1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Salmonella là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh ngộ độc thực
phẩm cho người trên diện rộng và luôn là mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng. Vi sinh
vật này phân bố rộng rãi trong đất, nước, gia súc, thực phẩm trong đó thịt và các sản
phẩm gia cầm là các nguồn bệnh quan trọng. Các báo cáo của Ủy Ban Châu Âu năm
1995 xác định rằng các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là Salmonella và
Campylobacter là vấn đề quan trọng cho sức khỏe cộng đồng. Vì tính chất rất nguy
hiểm của Salmonella, tất cả các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước
trên thế giới đều xếp Salmonella vào nhóm không được phép có mặt.
Hiện nay, khoảng 2500 kiểu huyết thanh về Salmonella đã được xác định. Qua
các nghiên cứu cho thấy không phải tất cả các chủng mà chỉ có một số ít có khả năng
gây bệnh. Nếu có phương pháp phân biệt được các dòng Salmonella gây bệnh với các
dòng lành tính thì sẽ tạo thuận lợi hơn trong việc mua bán và trao đổi hàng hóa thực
phẩm giữa các nước. Đồng thời việc phân biệt các dòng trên còn giúp ích nhiều trong
việc điều tra và kiểm soát dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Tiến Dũng, TS.
Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY
BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH
PHẨM, THỰC PHẨM”.
LUẬN VĂN 4 CHƯƠNG VÀ 44 TRANG HOÀN CHỈNH
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM
44 trang |
Chia sẻ: maiphuongtl | Lượt xem: 1994 | Lượt tải: 4
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Khóa luận Nghiên cứu khả năng gây bệnh cho chuột ở các chủng salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm, thực phẩm, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
tùy vào kiểu huyết thanh Salmonella
và sự phòng vệ của ký chủ, một vài Salmonella xâm nhiễm vào gan, lách, túi mật,
xương, màng não và những cơ quan khác. Một lượng lớn Salmonella bị tiêu diệt tại
những vị trí ở ngoài ruột [3, 28].
15
Hình 2.4. Sự xâm nhiễm của Salmonella vào tế bào biểu mô ruột [28]
Sau khi xâm chiếm vào ruột, Salmonella thường gây ra phản ứng viêm nặng,
phản ứng này có thể gây ra sự lở loét. Vi khuẩn Salmonella có thể tạo ra độc tố
cytotoxin nhằm ngăn chặn quá trình tổng hợp protein của cơ thể ký chủ. Độc tố
cytotoxin có góp phần trong việc tạo ra phản ứng viêm và lở loét thì không được biết
rõ. Tuy nhiên, sự xâm chiếm vào dịch nhầy là nguyên nhân làm cho những tế bào biểu
mô tổng hợp và phóng thích những cytokine khác nhau gồm: IL-1, IL-6, IL-8, TNF-2,
IFN-U, MCP-1 và GM-CSF. Các chất này đã gây ra phản ứng viêm và gây hại cho
ruột, những triệu chứng viêm thông thường như phát sốt, ớn lạnh, đau bụng, bệnh bạch
cầu và tiêu chảy [28].
Cơ chế về phản ứng viêm dạ dày- ruột và tiêu chảy xảy ra khi những chủng
Salmonella xuyên qua được lớp niêm mạc ruột. Tiêu chảy là sự bài tiết chất lỏng và
những chất điện phân ở ruột non và ruột già. Salmonella xuyên qua những tế bào biểu
mô ruột nhưng không giống với Shigella và E. coli, chúng vẫn bị giữ lại bên trong thể
thực bào. Vì thế, phạm vi của gian bào được mở rộng và sự lở loét ở những biểu mô là
Sự gắn bám
Những tế bào
biểu mô của
ruột non
Sự xâm nhập
Lớp lumen
Nhân lên
Lớp lamina propria
Tiêu
chảy
Tiết ra nước và chất điện phân
Bị thực bào bởi bạch
cầu trung tính và
những đại thực bào
Sự phát tán có
hệ thống
Lối vào
Salmonella
Xâm nhập vào mô sâu
Sự tiêu hóa bởi
lysozyme
Sự gắn bá
tế à
iể c a
r t
Sự xâm nhập
Lớp lumen
Nhân lên
Lớp lamina propria
Tiêu
chảy
Gây tiết nước và chất điện phân
Bị thực bào bởi bạch
cầu trung tính và
những đại thực bào
Sự phát tán có
hệ thống
16
rất nhỏ. Salmonella vượt qua khỏi ranh giới của những tế bào biểu mô để vào lớp
lamina propria. Sự xâm chiếm vào niêm mạc ruột diễn ra bởi sự hoạt hóa adenylate
cyclase, kết quả là làm tăng lượng c-AMP gây ra hiện tượng bài tiết. Cơ chế thì không
được hiểu rõ nhưng có liên quan đến việc tạo ra prostaglandin hoặc những thành phần
gây ra phản ứng viêm. Thêm vào đó, những dòng Salmonella tạo ra một hoặc nhiều
hợp chất tương tự như enterotoxin gây bài tiết ở ruột [28].
Tóm lại, để Salmonella có thể xâm nhiễm vào bên trong và gây độc cho vật chủ
thì vi khuẩn phải mang những gen độc giúp cho nó thể hiện tính độc trong vật chủ. Các
gen gây bệnh thường có hàm lượng G+C khác biệt so với các vùng còn lại trên nhiễm
sắc thể vi khuẩn, các gen này thường xen giữa các gen có tính bảo tồn cao. Một vài
gen được biết là có liên quan đến sự bám dính và xâm chiếm như viz., sef1, pef2, spv3
và inv4. Những gen giúp Salmonella sống sót trong cơ thể ký chủ là mgtC5 hoặc gây
bệnh cho ký chủ là viz., sop, stn7, pipA, B, D8… [14, 25, 26, 28, 29].
2.2. TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG VÀ BIỆN PHÁP PHÕNG NGỪA
2.2.1. Triệu chứng lâm sàng
Bệnh do Salmonella thường gây ra 3 triệu chứng chính sau: [9, 16, 18, 26, 34]
Viêm dạ dày- ruột
Được gây ra bởi nhiều kiểu huyết thanh Salmonella khác nhau. Các kiểu huyết
thanh gây bệnh đường ruột thường gặp là S. typhimurium và S. enteritidis. Nguồn
truyền nhiễm thường là các thức ăn nhiễm khuẩn, chủ yếu là các thức ăn đã qua chế
biến. Thời kỳ ủ bệnh của giai đoạn viêm dạ dày- ruột do Salmonella tùy thuộc vào liều
vi khuẩn. Triệu chứng thường bắt đầu từ 6 - 48 giờ sau khi ăn phải thức ăn hoặc nước
uống bị nhiễm các Salmonella trên với mật độ từ 107- 1010 CFU/g. Các biểu hiện lâm
sàng là buồn nôn, tiêu chảy và đau bụng. Đồng thời bệnh nhân thường bị chứng đau cơ
và đau đầu, nhưng biểu hiện chính của bệnh là bị tiêu chảy, sốt 38 – 39oC và cảm thấy
lạnh. Tối thiểu 2/3 bệnh nhân bị đau thắt ở vùng bụng. Hầu hết các bệnh nhân đều tự
khỏi trong vòng 2 - 7 ngày.
Nhiễm trùng máu
Chủ yếu gây ra do S. cholerasuis. Bệnh nhiễm trùng máu do Salmonella thường
xuất hiện ở giai đoạn giữa của quá trình nhiễm Salmonella vào người bệnh. Salmonella
xâm nhập vào hệ tuần hoàn của ký chủ nhưng không gây viêm đường ruột vì chúng
không khu trú trong túi mật, không trở về ruột sau khi đã vào máu và không thể phân
17
lập Salmonella từ phân của bệnh nhân. Salmonella có hạn chế trong đường ruột hay
phổ biến trong đường máu có lẽ phụ thuộc vào sức đề kháng của bệnh nhân và tính
độc của Salmonella. Nhưng một khi các tế bào vi khuẩn này nhiễm vào máu, chúng
gia tăng nhiều lần trong các đại thực bào, rồi xâm nhập vào các cơ quan khác như
xương, màng não. Biểu hiện của bệnh rất nghiêm trọng như gây ra sỏi phổi, viêm
màng não và thường có tỷ lệ tử vong rất cao.
