Khóa luận Nghiên cứu định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

3, 14, 15] Công thức cấu tạo Công thức cấu tạo cetirizin. Mô phỏng cấu tạo của cetirizin Công thức phân tử : C18H25ClN2O3 Khối lượng phân tử: 461, 82 Tên khoa học: acid (RS)-2-[2[4[(4-Clorophenyl)phenylmethyl]piperazin-1-yl] ethoxy]acetic. Tính chất Cetirizin có dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, pKa1 = 2,9 tương ứng pKa cuả nhóm cacboxylic; pKa2 = 8,3 tương ứng pKa nhóm amin bậc 3; Tan tốt trong nước, đặc biệt là trong aceton và methylen clorid; Trong phân tử cetirizin có dây nối liên hợp nên có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại. Phổ hấp thụ của dung dịch 20µg/ml trong acid hydrochlorid R (10,3g/l) trong giới hạn quét phổ từ 210nm đến 350 nm có cực đại hấp thụ tại 231nm với độ hấp thụ riêng 359-381. Tác dụng dược lý Tác dụng dược lực học: Cetirizin là chất thuộc nhóm dẫn chất của piperazin, là chất chuyển hoá của hydroxyzin (oxy hoá nhóm chức –OH alcol thành –COOH) có tác dụng đối kháng histamin mạnh, kéo dài và đặc biệt chọn lọc trên thụ thể H1. Cetirzin có tác dụng an thần, gây ngủ và kháng cholinergic đều rất yếu, không kháng serotonin. Cetirizin ức chế giai đoạn sớm của phản ứng dị ứng qua trung gian histamin và cũng làm giảm sự di dời của các tế bào viêm. Giảm giải phóng các chất trung gian ở giai đoạn muộn của phản ứng dị ứng. Chất này có tác dụng bảo vệ dưỡng bào, giảm đáng kể đáp ứng hen suyễn với histamin. Tác dụng dược động học: Cetirizin sau khi uống phân bố rất nhanh, nồng độ thuốc trong huyết tương đạt được sau 30 phút đến 60 phút. Trên nghiên cứu những người tình nguyện với 10mg cetirizin mỗi ngày, uống trong 10ngày nồng độ đỉnh huyết tương đạt 311 ng /ml, nửa đời huyết tương xấp xỉ 11h, liên kết với protein mạnh 93%. Thời gian bán huỷ trung bình khoảng 8,3h. Thuốc chịu ảnh hưởng chuyển hoá của hệ enzym cytochrom 3A4P. Thuốc được đào thải chủ yếu qua thận khoảng 70%, qua gan khoảng 10%. Tác dụng không mong muốn Tác dụng không mong muốn xảy ra nhiều nhất là hiện tượng ngủ gà phụ thuộc vào liều sử dụng. Ngoài ra thuốc có thể gây mệt mỏi, khô miệng viêm họng, chóng mặt, buồn nôn, nhức đầu. Chỉ định Cetirizin được chỉ định trong viêm mũi dị ứng dai dẳng, viêm mũi dị ứng theo mùa. Mày đay mạn tính vô căn ở người lớn và trẻ em trên 12 tuổi. Cetirizin chỉ định điều trị các dạng ngứa, ngứa kết hợp với tổn thương da Theo nghiên cứu mới nhất của trường đại học ở Mỹ cetirizin có tác dụng làm giảm các tổn thương da ở những người điều trị prednisolon Một số chế phẩm Hiện nay chế phẩm citirizine tương đối nhiều, có thể ở dạng đơn thành phần: ZYRTEC viên nén 10mg ZYRTEC dung dịch uống 1mg/1ml lọ 75ml ZYRTEC dung dịch uống 10mg/ml lọ 10ml Chế phẩm của hãng UCB PHARM CETINAX viên nén 10mg Chế phẩm của MEDOPHARM -TENAMYD CANADA HICET viên nén 10mg bao phim Chế phẩm của công ty Micro labs limited CEZILviên nén 10mg bao phim Chế phẩm của công ty Alkem labs. Ngoài ra cetirizin thường được kê đơn với pseudoephedrin nên có chế phẩm kết hợp với pseudoephedrin ZYRTEC-D, VILIX-D chế phẩm của UCB pharma. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12] Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng đã được đưa ra như sau: Phương pháp chuẩn độ acid –base [9, 10] Cân chính xác lượng bột tương ứng với khoảng 0,1g cetirizin hoà tan trong 100 ml dung dịch gồm 30 thể tích nước và 70 thể tích aceton. Chất chuẩn độ dùng là dung dịch NaOH 0,1M. 1ml NaOH 0,1M tương ứng với 15,39mg C21H27Cl3N2O3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [7, 11, 12] Phương pháp 1 [7] : Cột C18 (phenomenex) Pha động dung dịch đệm phosphat 0,01M (1,36g KH2PO4 trong 1000ml H2O): acetonitrile tỉ lệ 70:45 Detector UV 230nm Tốc độ dòng: 1,5ml/phút Thể tích tiêm 10µl, nồng độ định lượng 20µg/ml Phương pháp 2 [12]: Cột C18 (Nova – Pak, 300 x 4,6mm) Pha động dung dịch đệm phosphat 0,067M pH=3,4: acetonitrile (1:1;v/v) Detector UV 227 nm Phương pháp 3 [11]: Cột C18 (250 x 4,6mm; 5µm) Pha động Acid orthophosphoric, pH 3,0 : acetonitril (60 : 40 ) Tốc độ 1,0ml/phút Detector 232 nm. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)[3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19, 20] Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Khái niệm về sắc ký Sắc ký là một nhóm phương pháp hoá lý dùng để tách và phân tích các cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào việc sử dụng các quá trình sắc kí khác nhau trong các điều kiện động. Sự tách các thành phần trong mẫu dựa vào sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ nền chất rắn. Chất rắn được nhồi vào trong cột hay tráng trên bản mỏng thành film. Pha động là khí hay chất lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [3]. Khái niệm về sắc kí lỏng hiệu năng cao Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc không trộn lẫn vào nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực của một bơm cao áp. Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dang tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi băng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Sắc ký lỏng phân tách dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học trên bề mặt [3]. Nguyên tắc của quá trình sắc ký Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký: Nếu pha tĩnh là bản chất hấp phụ (silicagel, nhôm oxy hoặc polyme thuần tuý) thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh bản chất là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ hoặc đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là các gel, ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử). Khi đặt chất phân tích lên đầu cột ta cho pha động chạy liên tục cột ta đã thực hiện quá trình sắc ký Ví dụ, nếu ta nạp một hỗn hợp ba chất A, B, C vào cột tách thì khi bơm pha đông qua cột tách các quá trình sắc ký xảy ra. Khi đó A, B, C tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp của các tương tác: Tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh F1 là lực giữ chất phân tích trên cột. Tương tác giữa chất phân tích và pha động F2 là lực kéo chất phân tích ra khỏi cột. Tương tác giữa pha tĩnh và pha động F3. Theo sơ đồ sau: Trong đó F1, F2 đóng vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn [6]. Cơ sở lý thuyết sắc ký Quá trình phân tách trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách đuợc các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic. Tín hiệu của quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiều thành phần. