 ------------------------------------------------------------------------- Total 15 11.262000 .1583372 .1583372 11.012468 11.511532 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.53183 P = 0.240206 Bartlett's test: B = 1.99468 P(5.75403) = 0.218286 Hartley's test: 97.0874 Multiple range analysis for CHOINDAM.sctbtmc by CHOINDAM.nt ------------------------------------------------------------------------ Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------ 0 3 2.110000 X 1 3 10.000000 X 4 3 11.700000 X 3 3 15.500000 X 2 3 17.000000 X ------------------------------------------------------------------------ contrast difference limits 0 - 1 -7.89000 1.11594 * 0 - 2 -14.8900 1.11594 * 0 - 3 -13.3900 1.11594 * 0 - 4 -9.59000 1.11594 * 1 - 2 -7.00000 1.11594 * 1 - 3 -5.50000 1.11594 * 1 - 4 -1.70000 1.11594 * 2 - 3 1.50000 1.11594 * * denotes a statistically significant difference. 5. Phụ lục 5: Bảng phân tích thống kê chiều cao trung bình của chồi lô hội in vitro One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------ Data: CHOINDAM.cctb Level codes: CHOINDAM.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------ Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 19.796640 4 4.9491600 903.131 .0000 Within groups .054800 10 .0054800 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 19.851440 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for CHOINDAM.cctb by CHOINDAM.nt ------------------------------------------------------------------------ Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------ 0 3 4.0200000 .0305505 .0427395 3.9526446 4.0873554 1 3 2.3500000 .0404145 .0427395 2.2826446 2.4173554 2 3 2.4100000 .0472582 .0427395 2.3426446 2.4773554 3 3 1.0300000 .0351188 .0427395 .9626446 1.0973554 4 3 .8300000 .0556776 .0427395 .7626446 .8973554 ------------------------------------------------------------------------ Total 15 2.1280000 .0191137 .0191137 2.0978777 2.1581223 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.339416 P = 0.952099 Bartlett's test: B = 1.09335 P(0.743694) = 0.945833 Hartley's test: 3.32143 Multiple range analysis for CHOINDAM.cctb by CHOINDAM.nt ------------------------------------------------------------------------ Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------ 4 3 .8300000 X 3 3 1.0300000 X 1 3 2.3500000 X 2 3 2.4100000 X 0 3 4.0200000 X ------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 0 - 1 1.67000 0.13471 * 0 - 2 1.61000 0.13471 * 0 - 3 2.99000 0.13471 * 0 - 4 3.19000 0.13471 * 1 - 2 -0.06000 0.13471 1 - 3 1.32000 0.13471 * 1 - 4 1.52000 0.13471 * 2 - 3 1.38000 0.13471 * * denotes a statistically significant difference. 6. Phụ lục 6  Bảng giá trị đã đƣợc biến đổi dùng phƣơng pháp arcsin của tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi cây hoa phấn Nghiệm thức Số liệu thực (%) Số liệu biến đổi B0 0,00 0,00 0,00 0,95 0,95 0,95 B1 100,00 66,67 66,67 89,04 54,74 54,74 B2 66,67 66,67 66,67 54,74 54,74 54,74 B3 100,00 100,00 100,00 89,04 89,04 89,04 B4 100,00 100,00 100,00 89,04 89,04 89,04  Bảng phân tích thống kê tỉ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi cây hoa phấn in vitro. One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------- Data: HOAPHAN.tlmctc Level codes: HOAPHAN.nt Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------- Between groups 10209.800 4 2552.4499 8.136 .0035 Within groups 3137.307 10 313.7307 ------------------------------------------------------------------------ Total (corrected) 13347.106 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for HOAPHAN.tlmctc by HOAPHAN.nt ------------------------------------------------------------------------ Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------ 0 3 .950000 .000000 10.226284 -15.166136 17.066136 1 3 66.173333 11.433333 10.226284 50.057197 82.289469 2 3 66.173333 11.433333 10.226284 50.057197 82.289469 3 3 66.173333 11.433333 10.226284 50.057197 82.289469 4 3 66.173333 11.433333 10.226284 50.057197 82.289469 ------------------------------------------------------------------------ Total 15 53.128667 4.573333 4.573333 45.921312 60.336022 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.25 P = 1 Bartlett's test: B = 5.8668E6 P(129.873) = 0 Hartley's test: 2.12107E34 Multiple range analysis for HOAPHAN.tlmctc by HOAPHAN.nt ------------------------------------------------------------------------ Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------ 0 3 .950000 X 1 3 66.173333 X 2 3 66.173333 X 3 3 66.173333 X 4 3 66.173333 X ------------------------------------------------------------------------ contrast difference limits 0 - 1 -65.2233 32.2323 * 0 - 2 -65.2233 32.2323 * 0 - 3 -65.2233 32.2323 * 0 - 4 -65.2233 32.2323 * 1 - 2 0.00000 32.2323 1 - 3 0.00000 32.2323 1 - 4 0.00000 32.2323 2 - 3 0.00000 32.2323 * denotes a statistically significant difference. 