Sốt thương hàn
Bệnh chỉ biểu hiện ở người, chủ yếu do S. typhi, S. paratyphi và một số kiểu
huyết thanh khác. Thời kỳ ủ bệnh thường không có triệu chứng lâm sàng nhất định, từ
10 - 14 ngày đầu có thể thay đổi tùy thuộc vào số lượng vi khuẩn. Thời kỳ này tương
ứng với giai đoạn Salmonella vào cơ thể qua miệng cùng thức ăn và nước. Sau khi
vượt qua được môi trường acid trong dạ dày, một số vi khuẩn vào ruột non, chúng xâm
nhập vào các tế bào biểu mô của thành ruột rồi di chuyển tới lớp lamina propria để
sinh sản ở đó. Lúc này, vi khuẩn sẽ xâm nhiễm qua các hạch bạch huyết ở màng treo
ruột để vào máu và bị bắt giữ bởi các đại thực bào. Nhưng các tế bào Salmonella bên
trong đại thực bào không bị tiêu diệt, trái lại chúng vẫn phát triển và nhân lên bên
trong các tế bào này. Sau cùng, chúng phá vỡ các đại thực bào, lan truyền khắp cơ thể
và tập trung lại ở hệ lưới nội mô như tủy xương, gan, lách, mật và cả đường tiết niệu.
Kết quả là Salmonella có thể giải phóng ra ngoài cơ thể bằng đường phân, cả bằng
nước tiểu và sữa.
Bệnh thương hàn không có triệu chứng lâm sàng cố định. Thời kỳ khởi phát chỉ
có những triệu chứng lâm sàng thông thường như nhức đầu, đau bụng, sốt: sốt càng
cao khi tác nhân gây độc càng tích tụ nhiều trong máu. Thời kỳ toàn phát thì sốt là
triệu chứng quan trọng, kèm theo đó là các dấu hiệu nhiễm trùng độc, vẻ mặt vô cảm,
môi khô, má đỏ, tiêu chảy xen kẽ với táo bón và các tình trạng khác như vàng mắt,
vàng da… Khi các tế bào Salmonella bị tiêu diệt, chúng phóng thích nội độc tố gây
nhiễm độc máu. Tỷ lệ tử vong khi mắc bệnh vào khoảng 10% nhưng nếu sử dụng
kháng sinh thích hợp thì tỷ lệ này có thể giảm xuống còn 1%. Khi không bị tử vong,
bệnh nhân sẽ chuyển sang thời kỳ lui bệnh như hạ sốt nhanh và chuyển sang thời gian
hồi phục kéo dài. Vi khuẩn Salmonella lúc này vẫn còn tồn tại trong tủy xương, gan và
thận.
18
2.2.2. Biện pháp phòng ngừa
Đối với gia súc
Biện pháp quan trọng hàng đầu là chống bệnh do Salmonella trên thú, sau đó
tuân thủ những nguyên tắc vệ sinh như nuôi dưỡng trong điều kiện sạch sẽ. Kiểm tra
sức khỏe thú trước khi giết mổ, cho thú nhịn ăn 12 giờ trước khi giết mổ. Tách phủ
tạng cẩn thận để tránh vấy nhiễm.
Đối với thực phẩm
Tránh sự vấy nhiễm Salmonella từ người và động vật bị bệnh thương hàn, côn
trùng hoặc động vật mang trùng. Ngăn ngừa sự phát triển của Salmonella bằng cách
bảo quản lạnh ở nhiệt thích hợp hoặc các phương pháp khác.
Đối với thực phẩm công nghiệp và thương nghiệp
Áp dụng các biện pháp quản lý chất lượng trong sản xuất, bảo quản, vận
chuyển, phân phối… Định kỳ khám sức khỏe những người thao tác trực tiếp trên thực
phẩm. Đồng thời tuyên truyền giáo dục cho người tiêu thụ phải lưu ý và tuân thủ
nguyên tắc vệ sinh.
Việc phối hợp tốt giữa y khoa – thú y chắc chắn sẽ giảm bớt số trường hợp ngộ
độc do Salmonella. Tuy nhiên cũng cần lưu ý đến những thú hoang đã là ổ chứa
Salmonella [9, 10, 17, 21, 30].
2.3. Mối tƣơng quan giữa các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và Salmonella
trong môi trƣờng và trong thực phẩm
Người ta cho rằng, vi khuẩn Salmonella là một trong những vi sinh vật đường
ruột gây bệnh quan trọng nhất nên hầu hết các tiêu chuẩn vi sinh thực phẩm đều không
cho phép có vi khuẩn Salmonella trong thành phẩm. Quy định này trên thực tế đã trở
thành một rào cản thương mại gây nhiều trở ngại trong việc trao đổi hàng hóa thực
phẩm giữa các quốc gia trên thế giới. Điểm chú ý là có phải toàn bộ các chủng
Salmonella đều có khả năng gây bệnh? [3, 5, 8]
Trong một cuộc khảo sát ở Tây Ban Nha của Baudart et al., 2000 cho thấy các
chủng Salmonella phân lập từ các mẫu bệnh được lấy từ những bệnh nhân bị ngộ độc
thực phẩm thường gặp là S. enteritidis (85,9%), S. typhimurium (7,06%), S. virchow,
S. muenchen (2,36%), còn lại là S. azterca, S. bredeney, S. agona, S. infantis, S.
goldcoast, S. muenster, S. london [3]. Theo Ủy ban An toàn thực phẩm Pháp (AFSSA)
19
thì 11 kiểu huyết thanh trên đã chiếm 80% các chủng Salmonella phân lập được từ các
mẫu bệnh phẩm [5].
Trong khi đó, sự hiện diện của Salmonella trong môi trường và trong thực phẩm
là rất cao, chúng phân bố ở mọi nơi khắp thế giới. Theo nhiều cuộc điều tra ở Anh, Mỹ
cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella trong phân khoảng 9 – 14,4%, manh tràng nhiễm
44,8%, hạch màng treo ruột 27%, xúc xích 28 – 29,7% và thịt heo tươi nhiễm 4,15%
[15]. Salmonella hiện diện trong 65% mẫu nước được phân lập ở dọc theo Peavine
Creek ở Decatur [3]. Trong một cuộc khảo sát sự hiện diện của Salmonella tại các
sông ở Địa Trung Hải, các nhà nghiên cứu cũng phân lập được hơn 574 chủng
Salmonella thuộc hơn 40 kiểu huyết thanh khác nhau [5]. Tại Việt Nam, trong cuộc
điều tra về sự ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội, kết quả cho
thấy: tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn vào khoảng 33,33%, thịt bò khoảng 40%,
thịt gà khoảng 39,29% và giò sống khoảng 46,67% [13]. Theo Nguyễn Thị Oanh và
Tiêu Quang An (2003), tỷ lệ nhiễm Salmonella ở trâu, bò tại Đắc Lắc vào khoảng
45,36% và 41,25% [9]. Tại hội thảo 2004 về vệ sinh an toàn thực phẩm, chi cục Thú y
Tp.HCM cho biết kết quả xét nghiệm năm 2003 với 299 mẫu thịt tươi tại các chợ cho
thấy khoảng 18% nhiễm Salmonella [20]. Các tỷ lệ nhiễm Salmonella trong môi
trường và thực phẩm cao như trên cho thấy khả năng hiện diện Salmonella trong thành
phẩm chế biến có ít hay nhiều là không tránh khỏi.
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra có phải tất cả Salmonella hiện diện trong thực phẩm,
môi trường đều gây nguy hại cho người. Theo AFSSA, số kiểu huyết thanh Salmonella
phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm chỉ chiếm dưới 4,4% số kiểu huyết thanh phân
lập được từ môi trường [5]. Đồng thời, các nghiên cứu của Reilly et al., 1992 tại xứ
Wales và Australia cho thấy S. weltevreden là kiểu huyết thanh thường xuyên phát
hiện trong các hồ nuôi tôm nhưng kết quả thống kê của CDC Hoa Kỳ cho thấy kiểu
huyết thanh này rất hiếm khi được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của người [5]. Điều đó
có nghĩa là khả năng gây bệnh của các kiểu huyết thanh này là rất thấp. Một nghiên
cứu khác, xác định độc lực trên chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh
phẩm và thực phẩm cho thấy 20/20 chủng có nguồn gốc từ thực phẩm đều không có
khả năng gây bệnh và gây chết cho chuột [3, 5]. Như vậy, chúng ta có thể nói rằng chỉ
có một số ít trong khoảng 2500 kiểu huyết thanh Salmonella thì có khả năng gây bệnh.