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC Hệ thống bơm Bơm được xem là một trong các thành phần quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Bơm có tác dụng đẩy dung dịch pha động qua cột với một tốc độ hằng định. Có hai loại bơm Một loại bơm đẳng dòng (Isocratic pump) Hai là loại bơm chương trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump) Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bình chứa dung môi thường được làm bằng thuỷ tinh, đôi khi là thép không gỉ. Cần lọc các hạt trong dung môi (thường dùng các màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí). Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong phương pháp gradient có thể cần đến 2, 3, 4 bình chứa dung môi. Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột có thể dùng bơm tiêm để tiêm vào đầu cột. Phương pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với các dung tích khác nhau. Một số máy HPLC có hệ thống tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều khiển thể tích tiêm (microsyringe), số lần tiêm và chu kì rửa vòng chứa mẫu. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể coi là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở đây xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột có ảnh hưởng lớn tới khả năng tách các chất cần phân tách. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột có nhiều kích cỡ khác nhau, tuỳ mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Một cột phân tích thông thường dài 10-30cm có đường kính 4-10mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10µm, số đĩa lý thuyết 40.000 – 60.000 Với chất nhồi cột cỡ 3-5µm có thể dùng các cột ngắn (3 - 7,5 cm) và nhỏ (đường kính trong 1 - 4, 6mm), số đĩa lý thuyết có thể lên đến 100.000 và cột này có hiệu lực rất cao. Detector trong HPLC Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký liên tục. Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các hợp chất của chúng dựa theo một tính chất nào đó của chất cần phân tích. Các loại detector phổ biến Detector UV-VIS (Utraviolet/Visible Spectrophotometric Detertor) Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector) Detector khối phổ (Mass Spectrophometric Detector) Detector điện hoá (Electrochemical Detector) Detector tán xạ bay hơi (Evaprative Light Scattering Detector) Detector đo độ dẫn điện (Electrical Conductivity Detector) Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector) Detector chuỗi Diod (Diod Array Detector) Bộ phận ghi tín hiệu: Recorder Bộ điều khiển: Computer Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện pic). Nếu tR là thời gian lưu giữ của một chất thì Trong đó: tR’ là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực) t0 là thời gian chết (thời gian chất không bị lưu giữ nghĩa là tốc độ di chuyển của chất bằng tốc độ di chuyển của dung môi). Khi pha động chảy qua cột sắc ký với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu, VR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ. Trong đó: VR phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất của pha động, tốc Fc là thể tích pha động trong một đơn vị thời gian; tR và VR là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai đại độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ… Hệ số phân bố K Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của các chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố tính theo công thức: Trong đó, Cs và Cm là nồng độ chất tan phân bố ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển nó qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: bản chất của chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ. Nếu K lớn thì tR lớn (pic ra muộn) Nếu K nhỏ thì tR nhỏ (pic ra sớm) Thừa số dung lượng K’ K’ là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng Trong đó tR là thời gian lưu, to là thời gian chết. K’ phụ thuộc bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤K’≤8 Nếu K’ <1 thời gian phân tích ngắn pic ra sớm dễ lẫn với tạp Nếu K’ >8 thì thì gian phân tích sẽ quá dài, tốn dung môi Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity-factor) Để tách riêng hai chất thường chọn α = 1, 05 - 2,0. Nếu α càng lớn thì hai chất tách nhau càng tốt, α nhỏ hai chất khó tách nhau, nhưng α qua lớn thì thời gian phân tích sẽ quá dài. Độ phân giải Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) Như vậy Rs phụ thuộc vào: Hiệu lực cột Thừa số chọn lọc α Thừa số dung lượng K’B Rs tối ưu ≥ 1, 5 Có thể làm tăng Rs bằng cách: Tăng N: Tăng chiều dài cột giảm tốc độ dòng. Tăng K’B: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn Tăng α: Thay đổi pha động hay pha tĩnh làm Rs thay đổi lớn f. Hệ số bất đối AF Trong đó: W là độ rộng đáy píc đo ở 1/20 chiều cao của pic d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic. Yêu cầu AF = 0,9 - 2,0. Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả tính theo diện tích pic sẽ càng chính xác hơn. Các yếu tố ảnh hưởng: pH quyết định dạng tồn tại của chất tan nên từ đó ảnh hưởng đến AF Cột tốt thì AF sẽ tốt Thể tích tiêm Cải thiện AF Chọn cột phù hợp Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở dạng thích hợp. Thể tích tiêm thích hợp. Số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột. Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và W (độ rộng pic) Nếu tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài. W (độ rộng pic ở đáy) hay W1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng nhỏ thì N càng lớn nhưng W và W1/2 sẽ nhỏ hơn khi tR nhỏ. Khi tR cố định thì bản chất của cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định trong đó cột đóng vai trò quan trọng. Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị độ dài cột : Khi các điều kiện khác cố định thì cột nào có số đĩa lý thuyết cao hơn cột đó sẽ có hiệu lực cao hơn. Xác định tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu Trong đó H là chiều cao pic thành phần cần quan tâm trong sắc ký đồ từ dung dịch đối chiếu quy định (pic C). hn là giá trị tuyệt đối của chiều cao nhiễu lớn nhất lệch khỏi đường nền trong khoảng sắc đồ thu được sau khi tiêm dung dịch mẫu trắng. Khoảng sắc đồ cần quan sát có độ dài bằng 20 lần độ rộng đáy ở chiều cao của pic C và ở điểm giữa của nó là vị trí tương đương với vị trí của pic C (vị trí của pic thành phần cần quan tâm). Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký Lựa chọn cột (pha tĩnh) Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Đó là các chất rắn, xốp kích thước hạt rất nhỏ đường kính hạt từ 3-10µm, diện tích bề mặt thường từ 50-500m2/g. Trong phương pháp định lượng cetirizin sử dụng sắc ký phân bố nên dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký phân bố. Theo tài liệu mới sắc ký phân bố được chia làm ba loại sau [16, 21]: Sắc ký phân bố pha thuận (Normal phase –HPLC) Sắc lý phân bố pha đảo (Reserse phase –HPLC) Sắc ký pha thuận có sử dụng nước (Aqueous Normal phase) Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ lên bề mặt của pha tĩnh . Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ. Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực hơn (ví dụ silicagel) còn pha động không phân cực hexan, heptan, tetrafuran có thể trộn lẫn một lượng nhỏ các dung môi hữu cơ phân cực như isopropanol, ethylacetat, hoặc chloroform. Thời gian lưu của chất phân tích tăng khi độ không phân cực của pha động tăng, chất phân tích là các chất phân cực. Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực (hydrophobic) còn pha động phân cực như H2O hoặc là sự pha trộn của H2O, methanol hoặc acetonitrile Trong sắc ký pha thuận có sử dụng nước đó có thể nói đó là phương pháp có sự kết hợp của cả pha thuận và pha đảo. Cột sử dụng trong loại sắc ký này là cột pha thuận trên bề mặt Si –H, pha động thường sử dụng là acetonitrol hoặc methanol và một lượng nhỏ H2O, pha động này có sự hiện diện cả H2O và yếu tố “normal” ít phân cực hơn pha tĩnh. Thời gian lưu sẽ giảm khi hàm lượng H2O trong pha động tăng. Loại sắc ký này thường áp dụng cho các chất có nhóm cacboxylic, dạng racemic, các chất khá phân cực mà sắc ký pha đảo không đảm nhận được [16, 21]. Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC: Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký Tính chất bề mặt ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó) Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất. Lựa chọn pha động Pha động là dung môi dung để rửa giải chất tan (chất cần phân tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách Pha động trong HPLC có thể là dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỷ lệ nhất định, cũng có thể là các dung dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức. Mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải tách tốt nhất. Pha động có thể ảnh hưởng tới: Độ chọn lọc của pha động Thời gian lưu giữ của chất tan Hiệu lực tách của cột Độ phân giải của chất tan Độ rộng của pic sắc ký Hình dáng píc sắc ký Vì những lý do trên nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc lựa chọn pha động phù hợp là điều rất quan trọng. Những yếu tố chính cần chú ý trong khi lựa chọn pha động: Bản chất dung môi được lựa chọn Thành phần các chất trong pha động Tốc độ dòng của pha động pH của pha động (đặc biệt với sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion) Những yêu cầu của một pha động: Phải hoàn toàn trơ với pha tĩnh Phải hòa tan được chất mẫu Phải bền vững theo thời gian Các thành phần phải hoàn toàn tinh khiết Nhanh đạt được trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký Phù hợp với detector được sử dụng Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường Trong sắc ký pha thuận pha động thường là các dung môi ít phân cực như n- hexan hoặc n-heptan và thường trộn lẫn một lượng nhỏ các chất phân cực như isopropanol, ethylacetat,cloroform,… Trong sắc ký pha đảo thường hệ dung môi là sự pha trộn của nước và các chất phân cực như methanol, acetonitrile, THF…Các hệ dung môi nay có thể hòa tan một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ. Trong sắc ký pha thuận có sử dụng H2O pha động thường dùng là acetonitril, methanol và một lượng nhỏ H2O, có thể sử thêm một lượng nhỏ acid để tạo pH thấp. Chọn pH Cơ sở của việc chọn pH phù hợp được trình bày như dưới đây. Trong dung dịch ta có cân bằng sau: [AB] = [A+] + [B-] Theo cân bằng trên khoảng 50% phân tử sẽ bị ion hóa. Quá trình sắc ký có sự phân tách không giống nhau giữa ion và các phân tử trung tính. Các ion sẽ phân tách nhanh hơn khi đó trong dung dịch cân bằng mất đi và các phân tử trung tính sẽ tiếp tục phân chia kết quả pic thu được sẽ bị doãng. Chính vì vậy trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. pH thường phải ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion,sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base. Do pH ảnh hưởng đến quá trình phân ly như vậy nên pH sẽ góp phần làm hiệu quả tách được tốt hơn. Thông thường các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid, tuy nhiên cũng có trường hợp ngoại lệ. Và pH trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy từng trường hợp. Tốc độ dòng Sau khi chọn được pha tĩnh, pha động, pH, ta tiến hành chạy và lựa chọn tốc độ dòng. Tốc độ dòng ảnh hưởng tới thời gian lưu, thừa số dung lượng, số đĩa lý thuyết của cột. Ứng dụng của HPLC Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: Định tính Thời gian lưu của chất thử trên sắc ký đồ tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn trên đối chiếu trên sắc ký