7. Phụ lục 7: Bảng phân tích thống kê số chồi trung bình/mẫu cấy cây hoa phấn in vitro. One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------ Data: CHHPHAN.SCTBTMC Level codes: CHHPHAN.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------ Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------ Between groups 7.2621600 4 1.8155400 39.349 .0000 Within groups .4614000 10 .0461400 ------------------------------------------------------------------------ Total (corrected) 7.7235600 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for CHHPHAN.SCTBTMC by CHHPHAN.NT ------------------------------------------------------------------------ Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------ 0 3 1.0000000 .0000000 .1240161 .8045565 1.1954435 1 3 2.2000000 .0577350 .1240161 2.0045565 2.3954435 2 3 3.1700000 .0152753 .1240161 2.9745565 3.3654435 3 3 2.2000000 .1732051 .1240161 2.0045565 2.3954435 4 3 2.4000000 .2081666 .1240161 2.2045565 2.5954435 ------------------------------------------------------------------------ Total 15 2.1940000 .0554617 .0554617 2.1065950 2.2814050 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.563502 P = 0.181509 Bartlett's test: B = 2.66768 P(8.12034) = 0.043589 Hartley's test: 185.714 Multiple range analysis for CHHPHAN.SCTBTMC by CHHPHAN.NT ----------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------ 0 3 1.0000000 X 1 3 2.2000000 X 3 3 2.2000000 X 4 3 2.4000000 X 2 3 3.1700000 X ------------------------------------------------------------------------ contrast difference limits 0 - 1 -1.20000 0.39089 * 0 - 2 -2.17000 0.39089 * 0 - 3 -1.20000 0.39089 * 0 - 4 -1.40000 0.39089 * 1 - 2 -0.97000 0.39089 * 1 - 3 0.00000 0.39089 1 - 4 -0.20000 0.39089 2 - 3 0.97000 0.39089 * * denotes a statistically significant difference. 8. Phụ lục 8: Bảng phân tích thống kê chiều cao trung bình của chồi hoa phấn in vitro One-Way Analysis of Variance ------------------------------------------------------------------------ Data: CHPHAN.CCTB Level codes: CHPHAN.NT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance ------------------------------------------------------------------------ Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level ------------------------------------------------------------------------ Between groups 2.0283600 4 .5070900 178.553 .0000 Within groups .0284000 10 .0028400 ------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 2.0567600 14 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for CHPHAN.CCTB by CHPHAN.NT ------------------------------------------------------------------------ Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean ------------------------------------------------------------------------ 0 3 .5000000 .0000000 .0307679 .4515112 .5484888 1 3 1.6000000 .0577350 .0307679 1.5515112 1.6484888 2 3 1.1400000 .0305505 .0307679 1.0915112 1.1884888 3 3 1.1300000 .0057735 .0307679 1.0815112 1.1784888 4 3 .8100000 .0208167 .0307679 .7615112 .8584888 ------------------------------------------------------------------------ Total 15 1.0360000 .0137598 .0137598 1.0143151 1.0576849 Tests for Homogeneity of Variances ---------------------------------- Cochran's C test: 0.704225 P = 0.0382661 Bartlett's test: B = 2.12795 P(6.24961) = 0.100078 Hartley's test: 100 Multiple range analysis for CHPHAN.CCTB by CHPHAN.NT ------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------ 0 3 .5000000 X 4 3 .8100000 X 3 3 1.1300000 X 2 3 1.1400000 X 1 3 1.6000000 X ------------------------------------------------------------------------ contrast difference limits 0 - 1 -1.10000 0.09698 * 0 - 2 -0.64000 0.09698 * 0 - 3 -0.63000 0.09698 * 0 - 4 -0.31000 0.09698 * 1 - 2 0.46000 0.09698 * 1 - 3 0.47000 0.09698 * 1 - 4 0.79000 0.09698 * 2 - 3 0.01000 0.09698 * denotes a statistically significant difference.