20
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
Thời gian thực hiện: từ tháng 3/2005 – 7/2005.
Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại Trạm xá Thú Y- Khoa Chăn Nuôi
Thú Y và Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Môi trường- Khoa Công Nghệ Môi
Trường- Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM.
3.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
- Đĩa petri
- Ống nghiệm
- Erlen các loại
- Ống đong các loại
- Becher các loại
- Pipetman các loại 100 µl, 1000 µl
- Pipet 10 ml
- Đèn cồn
- Que cấy vòng, thẳng, trang
- Bao PE vô trùng
- Khay mổ
- Kéo mổ
- Kẹp gắp
- Máy lắc
- Tủ ấm
- Tủ sấy
- Cân
3.3. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƢỜNG
3.3.1. Hóa chất
- NaCl 0,85% vô trùng
- Cồn 60 – 70o
- Nước cất.
3.3.2. Môi trƣờng
- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth): Dùng để phục hồi và tăng sinh
các chủng Salmonella trong quá trình nghiên cứu. Thành phần môi trường gồm: Dịch
não bê 200g, Dịch tim bê 250g, Proteose peptone 10g, NaCl 5g, Na2HPO4 2,5g,
Dextrose 2g, Nước cất 1lít.
- Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar): Môi trường thạch dùng để giữ giống.
Thành phần môi trường gồm: Tripticase peptone 15g, Phytone peptone 5g, NaCl 5g,
Agar 15g, Nước cất 1lít.
21
- Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar): Môi trường dùng để
định lượng Salmonella. Thành phần môi trường gồm: Cao nấm men 3g, L- lysine 5g,
Xylose 3,75g, Lactose 7,5g, Sucrose 7,5g, Sodium desoxycholate 2,5g, Ferric
ammonium citrate 0,8g, NaCl 5g, Agar 15g, Phenol red 0,08g, Nước cất 1lít. Môi
trường XLD tổng hợp được pha chế trong nước cất vô trùng, đun sôi cho tan đều, để
nguội đến 50 – 60oC và sau đó đổ vào đĩa petri.
Tất cả các môi trường trên (trừ XLD) đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15
phút.
3.4. NGUYÊN VẬT LIỆU
3.4.1. Chủng vi sinh vật
Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
STT CHỦNG NGUỒN GỐC NGUỒN PHÂN LẬP
1 Salmonella enteritidis 99.303 Viện Pasteur (1) Bệnh phẩm người
2 S.enteritidis 02.158 Viện Pasteur Bệnh phẩm heo
3 S. typhimurium Viện Pasteur Bệnh phẩm heo
4 S.typhimurium 02.157 Viện Pasteur Bệnh phẩm heo
5 Salmonella SP 1b TT.CL,ATVS 4
(2)
Thịt heo
6 Salmonella SP 2a TT.CL,ATVS 4 Thịt heo
7 Salmonella SP1a TT.CL,ATVS 4 Thịt heo
8 Salmonella SB 10 TT.CL,ATVS 4 Thịt bò
9 Salmonella SB11 TT. CL,ATVS 4 Thịt bò
10 Salmonella Ô13 CNSHMT (3) Ốc
11 Salmonella B34 CNSHMT Thịt bò
12 Salmonella M14 CNSHMT Mực
13 Salmonella VTr11 CNSHMT Vỏ trứng
14 Salmonella H51 CNSHMT Thịt heo
(1) Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, (2) Trung Tâm Chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản
vùng 4, TP. Hồ Chí Minh, (3) Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm,
TP. Hồ Chí Minh.
22
3.4.2. Chuột
Thuộc loài chuột bạch Mus musculus trọng lượng khoảng 18 – 20 g, được mua
tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Chuột thí nghiệm khỏe mạnh, sạch bệnh.
3.5. PHƢƠNG PHÁP
Nguyên tắc chung: Mọi thao tác thí nghiệm phải được thực hiện trong điều kiện
vô trùng. Mọi dụng cụ thí nghiệm, môi trường dinh dưỡng phải được vô trùng trước
khi sử dụng.
3.5.1. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường BHI, ủ ở 37oC trong khoảng 18
– 24 giờ. Hút 1 ml dịch sau tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 9 ml NaCl vô trùng để
được độ pha loãng 10-1, lắc đều, hút 1 ml từ nồng độ này cho vào một ống nghiệm
khác chứa 9 ml NaCl để được độ pha loãng 10-2, cứ tiếp tục tương tự ta được các độ
pha loãng tiếp theo. Các thí nghiệm trong nghiên cứu này sử dụng đến độ pha loãng
10
-8
.
3.5.2. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc
Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn sau khi pha loãng cho vào đĩa môi trường XLD đã
được chuẩn bị trước. Dùng que tam giác trải đều dịch trên môi trường. Mỗi độ pha
loãng được trải ít nhất trên 2 đĩa. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Chọn các đĩa có số đếm
từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu được tính
theo công thức sau: [2, 3, 4]
Trong đó: C: Số lượng Salmonella trong 1 ml mẫu (CFU/ml)
N: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
ni: Số lượng đĩa được đếm tại độ pha loãng thứ i
Vi: Thể tích dịch mẫu cấy vào trong một đĩa
fi: Độ pha loãng tương ứng.
N
n1 x V1 x f1 + … + ni x Vi x fi
(cfu/ml) C =
23
3.5.3. Phƣơng pháp gây nhiễm trên chuột
Khử trùng sạch bề mặt khu vực tiến hành gây nhiễm bằng cồn. Người tiến hành
gây nhiễm phải đeo găng tay cao su. Chuẩn bị một cái khay sạch. Dùng xy-lanh hút
lượng dịch vi khuẩn cần cho chuột uống.
Cách gây nhiễm vi khuẩn vào chuột qua đường miệng được tiến hành như sau:
Đặt chuột bò trên bề mặt lồng, tay phải nắm lấy đuôi, ngón tay trỏ và ngón tay cái bên
trái nắm lấy hai tai và gáy chuột, ngón tay út trái kẹp lấy đuôi của chuột. Lật ngửa
chuột lên và để theo chiều thẳng đứng. Tay phải lấy xy-lanh có dịch vi khuẩn và cho
chuột uống. Thao tác được tiến hành nhẹ nhàng để tránh làm tổn thương chuột. Chuột
sau khi được gây nhiễm, theo dõi biểu hiện bệnh hằng ngày. Quá trình theo dõi được
thực hiện liên tục trong 14 ngày.
3.5.4. Phƣơng pháp khảo sát sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày,
ruột non và ruột già
Chuột bị chết sau khi gây nhiễm hoặc sau thời gian theo dõi được tiến hành giải
phẫu để xác định sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột
già.
Cách tiến hành: Sau khi chuột chết, dùng kim ghim bốn chân của chuột trên
mảnh cao su được đặt trên khay mổ. Dùng kéo cắt da theo đường thẳng dọc theo chiều
dài chuột và mở ra hai bên. Dùng kéo vô khuẩn để mở cơ hoành và lật ra hai bên để
quan sát nội tạng, gan, lách. Cắt lấy gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già cho một bao
PE vô trùng. Cho một thể tích xác định nước muối NaCl 0,85% tùy theo khối lượng
gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già thu được vào bao PE. Dùng vật nặng có bề mặt
nhẵn để nghiền nát các bộ phận đó. Toàn bộ dịch trong bao PE được cho vào bình tam
giác vô trùng có nắp đậy (mỗi bộ phận được cho vào những bình khác nhau), bình này
được lắc trên máy lắc khoảng 1 giờ.
Dịch đồng nhất sau khi lắc được đem trải đều trên môi trường XLD để định
lượng mật độ Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già.
24
Hình 3.1. Dụng cụ mổ chuột
Hình 3.2. Các bộ phận dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già trong đĩa
a. b.