đồ. Tuy nhiên việc định tính đơn thuần bằng HPLC không đảm bảo tính chắc chắn. Sắc ký điều chế Trong quá trình sắc ký các chất được tách ra và hứng lấy dung dịch rửa giải cho bốc hơi dung môi thu lấy chất. Định lượng và xác định giới hạn tạp chất Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Trong sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kĩ thuật HPLC: Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và mẫu chuẩn đều được tiến hành trong cùng một điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so sánh với mẫu chuẩn. Kết quả có thể tính theo cách chuẩn hóa một điểm hoặc chuẩn hóa từ một điểm trên dường tuyến tính. Phương pháp chuẩn nội : Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai đáp ứng gần giống chất phân tích vào cả hai mẫu chuẩn và thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai được gọi là chất chuẩn nội.Yêu cầu của pic của chất chuẩn nội phải tách hoàn toàn ra khỏi pic của chất cần phân tích. Kết quả được tính dựa vào tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic đáp ứng của chất phân tích và chất chuẩn nội. Phương pháp thêm chuẩn: Phương pháp này dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường chuẩn. Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic: Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu tử được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần. Yêu cầu: Tất cả các thành phần phải được phát hiện và rửa giải hoàn toàn Tất cả các chất có đáp ứng như nhau với detector. Khi đó hàm lượng các chất thành phần được tính theo công thức sau: Tuy vậy sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector là rất khó. Khắc phục nhược điểm này của sắc ký lỏng người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số đáp ứng người ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng bằng 1. Các hệ số đáp ứng của các chất tính theo công thức sau: Trong đó : Sc và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chất chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng. Cc và Cx là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng. fc là hệ số hiệu chỉnh. Khi đó hàm lượng thành phần X tính theo công thức: Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng và thử giới hạn tạp chất trong thuốc. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Chế phẩm thứ nhất (M1): Tên biệt dược: HICET –viên nén bao film 10mg Công ty sản xuất Micro labs limited Số đăng ký: VN -5908-01 Số kiểm soát: 37L49 Số lô : HICH 0007 Hạn dùng: 7/2009 Chế phẩm thứ 2 (M2) Tên biệt dược: CEZIL –viên nén bao phim 10mg Công ty sản xuất Alkem labs Số đăng ký VN-7451-03 Số kiểm soát 37L51 Số lô 6004 EN Hạn dùng 3/2009 PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT Hóa chất Sử dụng chất chuẩn của phòng kiểm nghiệm các dạng bào chế –viện kiểm nghiệm Chuẩn cetirizin Hàm lượng trên chế phẩm khô: 99, 22% nguyên trạng Acid H2SO4 1M Acid phosphoric 12,5% Acetonitrile dùng cho HPLC Nước cất dùng cho HPLC Thiết bị, dụng cụ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: MERCH –HITACHI D7000 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HEWLETT PACKARD 1100 Detector UV: Diod array Detector Máy lắc siêu âm Bransom 5210 Bộ lọc chân không Milipore, màng 0,45µm Whatman Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 độ chính xác 0,1mg Cân phân tích Mettler Toledo AB 245 độ chính xác 0,01mg Bình định mức dung tích 10ml, 20ml, 25ml, 50ml, 100ml Cốc đong 50ml, 100ml, 500ml Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh, phễu lọc Bơm tiêm, lọ đựng mẫu bình pha động, bình cầu các loại, giấy lọc… NỘI DUNG Khảo sát các điều kiện sắc ký Xây dựng chương trình sắc ký cho cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều, bao gồm: Chọn cột sắc ký Chọn pha động Chọn dung môi pha mẫu Detector UV, bước sóng đo Tốc độ dòng Thể tích tiêm Cách xử lý mẫu Đánh giá phương pháp Tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký Xác định độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic Xác định độ lặp lại của phương pháp Xác định độ đúng của phương pháp Ứng dụng định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp thực nghiệm để tìm điều kiện sắc ký cho phép phát hiện được cetirizin trong chế phẩm và tách tốt cetirizin với các pic của dung môi và tá dược, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả. Phương pháp cụ thể: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu Giá trị trung bình : Độ lệch chuẩn : Sai số chuẩn : Sai số tương đối : Sai số tương đối : Cách đánh giá kết quả Khi độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau, hàm lượng của cetirizin trong chế phẩm được tính theo công thức: Trong đó: St và Sc : Diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn mc : Lượng chất chuẩn đã cân (mg) C : Hàm lượng chuẩn tương ứng (%) mv : Khối lượng trung bình viên (g) mt : Khối lượng bột viên đem thử (g) THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ Xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng cetirizin trong chế phẩm Nghiên cứu lựa chọn sắc ký Qua tham khảo tài liệu, và các điều kiện cơ sở vật chất sẵn có của phòng hóa lý II - viện kiểm nghiệm, đặc biệt dựa trên những đặc tính của cetirizin. Ta tiến hành lựa chọn các điều kiện sắc ký như sau: Lựa chọn cột (pha tĩnh) Do Cetirizin có các đặc điểm cấu tạo như sau: Trong phân tử cetirizin có nhóm carboxylic. Dạng dược dụng ngậm 2HCl và tan tốt trong nước. Phân tử cetirizin khá phân cực. Chúng tôi quyết định lựa chọn phương pháp sắc ký mới đó là phương pháp sắc ký pha thuận có nước (Aqueous Normal Phase). Cột sắc ký sử dụng là Silica 5µm có dạng bề mặt hydrid Si-H, đường kính trong 4,6 mm; độ dài cột 25 cm. Lựa chọn pha động: Dựa theo các tài liệu pha động dùng trong sắc ký phân bố pha thuận có nước thường sử dụng ACN hoặc MeOH và một lượng nhỏ nước. Đồng thời trong phương pháp sắc ký pha thuận có dùng H2O này thường sử dụng thêm một số acid. Trên cơ sở đó chúng tôi sơ bộ lựa chọn pha động bao gồm acetonitril và một lượng nhỏ acid. Sau đó khảo sát các điều kiện để tiến hành lựa chọn pha động sao cho phù hợp nhất : Khảo sát 2 acid được sử dụng phổ biến trong kiểm nghiệm là H2SO4 và H3PO4. Hai pha động được sử dụng là: ACN : H2SO4 tỉ lệ (93: 7) trong đó (H2SO4 0,5%) ACN : H3PO4 tỉ lệ (93: 7) trong đó (H3PO4 0,5%) Tiến hành pha mẫu khảo sát: Cân chính xác khoảng 50mg cetirizin chuẩn cho vào bình dung tích 100,0 ml; thêm khoảng 70 ml pha động khuấy siêu âm trong 10 phút, thêm pha động vừa đủ 100,0 ml. Hút chính xác 10ml dung dịch trên pha loãng vừa đủ trong 50 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45µm ta thu được dung dịch dùng để khảo sát. Làm tương tự với hai pha động trên. Kết quả khảo sát pha động chứa acid phosphoric không cho đáp ứng pic hay cetirizin không được rửa giải. Pha động chứa acid sulfuric cho pic đáp ứng cân đối, gọn, đẹp. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ H2O trong pha động. Để xác định ảnh hưởng của tỉ lệ ACN và tỉ lệ H2O trong pha động ta tiến hành khảo sát pha động với hai thành phần ở các tỉ lệ: ACN : dung dịch H2SO4 0,5%( 90 : 10) ACN : dung dịch H2SO4 0,5%(93 : 7) ACN : dung dịch H2SO4 0,5%(95 : 5) ACN : dung dịch H2SO4 0,5% (97 : 3) Kết quả khảo sát đáp ứng pic xảy ra ở các thời gian lưu khác nhau tăng dần tỉ lệ nghịch với lượng H2O có trong pha động. Chúng tôi lựa chọn tỉ lệ 93 :7 là tỉ lệ cho thời gian lưu vừa phải đảm bảo thời gian tiến hành, đồng thời pic cân xứng, gọn đẹp nhất. Kết luận về pha động sử dụng trong chương trình sắc ký Acetonitril dùng cho HPLC Dung dịch H2SO4 0,5% được lọc qua màng 0,45µm Tỉ lệ ACN: H2SO4 (93: 7) Lựa chọn dung môi pha mẫu: Chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi pha mẫu trên 3 loại dung môi khác nhau như sau: Dung môi pha mẫu là H2O, do cetirizin dạng dược dụng ngậm 2HCl tan tốt trong H2O Dung môi là pha động Dung môi là hệ ACN: H2O tỉ lệ 93 : 7 tương ứng như tỉ lệ dung dịch H2SO4 trong pha động Cân chính xác vào mỗi bình dung tích 50,0 ml một lượng bột viên tương ứng khoảng 5mg cetirizin.Cho vào lần lượt các bình khoảng 35 ml dung dịch trên. Sau đó cho đồng thời cả 3 bình vào lắc siêu âm trong 10 phút. Thêm lần lượt vào các bình các dung môi tương ứng đến vạch, lắc kỹ. Lọc, bỏ 10ml dịch lọc đầu, lọc qua màng 0,45µm thu được các dung dịch để tiêm mẫu Kết quả khảo sát dung môi pha mẫu, với ba dung môi pha mẫu trên ta đều thu được các sắc đồ có đáp ứng pic tương đương nhau. Chúng tôi quyết định lựa chọn dung môi là H2O vì H2O không cho đáp ứng pic tá dược, sử dụng đơn giản và tiện lợi lại tránh được một phần độc hại do tiếp xúc với acetonitril trong quá trình pha mẫu. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử để tiến hành khảo sát các điều kiện tốc độ dòng, bước sóng. Dung dịch thử: Cân xác định khối lượng trung bình viên của 10 viên chế phẩm, nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên đã nghiền tương đương với khoảng 5mg cetirizin, cho vào bình định mức 50ml, thêm khoảng 35ml H2O lắc siêu âm 10 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc bỏ khoảng 10ml dịch đầu, lọc qua màng 0,45µm thu được dung dịch thử. Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50mg chất chuẩn cetirizin cho vào bình định mức dung tích 100,0 ml, thêm khoảng 70ml H2O, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ (dung dịch 1). Hút chính xác 10ml dung dịch 1 pha loãng bằng H2O vừa đủ 50,0ml thu đựợc dung dịch chuẩn để tiến hành khảo sát. Dung dịch chuẩn này có nồng độ khoảng 0, 1mg/ ml. Lựa chọn tốc độ dòng Tiến hành khảo sát tốc độ dòng với các điều kiện sắc ký như trên, tốc độ dòng thích hợp sao cho thời gian lưu vừa phải, pic của cetirizin tách hoàn toàn khỏi các pic dung môi và tá dược. Kết quả tốc độ dòng là 1,5 ml/phút cho thời gian lưu khoảng 5,4 phút và pic tách rõ ràng, gọn, đẹp. Lựa chọn bước sóng thích hợp. Tiến hành quét phổ UV của chất chuẩn cetirizin ta thu được kết quả cetirizin có độ hấp phụ lớn nhất tại bước sóng 230nm. Đây là bước sóng thích hợp để phát hiện cetirizin trong phương pháp sắc ký trên. Hình 3.1 : Phổ hấp thụ tử ngoại của chất chuẩn cetirizin. Như vậy qua các khảo sát trên chúng tôi lựa chọn phương pháp định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều như sau: Máy sắc ký lỏng Merch- Hitachi D 7000 –VKN/HL II Máy sắc ký lỏng Hewlett Packard 1100 Detector Diod array L – 7455 Bơm L-7100 Cột sắc ký: Adsorbosil silica 5u, độ dài 25 cm, đường kính 4,6 mm. Pha động: Acetonitril: H2SO4 (0,5%) ( 93: 7). Dung môi pha mẫu H2O Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút. Bước sóng 230nm Thể tích tiêm 20µl Điều kiện nhiệt độ: Nhiệt độ phòng. Với các điều kiện sắc ký trên ta thu được sắc đồ của dung dịch cetirizin chuẩn có nồng độ khoảng 0,1mg/ml như sau: Hình 3.2: Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn cetirizin Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký bằng cách tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ cetirizin khoảng 0,1mg/ml. Kết luận về tính thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết cột, độ lặp lại về thời gian lưu (đại lượng có giá trị định tính ), độ lặp lại của diện tích pic (đại lượng có giá trị về định lượng). Chuẩn bị dung dịch khảo sát Cân chính xác khoảng 50 mg chất chuẩn cetirizin cho vào bình định mức dungtích 100,0ml, thêm khoảng 70ml nước, lắc siêu âm trong 10 phút, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 10ml dung dịch này pha loãng vừa đủ trong 50ml nước và lọc qua màng 0,45µm. Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn trên, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, độ cân xứng của pic, số đĩa lý thuyết của cột. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký STT Thời gian lưu (tR) (phút) Diện tích pic(S) (mAU.min) 1 5,433 3426,4 2 5,436 3454,7 3 5,431 3404,6 4 5,428 3403,3 5 5,432 3412,5 6 5,418 3455,2 Trung bình 5,430 3426,1 RSD 0,12% 0,69% Số đĩa lý thuyết N =9056 Hệ số bất đối : AF =1,04 Nhận xét: RSD về thời gian lưu là 0,12%, RSD về diện tích pic là 0,76%, có số đĩa lý thuyết N= 9056, AF = 1,04. Điều đó chứng tỏ hệ thống sắc ký trên đảm bảo được tính thích hợp của hệ thống với việc phân tích định tính và định lượng thành phần cetirizin trong các chế phẩm rắn phân liều. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng trên chất chuẩn cetirizin bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn cetirizin có nồng độ biến thiên từ 0,01mg/ml đến 0,5g/ml. Khoảng tuyến tính này lựa chọn trên cơ sở sau: Nồng độ khi pha dung dịch trực tiếp từ lượng chất cân trên cân phân tích mà đảm bảo sai số có thể chấp nhận được. Chế phẩm cetirizin với lượng hoạt chất 10mg/viên, khi thử độ hòa tan 10mg /1000ml đảm bảo pic phát hiện được. Xác định sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ bằng phương pháp hồi quy tuyến tính. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của chất cần định lượng được trình bày ở bảng 3.2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất cần định lượng được thể hiện hình 3.3. Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic 1 2 3 4 5 6 Nồng độ (mg/ml) 0,01 0,03 0,05 0,10 0,25 0,50 Diện tích pic(mAU.min) 336,9 1007,2 1660,1 3359,2 8533,3 16605,1 Phương trình hồi quy: y = 33307,18x+32,1754 Hệ số tương quan: R= 0,9999 Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích pic và nồng độ của cetirizin. Nhận xét: Từ kết quả thu được cho thấy trong một khoảng nồng độ khảo sát khá rộng, nồng độ cetirizin từ 0,01 mg/ml đến 0,5 mg/ml, gấp 50 lần. Ta thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ chất cần định lượng với hệ số tương quan rất gần 1, chứng tỏ có sự tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic. Trên cơ sở đó chúng tôi đã lựa chọn nồng độ để định lượng chế phẩm có chứa cetirizin là: cetirizin có nồng độ khoảng 0,1mg/ml Khảo sát độ lặp lại của phương pháp Tiến hành khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên 2 mẫu M1 và M2. Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá dựa trên độ lặp lại của 6 thí nghiệm trên mỗi mẫu. Tiến hành pha các mẫu chuẩn và thử như sau: Dung dịch thử Cân 1 lượng bột viên tương ứng khoảng 5mg cetirizin cho vào bình định mức dung tích 50,0ml thêm khoảng 35ml nước lắc siêu âm trong 10 phút, thêm nước vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lọc qua màng lọc 0,45µm .Với mỗi mẫu thử ta làm như vậy với 6 lần cân khác nhau .Khi đó ta được các dung dịch thử của chế phẩm các mẫu có nồng độ 0,1mg/ml Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50,0mg chất chuẩn cetirizin cho vào bình định mức dung tích 100,0 ml cho khoảng 70 ml nước vào lắc siêu âm trong 10 phút, sau đó thêm nước vừa đủ đến vạch lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm. Hút chính xác 10,0 ml pha loãng vừa đủ 50,0ml bằng H20. Khi đó ta có dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1mg/ml. Tiến hành chạy sắc ký các dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong điều kiện sắc ký đã nêu ta tính hàm lượng hoạt chất theo công thức sau: Trong đó: St, Sc : lần lượt là diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn . mc : lượng chất chuẩn đã cân C : Hàm lượng chất chuẩn tương ứng % mv : Khối lượng trung bình viên (g) mt : Khi lượng bột viên đem thử(g) a : Lượng chất ghi trên nhãn (g) Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu M1 và M2 được trình bày qua bảng 3.3 và bảng 3.4 dưới đây: Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp trên chế phẩm Hicet STT Lượng cân(mt=g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng(%) 1 0,1642 3404,5 99,1 2 0,1646 3445,8 100,1 3 0,1698 3502,7 98,7 4 0,1659 3464,3 99,9 5 0,1643 3390,9 98,7 6 0,1652 3465,5 100,3 Trung bình 0,1657 3445,6 99,5 Số liệu thống kê RSD=1,2% Mẫu M2 Bảng 3.4.Kết quả khảo sát độ lặp trên chế phẩm CEZIL Lượng cân (mt=g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng(%) 1 0,1550 1540,8 101,3 2 0,1545 1527,5 100,8 3 0,1536 1504,8 99,9 4 0,1540 1490,2 98,6 5 0,1543 1499,4 99,0 6 0,1570 1513,1 98,2 Trung bình 0,1547 1516,6 99,6 Số liệu thống kê RSD = 1,1% Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy với chương trình sắc ký đã chọn, phương pháp định lượng cetirizin có độ chính xác cao với độ lệch chuẩn về hàm lượng % so với hàm lượng ghi trên nhãn là 1,2 % trên mẫu M1 và 1,1% trên mẫu M2. Kết quả này chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao, sai số tương đối nhỏ. Khảo sát độ đúng của phương pháp: Độ đúng của phương pháp được khảo sát trên 2 mẫu M1 và M2 bằng phương pháp thêm chuẩn: thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn vào trong mẫu thử sao cho nồng độ của hoạt chất vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình đã chọn, dựa vào hàm lượng cetirizin đã biết trong mẫu thử, lượng chát chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử ,tính dược lượng cetirizin tìm thấy lại trong mẫu thử và tỉ lệ thu hồi của lượng chất thêm vào. Trong các nghiên cứu này chúng tôi tiến hành thêm các lượng chuẩn bằng khoảng 10%; 20%; 30% so với lương hoạt chất đã sẵn có trong mẫu thử Tiến hành pha dung dịch khảo sát Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 50mg chất chuẩn cetirizin cho vào bình định mức dung tích 100,0 ml thêm khoảng 70 ml H2O; lắc siêu âm trong 10 phút ;thêm H2O đến vạch vừa đủ lắc kỹ. Hút chính xác 10,0ml dung dịch này pha loãng vừa đủ cho đến 50,0 ml. Lọc qua màng 0,45µm. Khi đó dung dịch chuẩn sẽ có nồng độ khoảng 0,1mg/ml. Dung dịch chuẩn để thêm vào mẫu thử (dung dịch A). Cân chính xác khoảng 50mg chất chuẩn cetirizin cho vào bình định mức dung tích 100,0ml. Thêm khoảng 70ml H2O lắc siêu âm trong khoảng 10 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch, lắc kỹ thu được dung dịch A. Dung dịch thử B1: Cân chính xác 1 lượng bột viên tương đương với khoảng 5mg cetirizin cho vào bình định mức dung tích 50,0ml thêm chính xác 1,00ml dung dịch A thêm khoảng 35 ml H2O lắc siêu âm trong 10 phút. Thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc bỏ 10ml dung dịch đầu, lọc qua màng 0,45µm. Với mỗi mẫu cân làm 2 lần với 2 lần cân khác nhau. Dung