Khóa luận Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc

3. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong toàn bộ quá trình thí nghiệm bao gồm: kính hiển vi quang học, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow), máy đo pH, tủ định ôn, màng lọc vô trùng (0,2 m và 0,45 m), màng parafilm, cối, chày, dao, hộp nhựa, bercher, kim tiêm, túi nilon, ống nghiệm, ống Durham, bình tam giác, đĩa petri, micropipet và đầu típ các loại. 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu Bệnh cằn mía gốc không tạo ra các triệu chứng biểu hiện rõ rệt và đặc trưng nên rất khó phát hiện cây bị bệnh (Pan và ctv., 1998; Brumbley và ctv., 2006; Taylor và ctv., 2003). Do đó, cần phải rất thận trọng trong quá trình thu thập mẫu để chọn đúng cây bị bệnh vì đây là khâu quan trọng đầu tiên quyết định thành công của tất cả các thí nghiệm. Chỉ tiêu quan sát Cây sinh trưởng và phát triển chậm, có đường kính nhỏ, lóng ngắn hơn so với các cây xung quanh. Tuy nhiên, nếu hầu hết cây trong ruộng mía đều bị bệnh thì sẽ không có sự khác biệt (Comstock và Lentini, 2005). Do đó, chúng tôi tiến hành so sánh với cây trong một ruộng khác có các điều kiện canh tác tương tự (cùng giống, cùng thời gian trồng, cùng lượng nước tưới và phân bón). Ngoài ra, cây bị bệnh còn có sự đổi màu của các bó mạch ở phía dưới mắt mía (khi dùng dao chặt chéo thân qua phần mắt mía có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn) (Comstock và Lentini, 2005; Brumbley và ctv., 2006; Pan và ctv., 1998). 36 37 3.3.2. Phƣơng pháp nhuộm STM Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Safranin 2,5 ‰: hòa tan 2,5 g safranin trong 100 ml cồn 96 . Sau đó, thêm nước cất vào dung dịch cho vừa đủ 1000 ml. Quy trình nhuộm STM để phát hiện cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.1): nhổ cây mía, chặt sát gốc, nhúng vào dung dịch thuốc nhuộm safranin 2,5 ‰ và để dưới trời nắng. Sau khoảng 30 phút, lấy cây mía ra; cây mía được lóc bỏ vỏ để lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Cắt thân mía thành từng lát mỏng theo chiều ngang và quan sát màu của các bó mạch dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 - 100 lần. Tiến hành ghi nhận số liệu tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng của thân mía đem nhuộm STM (trong đó, bó mạch đỏ là bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn; bó mạch vàng là bó mạch bị nhiễm vi khuẩn). Mức độ nhiễm bệnh của cây có thể được đánh giá dựa vào tỉ lệ của các loại bó mạch. Theo đó, cây mía được đánh giá là nhiễm nặng, nhiễm trung bình hay nhiễm nhẹ khi có tỉ lệ mạch đỏ lần lượt chiếm < 70 %, 70 – 84,9 % và 85 – 99,9 %. Ngược lại, cây mía không bị bệnh cằn mía gốc khi không có sự hiện hiện của mạch vàng, tức tỉ lệ mạch đỏ là 100 % (Hà Đình Tuấn, 2004). 3.3.3. Phƣơng pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh Tiến hành chủng bệnh cho cây nuôi cấy mô ba tháng tuổi bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.2). Quy trình chủng bệnh được tiến hành như sau: cắt ngang ngọn của cây mía nuôi cấy mô ở ngay phía trên phần mô phân sinh ngọn, dùng kim tiêm bơm 1ml dịch chiết từ cây mía bị nhiễm bệnh lên bề mặt mới cắt. Sau đó, bọc túi nilon vào phần ngọn mới cắt và cột lại để tránh sự tấn công của côn trùng phá hoại (Young và Brumbley, 2004). 3.3.4. Phƣơng pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn Dùng que cấy lấy dịch vi khuẩn và khuấy đều trong giọt KOH trên miếng lam. Sau đó, nhấc nhẹ que cấy, nếu xuất hiện dịch nhớt kéo theo que cấy (dài 2 – 3 cm) thì 38 39 vi khuẩn cần xác định là vi khuẩn Gram (-). Ngược lại, ở vi khuẩn Gram (+) không có dịch nhớt (Malcolm và Charles, 1997). 3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate Tiến hành kiểm tra khả năng lên men của các dòng vi khuẩn phân lập được với 2 loại nguồn carbon là manitol và sorbitol. Cách thực hiện như sau: hút 20 l dịch vi khuẩn cho vào các ống nghiệm chứa môi trường Phenol Red Carbohydate Broth (phụ lục 4; trong đó, carbohydrate là manitol hoặc sorbitol). Chỉ tiêu quan sát: sau khi ủ ở 28 C trong 48 h, khả năng lên men của vi khuẩn được đánh giá dựa vào khả năng sinh acid và khả năng sinh hơi. Vi khuẩn có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường chuyển thành màu vàng; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường không đổi màu. Vi khuẩn có khả năng sinh hơi khi có bọt khí xuất hiện trong ống Durham và ngược lại. Nếu vi sinh vật lên men chậm, sự đổi màu thường không rõ ràng và không có bọt khí xuất hiện trong ống Durham, cần phải so sánh với ống đối chứng không cấy vi sinh vật hoặc thực hiện lại thử nghiệm để thu được kết quả chính xác (Trần Linh Thước, 2003). 3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật Thử nghiệm Catalase: tất cả các vi sinh vật hiếu khí chứa chuỗi chuyền điện tử cytochrome đều có enzyme catalase, đây là enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử thông qua quá trình thủy phân H2O2 thành H2O và O2. Thử nghiệm được tiến hành bằng cách nhỏ trực tiếp 1 ml dung dịch H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt môi trường thạch SC; phản ứng được ghi nhận thông qua hiện tượng sủi bọt khí. Thử nghiệm Catalase được ghi nhận dương tính khi có hiện tượng sủi bọt khí; ngược lại, thử nghiệm âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2003). Thử nghiệm amylase: trong thí nghiệm này, môi trường Starch Agar (phụ lục 5) và dung dịch thuốc thử KI được sử dụng để xác định hoạt động phân giải tinh bột của enzyme amylase ngoại bào. Phản ứng được thực hiện bằng cách chuyển 20 l dịch vi khuẩn phân lập được lên đĩa môi trường Starch Agar. Sau khi ủ ở 28 C 40 trong 24 h, tiến hành kiểm tra lượng tinh bột trên đĩa môi trường bằng dung dịch KI. Phản ứng amylase được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải tinh bột xung quanh vùng phát triển của vi khuẩn. Ngược lại, phản ứng âm tính khi không có vòng phân giải tinh bột quanh vùng phát triển của vi khuẩn (Schaad, 1994). Thử nghiệm protease: nhằm xác định khả năng phân giải protein bởi enzyme protease ngoại bào của vi sinh vật. Thử nghiệm này được thực hiện trên môi trường SC có bổ sung 1% (w/v) casein và 0,05 % (w/v) ferric citrate (trong đó, nguồn protein được thử nghiệm là casein, đây là loại protein chính có trong sữa). Phản ứng được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải trong suốt xung quanh vùng phát triển của vi khuẩn; ngược lại là phản ứng âm tính (Schaad, 1994). 