Khóa luận Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

ếu không phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 4oC nhưng không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. Chuẩn bị mẫu Rã đông mẫu trước khi phân tích Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân tích. Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bên trong các dụng chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 – 5oC trong khoảng 18 giờ. Khi cần thiết, có thể giải đông nhanh ở 45oC trong 15 phút. Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu. Cân mẫu Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g. Lượng mẫu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng. Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích hợp. kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau: Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế bào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát triển được Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ống nghiệm có nắp. Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn ( hình 3.1). Hình 3.1 : Pha loãng mẫu [8] Đồng nhất mẫu Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng. Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu một lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng, lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính, lượng mẫu trích ra để phân tích là 25g. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 3.4.1 Phương pháp đổ đĩa 3.4.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Nguyên tắc Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ. 3.4.1.3 Môi trường sử dụng - Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer Pepton Water (BPW). - Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA) 3.4.1.4 Quy trình phân tích Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất được độ pha loãng 10-1 Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm 2 đĩa. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm Tính toán kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu 3.4.1.5 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2). Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10] Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí [10] - Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/ml - Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/ml - Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc Công thức tính kết quả Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo cong thức sau Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường fi: Độ pha loãng tương ứng Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau: Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5 Đĩa 1 235 26 16 Đĩa 2 246 21 10 Định lượng tổng số Coliforms 3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 3.5.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy 1 lượng nhất định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 10C trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red, crystal. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL. Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa. Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc. Quy trình phân tích Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu. Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms [8] Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa. Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để nguôị 45oC, lắc đều để đặc môi trường. Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn Coliforms. Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ ( hình 3.5) Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của Coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm ( hình 3.4) Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms [11] Thử nghiệm khẳng định. Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R ( hình 3.6) Hình 2.6 Khẳng định Coliforms Ghi kết quả Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi. Công thức tính Tổng số Coliforms (cfu/g). Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ. V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng. R = (Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số khuẩn lạc đã cấy). Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu 3.5.2 Phương pháp MPN 3.5.2.1 Nguyên tắc Số lượng Coliforms trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. Quy trình thưc hiện Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 3 ống chứa 10ml canh LSB Ủ 38oC trong 48 giờ, ghi nhận số ống có hơi Ủ ở 370C ± 10C trong 48 giờ, ghi nhận các ống sinh hơi (+) Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL 3.5.2.3 Thuyết minh quy trình Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 24-48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết qủa (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng ( hình 3.7) Hình 3.7 : Khẳng định Coliform[11] Hình 3.8: Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL[11] Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu ( hình 3.8) Xác định Escherichia coli trong thực phẩm Định tính E.coli trong thực phẩm 3.6.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm. 3.6.1.2 Nguyên tắc Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC). Quy trình phân tích Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu. Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-) Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa:Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC Cân 25g mẫu + 225 môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml môi trường BGBL Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính với E.coli Thuyết mình quy trình Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu Hình 3.9 : Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB[12] Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24 giờ ở 44oC Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi trong ống durham. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng E.coli: Khuẩn lạc tròn, dẹp,ánh kim tím, đường kính khoảng 0.5mm ( hình 3.9). Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc. Thử nghiệm khẳng định Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMViC. Thực hiện như sau. Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh Trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dương (+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện. Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng. Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt dung dịch KOH 40 % sau đó thêm dung dịch 1-αnapthol 5% tỷ lệ 1:3. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu. Thử nghiệm citrate : Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiên Simmon Citrate có màu xanh lục, ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Phản ứng dương (+) tính khi môi trường đổ sang màu xanh dương, âm tính (-) khi môi trường không đổi màu. Kết quả thử nghiệm phát hiện E.coli (bảng 3.1) Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá TT Thử nghiệm sinh hoá Kết quả 1 Indol + 2 Methyl red + 3 Voges Prokauer - 4 Khả năng sử dung citrate - Hình 3.10: Nghiệm pháp IMViC [12] A: Indol (+) , B: Methyl red(+) C: Voges Prokauer (-), D: khả năng sinh citrate (-) Ghi kết quả Phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC có kết quả (+ + - - ) ( hình 3.10) Không phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC không có kết quả (+ + - - ) Phát hiện hay không phát hiện E.coli trong 25g mẫu Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp dếm khuẩn lạc Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 440C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình đặc trưng của Coliforms. Khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC. Môi trường hóa chất Môi trường canh Trypton Soya Agar (VRB) Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth) Môi trường canh Lactose Trypton Laurl Sulphate Broth (LST Broth) Môi trường canh Trypton Broth. Môi trường canh MR-VR Broth Môi trường thạch Simmon Citrate Thuốc khử Kovac’s. Quy trình phân tích Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đĩa Petri, bổ sung 5ml môi trường TSA, lắc đều, để yên 1-2 giờ Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB, để đông, ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ Chọn 3-5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào ống canh EC, ủ ở 440C, 24-48 giờ Cấy vào các môi trường Trypton, Methyl Red, Voges- Prokauer, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC , ủ ở 440C, 24 giờ Chọn ống canh (+) ( sinh hơi) IMViC ++--, tính tỷ lệ khẳng định E.coli Tính toán mật độ E.coli Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5mm Thử nghiệm IMViC Thuyết minh quy trình Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa Petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 450C. Lắc tròn đĩa Petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều khoảng 3-5 lần để trộn đều dịch mẫu với môi trường. bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370C ±10C trong 24-48 giờ. Thực hiện trên 2 mẫu nồng độ pha loãng lien tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10-100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với nồng độ pha loãng. Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường EC, ủ ở 44 ±0,50C trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) ( sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các môi trường sau: canh trypton, canh MR-VR, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 ±0,50C trong 24 giờ. Thực hiện thử nghiệm Indol, Merthy Red, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( nghiệm pháp IMViC là ++--). Cách tính kết quả Tính tỷ lệ khẳng định và tính mật độ E.coli ( CFU/ml hay CFU/mg) theo công thức: Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại mỗi độ pha loãng V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng R: Tỷ lệ khẳng định Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp MPN Nguyên tắc Số lượng E.coli trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. Môi trường và hóa chất - Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate). - Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL). - Môi trường lỏng E. coli (E. coli medium, canh EC). Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. - Canh tryptone. - Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate). - Dịch nước muối pepton SPW (Saline pepton Water). - Thuốc khử Kovac's. - Canh MR- VP. - Thuốc khử Methyl Red. - Thuốc khử α - napthol. 3.6.3.3 Quy trình phân tích Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 3 ống chứa 10ml canh LSB Ủ 38oC trong 48 giờ, ghi nhận số ống có hơi Ủ ở 44,50C ± 0,20C trong 24 giờ, ghi nhận các ống sinh hơi (+) Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) môi trường canh EC Cấy chuyền dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Chọn khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MDVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC Ủ ở 370C trong 24 giờ Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu. Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-) Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli 3.6.3.4 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị dịch đồng nhất mẫu pha loãng mẫu đề có dịch mẫu có độ pha loãng 10-1 Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng E.coli trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ±10C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết qủa (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng. Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5oC ±0,20C trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng. Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB ủ các đĩa này ở 370C trong 24 giờ để tìm các khuẩn lạc E. coli giả định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MDVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC. Khuẩn lạc E. coli. giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là ++ - - chính là E.coli. Ống nghiệm cho các kết quả (+) trong môi trường EC vào khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E. coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi bộ pha loãng của mẫu. Xác đinh E.coli trong thực phẩm bằng Phương pháp ELISA Định nghĩa, nguyên tắc Phương pháp ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay phương pháp thử miễn dịch dùng men ( Enzyme Immuno Assay, EIA) dựa cơ sở sử dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc hiệu với một kháng nguyên và được gắn với một loại enzyme nhất định. Tiền đề cho phương pháp này là hoạt tính của cả kháng nguyên (hoặc kháng thể) lẫn của enzyme khi liên kết với nhau trong thể tiếp hợp đều không chịu sự thay đổi nào đáng kể. Enzyme liên kết trong thể tiếp hợp xúc tác cho một phản ứng hóa học, phản ứng này sinh ra một chất có màu từ cơ chất không màu. Sản phẩm có màu này có thể tan hoặc không tan tùy thuộc vào tác nhân phản ứng được lựa chọn dùng cho enzyme nói trên và phương thức miễn dịch. Sản phẩm có màu này có thể phát hiện bằng mắt thường khi cần kết quả định tính hoặc có thể đo bằng quang phổ kế khi cần kết quả định lượng. Các enzyme tiêu biểu thường dùng là peroxidase, phosphatase kiềm... Chủng bị bề mặt ( microtiter) có gắn kháng thể Rửa đĩa, kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi Phủ mẫu chứa kháng nguyên cần xác định Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzyme Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chuẩn đoán Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi Thêm cơ chất Đo cường độ sáng, qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể Quy trình phân tích Thuyết minh quy trình Mẫu hoặc dịch chiết mẫu được tiếp xúc với chất mang, đáy ống nghiệm hoặc khuôn lõm có gắn kháng thể. Sau đó được ủ ở370C trong 