Hình 3.3. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trƣờng XLD
a. Môi trƣờng trƣớc khi cấy; b. Khuẩn lạc đặc trƣng của Salmonella trên XLD
25
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH, GÂY CHẾT Ở CHUỘT DO CÁC CHỦNG
SALMONELLA
4.1.1. Khả năng gây bệnh và gây chết chuột do các chủng Salmonella có nguồn
gốc từ bệnh phẩm
Thí nghiệm được tiến hành trên 4 chủng Salmonella được phân lập từ các
nguồn bệnh phẩm nhận từ Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Các chủng Salmonella được
gây nhiễm vào chuột qua đường miệng sau khi được phục hồi trên môi trường BHI
trong 18 – 24 giờ ở 37oC, theo dõi diễn biến bệnh lý ở chuột gây nhiễm trong thời gian
14 ngày. Mỗi chủng được gây nhiễm trên 4 chuột, mỗi chuột gây nhiễm 0,3 ml canh
khuẩn, mật độ vi sinh vật trong canh khuẩn đã được xác định trước bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Kết quả thí nghiệm thu được sau 14 ngày
gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả thí nghiệm khả năng gây bệnh, gây chết cho chuột ở các chủng
Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm
STT Chủng
Mật độ gây nhiễm
(CFU/ml)
Biểu hiện
bệnh
Số lƣợng
chuột chết
Thời gian
gây chết
1 S.enteritidis 99.303
2,8 x 10
9
+ 1/2 4 ngày
2,5 x 10
8
- 0/2 > 14 ngày
2 S.enteritidis 02.158
1,4 x 10
8
+ 0/2 > 14 ngày
9,0 x 10
7
- 0/2 > 14 ngày
3 S. typhimurium
1,5 x 10
8
+ 0/2 > 14 ngày
1,3 x 10
8
+ 0/2 > 14 ngày
4 S. typhimurium 02.157
1,4 x 10
7
+ 0/2 > 14 ngày
1,8 x 10
8
+ 0/2 > 14 ngày
Ghi chú: (+): có biểu hiện bệnh, (-): không biểu hiện bệnh
26
Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hầu hết các chủng Salmonella có nguồn gốc từ
bệnh phẩm đều có khả năng gây bệnh cho chuột. Nhưng chỉ có chủng S. enteritidis
99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm người là chủng duy nhất có khả năng gây chết 1/2
chuột thí nghiệm sau 4 ngày gây nhiễm. Mật độ để Salmonella gây nhiễm vào chuột ở
chủng S. enteritidis 99.303 là rất cao, khoảng 2,8 x 109 CFU/ml. Các chủng bệnh phẩm
còn lại không có khả năng gây chết chuột nhưng hầu như đều làm cho chuột bệnh.
Biểu hiện bệnh của chuột là xù lông, biếng ăn, gầy và ít chuyển động.
Đối với chủng S. enteritidis 99.303 và chủng S. enteritidis 02.158 với mật độ
gây nhiễm tương ứng là 2,5 x 108 CFU/ml và 9,0 x 107 CFU/ml thì biểu hiện bệnh lý
của chuột không rõ ràng.
So sánh với các nghiên cứu khác về khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các
chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm trên thì trong khảo sát này cho thấy mật
độ gây bệnh gây chết chuột cao hơn rất nhiều so với các khảo sát trước đó. Theo Lu và
cộng sự (1999), mật độ gây chết 50% chuột thí nghiệm của các chủng S. enteritidis và
S. typhimurium trung bình vào khoảng 104 – 105 tế bào, một số chủng có độc lực mạnh
có khả năng gây chết chuột với mật độ dưới 100 tế bào [3]. Theo Nguyễn Tiến Dũng
và cộng sự (2004), các chủng S. enteritidis 99.303 và S. enteritidis 02.158 đều có khả
năng gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm, với mật độ gây nhiễm tương ứng là 9,5 x
10
7
CFU/ml và 2,4 x 108 CFU/ml [5]. Trong khảo sát này, có sự khác biệt như vậy có
thể do các lý do sau: (1) Các chủng Salmonella bị giảm hay mất độc lực do quá trình
bảo quản và cấy chuyền nhiều lần, (2) Các chủng phân lập từ các nguồn khác nhau nên
có độc lực khác nhau…
4.1.2. Khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella có nguồn gốc
từ thực phẩm
Đối với các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì cũng được tiến
hành thí nghiệm tương tự như trong các chủng từ bệnh phẩm trên. Thí nghiệm được
tiến hành trên 10 chủng có nguồn gốc từ những mẫu thực phẩm khác nhau. Kết quả thí
nghiệm thu được sau 14 ngày gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.2.
27
Bảng 4.2. Khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các chủng Salmonella có
nguồn gốc từ thực phẩm
Kết quả ở Bảng 4.2 cho thấy, trong số các chủng Salmonella có nguồn gốc từ
thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng gây bệnh cho chuột nhưng có biểu
hiện nhẹ, không có khả năng gây chết chuột, mật độ gây nhiễm khoảng 4,8 x 108 – 5,9
x 10
10
CFU/ml. Các chủng còn lại sau khi gây nhiễm vào chuột, qua theo dõi trong
suốt quá trình thí nghiệm cho thấy các chuột này đều không có biểu hiện bệnh hay
giảm cân. Trái lại, các chuột sau khi gây nhiễm này đều khỏe mạnh, nhanh nhẹn và
tăng trọng sau 14 ngày gây nhiễm.
4.1.3. So sánh khả năng gây bệnh gây chết ở chuột giữa các chủng Salmonella từ
bệnh phẩm và từ thực phẩm
Kết hợp kết quả được thể hiện trên Bảng 4.1 và Bảng 4.2 cho thấy có sự khác
biệt rõ ràng về khả năng gây bệnh gây chết chuột ở những chủng Salmonella có nguồn
gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Các chủng Salmonella từ bệnh phẩm thì có độc lực
cao như có thể gây bệnh, gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm. Những chuột không
chết trong khoảng thời gian này thì đều có biểu hiện bệnh như xù lông, giảm cân…
Ngược lại, các chủng Salmonella từ thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng
gây bệnh chuột nhưng với biểu hiện nhẹ, còn 8 chủng còn lại đều không có khả năng
STT Chủng
Mật độ gây
nhiễm (CFU/ml)
Biểu hiện bệnh
Số lƣợng
chuột chết
Thời gian gây
chết
1 Salmonella SP 1b 1,1 x 10
8
- 0/2 /
2 Salmonella SP 2a 6,6 x 10
10
- 0/2 /
3 Salmonella SP 1a 4,8 x 10
9
- 0/2 /
4 Salmonella SB 10 5,9 x 10
10
+ 0/2 > 14 ngày
5 Salmonella SB11 2,5 x 10
8
- 0/2 /
6 Salmonella Ô13 1,5 x 109 - 0/2 /
7 Salmonella B34 2,4 x 10
11
- 0/2 /
8 Salmonella M14 1,5 x 10
8
- 0/2 /
9 Salmonella VTr11 5,7 x 10
7
- 0/2 /
10 Salmonella H51 4,8 x 10
8
+ 0/2 > 14 ngày
28
gây bệnh, gây chết chuột. Từ đó, có thể kết luận rằng độc lực của các chủng
Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thấp hơn nhiều so với các chủng Salmonella có
nguồn gốc bệnh phẩm.
Chuột bệnh Chuột khỏe mạnh
Hình 4.1. Biểu hiện ở chuột bệnh và chuột khỏe mạnh
4.2. KHẢ NĂNG XÂM NHIỄM VÀO GAN VÀ LÁCH CỦA CÁC CHỦNG
SALMONELLA
4.2.1. Khả năng xâm nhiễm vào gan và lách chuột của các chủng Salmonella có
nguồn gốc từ bệnh phẩm
Khảo sát cũng được tiến hành ở 4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh
phẩm. Chuột sau khi gây nhiễm được theo dõi các biểu hiện bệnh lý, các chuột chết
hoặc sau khi theo dõi 14 ngày được mổ để tách các phủ tạng gan và lách. Xác định mật
độ Salmonella trong gan và lách bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường
XLD. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trên Bảng 4.3.