3.4. Bố trí thí nghiệm Luận văn bao gồm bốn thí nghiệm như sau: Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh Tiến hành nhuộm STM đối với 20 cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, quan sát dưới kính hiển vi và thống kê tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch vàng) trong mỗi lóng; từ đó suy ra vị trí lóng có mật độ vi khuẩn cao nhất (tức là lóng có tỉ lệ bó mạch bị nhiễm vi khuẩn cao nhất). Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Dịch chiết này được lọc qua màng lọc 0,45 m và chủng bệnh vào các cây nuôi cấy mô 3 tháng tuổi. Sau các khoảng thời gian 15, 30, 45, 60 ngày, khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng bằng phương pháp STM. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Sau đó, lọc dịch 41 chiết qua màng lọc 0,45 m và tiến hành cấy trãi dịch chiết trên môi trường thạch SC và MSC. Sau 28 – 42 ngày ủ ở 28°C, các khuẩn lạc có đặc điểm giống như mô tả khuẩn lạc Lxx (đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố) (Davis, 1980) được cấy chuyền sang các đĩa môi trường khác. Tăng sinh các khuẩn lạc thuần sau 2 lần cấy chuyền trong môi trường lỏng S8 để thu sinh khối. Thành phần các môi trường nuôi cấy được trình bày trong bảng phụ lục 1, 2, 3. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được Dịch vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng S8 (thí nghiệm 3) được sử dụng trong các thử nghiệm sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx. Trong thí nghiệm này, chúng tôi chỉ tiến hành một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Lxx (xác định Gram, thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate (manitol, sorbitol), thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào (catalase, amylase, protease). Từ bảng liệt kê các thử nghiệm sinh hóa của Lxx (phụ lục 6) cho thấy loại vi khuẩn này cho kết quả dương tính với manitol và catalase; âm tính với sorbitol, amylase, protease. Kết quả của các phản ứng sinh hóa chính là cơ sở ban đầu nhằm phát hiện vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. 42 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh Tiến hành nhuộm STM đối với 20 cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, tiến hành khảo sát tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch vàng) trong từng lóng dọc theo chiều cao cây. Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng trong mỗi lóng dọc theo chiều cao cây Số lóng Số bó mạch đỏ trung bình Số bó mạch vàng trung bình Tổng số bó mạch trung bình Tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình (%) 1 2 3 4 5 6 7 142 156 168 182 185 180 176 49 36 25 10 8 13 16 191 192 193 192 193 193 192 74,4 81,3 87,1 94,8 95,9 93,3 91,7 * số lóng được tính theo vị trí từ gốc lên ngọn. ** số bó mạch trung bình của 20 cây đã được làm tròn. Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình của các cây bị bệnh thấp nhất ở lóng số 1 (74,4 %), tỉ lệ này tăng dần theo chiều cao cây ở các lóng tiếp theo và cao nhất ở lóng số 5 (95,9 %). Ngoài ra, trong quá trình quan sát, sự phân bố vi khuẩn trong cùng một lóng theo tiết diện ngang của cây cũng được ghi nhận, số lượng bó mạch bị nhiễm vi khuẩn tập trung nhiều nhất ở phần lõi bên trong và ít nhất ở các bó mạch bên ngoài gần biểu bì. Ghi nhận này có độ tin cậy cao bởi theo kết quả khảo sát bằng phương pháp nhuộm STM trên 8 giống mía khác nhau của Giglioti và ctv. (2000) cho thấy sự phân bố của các bó mạch bị mất chức năng trên một lát cắt lần lượt là 29,8 %, 15,5 % và 6,7 % đối với những mô ở trong, mô ở 43 giữa và mô ở ngoài gần biểu bì. Bó mạch bị mất chức năng khi có sự xâm nhiễm của vi khuẩn Lxx gây tắc bó mạch. Nước đi lên trong mạch mộc và thoát ra ngoài khí quyển nhờ 3 lực: lực đẩy nước từ rễ, lực mao dẫn và lực kéo nước từ lá (sự thoát hơi nước). Tuy nhiên, đối với những cây cao như cây mía, lực đẩy nước do áp suất dương ở gốc (rễ) không đủ mạnh để dẫn nước trong mạch mộc đi lên, chính lá tạo sức căng lớn (áp suất thủy tĩnh âm) kéo cột nước đi lên (Bùi Trang Việt, 2002). Phương pháp nhuộm STM được thực hiện dựa vào sự thoát hơi nước của lá, trong đó, thuốc nhuộm safranin được dẫn lên thân qua các bó mạch còn chức năng tức là chỉ nhuộm được các bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn chứ không nhuộm các bó mạch bị nhiễm khuẩn. Nếu mạch mộc bị tắc ở lóng bên dưới thì không thể dẫn thuốc nhuộm safranin lên các lóng tiếp theo; do đó, tỉ lệ bó mạch đỏ trong lóng bên trên sẽ bằng hoặc giảm hơn so với lóng bên dưới nếu ở lóng này xuất hiện các mạch tắc mới do sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Vì vậy, trên lý thuyết, tỉ lệ bó mạch đỏ sẽ giảm dần trong các lóng dọc theo chiều cao cây. Tuy nhiên, kết quả thực tế ghi nhận được ở bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình thấp nhất ở lóng sát gốc và tăng dần trong các lóng tiếp theo dọc theo chiều cao cây. Có thể giải thích được sự thay đổi tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình dọc theo các lóng dựa vào cấu tạo mạch mộc. Hình 4.1. Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM a: quan sát bằng mắt thƣờng; b: quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 lần; c: quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần 1. Bó mạch vàng: bó mạch bị nhiễm vi khuẩn Lxx; 2. Nội bì; 3. Bó mạch đỏ: bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn Lxx. Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ không có vi khuẩn; c: nội bì 1 2 3 44 45 46 Theo Bùi Trang Việt (2002), sợi mộc có cấu tạo là sợi dài với vô số các lỗ trên vách và các yếu tố mạch ngắn hơn có hai đầu bị "xoi lỗ" một phần hay hoàn toàn. Các yếu tố mạch xếp chồng lên nhau, tạo nên những ống liên tục rất dài. Các yếu tố mạch cũng thông thương với nhau và với các sợi mạch qua các lỗ trên vách dọc, đây là điều kiện thuận lợi để nước vào và di chuyển khá tự do trong mạch mộc. Trong quá trình vận chuyển nước lên lá, vấn đề quan trọng của thực vật là phải tránh các bọt khí xuất hiện làm gián đoạn cột nước trong mạch mộc. Đây là một vấn đề rất phức tạp vì lực cần để loại bỏ các bọt khí trong cột nước rất lớn, hơn nữa, bóng khí nhỏ khi xuất hiện sẽ kéo dài dưới sức kéo, lan rộng cả hệ thống mạch làm thực vật bị khô và chết. Tuy nhiên, điều này thường không xảy ra vì nước có thể đi vòng bóng khí để qua các ống dẫn xung quanh nhờ các lỗ trên vách (Bùi Trang Việt, 2002). Nguyên tắc này được áp dụng để giải thích khả năng dẫn truyền của thuốc nhuộm safranin trong các mạch mộc bị vi khuẩn kí sinh. Trong trường hợp này, có thể các lỗ trên vách dọc của mạch mộc cũng đóng vai trò như một cửa thông cho phép thuốc nhuộm safranin vòng qua vị trí tắc trong mạch mộc do vi khuẩn gây ra và tiếp tục quá trình dẫn truyền lên các lóng mía phía trên. Do vậy, dựa vào sự hiện diện của bó mạch tắc và tỉ lệ bó mạch thông trong thân mía người ta có thể xác định, đánh giá mức độ nhiễm bệnh của cây trên cánh đồng (Giglioti và ctv., 1999). Phương pháp nhuộm STM được Giglioti và ctv. (1999, 2000); Hà Đình Tuấn (2004) sử dụng để phát hiện và đánh giá tình hình nhiễm bệnh cằn mía gốc. Do tính chất định tính của nghiên cứu, các tác giả này đã đề nghị thời gian thực hiện phương pháp nhuộm STM là 30 phút; tuy nhiên, khoảng thời gian 30 phút có thể là quá ngắn đối với thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây bị bệnh. Lập luận này được chứng minh thông qua sự giảm tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình ở lóng số 6 và lóng số 7, có lẽ thuốc nhuộm safranin không thể dẫn lên được toàn bộ các lóng của cây, đặc biệt là các lóng gần ngọn (lóng 6, 7, 8) sau thời gian 30 phút. Mặc dù tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình ở lóng số 6 và lóng số 7 không phù hợp với quy luật đã được khảo sát ở 5 lóng gần gốc, nhưng kết quả ở bảng 4.1 đã khẳng định lóng số 1 là nơi có sự phân bố của vi khuẩn Lxx nhiều nhất so với tất cả các lóng còn 47 lại dọc theo chiều cao của cây bị bệnh. Kết quả này phù hợp với nhận định của Grisham và ctv. (2007), tác giả cho rằng mặc dù Lxx là một loại vi khuẩn gây tắc bó mạch có sự xâm nhiễm mang tính hệ thống trên toàn cây mía nhưng mật độ vi khuẩn khác nhau giữa các mô; trong đó, Lxx tập trung nhiều nhất ở mô thân. Ông kết luận rằng mật độ vi khuẩn trong thân cao nhất ở lóng sát gốc và giảm dần ở các lóng hướng về phía ngọn. Trong các công trình nghiên cứu đã được công bố, Davis và Dean (1984) cũng thấy rằng có nhiều vi khuẩn trong thân ở các giai đoạn sau của mùa vụ và nồng độ vi khuẩn cao nhất ở phần sát gốc. Sự phân bố của vi khuẩn dọc theo các lóng của cây mía bị bệnh có thể liên quan đến hàm lượng đường trong quá trình chín của mía. Trong quá trình chín, đường được tích lũy trong cây mía theo hướng từ dưới lên trên, lần lượt lóng này đến lóng khác, lóng dưới chín trước lóng trên (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). Ngoài ra, sự đổi màu bên trong bó mạch ở các đốt của thân cây mía bệnh đã trưởng thành cũng có thể liên quan đến sự phân bố của vi khuẩn trong các lóng; theo Davis và Dean (1984), sự đổi màu thường diễn ra ở lóng dưới rồi mới lên đến các lóng phía trên và các vết đổi màu này thường được định vị ở những vùng dưới bẹ lá ngay tại vị trí xuất dịch cây, đây là nơi phát sinh ra lá và nhánh của các bó mạch. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng Nguồn cây con nuôi cấy mô được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương và trồng tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Sau thời gian 3 tháng, tiến hành chủng bệnh đối với tất cả các cây trong mỗi bụi bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh cằn mía gốc. Kết quả khảo sát ở thí nghiệm 1 cho thấy VN85-1427 là giống có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất trong 5 giống mía sản xuất được trồng tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương (C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427). Do đó trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất thuộc giống VN85-1427 để thu nhận dịch chiết. Dịch chiết được thu nhận từ lóng 1 (lóng có mật độ vi khuẩn cao nhất) (theo kết quả thí nghiệm 48 1) và lọc qua màng lọc 0,45 m nhằm hạn chế sự tạp nhiễm với các loại mầm bệnh khác trước khi chủng vào cây nuôi cấy mô (Brumbley và ctv., 2006). Sau các khoảng thời gian khác nhau (15, 30, 45, 60 ngày), tiến hành khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng bằng phương pháp nhuộm STM; số liệu được ghi