20 – 24 giờ để kháng nguyên ( nếu có) kết hợp với kháng thể bắt ( capture antibody). Sau đó người ta rửa đĩa, kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Sau đó, ta thêm các kháng thể đặc hiệu cho Hình 3.11: Dạng bánh kẹp gồm kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp hợp chứa kháng thể [13] kháng nguyên cần chuẩn đoán. Tiếp theo ta thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn kết với enzyme và đem ủ ở 250C trong 2 giờ. Kế tiếp, người ta đổ dịch thế tiếp hợp đi, lại rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. Và cho dung dịch chứa cơ chất của enzyme vào. Sau 30 phút ở nhiệt độ phòng, thì dừng phản ứng lại và màu sắc hiện ra được quan sát bằng mắt thường hoặc được đo bằng quảng phổ kế ở bước sóng 450nm. Nếu kháng nguyên có trong mẫu, một dạng bánh kẹp gồm: kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp hợp chứa kháng thể phát hiện được hình thành trên bề mặt chất mang, trong ống nghiệm hoặc khuôn lõm. Enzyme của thể tiếp hợp sẽ tạo ra một sản phẩm có màu từ cơ chất được đưa vào. Trong trường hợp không có kháng nguyên, thể tiếp hợp chứa kháng thể phát hiện sẽ không gắn với chất mang, đáy ống nghiệm hoặc khuôn lõm, như vậy màu sẽ không hiện ra khi cho cơ chất của enzyme vào ( hình 3.11 và hình 3.12) Hình 3.12: Tổng quát quá trình phát hiện E.coli bằng phương pháp ELISA [13] Xác định tổng nấm men, nấm mốc trong thực phẩm 3.7.1 Nguyên tắc Trong thực phẩm, nấm men và nấm mốc hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm men nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải và để khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar ( DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm có hàm lượng nước thấp như các loại thực phẩm khô, gạo, ngũ cốc, tiêu, các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường hay muối cao. Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có hàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm từ sữa, các loại rau quả và trái cây tươi, các loại đồ hộp... Đối với mẫu có mật độ nấm mốc thấp, ví dụ như mỹ phẩm, môi trường được sử dụng là môi trường Malt Extract Agar (MEA) hay Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40ppm Chloramphenicol hay cholotetracyline. Ý nghĩa Tổng vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu thực phẩm chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm. Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thực phẩm đẫn đến biến đổi chất lượng: 106 tế bào/g (ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không. Một vài trường hợp vi sinh vật bằng 106 tế bào/g (ml) thực phẩm chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học. Môi trường và hóa chất - Dung dịch pha loãng ( nước pepton 1%) - Môi trường thạch DBRC. - Môi trường thạch MEA. - Môi trường thạch PDA. - Môi trường thạch SDA - Môi trường thạch SDB Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong đĩa petri, làm khô bề mặt trong đều kiện vô trùng, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng. Quy trình phân tích định tính nấm mốc Quy trình phân tích Đồng nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ ở 300C, 1-7 ngày Cấy tranh trường có mốc mọc lên đĩa SDA, MEA hay PDA, ủ ở 300C trong 7 ngày Kết luận: có hay không có nấm mốc Thuyết minh quy trình Đối với mẫu có nguy cơ nhiễm và mật độ nhiễm mốc quá thấp, việc phân tích thường được thực hiện một cách định tính theo trình tự sau: mẫu được pha loãng 10-1 và đồng nhất trong môi trường SDB. Dịch đồng nhất được ủ 300C, theo dõi từng ngày đến 7 ngày. Nếu trong canh trường có sự xuất hiện của nấm mốc, tiến hành chuyển lên các đĩa thạch SDA, MEA hay PDA, ủ ở 300C trong 7 ngày. Các khuẩn lạc nấm mốc xuất hiện trên các đĩa môi trường này được cấy chuyền lên bề mặt ống thạch nghiêng SDA để định danh khi cần thiết. 3.7.5 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc 3.7.5.1 Quy trình phân tích Đồng nhất pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18 ủ ngửa đĩa ở 250C, 5-7 ngày Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính mật độ (CPU/g) Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ ở 300C, 7 ngày Định danh 3.7.5.2 Thuyết minh quy trình Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng. Trường hợp mẫu dạng khô, ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 30 phút trước khi đồng nhất mẫu. Mẫu được đồng nhất bằng máy dập mẫu trong 2 phút và được pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân liên tiếp thích hợp. Hút vô trùng 0,1ml dịch mẫu lên các đĩa môi trường DBRC hoặc DG18. Nếu mật độ nấm men và nám mốc có thể cấy 1ml mẫu. Dùng