29
Bảng 4.3. Mật độ xâm nhiễm vào gan và lách chuột của các Salmonella có
nguồn gốc từ bệnh phẩm
Chủng
Mật độ gây
nhiễm (CFU/ml)
Chuột
Mật độ Salmonella
(CFU/g)
Trong gan Trong lách
S. enteritidis 99.303
2,8 x 10
9
Chết 8,2 x 105 2,1 x 106
Bệnh 2,5 x 102 5,2 x 102
2,5 x 10
8
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 0 0
S. enteritidis 02.158
1,4 x 10
8
Bệnh 5,3 x 102 3,6 x 102
Bệnh 2,1 x 104 3,2 x 103
9,0 x 10
7
Khỏe mạnh 1,8 x 101 0
Khỏe mạnh 0 0
S. typhimurium
1,5 x10
8
Bệnh 8,9 x 101 1,2 x 102
Bệnh 2,1 x 104 3,2 x 103
1,3 x 10
8
Bệnh 4,7 x 102 5,5 x 101
Bệnh 9,5 x 103 4,4 x 103
S. typhimurium 02.157
1,8 x 10
8
Bệnh 1,3 x 103 2,0 x 103
Bệnh 2,2 x 102 3,0 x 102
1,4 x 10
7
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 0 0
Kết quả Bảng 4.3 cho thấy 4 chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm đều
có khả năng xâm nhiễm vào gan hoặc lách hoặc cả hai cơ quan chuột. Ngoại trừ,
chủng S. enteritidis 99.303 và S. typhimurium 02.157 với mật độ gây nhiễm tương ứng
là 2,5 x 108 CFU/ml và 1,4 x 107 CFU/ml thì không có khả năng xâm nhiễm vào gan,
lách, đồng thời biểu hiện bệnh lý ở chuột của các chủng này cũng không rõ ràng nhưng
nếu mật độ gây nhiễm cao hơn thì có thể xâm nhiễm vào gan, lách với mật độ cao. Ở
chủng S. enteritidis 99.303 có khả năng gây chết chuột, mật độ Salmonella hiện diện
trong gan là 8,2 x 105 CFU/g và trong lách là 2,1 x 106 CFU/g. Kết quả cũng cho thấy
rằng để gây chết chuột trước 14 ngày, mật độ gây nhiễm vào phải lớn hơn 109
30
CFU/ml, và Salmonella hiện diện trong gan, lách với mật độ cao từ 105 – 106 CFU/g.
Các chủng còn lại vẫn cho thấy có khả năng xâm nhiễm vào gan, lách nhưng với mật
độ thấp nên không làm chết chuột.
4.2.2. Mật độ xâm nhiễm vào gan và lách chuột của các chủng Salmonella có
nguồn gốc từ thực phẩm
Thí nghiệm khảo sát khả năng xâm nhiễm vào gan và lách của các chủng
Salmonella từ thực phẩm cũng tiến hành tương tự như chủng từ bệnh phẩm. Khảo sát
được thực hiện trên 10 chủng Salmonella, kết quả được thể hiện ở Bảng 4.4.
Bảng 4.4. Mật độ xâm nhiễm vào gan và lách chuột ở các chủng Salmonella
có nguồn gốc từ thực phẩm
Chủng
Mật độ Salmonella
gây nhiễm
(CFU/ml)
Biểu hiện ở
chuột
Mật độ Salmonella (CFU/g)
Gan Lách
Samonella SP 1b 1,1 x 10
8
Khỏe mạnh 3,3 x 102 4,0 x 102
Khỏe mạnh 0 0
Salmonella SP 1a 6,6 x 10
10
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 0 0
Salmonella SP 2a 4,8 x 10
9
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 0 0
Salmonella SB 10 5,9 x 10
10
Bệnh 4,9 x 103 8,1 x 103
Khỏe mạnh 0 0
Salmonella SB 11 2,5 x 10
8
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 6,1 x 101 8,5 x 101
Salmonella Ô13 1,5 x 109
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 0 0
Salmonella B34 2,4 x 10
11
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 0 0
Salmonella M14 1,5 x 10
8
Khỏe mạnh 8,3 x 101 0
Khỏe mạnh 8,3 x 101 0
Salmonella VTr11 5,7 x 10
7
Khỏe mạnh 0 0
Khỏe mạnh 0 0
Salmonella H51 4,8 x 10
8
Bệnh 5,7 x 103 2,2 x 104
Khỏe mạnh 1,4 x 102 2,0 x 102
31
Kết quả trên Bảng 4.4, cho thấy trong 10 chủng Salmonella phân lập từ thực
phẩm thì có 5 chủng không có khả năng xâm nhiễm vào gan và lách chuột sau khi bị
gây nhiễm, 5 chủng còn lại thì có khả năng xâm nhiễm vào gan hay lách nhưng với
mật độ thấp, từ 1,0 x 101 – 1,0 x 104 CFU/g. Trong 14 ngày theo dõi chuột sau khi gây
nhiễm cũng không thấy có sự biểu hiện bệnh lý, ngoại trừ Samonella SB 10 và H51.
Chủng Salmonella SB 10 và H51 có khả năng gây bệnh chuột, với mật độ xâm nhiễm
vào gan và lách là từ 1,0 x 103 – 1,1 x 104 CFU/g. Như vậy, các chủng Salmonella
phân lập từ thực phẩm không có khả năng gây bệnh hay có khả năng gây bệnh nhưng
với biểu hiện bệnh tương đối nhẹ như có xù lông nhưng không bị giảm cân sau 14
ngày theo dõi.
4.2.3. So sánh khả năng xâm nhiễm vào gan và lách giữa các chủng Salmonella từ
bệnh phẩm và từ thực phẩm
Qua kết quả ở Bảng 4.3 và Bảng 4.4, cho thấy có sự khác biệt rất rõ ràng về
khả năng gây bệnh gây chết và xâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng gan và lách chuột
giữa các chủng Salmonella phân lập từ bệnh phẩm và thực phẩm. Tất cả các chủng
Salmonella từ bệnh phẩm đều có khả năng xâm nhiễm vào cả gan và lách chuột, ngoại
trừ hai chủng S. enteritidis 99.303 và chủng S. typhimurium 02.157 với mật độ gây
nhiễm thấp không đủ để gây bệnh chuột là không có khả năng xâm nhiễm vào gan và
lách. Nhưng nếu tăng mật độ gây nhiễm lên thì chúng có thể gây bệnh và xâm nhiễm
vào gan và lách chuột với mật độ cao. Trong khi đó, các chủng Salmonella từ thực
phẩm, trừ 2 chủng Salmonella SB 10 và H51 có khả năng gây bệnh chuột, 8 chủng còn
lại không có khả năng xâm nhiễm hay xâm nhiễm được vào gan hay lách nhưng với
mật độ thấp từ 83 – 250 CFU/g. Từ đó ta có thể kết luận rằng, các chủng Salmonella
có nguồn gốc từ bệnh phẩm thì có khả năng xâm nhiễm và gây bệnh mạnh hơn các
chủng có nguồn gốc từ thực phẩm. Qua kết quả thí nghiệm này cũng cho phép kết luận
rằng độc lực của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm rất thấp, thậm chí
một số chủng không biểu hiện độc lực khi gây nhiễm vào chuột thí nghiệm.
32
4.3. KHẢ NĂNG XÂM NHIỄM SALMONELLA VÀO CÁC CƠ QUAN CỦA HỆ
TIÊU HÓA CHUỘT
4.3.1. Khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan của hệ tiêu hóa chuột ở chủng
Salmonella khi nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo
4.3.1.1. Khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột của chủng
Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm
Các đối tượng được khảo sát trong nghiên cứu này gồm: dạ dày, ruột non, ruột
già, gan và lách chuột. Thí nghiệm này được thực hiện nhằm mục đích nghiên cứu khả
năng chống lại các rào cản của cơ thể vật chủ của Salmonella sau khi chúng được đưa
vào cơ thể chuột bằng con đường tiêu hóa. Chủng được chọn trong khảo sát này là S.
enteritidis 99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm người do Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh
cung cấp. Sở dĩ chủng này được chọn vì chúng có độc lực cao nhất trong số các chủng
đã khảo sát ở trên. Thí nghiệm cũng được thực hiện với đối chứng là những chuột
không gây nhiễm Salmonella. Kết quả khảo sát trên đối chứng cho thấy không phát
hiện được Salmonella trong các cơ quan đã khảo sát. Kết quả khảo sát ở các chuột bị
gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.1.