nhận là tỉ lệ mạch đỏ của một cây mía đã được chủng trong mỗi bụi ở các thời điểm khảo sát. Bảng 4.2. Kết quả khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô đƣợc chủng thông qua tỉ lệ mạch đỏ trung bình Số liệu khảo sát được trình bày trong bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ thành công của phương pháp chủng rất cao, hầu hết các cây nuôi cấy mô 3 tháng tuổi sau khi chủng đều bị bệnh với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình (77,5 % - 98,5 %). Sau quá trình thử nghiệm hiệu quả của các phương pháp khác nhau, Young và Brumbley (2004) cho rằng phương pháp chủng bệnh bằng cách cắt ngang cây mía ở phía trên mô phân sinh ngọn và chuyển 100 l dịch vi khuẩn nuôi cấy vào bề mặt mới cắt là tốt nhất. Các tác giả cũng đã chứng minh rằng chủng bệnh bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx được vô trùng qua màng lọc sẽ làm tăng khả năng tạo thành khuẩn lạc của vi khuẩn trong thân mía. Vi khuẩn Lxx bắt đầu phát triển làm tắc bó mạch của các cây nuôi cấy mô sau thời gian chủng khoảng 30 ngày, điều này được thể hiện trong bảng 4.2 thông qua tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình (92,9 %). Trong các lần khảo sát tiếp theo (45 ngày và 60 ngày sau chủng), tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình lần lượt là 90,4 % và 89,5 % cho thấy tỉ lệ này có sự giảm dần theo thời gian sau khi chủng bệnh, điều này đồng nghĩa với tỉ Thời gian sau chủng Tỉ lệ mạch đỏ (%) Bụi đối chứng Bụi 1 Bụi 2 Bụi 3 Bụi 4 Bụi 5 Bụi 6 Bụi 7 Trung bình 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày 100 100 100 100 100 98,5 81,8 77,5 100 93,2 91,5 89,5 100 92,0 92,1 94,0 100 97,1 86,0 94,6 100 89,4 86,7 83,0 100 83,1 96,2 94,0 100 97,3 98,4 94,1 100 92,9 90,4 89,5 49 lệ bó mạch bị nhiễm vi khuẩn trong cây tăng dần lên theo thời gian; do đó, có thể kết luận rằng mật độ vi khuẩn Lxx trong thân mía gia tăng dần theo thời gian. Sau khi chủng khoảng 30 ngày, sự tắc mạch do vi khuẩn mới có thể phát hiện được bằng phương pháp nhuộm STM; trước khoảng thời gian này, rất khó nhận biết được sự hiện diện của vi khuẩn trong bó mạch và dường như không thể xác định được tình trạng bệnh của cây. Kết luận này phù hợp với phát biểu của nhiều nhà nghiên cứu trước đây trên thế giới. Theo Hoy và ctv. (1999), nồng độ vi khuẩn trong dịch chiết gia tăng trong suốt quá trình phát triển của cây, vì vậy giai đoạn lan truyền bệnh quan trọng nhất diễn ra trong quá trình trồng và thu hoạch. Pan và ctv. (1998) cũng cho rằng nồng độ vi khuẩn Lxx cao nhất ở trong cây vào thời điểm cuối vụ mía và có thể được phát hiện bằng kính hiển vi hoặc phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên, các phương pháp này lại cho kết quả không chắc chắn nếu thực hiện vào đầu hay giữa vụ mía vì lúc này nồng độ vi khuẩn trong thân thấp hơn. Kết quả quan sát vi khuẩn của Bailey (1977) bằng kính hiển vi đối pha trên tất cả các mô và vị trí lóng cho thấy nồng độ vi khuẩn cao nhất khi cây mía đã trưởng thành (trích dẫn bởi Davis và Dean, 1984). Theo Grisham và ctv. (2007), các phương pháp miễn dịch có thể phát hiện vi khuẩn Lxx trong mô thân của cây lớn hơn 5 tháng tuổi một cách hiệu quả vì ở giai đoạn này trong thân có nồng độ vi khuẩn cao hơn. Hình 4.3. Mẫu thân cây mía cắt dọc a. cây mía đối chứng không bị bệnh; b. cây mía bị bệnh sau khi chủng có vết đổi màu tại các bó mạch ở phía dưới mắt mía 50 Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành chủng bệnh ở phần ngọn của cây nhưng kết quả vẫn cho thấy mật độ vi khuẩn tập trung cao nhất ở phần gốc. Để giải thích cơ chế lan truyền của vi khuẩn Lxx sau khi được chủng vào cây khỏe mạnh phải dựa vào vai trò của mạch libe và mạch mộc cũng như sự liên hệ giữa chúng trong chu trình vận chuyển vật chất của thực vật. Mạch mộc có cấu tạo là những ống liên tục, rất dài với các tế bào chết có vách thứ cấp, tẩm lignin, không còn màng và nguyên sinh chất (Bùi Trang Việt, 2002). Sau khi chủng bệnh, có thể dịch vi khuẩn lan truyền xuống phần gốc theo con đường mạch mộc. Ngoài ra, dịch vi khuẩn cũng có thể hiện diện ở phần gốc thông qua con đường dẫn truyền của mạch libe. Nếu mô mộc vận chuyển nước và các chất khoáng từ rễ tới các phần hiếu khí (lá), thì libe chuyển vị các sản phẩm đồng hóa từ lá tới các vùng đang tăng trưởng và dự trữ (thân, rễ).Tuy nhiên, giữa mạch mộc và mạch libe có sự liên hệ với nhau nhờ các tia. Tia là các dãy tế bào nhu mô nằm xuyên mô mộc, đây là con đường vận chuyển ngang của các chất dinh dưỡng, từ con đường này có sự lưu thông vật chất giữa mạch mộc và mạch libe do có sự chênh lệch về nồng độ (Bùi Trang Việt, 2002). Do đó, có khả năng vi khuẩn Lxx được chủng ở phần ngọn của cây sẽ lan truyền xuống phần gốc theo dịch nhựa luyện được tổng hợp ở lá và “cư trú” trong mạch mộc nhờ các con đường lưu thông vật chất giữa mạch mộc và mạch libe. Giả thiết này cũng có cơ sở để chứng minh do phương pháp nhuộm STM chỉ phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn trong mạch mộc sau khi chủng bệnh khoảng 30 ngày. Có lẽ trong thời gian đầu sau khi chủng bệnh, phần ngọn và lá của cây đã bị cắt mất nên không có khả năng quang hợp tạo đường; do đó, sự chuyển vị trong mạch libe diễn ra rất hạn chế, chỉ sau khi bộ lá phát triển lại đầy đủ, quá trình quang hợp xảy ra thì vi khuẩn mới có khả năng đi xuống phần gốc theo dịch libe. Steindl (1949) cũng xác nhận rằng sự di chuyển của tác nhân gây cằn mía gốc nhờ vào sự di chuyển của dịch cây và từ đó lây bệnh khắp cây (trích dẫn bởi Davis và Dean, 1984). Davis và Dean (1984) nhận thấy có sự xuất hiện của chất kết dính có màu ở bên trong các bó mạch và nằm bịt kín các mạch mộc lớn. Một số cấu trúc libe cũng bị hủy hoại và bít kín, đồng thời các tế bào nằm bên cạnh các mô này cũng bị 51 chuyển sang màu nâu đỏ. Ngoài ra, Hoy và ctv. (1999) đã chứng minh rằng nồng độ vi khuẩn có trong dịch chiết cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng lan truyền và gia tăng dịch bệnh sau khi chủng. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2 còn cho thấy mức độ nhiễm bệnh sau khi chủng của các cây khác nhau trong cùng một bụi không giống nhau. Cụ thể trong bụi 3, tỉ lệ bó mạch đỏ của cây được quan sát sau 30 ngày là 92 %, tỉ lệ này tăng lên đến 92,1 % ở cây quan sát sau 45 ngày và 94 % ở cây quan sát sau 60 ngày. Trường hợp tương tự cũng xảy ra trong quá trình khảo sát bụi 4, bụi 6, bụi 7 cho thấy sự đáp ứng đối với vi khuẩn của các cây khác nhau trong cùng một bụi có thể không giống nhau. Theo Brumbley và ctv. (2006), hiện nay vẫn chưa biết được sự tắc mạch là do sản phẩm của vi khuẩn tạo ra, do cơ chế đáp ứng của cây trồng, hay là do sự kết hợp của cả hai. Sau quá trình quan sát dưới kính hiển vi điện tử, Kao và Damanm (1978) đã nhận thấy sự cư trú của vi khuẩn ở bên trong các hốc của mạch gỗ, gần với thành tế bào và đôi khi tồn tại cả bên trong thành tế bào. Sự liên kết giữa tế bào vi khuẩn và các cơ chất ở đây là nguyên nhân dẫn đến sự tắt nghẽn tại các mạch gỗ của cây. Năm 1980, các tác giả đã kiểm tra mẫu mô mía bị bệnh dưới kính hiển vi và nhận thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong các bó mạch, quản bào, nhu mô, và các kẽ hở của mạch mộc (trích dẫn bởi Monteiro – Vitorello, 2004). 4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx Dịch chiết sử dụng để phân lập vi khuẩn Lxx được thu nhận tương tự như trong thí nghiệm 2. Sau đó, tiến hành lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 m và cấy trãi dịch chiết trên môi trường thạch SC và MSC. Sau 28 – 42 ngày ủ ở 28°C, chúng tôi ghi nhận được sự xuất hiện của 11 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc mang các đặc điểm giống như mô tả của Davis (1980): có đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền tiếp tục trên môi trường thạch MSC và SC để thu nhận khuẩn lạc thuần. Tuy nhiên, sau 3 ngày ủ ở 28 C, chỉ có 8 dòng khuẩn lạc vẫn duy trì các đặc điểm của khuẩn lạc ban đầu, các dòng này được tiếp tục cấy chuyền sang môi trường thạch SC và MSC; sau đó, tăng sinh trong môi trường lỏng S8 để thu sinh khối. 52 Lxx là một loại vi khuẩn rất khó nuôi cấy. Do vi khuẩn Lxx không tạo ra các triệu chứng đáng tin cậy ở bên ngoài hay bên trong cây mía nên sự nhầm lẫn rất dễ xảy ra trong quá trình thu thập mẫu. Hơn nữa, dưới điều kiện tưới tiêu đầy đủ hoặc trong mùa mưa, triệu chứng cằn cỗi của bệnh có thể giảm xuống đến mức không thể nhận thấy (Brumbley và ctv., 2006). Ngoài ra, Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy SC (Davis và ctv., 1980) hoặc MSC (Brumbley và ctv., 2006), đây là hai loại môi trường rất phức tạp. Bên cạnh đó, thời gian nuôi cấy đối với loại vi khuẩn này thường rất dài (28 – 42 ngày). Do môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra; để hạn chế điều này, nalidixic acid được bổ sung vào môi trường nuôi cấy qua màng lọc nitrocellulose (0,2 m). Brumbley và ctv. (2006) đã chứng minh rằng vi khuẩn Lxx có khả năng kháng lại nalidixic acid nhưng nó nhạy cảm cao đối với ampicillin (100 g/mL); tetracycline (2 g/mL) và kanamycin (50 g/mL). Năm 2002, Brumbley và ctv. đã chứng minh rằng để vi khuẩn phát triển một cách hiệu quả trong môi trường lỏng cần gia tăng nồng độ của KH2PO4 và glucose, giảm nồng độ của K2HPO4 và cystein trong môi trường S8 được đề nghị bởi Davis và ctv. (1980). Nhiều công trình nghiên cứu về sinh học phân tử đã được thực hiện nhằm giải thích sự khó phát triển của vi khuẩn Lxx trên môi trường nhân tạo. Bộ gen của Leifsonia xyli subsp. xyli Brazillian (CTCB07) đã được giải trình tự hoàn chỉnh bởi nhóm di truyền môi trường và nông nghiệp (AEG) Brazil. Vi khuẩn Lxx có bộ gen dài 2,6 Mb, có tỉ lệ G – C là 68 % và chứa khoảng 2022 khung đọc mở (open reading frame); trong đó thiếu các gen trao đổi chất và sinh tổng hợp acid amine, đặc biệt là gen sinh tổng hợp cystein và methionin nên chúng trở nên rất khó nuôi cấy. Monteiro – Vitorello và ctv. (2004) đã tiến hành thí nghiệm và phát hiện rằng sự phát triển của vi khuẩn sẽ nhanh hơn nếu bổ sung cysteine và methionine vào môi trường nuôi cấy. Năm 2004, Monteiro – Vitorello và ctv. đã tiến hành phân tích trình tự nhiễm sắc thể của vi khuẩn Lxx và phát hiện có một số lượng lớn pseudogen (gen khuyết). Pseudogen là các đoạn gen được hình thành do sự xê dịch khung đọc mở, sự mất 53 nucleotide hoặc do các đột biến điểm dẫn tới sự thừa hoặc thiếu các codon kết thúc và tạo ra các gen không hoàn chỉnh (Monteiro – Vitorello và ctv., 2004), theo tác giả đây chính là sự thoái hóa về mặt di truyền trong quần thể Lxx. Ông cũng cho rằng sự thoái hóa này được xảy ra bởi quá trình thích nghi kí chủ và phổ kí chủ hẹp; các pseudogen của Lxx đã được xác định bao gồm 51 gen mã hóa transposase, các gen cần thiết cho sự biến dưỡng galactose và glutarate, các gen cần cho sự tổng hợp cystein và methionine, 20 gen gây bệnh và gây độc; số lượng lớn các gen rối loạn chức năng giải thích sự kém chịu đựng về dinh dưỡng của Lxx, qua đó, lý giải tại sao loại vi khuẩn này chỉ sống được trong bó mạch của cây mía và rất khó nuôi cấy. Gillaspie và Teakle (1989) nhận thấy rằng vi khuẩn Lxx có thể xâm nhiễm vào các loài cây thân cỏ khác (bắp, cỏ voi, cỏ kê, cỏ tranh, cỏ lồng vực) trong thí nghiệm chủng, nhưng chưa bao tìm thấy khuẩn lạc Lxx ở các loài thân cỏ này một cách