que gạt thủy tinh trải dịch mẫu đều trên bề mặt đĩa môi trường cho đến khi khô. Đặt ngửa đĩa trong bao nylon, để hở miệng bao, ủ ở nhiệt độ 250C trong 5-7 ngày. Đĩa đã được đặt ngửa để tạo độ ẩm cho sự phát triển cuẩ nấm men mốc và hạn chế làm khô thạch. Thực hiện 3 đĩa cho mỗi độ pha loãng. Đếm và số lượng khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên tất cả các đĩa cấy. Khi cần thiết quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hay kính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay mốc. Kết quả được ghi bằng đơn vị CPU/g. Nếu có yêu cầu phân loại hay định danh các loại nghi ngờ sinh độc tố, các khuẩn lạc nấm mốc được cấy chuyền vào trong các ống thạch nghiêng SDA để gởi đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh và phân loại nấm Cần lưu ý rằng tổng thời gian ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thời gian ủ không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào trong không khí, gây nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. Công thức tính: Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g. CHƯƠNG 4 : ĐÁNH GIÁ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm tổng vi sinh vật hiếu khí Nhận xét: phương pháp đổ đĩa cho kết quả chính xác. Phương pháp đổ đĩa cho kết quả nhanh hơn và phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt độ ở nước ta hơn. Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: hầu hết qua kiểm nghiệm các mẫu hực phẩm chế biến sẵn đều bắt gặp vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên vi sinh vật hiếu khí chỉ có giá trị chỉ thị về hiện trạng của sản phẩm hơn là dự báo về thời hạn sử dụng của sản phẩm bởi khó xác định tỷ lệ vi khuẩn gây hư hỏng. Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm Coliforms Phương pháp thử: Phương pháp Đổ đĩa MPN Môi trường nuôi cấy VRB LSB Tiến hành thử Pha loãng TSA VRB Ủ 37oC/24 giờ, Khuẩn lạc đặc trưng của coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm Pha loãng LSB Ủ 38oC trong 48 giờ Nhận xét: Cả hai phương pháp đổ đĩa và phương pháp MPN đều có ưu điểm là: chi phí thấp, không cần máy móc hiện đại. Nhưng cũng đồng thời có một số nhược điểm như: thời gian cho kết quả lâu, kết quả không chính xác tuyệt đối. Tuy nhiên phương pháp đổ đĩa thời gian cho kết quả nhanh hơn và phù hợp với điều kiện ở nước ta đồng thời đây cũng là phương pháp tối ưu. Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: Hầu hết qua quá trình kiểm nghiệm các mẫu thực phẩm chế biến sẵn đều không bắt gặp Coliforms. Cần lưu ý là các vi sinh vật gram (+) như Staphylococcus aureus, Streptococcus, Lactobacillus, trực khuẩn sinh bào tử dạng hiếu khí lẫn kỵ khí đều mọc rất chậm nên môi trường VRB và rất khó phát triển thành khuẩn lạc nhìn thấy được trong vòng 24 giờ. Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn thực phẩm. sự có mặt một lượng lớn Coliforms và E.coli trong thực phẩm là điều không mong muốn nhưng cũng không dễ dàng loại bỏ chúng hoàn toàn khỏi thực phẩm chế biến. Vấn đề ở chỗ số lượng chúng đến mức nào là chỉ thị cho tính không an toàn của thực phẩm. Test Coliforms được dùng rộng rãi trong việc kiểm soát vệ sinh môi trường của nhuyễn thể hai mảnh song không phải luôn là chỉ thị tốt về chất lượng vệ sinh. Nói chung các nhuyễn thể hai mảnh khai thác từ vùng nước đạt chỉ tiêu về Coliforms thương có chỉ tiêu về chất lượng vệ sinh đạt, song một số vi sinh vật gây bệnh vẫn hiện diện ở chúng. Chỉ tiêu Coliforms cũng có giá trị nhất định như một chỉ thị vệ sinh đối với thự phẩm và tỏ ra khá hữu hiệu trong chương trình an toàn chất lượng thực phẩm. 4.3 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm E.coli 4.3.1 Kiểm nghiệm theo phương pháp định tính, phương pháp MPN và phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp Định tính MPN Đếm khuẩn lạc Tiến hành thử Pha loãng BGBL , ủ 44oC trong 24 giờ chọn các ống sinh hơi EMB , ủ ở 37 oC trong 24 giờ, khuẩn lạc E.coli dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm. TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ , thử các test sinh hóa để xác định có hay không có E.coli trong mẫu. Pha loãng LSB ủ 38oC trong 48 giờ, cấy chuyển những ống (+) sang EC ủ 44,50C trong 24 giờ. EMB ủ ở 37 oC trong 24 giờ, khuẩn lạc E.coli dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm Thử các test sinh hóa để xác định có phải là E.coli trong mẫu hay không. Pha loãng cấy 1ml mẫu vào đĩa petri + 5ml môi trường TSA, để yên 1-2 giờ thêm 10-15ml môi trường VRB, ủ 370C trong 24 – 48 giờ Đếm khuẩn lạc màu đỏ đến đổ đậm, có vòng tủa muối mật cấy vào canh EC, ủ 440C, 24-48 