Bảng 4.5. Mật độ xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột đối với
chủng S. enteritidis 99.303
Mật độ nhiễm
(CFU/ml)
Thời gian sau
khi nhiễm
Mật độ Salmonella (CFU/g)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
1,2 x 10
9
15 phút 4,6 x 103 8,9 x 103 2,9 x 104 0 0
2 giờ 8,9 x 103 1,5 x 104 2,7 x 103 0 0
2 ngày 1,9 x 102 4,0 x 102 0 0 0
4 ngày 3,1 x 103 1,4 x 103 6,0 x 102 8,3 x 101 0
6 ngày 1,4 x 103 3,7 x 103 0 2,8 x 102 0
8 ngày 3,9 x 104 2,9 x 105 9,9 x 101 0 0
9 ngày 2,3 x 103 9,7 x 103 0 0 0
11 ngày 2,4 x 103 8,7 x 103 0 0 0
13 ngày 7,5 x103 6,6 x 104 2,5 x 102 0 0
14 ngày 1,1 x 103 9,5 x 103 0 0 0
33
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
15' 2h 2 4 6 8 9 11 13 14
NGÀY
M
Ậ
T
Đ
Ộ
X
Â
M
N
H
IỄ
M
(l
og
N
)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
Biểu đồ 4.1. Biểu diễn khả năng xâm nhiễm của S. enteritidis 99.303 vào các
cơ quan của hệ tiêu hóa
Kết quả ở Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.1 cho thấy chủng S. enteritidis 99.303 có khả
năng xâm nhiễm vào gan và lách tương đối sớm, chỉ sau 15 phút gây nhiễm đã phát
hiện được Salmonella trong các cơ quan này, mật độ xâm nhiễm tương đối cao, từ 4,6
x 10
3
– 8,9 x 103 CFU/g và chúng duy trì trong suốt 14 ngày sau khi xâm nhiễm. Mật
độ duy trì trong gan và lách trung bình trong khoảng từ 102 - 105 CFU/g. Ở dạ dày mật
độ Salmonella được tìm thấy cao nhất trong khoảng 2 giờ sau khi xâm nhiễm và chúng
giảm dần theo thời gian. Đến ngày thứ 13 thì mật độ Salmonella ở dạ dày còn lại cao
nhất là 250 CFU/g. Ở ruột non chỉ tìm thấy Salmonella ở ngày thứ 4 - 6 sau khi gây
nhiễm. Mật độ Salmonella được tìm thấy ở cơ quan này trong khoảng 80 – 280 CFU/g,
sau đó chúng bị đào thải hoàn toàn ra khỏi ống tiêu hóa. Chúng tôi hoàn toàn không
tìm thấy Salmonella bám vào trong thành ruột già trong suốt 14 ngày khảo sát.
4.3.1.2. Khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột của chủng
Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm
Thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự với chủng bệnh phẩm. Chủng được
chọn trong thí nghiệm này là Salmonella SP1a. Sở dĩ chọn chủng này để đại diện cho
nhóm Salmonella không có khả năng biểu hiện bệnh trên chuột. Kết quả khảo sát được
thể hiện trên Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.2.
34
Bảng 4.6. Mật độ xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột của chủng
Salmonella SP1a
Mật độ gây
nhiễm (CFU/ml)
Thời gian sau
gây nhiễm
Mật độ Salmonella (CFU/g)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
1,7 x 10
10
15 phút 5,5 x 102 6,8 x 103 8,8 x 103 0 0
2 giờ 8,3 x 101 4,0 x 103 4,0 x 103 0 0
2 ngày 0 0 1,0 x 102 0 0
3 ngày 2,2 x 103 2,2 x 103 0 0 0
4 ngày 0 0 4,4 x 102 0 0
5 ngày 2,4 x 103 2,8 x 103 0 2,1 x 102 0
7 ngày 0 1,5 x 102 0 0 0
8 ngày 0 0 0 0 0
10 ngày 0 0 0 0 0
12 ngày 0 0 0 0 0
14 ngày 0 0 0 0 0
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3 0
3,50
4,00
15' 2h 2 3 4 5 7 8 10 12 14
NGÀY
M
ẬT
Đ
Ộ
X
ÂM
N
H
IỄ
M
(l
og
N)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
Biểu đồ 4.2. Biểu diễn khả năng xâm nhiễm của Salmonella SP1a vào các cơ quan
thuộc hệ tiêu hóa
35
Kết quả ở Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.2 cho thấy Salmonella SP1a được tìm thấy
trong gan và lách ở giai đoạn rất sớm sau 15 phút gây nhiễm và chúng duy trì trong
các cơ quan này đến ngày thứ 7, sau đó chúng bị đào thải hoàn toàn ra ngoài cơ thể. Ở
dạ dày, vi sinh vật này được tìm thấy đến ngày thứ 4 với mật độ 440 CFU/g. Ở ruột
non, chúng được tìm thấy ở ngày thứ 6. Riêng ở ruột già không tìm thấy vi sinh vật
này sau 14 ngày gây nhiễm. Kết quả thí nghiệm này cho thấy chủng Salmonella SP1a
có nguồn gốc thực phẩm cũng có khả năng xâm nhiễm vào các nội tạng gan và lách
chuột nhưng chúng không có khả năng biểu hiện bệnh vì độc lực kém, chỉ sau 7 ngày
xâm nhiễm chúng đã bị cơ thể chuột loại thải hoàn toàn ra ngoài cơ thể. Kết quả thí
nghiệm này cũng giải thích tại sao sau 14 ngày theo dõi sau khi gây nhiễm lại không
phát hiện được Salmonella này trong gan và lách chuột như kết quả ở mục 4.1.2 và
4.2.2.
4.3.1.3. So sánh khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc hệ tiêu hóa chuột
giữa chủng bệnh phẩm và chủng từ thực phẩm
So sánh giữa hai kết quả ở mục 4.3.1.1 và 4.3.1.2 cho thấy chủng S. enteritidis
99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả năng xâm nhiễm vào gan, lách cao hơn và
thời gian tồn tại cũng lâu hơn so với chủng Salmonella SP1a có nguồn gốc từ thực
phẩm. Chủng từ bệnh phẩm S. enteritidis 99.303 có thể tồn tại sau 14 ngày trong gan
và lách chuột, mật độ của chúng trong các cơ quan này vẫn chưa có chiều hướng giảm.
Trong khi đó chủng từ thực phẩm Salmonella SP1a sau 8 ngày đã bị loại thải hoàn
toàn ra khỏi các cơ quan này. Còn tại ruột non và ruột già thì cả chủng có nguồn gốc từ
bệnh phẩm hay thực phẩm đều không có khả năng xâm nhiễm hay có xâm nhiễm
nhưng với mật độ rất thấp và hầu như chúng không tồn tại lâu trong ống tiêu hóa.
Ngoài ra các kết quả trên cũng cho ta thấy dường như không có mối liên hệ giữa tính
gây bệnh với khả năng xâm nhiễm vào các cơ quan thuộc ống tiêu hóa của Salmonella.
4.3.2. Khả năng tái xâm nhiễm của các chủng Salmonella
Mục đích của thí nghiệm này là nghiên cứu sự thay đổi độc lực sau khi
Salmonella đã qua quá trình xâm nhiễm vào vật chủ.
4.3.2.1. Khả năng tái nhiễm vào các cơ quan của hệ tiêu hóa chuột ở chủng
Salmonella từ bệnh phẩm
Chủng S. enteritidis 99.303 được gây nhiễm vào cơ thể chuột, nuôi chuột bị
nhiễm trong khoảng 4 - 5 ngày. Dịch gan của chuột bị nhiễm được xác định mật độ
36
Salmonella và được sử dụng để gây nhiễm trở lại vào chuột khỏe mạnh. Thí nghiệm
được tái gây nhiễm vào 4 chuột, mổ chuột theo từng khoảng thời gian, quan sát từng
cơ quan của hệ tiêu hóa và định lượng mật độ Salmonella trong các cơ quan này. Kết
quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 4.7.