tự nhiên hay sự hiện diện của Lxx một cách tự do trong môi trường. Brumbley và ctv. (2006) đã kết luận rằng bộ gen của Lxx cũng mã hóa một vài sản phẩm cho phép chúng chống lại cơ chế phản vệ của cây chủ và sống sót được trong bó mạch của cây chủ như các mầm bệnh thực vật khác. Chẳng hạn như các gen mã hóa cho hai enzyme phân giải vách tế bào - pectinase và cellulase (Monteiro - Vitorello và ctv., 2004). Theo Kao and Damann (1978), các gen này có thể liên quan đến sự hút chất dinh dưỡng từ bó mạch và cũng có thể khởi đầu việc sản xuất chất kết dính làm bít bó mạch dẫn của cây bị bệnh. Ngoài ra, Monteiro - Vitorello và ctv., (2004) cho rằng các gen này còn có thể liên quan đến sự tổng hợp hormone acid abscisic ở thực vật, đây là một chất ức chế tăng trưởng có thể liên quan đến sự cằn cỗi và làm giảm lượng chồi trên cây mía bị nhiễm bệnh cằn mía gốc (trích dẫn bởi Brumbley và ctv., 2006). 4.4. Thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc Dịch vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng S8 từ thí nghiệm 3 được sử dụng để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx. 54 Các kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập được trình bày trong bảng 4.3, hình ảnh minh họa được trình bày trong hình 4.4. Bảng 4.3. Bảng kết quả của các thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc Dòng vi khuẩn phân lập được Xác định Gram Phản ứng Manitol Sorbitol Catalase Amylase Casein Dòng 1 + + + + - - Dòng 2 + + - + - - Dòng 3 + - - - - - Dòng 4 + - - - - - Dòng 5 + + + + + - Dòng 6 + - - - ND - Dòng 7 + + + + ND + Dòng 8 + - - - ND + ND: không xác định được do các dòng vi khuẩn này không phát triển thành khuẩn lạc trên các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Do vi khuẩn Lxx có kích thước rất nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 m, đôi khi dài đến 10 m) nên không thể quan sát được dưới kính hiển vi quang học thông thường mà đòi hỏi phải sử dụng kính hiển vi nền tối hoặc kính hiển vi đối pha ở độ phóng đại X 1000 (Davis và Bailey, 2000). Do đó, phương pháp nhuộm để xác định Gram không thích hợp đối với Lxx, chúng tôi tiến hành xác định Gram của 8 dòng vi khuẩn phân lập được bằng dung dịch KOH 3% (Malcolm và Charles, 1997). Thử nghiệm khả năng lên men nhằm xác định nguồn carbon được vi khuẩn sử dụng trong quá trình tăng trưởng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng hai loại nguồn carbon là manitol và sorbitol. Khi vi khuẩn có khả năng lên men, các sản phẩm hữu cơ được tạo ra (rượu, acid hữu cơ và CO2) đều làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường. Vi khuẩn có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường chuyển thành màu vàng; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường không đổi màu (Trần Linh Thước, 2003). 55 56 Theo bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy chỉ có 4 dòng vi khuẩn (1, 2, 5, 7) từ 8 dòng vi khuẩn phân lập được cho kết quả dương tính với manitol; 5 dòng vi khuẩn (2, 3, 4, 6, 8) cho kết quả âm tính với sorbitol. Kết quả thử nghiệm catalase cho thấy 4 dòng (1, 2, 5, 7) dương tính; chỉ có 2 dòng (1, 2) cho phản ứng âm tính với amylase. Trong phản ứng casein, hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho kết quả âm tính (ngoại trừ dòng 7, 8). Đối chiếu bảng kết quả 4.3 với bảng phụ lục 6, chúng tôi nhận thấy trong 8 dòng vi khuẩn phân lập được chỉ có dòng 2 có thể là vi khuẩn Lxx. Để giải thích kết quả trong bảng 4.3, có 2 giả thiết được đặt ra. Một là trong dịch chiết đem nuôi cấy không có sự hiện diện của vi khuẩn Lxx, điều này có nghĩa là phương pháp nhuộm STM cho kết quả dương tính giả trong quá trình phát hiện bệnh. Nói cách khác, phương pháp STM là phương pháp không hiệu quả trong chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Hai là có sự tạp nhiễm xảy ra trong quá trình nuôi cấy hoặc ủ vi khuẩn. Giả thiết thứ nhất được loại bỏ do phương pháp nhuộm STM là một phương pháp thông dụng đã được thừa nhận bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới (Hà Đình Tuấn, 2004). Theo Giglioti và ctv. (1999), phương pháp nhuộm STM là phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc, dựa vào tỉ lệ bó mạch tắc và bó mạch thông trong thân mía người ta có thể xác định, đánh giá mức độ nhiễm bệnh của cây trên cánh đồng. Từ kết quả khảo sát ở thí nghiệm 1, chúng tôi đã tiến hành thu nhận dịch chiết từ lóng 1 (lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất) của cây mía ở trong bụi có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất. Cây mía được chọn thuộc giống VN85-1427, đây là giống có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất trong 5 giống mía sản xuất được trồng tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương (C90-127, VN84- 4137, DLM24, R570, VN85-1427). Kết quả khảo sát của Nguyễn Anh Khoa (2006) về tình hình nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khác nhau tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương cho thấy vào thời điểm khảo sát, giống mía VN85-1427 đã bị nhiễm Lxx ở mức trung bình. Từ đó, có thể khẳng định rằng vi khuẩn Lxx vẫn tồn tại và ngày càng phát triển trên giống mía này vì cho đến nay, vẫn chưa có biện pháp xử lý và kiểm soát dịch bệnh cằn mía gốc nào được thực hiện tại Trung tâm. 57 Như vậy, trong 8 dòng vi khuẩn phân lập được chỉ có dòng 2 có thể là vi khuẩn Lxx, 7 dòng vi khuẩn còn lại là các dòng tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra trong quá trình nuôi cấy do vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian ủ từ 28 – 42 ngày. Môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian quá