dịch thử B2: Cân chính xác 1 lượng bột viên tương đương với khoảng 5mg cetirizin cho vào bình định mức dung tích 50,0ml. Hút chính xác 2,0ml dung dịch A, thêm vào khoảng 35ml H2O vào bình lắc siêu âm trong 10 phút. Thêm H2O vừa đủ đến vạch, lắc kỹ. Lọc bỏ 10ml dịch lọc đầu, lọc qua màng lọc 0,45µm .Với mỗi mẫu làm 2 lần như vậy với 2 lần cân khác nhau. Dung dịch thử B3: Cân chính xác 1 lượng bột viên tương đương với khoảng 5mg cetirizin cho vào bình định mức dung tích 50,0 mg, thêm chính xác 3,0ml dung dịch A, thêm khoảng 35ml H2O lắc siêu âm 10 phút, thêm H2O vừa đủ đến vạch lắc kỹ. Lọc, bỏ 10ml dịch lọc đầu, lọc qua màng lọc 0,45µm. Với mỗi mẫu làm 2 lần như vậy (với 2 lần cân khác nhau). Tiến hành chạy sắc ký theo chương trình lựa chọn với các dung dịch B1, B2, B3 như trên. Lượng chất chuẩn thêm vào mỗi bình thử được tính theo công thức: Lượng chất thêm vào = mchuẩn x Cchuẩn x hệ số pha loãng Thực tế dung dịch A được chuẩn bị từ 0,0503 g chất chuẩn cetirizin. Vì vậy lượng chất chuẩn thêm vào mỗi bình thử cụ thể như sau: Bình 1 : 0, 0503 x 0,9922 x1/100 = 0,4990 mg Bình 2: 0, 0503 x 0,9922 x 2/100 = 0,9981mg Bình 3: 0,0503 x 0,9922 x 3/100 = 1,4972 mg Kết quả khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm được trình bày ở bảng 3.5 và 3.6 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu M1 (mv=0,3294) STT Lượng cân thử(g) Lượng chuẩn thêm vào(mg) Lượng chuẩn tìm lại được(mg) Tỉ lệ tìm lại được (%) Sai số tương đối(%) 1 0,1655 0,4990 0,5011 0,5006 100,4 0,4 2 0,1648 0,4990 0,5002 100,2 0,2 3 0,1636 0,9981 0,9854 0,9921 98,7 1,3 4 0,1635 0,9981 0,9988 100,1 0,1 5 0,1640 1,4972 1,4865 1,4836 99,3 0,7 6 0,1650 1,4972 1,4798 98,8 1,2 TB 99,6 0,65 Hình 3.4. Đồ thị đánh giá khả năng thu hồi của phương pháp trên mẫu M1. Phương trình hồi qui là: y = 0,9906x + 0,0076 Hệ số tương quan R1=0,9999 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu M2 (mv= 0,3079g) STT Lượng cân thử(g) Lượng chuẩn thêm vào(mg) Lượng chuẩn tìm lại được(mg) tỉ lệ tìm lại được (%) Sai số tương đối(%) 1 0,1545 0,4990 0,4964 0,4972 99,6 0,4 2 0,1548 0,4990 0,4981 99,8 0,2 3 0,1560 0,9981 1,000 0,9940 100,1 0,1 4 0,1570 0,9981 0,9880 98,9 1,1 5 0,1566 1,4972 1,5012 1,5006 100,3 0,3 6 0,1550 1,4972 1,5001 100,2 0,2 TB 99,8 0,4 Hình 3.5. Đồ thị đánh giá khả năng thu hồi của phương pháp trên mẫu M2 Phương trình hồi qui tuyến tính y = 1,006x -0,0071 Hệ số tương quan R2 =0,9999 Nhận xét: Trên cả 2 mẫu M1 và M2, khảo sát tính đúng của phương pháp đều cho kết quả lượng chất chuẩn thu hồi lại được nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0%, trong đó hàm lượng thấp nhất tìm lại được là 98,9%, hàm lượng cao nhất tìm lại được là 100,4%. Sai số tương đối của phép đánh giá độ đúng cảu phương pháp thu được khoảng 0,65% với mẫu M1 và 0,4% với mẫu M2. Kết quả trên chứng tỏ phương pháp xây dựng trên có độ đúng cao. Ứng dụng định lượng cetirizin trong chế phẩm Trên cơ sở phương pháp đã được xây dựng, áp dụng để định lượng cetirizin trong các chế phẩm rắn phân liều đã được sản xuất và đang lưu hành tại Việt nam. Chúng tôi tiến hành ứng dụng định lượng phương pháp trên hai mẫu đang được kiểm nghiệm tại viện. Mỗi mẫu thử được định lượng lặp lại 3 lần bằng cách cân và pha mẫu thử 3 lần. Tiêm sắc ký dung dịch chuẩn và dung dịch thử trong cùng điều kiện sắc ký. Kết quả định lượng được tính theo phương pháp chuẩn ngoại, nghĩa là so sánh diện tích pic dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký, từ đó tính ra hàm lượng cetirizin trong chế phẩm so với hàm lượng ghi trên nhãn theo công thức : Trong đó: St, Sc lần lựơt là diện tích pic hoặc chiều cao pic của mẫu thử và mẫu chuẩn mc : Lượng chất chuẩn đã cân C : Hàm lượng chất chuẩn tương ứng (%) mv : Khối lượng trung bình viên (g) mt : Khối lượng bột viên đem thử (g) Cụ thể định lượng trên chế phẩm thứ nhất HICET như sau: Tên thương mại HICET –viên bao film 10 mg Qui cách đóng gói: vỉ 10 viên bao film hàm lượng 10 mg Công ty sản xuất: Micro labs Limited Số đăng kí: VN 5908-01 Số lô Mfg lic 300 Hạn sử dụng : 7/2009 Bảng 3.7. Kết quả định lượng cetirizin trong chế phẩm Hicet (mv=0,3294g) STT Lượng cân mt(g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) 1 0,1670 1614,6 99,3 2 0,1655 1620,9 100,6 3 0,1689 1623,5 99,5 TB 0,1671 1626,3 99,8 Chế phẩm thứ hai Cezil như sau: Cezil viên nén bao film 10mg Công ty sản xuất : Alkem labs ltd Số đăng ký : VN 7451-03 Số kiểm soát 37151 Hạn dùng Bảng 3: Kết quả định lượng cetirizin trong CEZIL (mv = 0,3079g) STT Lượng cân mt (g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) 1 0,1538 1499,8 99,2 2 0,1556 1519,4 99,1 3 0,1553 1523,2 99,8 TB 0,1549 1520,8 99,4 Bàn luận về kết quả Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại với những ưu điểm nổi bật là có độ chọn lọc cao, độ ổn định, độ lặp lại và độ đúng tốt, đồng thời lại có phương pháp xử lý mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh. Ngày nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hóa nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích, vì vậy phương pháp này đã và đang ứng dụng rộng rãi trong trong các ngành phân tích. Trong ngành kiểm nghiệm thuốc hiện, HPLC được coi là phương pháp đầu tay để phân tích các dạng bào chế khác nhau nhờ khả năng phân tích các chất với hiệu năng cao của cột và dung động, khả năng phát hiện rất nhạy để định tính, định lượng các chất của các loại detector. Trong Dược điển mới nhất như Dược điển châu Âu 4th, BP (2005) chỉ có chuyên luận kiểm tra nguyên liệu cetirizin mà chưa có chuyên luận kiểm tra cetirizin trong viên nén. Trong chuyên luận kiểm tra nguyên liệu này cetirizin được định lượng theo phương pháp acid-base. Tuy nhiên phương pháp này khi áp dụng trong chế phẩm viên nén kết quả có thể sẽ bị ảnh hưởng bởi các tá dược đồng thời qui trình xử lý mẫu phức tạp. Ngoài ra theo một số nghiên cứu của các tác giả nước ngoài sử dụng cột C18, pha động dùng acetonitril và đệm phosphat ở các tỉ lệ khác nhau. Nhưng với phương pháp này theo kết quả