Bảng 4.7. Mật độ S. enteritidis 99.303 trong dịch gan tái xâm nhiễm vào các cơ
quan của hệ tiêu hóa theo thời gian
Mật độ
gây nhiễm
(CFU/ml)
Thời gian
sau khi
nhiễm
Mật độ Salmonella (CFU/g)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
1,9 x 10
3
3 ngày 0 0 6,3 x 102 0 0
6 ngày 3,3 x 102 4,5 x 102 1,4 x 102 4,4 x 102 0
10 ngày 2,0 x 103 5,2 x 103 2,1 x 102 7,2 x 102 58 x 102
14 ngày 3,9 x 102 3,5 x 102 8,0 x 101 4,1 x 102 8,0 x 101
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
3 6 10 14
NGÀY
M
Ậ
T
Đ
Ộ
X
Â
M
N
H
IỄ
M
(
lo
gN
)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
Biểu đồ 4.3. Khả năng tái xâm nhiễm của chủng S. enteritidis 99.303 từ dịch gan
vào hệ tiêu hóa chuột
Kết quả ở Bảng 4.7 và Biểu đồ 4.3 cho thấy chủng S. enteritidis 99.303 có khả
năng tái xâm nhiễm xuyên qua ống tiêu hóa khi mật độ gây nhiễm thấp, chỉ 1,9 x 103
37
CFU/g từ dịch gan chuột. Sau khi tái xâm nhiễm chúng có khả năng duy trì trong dạ
dày đến 14 ngày. Sau 6 ngày có thể tìm thấy vi sinh vật này nhiễm trong khắp các cơ
quan đã khảo sát như gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già. Chúng không bị đào thải
trong suốt 14 ngày theo dõi. Mật độ chúng nhiễm vào các cơ quan này cao hơn so với
khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo BHI. Mật độ Salmonella tái nhiễm trong gan
và lách cao hơn với mật độ tế bào gây nhiễm vào ban đầu, chứng tỏ Salmonella đã
tăng trưởng lên sau khi xâm nhiễm vào các cơ quan này. Từ các kết quả trên có thể kết
luận rằng chủng S. enteritidis 99.303 khi phát triển trong môi trường in vivo có khả
năng xâm nhiễm và gây bệnh mạnh hơn so với khi nuôi cấy chúng trên môi trường
nhân tạo (in vitro). Nói cách khác là độc lực của nó đã được tăng lên khi chúng được
một lần sống sót và thích nghi với các các điều kiện chống cự của cơ thể vật chủ. Hiện
tượng này có thể là do: (1) Chủng Salmonella đã thích nghi với khả năng xâm nhiễm,
(2) Môi trường in vivo đã hoạt hóa các gen gây độc ở Salmonella trong khi các gen
này bị kìm hãm khi nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo, (3) Chủng S. enteritidis
99.303 gốc có độc lực đã giảm do thời gian bảo quản và cấy chuyền nhiều lần.
4.3.2.2. Khả năng tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột của chủng Salmonella từ
thực phẩm
Cách tiến hành thí nghiệm tương tự như chủng Salmonella từ bệnh phẩm.
Chủng Salmonella từ thực phẩm được dùng trong khảo sát là Salmonella SP1a. Chủng
Salmonella này cũng được cho xâm nhiễm vào chuột, nuôi chuột bị nhiễm sau 3 – 4
ngày, dịch gan chuột bị nhiễm được định lượng Salmonella và được tái gây nhiễm vào
chuột . Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 4.8 và Biểu đồ 4.4.
Bảng 4.8. Mật độ Salmonella SP1a tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột
theo thời gian
Mật độ gây
nhiễm (CFU/ml)
Thời gian
sau khi
nhiễm
Mật độ Salmonella (CFU/g)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
5,5 x 10
3
3 ngày 0 0 2,0 x 102 0 0
6 ngày 5,5 x 101 1,5 x 102 90 0 0
9 ngày 4,2 x 103 9,8 x 103 0 0 0
12 ngày 0 0 0 0 0
38
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
3 6 9 12
NGÀY
M
Ậ
T
Đ
Ộ
X
Â
M
N
H
IỄ
M
(
lo
gN
)
Gan Lách Dạ dày Ruột non Ruột già
Biểu đồ 4.4. Khả năng tái xâm nhiễm của chủng Salmonella SP1a từ dịch gan vào
hệ tiêu hóa
Qua kết quả thể hiện ở Bảng 4.8 và Biểu đồ 4.4 cho thấy chủng Salmonella
SP1a có khả năng tái nhiễm thì có khả năng sống sót trong dạ dày đến ngày thứ 6 và
duy trì trong gan và lách đến ngày thứ 9. Mật độ nhiễm vào gan vào lách cao hơn so
với khi nuôi cấy chúng trong môi trường nhân tạo BHI, thậm chí cao hơn mật độ tế
bào đã nhiễm ban đầu. Như vậy, chúng đã có khả năng tăng trưởng bệnh trong các cơ
quan này. Song chúng vẫn không được tìm thấy trong ruột non và ruột già. Qua 12
ngày, Salmonella xâm nhiễm trong các cơ quan này bị đào thải hoàn toàn. Về biểu
hiện bệnh lý, mặc dù Salmonella được tái nhiễm vào gan và lách mạnh hơn so với ban
đầu nhưng vẫn không có khả năng biểu hiện bệnh ở chuột. Qua kết quả này cho thấy
rằng, mặc dù chủng Salmonella SP1a đã được trải qua sự thích nghi trong môi trường
vật chủ (in vivo) nhưng độc lực của chúng cũng rất kém, chúng vẫn bị hệ thống phòng
vệ của vật chủ loại bỏ khỏi cơ thể.
4.3.2.3. So sánh khả năng tái xâm nhiễm vào hệ tiêu hóa chuột của S. enteritidis
99.303 và Salmonella SP1a
Căn cứ vào kết quả ở Bảng 4.7 và Bảng 4.8 cho thấy chủng S. enteritidis
99.303 có khả năng xâm nhiễm vào toàn bộ các bộ phận ta khảo sát như gan, lách, dạ
39
dày, ruột non và ruột già với mật độ tương đối cao so với mật độ tế bào đã nhiễm vào
ban đầu. Trong khi đó, chủng Salmonella SP1a chỉ có thể nhiễm vào gan, lách và
không có khả năng bám vào thành ruột non, ruột già. Ở dạ dày, chủng S. enteritidis
99.303 từ bệnh phẩm có thời gian tồn tại lâu hơn so với chủng Salmonella SP1a từ
thực phẩm. Sau 12 ngày gây nhiễm, chủng Salmonella SP1a bị đào thải hoàn toàn.
Trong khi đó chủng S. enteritidis 99.303 vẫn duy trì được mật độ xâm nhiễm cao trong
các cơ quan của hệ tiêu hóa chuột.
Các kết quả trên cho thấy cả 2 chủng Salmonella từ bệnh phẩm và thực phẩm
sau khi tái nhiễm đều có khả năng xâm nhiễm vào gan và lách mạnh hơn so với ban
đầu khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo BHI. Từ đó có thể kết luận rằng các chủng
Salmonella có nguồn gốc từ môi trường in vivo có khả năng xâm nhiễm và thích nghi
mạnh hơn so với khi phân lập từ môi trường in vitro.
4.4. SỰ TÁC ĐỘNG CỦA MÔI TRƢỜNG XUNG QUANH ĐẾN CÁC KẾT
QUẢ THÍ NGHIỆM
Để khẳng định Salmonella nhiễm và gây bệnh cho chuột có nguồn gốc từ sự
gây nhiễm, không có sự nhiễm bẩn từ các yếu tố bên ngoài, trong các lô thí nghiệm
chúng tôi đều tiến hành phân tích Salmonella trong thức ăn và nước uống của chuột.
Bên cạnh đó, trong mỗi lô thí nghiệm đều có chuột dùng làm đối chứng âm, là chuột
được cho uống nước đã hấp vô trùng thay cho dịch vi khuẩn. Chuột dùng làm đối
chứng âm được nuôi cách biệt với các chuột được gây nhiễm, các điều kiện và khảo
sát đều được thực hiện tương tự như lô thí nghiệm.
Kết quả cho thấy các yếu tố bên ngoài như thức ăn, nước uống, môi trường nuôi
chuột đều không bị nhiễm Salmonella. Các chuột trong lô đối chứng âm đều không có
dấu hiệu bệnh lý, chúng vẫn khỏe mạnh, nhanh nhẹn và tăng trọng. Kết quả khảo sát ở
các cơ quan của hệ tiêu hóa như gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già cũng cho thấy
không có sự hiện diện của Salmonella. Qua kết quả trên, chúng ta có thể loại bỏ khả
năng xâm nhiễm Salmonella do các yếu tố bên ngoài như thức ăn, nước uống, môi
trường xung quanh.