dài nên sự tạp nhiễm là vấn đề rất khó tránh khỏi. Bên cạnh đó, sự tạp nhiễm cũng có thể xảy ra trong quá trình thu nhận dịch chiết do ở thân mía có chứa hàm lượng đường cao, đây là điều kiện thuận lợi cho các loại vi khuẩn và nấm phát triển. Đối tượng nuôi cấy là một loại vi khuẩn kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch nên việc khử trùng thân mía rất khó khăn, trong thí nghiệm này, chúng tôi chỉ sử dụng cồn 70 vì nếu sử dụng các chất có tác dụng khử trùng bề mặt mạnh thì sự sống của vi khuẩn Lxx trong thân mía sẽ không đảm bảo. Theo bảng 4.3, cả 7 dòng vi khuẩn tạp nhiễm đều là vi khuẩn Gram dương. Do nalidixic acid chỉ có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn Gram âm nên sự xuất hiện của các loại vi khuẩn Gram dương khác trên môi trường nuôi cấy là điều không thể tránh khỏi. Ngoài ra, Brumbley và ctv. (2006) đã chứng minh rằng vi khuẩn Lxx có khả năng kháng lại nalidixic acid nhưng lại nhạy cảm cao đối với kháng sinh (ampicilin, tetracycline, kanamycin); do đó, không thể bổ sung các loại chất kháng sinh này vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lxx. Sự tạp nhiễm nấm và các loại vi khuẩn có kích thước lớn đã được hạn chế bằng cách lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 m. Tuy nhiên, phương pháp này không thể loại bỏ được các loại vi khuẩn có kích thước nhỏ khác cùng tồn tại trong dịch chiết, điều này lý giải tại sao 7 dòng vi khuẩn tạp nhiễm đều có kích thước và mô tả khuẩn lạc tương tự như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Trong quá trình ủ, các loại vi khuẩn tạp nhiễm này sẽ phát triển rất nhanh trên môi trường giàu dinh dưỡng, qua đó, ức chế sự phát triển của vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli. 58 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với sản lượng mía nói riêng và ngành công nghiệp mía đường nói chung. Ở Việt Nam, bệnh cằn mía gốc đã được phát hiện từ lâu, tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh nguy hiểm này. Qua quá trình tiến hành các thí nghiệm, chúng tôi đã rút ra được một số kết luận sau: Kết quả khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng của cây mía bị bệnh cho thấy mật độ vi khuẩn tập trung cao nhất ở lóng thứ nhất (lóng gần gốc nhất), mật độ này có xu hướng giảm dần theo chiều cao cây. Ngoài ra, sự phân bố của vi khuẩn trong cùng một lóng tập trung chủ yếu ở phần lõi bên trong. Thời gian cần thiết để vi khuẩn Lxx gây tắc mạch là khoảng 30 ngày sau khi cây bị nhiễm bệnh. Trước khoảng thời gian này, không thể phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn ở trong bó mạch. Trong quá trình tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tôi nhận thấy đây là một loại vi khuẩn kí sinh chuyên tính rất khó nuôi cấy, đòi hỏi môi trường dinh dưỡng phức tạp và thời gian nuôi cấy rất dài. Sau 28 – 42 ngày nuôi cấy, chúng tôi đã phân lập được 8 dòng khuẩn lạc có đặc điểm giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx (đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố). Kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy trong 8 dòng khuẩn lạc được phân lập thì chỉ có dòng 2 có khả năng là vi khuẩn Lxx. 5.2. Đề nghị Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ tiến hành được đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi. Chính điều này làm cho việc quản lý bệnh trở nên rất khó 59 khăn. Do đó, cần nghiên cứu và phát triển một quy trình chẩn đoán bệnh ngay từ khi cây còn nhỏ để có biện pháp xử lý kịp thời. Kết quả đạt được trong các thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm loại bớt những trường hợp không phải là vi khuẩn Lxx trong 8 dòng được phân lập chứ không thể xác định chính xác dòng nào là vi khuẩn Lxx. Do đó, cần phải tiến hành các thí nghiệm sinh học phân tử để xác định lại xem dòng 2 (dựa trên kết quả phản ứng sinh hóa) có phải là vi khuẩn Lxx hay không. Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là loại vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. Vì vậy, cần phải thiết lập một quy trình nuôi cấy vô trùng hiệu quả nhằm hạn chế tối đa sự tạp nhiễm trên môi trường nuôi cấy. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 1. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh lý thực vật đại cương. Phần I: Dinh dưỡng. Nhà xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Trang 34, 67 – 75. 2. Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996. Chương 8: Cây mía. Giáo trình cây công nghiệp (Đoàn Thị Thanh Nhàn). Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. Trang 151 – 165. 3. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần bệnh hại mía trên một số giống mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu miền Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 4. Nguyễn Anh Khoa, 2006. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật ELISA và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kĩ thuật PCR. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Huy Ước, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Trang 78 – 79. 6. Nguyễn Huy Ước, 1999. Cây mía và kĩ thuật trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Trang 11 – 16. 7. Trần Linh Thước, 2003. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 74 – 77, 216. 8. Trần Thùy, 1996. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Trang 4 – 8. 9. Trần Văn Sỏi, 2001. Kỹ thuật trồng mía ở vùng đồi núi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 3. 10. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. Trang 7. 