kiểm nghiệm của cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế đáp ứng pic không cân đối, tạo đuôi, khó ứng dụng trong kiểm nghiệm. Mặc dù điều kiện mẫu hiện nay gửi tới khoa kiểm nghiệm quá lớn nên việc thực nghiệm khảo sát phải tiến hành trên 2 máy. Nhưng kết quả của chương trình sắc ký chúng tôi đưa ra dùng để định lượng cetirizin như trên cho đáp ứng pic cân đối, đẹp, thời gian lưu vừa phải khoảng 5,5 phút ; các thông số như số đĩa lý thuyết, độ cân xứng đều nằm trong giới hạn cho phép. Ngoài ra phương pháp còn có độ lặp lại tốt sai số tương đối nhỏ 1,1%- 1,2% ; độ đúng của 2 chế phẩm thẩm định là 99,6% và 99,8%. Kết quả thực nghiệm này càng chứng tỏ chương trình chúng tôi đưa ra có độ tin cậy cao, độ lặp lại và độ đúng tốt, kỹ thuật tiến hành đơn giản, nhanh chóng và dễ thực hiện và sai số đáp ứng trên hai máy là nhỏ. Chúng tôi đã tiến hành áp dụng phương pháp để định lượng 2 chế phẩm đang được kiểm nghiệm tại viện là CEZIL và HICET cho kết quả là 99,4% và 99,8%. KẾT LUẬN Sau khi hoàn thành khóa luận này, tôi đã đạt được các kết quả sau: Xây dựng được một chương trình định lượng cetirizin trong các chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp HPLC với các thông số và điều kiện như sau: Cột silica 5u Altech ( 250 x 4,6mm; 5µm), nhiệt độ phòng thí nghiệm. Pha động acetonitril : dung dịch H2SO4 (93: 7) (dung dịch H2SO4 nồng độ 0,5%) Detector 230nm Tốc độ dòng 1,5 ml/phút Thể tích tiêm 20µl Dung dịch chuẩn và thử có nồng độ khoảng 0,1mg/ml pha trong H2O. Áp dụng chương trình sắc ký này, chúng tôi đã tiến hành định lượng cetirizin trong các chế phẩm CEZIL của Alkem và HICET của Micro labs đang được kiểm tra chất lượng tại viện. Kết quả hàm lượng của HICET là 99,4% và CEZIL là 99,8% so với hàm lượng ghi trên nhãn. Tuy chưa có điều kiện khảo sát kĩ các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký như dạng dược dụng, tá dược của chế phẩm, ảnh hưởng của qui trình xử lý mẫu nhưng với kết quả đạt được chúng tôi cho rằng phương pháp trên có thể được ứng dụng được trong kiểm nghiệm các thuốc có thành phần cetirizin trong các trung tâm kiểm nghiệm, phòng kiểm nghiệm của các đơn vị sản xuất có điều kiện trang thiết bị máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. PHỤ LỤC Một số sắc ký đồ và phổ hấp thụ tử ngoại thu được trong chương trình thực nghiệm Hình 1.1. Sắc ký đồ của cetirizine với tỉ lệ pha động 90: 10 Hình 1. Sắc ký đồ của cetirizin với pha động tỉ lệ 93 : 7 Hình 3. Sắc ký đồ của cetirizin với tỉ lệ pha động 95 : 5 Hình 4. Sắc ký đồ của dung dịch với tỉ lệ pha động 97: 3 Hình 5. Sắc ký đồ của dung dịch với dung môi pha mẫu là H2O Hình 6. Sắc kí đồ của dung dịch dung môi pha mẫu là pha động Hình 7. Sắc ký đồ của dung dịch với dung môi pha mẫu là ACN: H2O (93:7) Hình 8. Phổ DAD Counter của dung dịch thử Cetirizin hydroclorid trong viên nén Hicet Hình 9. So sánh phổ tử ngoại của chuẩn cetirizin hydroclorid và dung dịch thử Hicet Hình 10. Sắc ký đồ của dung dịch thử Hicet Hình 11. So sánh phổ tử ngoại của dung dịch chuẩn cetirizin hydroclorid và dung dịch thử trong viên nén cezil Hình 12. Phổ DAD counter của dung dịch cetirizin hydroclorid trong viên nén Cezil. Hình 13. Sắc ký đồ của dung dịch thử cetirizin trong viên nén Cezil TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Bộ môn Dược lâm sàng – Trường Đại học Dược Hà Nội (2003), Bài giảng bệnh học (Dùng cho sinh viên Dược), Trung tâm thông tin – thư viện Đại học dược Hà Nội, trang 9 – 26. Bộ môn Hóa Dược – Trường đại học Dược Hà Nội (2005), Hóa Dược tập 2, Trung tâm thông tin – Thư viện đại học Dược Hà Nội, trang Bộ môn Hóa phân tích –Trường đại học Dược Hà Nội (2002), Hóa phân tích tập 2, Trung tâm thông tin – thư viện Đại Học Dược Hà Nội, trang 55- 85. Bộ môn Hóa phân tích – Trường Đại học Dược Hà Nội (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trung tâm thông tin – thư viện Đại Học, trang 68- 98. Trần Thị Thu Hiền (2006), Nghiên cứu định lượng Nevirapine trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, Trường đại học Dược Hà Nội. Từ Văn Mặc (1995), Phân tích Hóa lý, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, trang 293- 338. Tiêu chuẩn cơ sở, Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho viên nén Cezil, Alkem labs ltd. Dược thư quốc gia, chuyên luận về cetirizin hydroclorid, Nhà xuất bản Y học, trang 269, 270. Tài liệu tham khảo nước ngoài European Pharmacopoeia 4th, volume I, p. 864. The Brishtish pharmacopoeia (2005), volume I, p. 418 – 419 Bajerski L, Cardoso SG, Diefenbach IF, Malesuik MD, Silvia H, Borgmann H. Liquid chromatography determination of cetirizine in oral formulation. J AOAC Int. 2005 Mar –Apr. Paw B, Misztal G, Hopkala H, Drozd J. Development and validation of a HPLC method for the determination of cetirizine in pharmaceutical dosage forms. Pharmazie. 2002 May; 57(5):313-5. Anderson, P. O., Knoben, J. E., (2002) Handbook of clinical drug data 10th ed. et al. McGraw-Hill International Pfizer Inc, ZYRTEC (cetirizine hydrochloride) Tablets, Chewable Tablets and Syrup For Oral Use et al. (2006). Pfizer Incorporated publications Chetrit, E. B., Amir, G., Shalit, Cetirizine: an effective agent in Kimura's Disease M. (2005). Arthritis & Rheumatism (Arthritis care & research) Vol 53, p117-118 Pesek JJ, Matyska MT, Gangakhedkar S, Aqueous Normal phase – Wikipedia encyclopedia. et al., J. Sep. Sci. 29 (6): 872-880 Yuri V. Kazakevich, Rosario Lo Brutto, HPLC for Pharmaceutical scientists (2007) Prof. Yuri Kazakevich; Prof. H. M Harold McNair (1996), Textbook on High Performance Liquid Chromatography (HPLC),p. 127, p.128, p. 231-239. W. John Lough, Irving W. Wainer, High Performance Liquid Chromatography Fundamental Principles and Practice.p. 54- p. 78. B G Gowda, M B Melwanki, J Seethanramappan, Extractive spectrophotometric determination of cetirizine HCl in pharmaceutical prepations. J Pharm biomed Anal. 2001 Jul, 25 (5-6). What is Aqueous Normal Phase (ANP) and how can it help you? Microsolv Tech.