giờ chọn ống sinh hơi cấy vào ống canh trypton, MR-VR, thạch Simmon Citrate ủ 440C trong 24 giờ,thử nghiệm IMViC sau đó tính tỷ lệ khẳng định E.coli , tính toán mật độ E.coli. Nhận xét: Ba phương pháp trên là ba phương pháp cổ điển thường dùng nhất cho việc xác định E.coli. Nếu nghi ngờ có E.coli sẽ thử phản ứng sinh hóa. Tuy nhiên, thay vì thử phản ứng sinh hóa mất 24 giờ ta sẽ chuyển sang cấy vào môi trường Rapid E.coli. Ba phương pháp này có ưu điểm là không tốn nhiều chi phí. Tuy nhiên có một số nhược điểm như kết quả không được chính xác hoàn toàn, tốn nhiều thời gian… Trong ba phương pháp trên, phương pháp định tính là tối ưu nhất và được dùng để khẳng định E.coli trong thực phẩm nhiều nhất. Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận, chính xác. 4.3.2 Kiểm nghiệm theo phương pháp ELISA Một số bước quan trọng trong phương pháp ELISA để phá hiện E.coli Phủ đãi bằng kháng thể. Thêm mẫu xác định kháng nguyên. Kháng nguyên ( nếu có) sẽ gắn với kháng thể. Kháng thể dùng để phát hiện được thêm vò và kết hợp với kháng nguyên. Thêm kháng thể thứ cấp lien kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể dùng để phát hiện. Thêm cơ chất. enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được. Nhận xét: Phương pháp ELISA có ưu điểm là cho kết quả chính xác, nhanh chóng, tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên chi phí để mua thiết bị quá lớn. Ngoài phương pháp ELISA còn có các phương pháp hiện đại khác như kỹ thuật Petrifilm, Polymerase Chain Reaction (PCR)… Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: hầu hết qua kiểm nghiệm các mẫu thực phẩm chế biến sẵn đều không bắt gặp vi khuẩn E.coli Thảo luận về khả năng sinh Indol trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: phát hiện khả năng của vi khuẩn có thể tạo indol trong môi trường canh trypton. Cơ sở sinh hóa: Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo nên các hợp chất indol hay các dẫn xuất của chúng như: indol, skatol (methyl indol) và indolacetic. Một số enzyme nội bào được goị chung là trytophanase tham gia quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động thủy giải tryptophane. Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolepyruvic, từ đó indol được hình thành trong quá trình khử amin, hình thành skatol là quá trình khử carboxyl của acid indol acetic. Quá trình thủy giải trytophan có thể được mô tả qua quá trình: Enzyme trytophanase xúc tác phản ứng khử amin bởi sự tấn công vào phân tử tryptophan ở vị trí mạch nhánh và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Sự tách amin từ trytophanane là một dạng phản ứng khử. Qua quá trình này nhóm amin được tách ra và chuyển thành NH3, quá trình khử giải phóng một phần năng lượng được sử dụng cho hoạt động tăng trưởng của vi sinh vật. Đồng thời quá trình này còn tạo thành acid pyruvic, cơ chất tham gia vào chu trình Krebs’ để tiếp tục thu năng lượng. Phát hiện indol và các dẫn xuất cảu chúng trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc khử Kovac’s hay Ehrlich’s. Cơ chất chính tham gia phát hiện indol trong môi trường nuooicaays là p-dimethylaminbenzaldehyde. Chất này phản ứng với indol tạo thành một phức hợp màu đỏ. Phản ứng này là do nhân pyrrol của indol hản ứng với nhóm aldehyde của p-dimethylaminbenzaldehyde qua hai giai đoạn để tạo thành nhân quinine có màu đỏ, phản ứng như sau: Hình 4.1: Indol + và Indol - [11] Phương pháp thử: vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường canh trypton khoản 24-48 giờ. Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc khử Kovac’s hay Erhlich. Quan sát sau vài phút, phản ứng dương tính nếu trên bề mặt môi trường có vòng tròn màu đỏ xuất hiện. ngược lại nếu không có sự xuất hiện của màu đỏ hồng được coi là phản ứng âm tính ( hình 4.1) Thảo luận về thử nghiệm methyl red (MR) trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: thử nghiệm Methyl red nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bề trong môi trường từ trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa: thử nghiệm Methyl red trên cơ sử sử dụng chất chỉ thị pH là methyl red để nhận biết lượng ion H+ trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men gluco. Hàm lượng ion H+ có trong môi trường phụ thuộc vào tỉ lệ CO2 và H2, hàm lượng các chất này lại tùy thuộc vào con đường chuyển hóa của tường loài vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường được xác định trong khoảng 18- 24 giờ, tuy nhiên các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường ngay từ khi chúng bắt đầu phát triển. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy vi sinh vật có phản ứng MR dương tính sẽ tích lũy acid trong môi trường ngày càng nhiều hơn, độ pH trong môi trường ngày càng giảm. Đối với các vi sinh vật cho phản ứng MR âm tính, ngay ban đầu một lượng acid được hình thành trong môi trường, nhưng kéo dài thời gian nuoi cấy vi sinh vật này tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm acid bằng các phản ứng như decarboxyl tạo nên các sản phẩm trung tính như acetoin ( acetyl methylcarbinol) và kết quả là làm cho pH trong môi trường chuyển dần về trung tính. Trong một số trường hợp khác vi sinh vật cũng sản sinh acid tỏng môi trường nhưng các acid này cho hàm lượng ion H+ thấp như acid lactic, acid acetic, acid formic… Bởi vid các acid này có xu hướng chuyển về trung tính do hiện tượng tạo thành các carbonate và tạo thành các sản phẩm như CO2 và các hợp chất ammonium trong môi trường các sản phẩm này làm tăng pH trong môi trường. Thử nghiêm MR phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định sự khác nhau trong các con đường chuyển hóa Glucose. Thử nghiệm này thường được tiến hành trong khoảng 2-5 ngày ở 370C. Phương pháp tiến hành: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose phosphate (MR-VP broth) ủ trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc khử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng. ( hình 4.2) Chủng VSV ủ 2 – 5 ngày 37oC Pứ âm tính Pứ dương tính Đối chứng MR broth Hình 4.2 : Thử nghiệm MR [7] Thảo luận về thử nghiệm Voges – Proskauer trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa: thử nghiệm Voges – Proskauer nhằm mục đích phát hiện acetylmethylcarbimol, mọt sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Quá trình phân hủy glucose trong tế bào vi sinh vật tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đây có thể chia vi sinh vật thành hai nhóm theo hai con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau như: Nhóm trao đổi không tạo thành 2,3-butanediol; nhóm thứ hai quá trình này tạo thành sản phẩm trung gian là 2,3-butanediol, được gọi là nhóm Voges- Prokauer dương. Tuy nhiên thử nghiệm Voges- Prokauer nhằm mục đích phát hiện acetylmethylcarbimol, một tiền chất của 2,3-butanediol. Phân tử acetylmethylcarbimol được tạo thành do quá trình khử nhóm carboxyl của acid pyruvic, phản ứng như sau: 2 Pyruvate acetoin + 2 CO2 Vì acetylmethylcarbimol là một sản phẩm trung gian trong bước tạo thành 2,3-butanediol nên trong moi trường nuôi cấy tích lũy một lượng rất ít tiền chất này. Để acetylmethylcarbimol tích lũy nhiều, dễ dàng cho việc phát hiện, vi sinh vật phải nuôi trong điều kiện hiếu khí. Quá trình chuyển hóa giữa acetylmethylcarbimol và 2,3-butanediol là một quá trình thuận nghịch, có thể biểu diễn quá trình này như sau: Để phát hiện acetylmethylcarbimol trong môi trường nuôi cấy 1-napthol được sử dụng như mooyj thuốc khử phát hiện trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra do KOH 40% hay NaOH 40% được cho vào môi trường thử nghiệm. Cơ chế phản ứng nhận biết acetylmethylcarbimol được biểu diễn như sau: Phức hợp màu đỏ hồng Trong các thành phần tham gia phản ứng để tạo phức chất có màu đổ hòng có hợp chất guanidine, ví dụ arginine NH:C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-CÔH, chất này hiện diện trong peptone được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp tiến hành: cấy vi sinh vật vào trong môi trường canh glucose phosphate, ủ ở nhiệt độ 370C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào canh khuẩn sau nuôi cấy 3ml dung dịch 1-napthol 5% trong cồn, bổ sung thêm 3ml dung dịch KOH hay NaOH 40%, lắc mạnh. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges- Prokauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sang, phản ứng Voges- Prokauer âm tính khi không có sự chuyển màu này. Thảo luận về thử nghiệm citrate trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrate như nguồn carbon duy nhất. Cơ sở sinh hóa: năng lượng cung cấp cho vi sinh vật khi trong môi trường không có nguồn nguyên liệu sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất. Thông thường, sự trao đổi chất citrate bao gồm các bước kết hợp acetyl – CoA để tạo thành oxalacacetate để cho chúng đi vào chu trình Kreb. Con đường đồng hóa citrate ở các vi khuẩn rất nhanh qua chu trình tricarboxylic acid hay con đường lên men citrate. ở vi khuẩn sự tách citrate bao gồm một hệ thống enzyme không có sự tham gia của enzyme acetyl – CoA, enzyme này được gọi là citratase ( citrate axaloacetat – lyase) hay citate demolase. Enzyme này đòi hỏi một cation có hóa trị 2 cho hoạt động của chúng, thông thường các