40
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Những nghiên cứu đã thực hiện như trên là bước đầu so sánh sự khác nhau về
khả năng xâm nhiễm, gây bệnh và gây chết chuột của các chủng Salmonella có nguồn
gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Từ kết quả đã nhận được cho phép chúng tôi rút ra
những kết luận như sau:
- Có sự khác biệt rõ rệt về khả năng xâm nhiễm, gây bệnh và gây chết giữa các
chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng Salmonella
có nguồn gốc từ bệnh phẩm có khả năng gây bệnh và gây chết chuột. Trong khi đó ở
10 chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì có 2/10 chủng có khả năng gây
bệnh còn 8/10 chủng là không có khả năng gây bệnh, không có chủng nào có khả năng
gây chết chuột. Như vậy các chủng Salmonella từ bệnh phẩm có độc lực mạnh hơn
chủng từ thực phẩm.
- Có sự khác biệt về khả năng xâm nhiễm vào gan và lách của chuột ở các
chủng Salmonella từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. 4/4 chủng từ bệnh phẩm đều có khả
năng xâm nhiễm vào cả gan và lách chuột. 5/10 chủng từ thực phẩm mới có khả năng
xâm nhiễm vào. Hầu như không có sự khác biệt về khả năng xâm nhiễm vào dạ dày,
ruột non và ruột già giữa các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực
phẩm.
- Các chủng Salmonella nuôi cấy trong môi trường tổng hợp nhân tạo có khả
năng xâm nhiễm và gây bệnh kém hơn so với khi chủng đã qua giai đoạn sinh trưởng ở
môi trường tự nhiên trong nội tạng của chuột.
5.2. ĐỀ NGHỊ
Nếu nghiên cứu này được thực hiện tiếp tục, chúng tôi đề nghị được tiến hành
với các nội dung sau:
- Nghiên cứu thời gian Salmonella bị đào thải hoàn toàn ra khỏi cơ thể chuột
nếu chủng đó không gây bệnh và chưa đủ liều gây chết chuột.
- Tiến hành khảo sát các chủng Salmonella với số lượng lớn hơn, đặc biệt là các
chủng Salmonella từ thực phẩm và môi trường.
41
- Nghiên cứu sự khác biệt di truyền, sự biểu hiện của các gen tham gia trong
quá trình xâm nhiễm và gây bệnh ở các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và Salmonella
từ thực phẩm, môi trường.
42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Mai Chí Cần, 2002. Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli, Salmonella và nấm
phổi trên gà một ngày tuổi. Khóa luận tốt nghiệp Bác sỹ Thú y, Đại học Nông Lâm
TP. Hồ Chí Minh.
2. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh và Nguyễn Quang Tuyên, 2001. Kết quả phân lập và
xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella spp. gây bệnh phó
thương hàn lợn ở một số tỉnh miền núi phía Bắc. Khoa học kỹ thuật Thú y, 8 (3):
10 – 19.
3. Nguyễn Hoàng Dũng, 2004. Bước đầu nghiên cứu so sánh khả năng gây bệnh của
các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm và bệnh phẩm. Khóa luận tốt
nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí
Minh.
4. Nguyễn Tiến Dũng, 2002. Phát hiện phân biệt Salmonella spp., Salmonella
enterica I trong thủy sản, nước tự nhiên. Luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành
Vi sinh, Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Hoàng Dũng và Trần Linh Thước, 2005. Nghiên cứu
độc lực trên chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ
thực phẩm. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2 (2): 157-168.
6. Vương Thị Việt Hoa, 2002. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Khoa Công
Nghệ Thực Phẩm - Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
7. Đinh Nam Lâm, 1999. Nghiên cứu vi khuẩn học tình hình nhiễm Salmonella trên
vịt. Luận án Thạc sĩ khoa học Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh.
8. Dương Thanh Liêm và Dương Thị Lê Hà, 2003. Dinh dưỡng và sức khỏe vệ sinh
an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh.
9. Nguyễn Thị Oanh và Phùng Quốc Chướng, 2003. Tình hình ô nhiễm Salmonella và
một số đặc tính gây bệnh của Salmonella phân lập trên trâu bò tại Đak Lak. Khoa
học kỹ thuật Thú y, 10 (2): 26 – 32.
10. Trần Thanh Phong, 1996. Bệnh truyền nhiễm do vi trùng trên heo. Tủ sách trường
Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật học thú y. Nhà xuất bản Đại học và Trung
học chuyên nghiệp, Hà Nội.
12. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm
và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục, TP. Hồ Chí Minh.
43
13. Võ Thị Bích Thủy, Trần Thị Hạnh và Lưu Quỳnh Hương, 2002. Tình trạng ô
nhiễm Salmonella trong thực phẩm nguồn gốc động vật trên địa bàn Hà Nội. Khoa
học kỹ thuật Thú y, 9 (1): 18 - 23.
14. Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức và Nguyễn Văn Dịp, 2003. Kỹ thuật kiểm tra
và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
15. Nguyễn Ngọc Tuân, 2002. Vệ sinh thịt. Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí
Minh.
16. Bộ Y tế, 2001. Vi sinh vật y học. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
17. Trần Cẩm Vân, 2002. Giáo trình vi sinh học môi trường. Nhà xuất bản Đại học
quốc gia Hà Nội.
TÀI LIỆU TỪ MẠNG INTERNET
18. Centers for Disease Control. Salmonellosis. USA, September 2004
19. Centers for Disease Control. How can I prevent Salmonella infection?. USA, 1996.
20. Chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm: vẫn rất đáng lo ngại!
Submit%3AcboInputMethod=0
21. Haghjoo E, Galan JE. Salmonella typhi encodes a functional cytolethal distending
toxin that is delivered into host cells by a bacterial-internalization pathway.
Section of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, New
Haven, CT 06536, USA, March 2004.
uids=10531212&dopt=Abstract
22. Hands Hedrich. The laboratory mouse. Institute for Laboratory Animal Science,
Hanover Medical School, Germany, Jun 2005.
23. Houston CW, Koo FC, Peterson JW. Characterization of Salmonella toxin released
by mitomycin C-treated cells. American Society for microbiology, may 1981.
uids=6788702&dopt=Abstract
24. Intestinal Bacteria- Salmonella
44
25. Kenneth Todar . Salmonella and Salmonellosis. University of Wisconsin-
Madison Department of Bacteriology, 2005.
26. Lu S, Manges AR, Xu Y, Fang FC, Riley LW. Analysis of virulence of clinical
isolates of Salmonella enteritidis in vivo and in vitro. November, 1999.
”Ma
nges+AR”
27. Malik P, Sharma VD, Thapliyal DC. Partial purification and characterization of
Salmonella cytotoxin. University of Agriculture and Technology, India.
861639&dopt=Abstract
28.Murugkar HV, Rahman H, Dutta PK. Distribution of virulence genes in Salmonella
serovars isolated from man & animals. Indian Joural o Medical Research, Feb
2003.
28. Ralph A. Giannella. Salmonella. Walter Reed Army Institute of Research,
Washington, USA.
Medmicro Chapter 21.htm
29. Rosalyn Carson-DeWitt MD. Salmonella food poisoning. CDC, USA, December,
2002
30. Wallace H. Andrews and Thomas S. Hammack. Salmonella spp. Foodborne
Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook, January 1992.
ebam/bam-5.html
TIẾNG ANH
31. Daniel P. S., John D. S., and J. Vivian Wells, 1987. Basic & Clinical Immunology.
Prentice-Hall International, Inc, USA. p. 555.
32. Jay J. M., 2000. Modern food Microbiology. An Arpen publication, Maryland. p.
511 - 528.
33. Quinn P. J., Carter M. E., Markey B. K., and Carter G. R. Clinical veterinary
microbiology. p. 226 - 234.
34. William B., Robert M. L., and John W. R., 1968. The enteric Bacilli - The
Salmonella group. The pathogenic microorganisms. W.B Saunders Company,
USA. p. 495 – 513.