cation này là magie (Mg2+) hay mangan (Mn2+). Bước đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate. Đây là hai sản phẩm trung gian trong quá trình đồng hó citrate, còn sản phẩm nhận được từ quá trình này phụ thuộc vào pH của mooi trường. nếu pH kiềm thì trong môi trường sẽ nhận được nhiều acetate và formate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactate và CO2. pH trên 7,0 không có sản phẩm lactate trong môi trường và sản phẩm nhận được như sau: Citrate CO2 + Formic acid +2 Acetic acide ở pH acid acetyl methylcarbinol (acetoin) và latate là sản phẩm chính của quá trình sử dụng citate. Môi trường sử dụng cho quá trình lên men citrate còn chứa muối vô cơ ammonium. Một vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate là nguồn carbon duy nhất cũng có thể sử dụng ammonium như nguồn nitơ duy nhất, ammonium bị phân hủy để tạo thành ammonia, chất này sẽ làm kiềm môi trường nuôi cấy. Deffner và Franke thành lập công thức cho môi trường citrate cho các vi sinh vật đường ruột, sản phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy như sau: 4 Citrate 7 Acetate + 5CO2 + formate + Succinate Sự sử dụng các acid hữu cơ ở dạng muối của chúng như là nguồn carbon tạo nên các carbonate hay bicarbonate kiềm tính. Để sử dụng cho việc thử nghiệm citrate, có thể sử dụng môi trường Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser. Nên cấy một lượng vi sinh vật vừa phải, nếu cấy với mật độ quá dày có thể gây nên hiện tượng dương tính giả. Sau khi cấy, ử ở nhiệt độ 30-370C, quan sát sự phát triển của vi sinh vật và sự di chuyển sang kìm của môi trường. Các chủng vi sinh vật đối chứng: đối chứng dương: P.rettgeri; đối chứng âm: S. epidermidis. Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm Tổng nấm men, nấm mốc 4.4.1 Quy trình phân tích định tính nấm mốc - Phương pháp thử : Đổ đĩa - Môi trường nuôi cấy: SDA, MEA hay PDA - Ủ ở 30oC trong 7 ngày Nhận xét: Phương pháp này cho kết quả chính xác, tốn ít chi phí. Phương pháp này phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt độ ở nước ta. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là mất nhiều thời gian Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. 4.4.2 Quy trình phân tích định lượng tổng nấm men, nấm mốc Phương pháp thử: đổ đĩa Môi trường nuôi cấy:DRBC hoặc DG18 Ủ ở 25oC từ 5-7 ngày Nhận xét: phương pháp này cho kết quả chính xác, tốn ít chi phí. Phương pháp này phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt độ ở nước ta. Tuy nhiên, phương pháp này mất nhiều thời gian Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: hầu hết qua kiểm nghiệm các mẫu thực phẩm chế biến sẵn đều bắt gặp tổng nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên tổng nấm men, nấm mốc chỉ có giá trị chỉ thị về hiện trạng của sản phẩm hơn là dự báo về thời hạn sử dụng của sản phẩm bởi khó xác định tỷ lệ vi khuẩn gây hư hỏng. CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau quá trình nghiên cứu, tôi nhận thấy rằng Coliform và E.coli là loài vi khuẩn khá nguy hiểm, chúng gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết, một só bệnh khác và có thể dẫn đến tử vong. Ngoài ra còn có nấm men, nấm mốc và một số loài vi khuẩn hiếu khí khác cũng có khả năng gây bệnh nhưng không nặng như E.coli. Hầu như thực phẩm chế biến sẵn không có các vi khuẩn gây bệnh nên không gây hại cho cơ thể con người. Tuy nhiên, một số loại thực phẩm được bán ở một số các tiệm ăn , vỉa hè mất vệ sinh, không an toàn vệ sinh thực phẩm dẫn đến một số trường hợp bị ngộ độc thực phẩm và có thể dẫn đến tử vong. Mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm của nước ta tuy đã trải rộng khắp đất nước nhưng nguồn nhân lực quá mỏng cộng với năng lực của cán bộ kiểm dịch còn thấp ở các địa phương, nhất là Thành phố Hồ Chí Minh và Thủ Đô Hà Nội. Kiến nghị Trong việc kiểm tra các chỉ tiêu trên, có một số phần do thời gian quá gấp mà tôi chưa thể thực hiện được: + Khảo sát trực tiếp các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn. + Khảo sát tình trạng vệ sinh của các khu buôn bán. + Khảo sát quá trình giết mổ gia súc, gia cầm trên một số địa bàn. Đặc biệt là địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh. Thành lập các trung tâm kiểm dịch trên các địa bàn và yêu cầu trước khi bán các thực phẩm chế biến sẵn phải qua kiểm dịch và sử dụng các dụng cụ phân phối hợp vệ sinh. Nên thành lập các địa điểm bán thực phẩm chế biến sẵn tập trung để dễ dàng kiểm tra vệ sinh khu buôn bán. Thường xuyên tổ chức các đợt kiểm tra khu chăn nuôi và giết mổ để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.