61 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 11. Bailey R. A. and Bechet G. R., 1995. Further evidence of the effects ratoon stunting disease on production under irrigated and rainfed conditions. Proc. S. Afr. Sugar Technol. Assoc. 69: 74 – 78. 12. Bailey R. A., Tough S. A., 1992. Ratoon Stunting Disease: survival of Clavibacter xyli subsp. xyli, in field soil and its spread to newly planted sugarcane. Proceedings South African Sugar Techonogists Association Annual Congress 66: 75 – 77. 13. Brumbley S. M., Petrasovits L. A., Hermann S. R., Young A. J. and Croft B. J., 2006. Recent advances in the molecular biology of Leifsonia xyli subsp. xyli, causal organism of ratoon stunting disease. Australian Plant Pathology 35: 681 – 689. 14. Brumbley Stevens M., Petrasovits Lars A., Birch Robert G., and Taylor Paul W. J., 2002. Transformation and transposon mutagenesis of Leifsonia xyli subsp. xyli, causal organism of ratoon stunting disease of sugarcane. Molecular Plant- Microbe Interactions 3: 262 – 268. 15. Comstock J. C. and Lentini R. S., 2005. Sugarcane Ratoon Disease. Florida Sugarcane Handbook, an electronic publication of the Agronomy Department. 16. Comstock J. C., Shine J. M., Davis M. J., and Dean J. L., 1996. Relationship between resistance to Clavibacter xyli subsp. xyli colonization in sugarcane and spread of ratoon stunting disease in the field. Plant Disease 80: 704 – 708. 17. Damann K. E., 1992. Effect of sugarcane cultivar susceptibility on spread of ratoon stunting disease by the menichal harvester. Plant Disease 76: 1148 – 1149. 18. Davis M. J. and Bailey R. A., 2000. Ratoon stunting. A Guide to Sugarcane Diseases (Eds Rott P., Bailey R. A., Comstock J. C., Croft B. J. and Saumtally A. S.). Montpellier, France. p 49 – 54. 19. Davis M. J., Dean J. L., 1984. Comparison of diagnostic techniques for determining incidence of ratoon stunting disease of sugarcane in Florida. Plant Disease 68: 896 – 899. 62 20. Davis M. J., Gilaspie A. G., Harris R. W., and Lowson R. H., 1980. Ratoon Stunting Disease of sugarcane: Isolation of the causal bacterium. Science 210: 1365 – 1367. 21. Evtushenco Lyudmila I., Dorofeeva Lubov V., Subbotin Sergey A., Cole James R. and Tiedje M., 2000. Leifsonia poae gen. nov., sp. nov., isolated from nematode galls on Poa annua, and reclassification of “Corynebacterium aquaticum” Leifson 1962 as Leifsonia aquatica (ex Leifson 1962) gen. nov., nom. Rev., comb. Nov and Clavibacter xyli Davis et al, 1984 with two subspecies as Leifsonia xyli (Davis et al, 1984) gen. nov., comb. nov. International Journal of systematic and Evolutionary microbiology 50: 371 – 380. 22. Frison E. A. and Putter C. A. J., 2003. FAO/IBPGR Technical guidelines for the safe movement of sugarcane germplasm. The International society of sugar cane technologists, 15 – 41. 23. Grisham M. P., Pan Y. B., and Richard E. P., 2007. Early detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in sugarcane leaves by Real – Time Polymerase Chain Reaction. Plant disease 91: 430 – 434. 24. Giglioti E. A., Comstock J. C., Davis M. J., Matsuoka S. and Tokeshi H., 1999. Combining tissue blot enzyme immunoassay and staining by transpiration methods to evaluate colonization of sugarcane stalks by Clavibacter xyli subsp. xyli and its effects on the xylem functionality. Summa Phytopathologica 25: 125 – 132. 25. Gillaspie A. G., Teakle D. S., 1989. Ratoon Stunting Disease. Diseases of sugarcane: major diseases. (Eds Ricaud C., Egan B. T., Gillaspie A. G., Hughes C. G.). Elsevier Science Publishing, Inc., New York. p 59 – 80. 26. Harris R. W., Gillaspie A. G., 1978. Immunofluorescent diagnosis of ratoon stunting disease. Plant Disease Report 62: 93 – 196. 27. Hoy J. W., Grisham M. P., Damann K. E., 1999. Spread and increase of ratoon stunting disease of sugarcane and Comparision of disease detection methods. Plant Disease 12: 1170 – 1175. 28. Kao J. and Damann K. E., 1978. Microcolonies of the bacterium associated with ratoon stunting disease found in sugarcane xylem matrix. Phytopathology 68: 545 – 551. 63 29. Kao J. and Damann K. E., 1980. In situ localization and morphology of the bacterium associated with ratoon stunting disease of sugarcane. Can. J. Bot. 58: 310 – 315. 30. Malcolm C. Shurtleff and Charles W. Averre III, 1997. The plant disease clinic and field diagnosis of abiotic disease. APS PRESS, The American Phytopathological Society. p 216. 31. Monteiro – Vitorello Claudia B., Camargo Luis E. A., Sluys Marie A. Van, 2004. The Genome sequence of the Gram – Positive Sugarcane Pathogen Leifsonia xyli subsp. xyli. Molecular Plant – Microbes interaction 8: p 827 – 836. 32. Pan Y. B., Grisham M. P., and Burner D. M., 1998. A Polymerase Chain Reaction Protocol for the Detection of Clavibacter xyli subsp. xyli, the causal bacterium of Sugarcane Ratoon Stunting Disease. Plant Disease 82: p 285 – 290. 33. Ricaud C., Egan B.T., Gillaspie A. G. and Hughes C.G., 1989. Disease of sugarcane: Major diseases. International Society of Sugarcane Technologist. 34. Schaad N. W., 1994. Laboratory guide for identifycation of plant pathogenic bacteria.2nd Edition. APS. PRESS, The American Phytopathological Society. 35. Taylor P. W. J., Petrasovits L. A., Velde R. Vander, Birch R. G., Croft B. J., Fegan M., Smith G. R. and Brumbley S. M., 2003. Development of PCR- based markers for detection of Leifsonia xyli subsp. xyli in fibrovascular fluid of infected sugarcane plants. Australasian Plant Pathology 32: 367 – 375. 36. Teakle D. S., Appleton J. M., Steindl D. R., 1978. An anatomical basis for resistance of sugarcane to ratoon stunting disease. Physiol. Plant Pathol 12: 83 – 91. 37. Westphal Andreas and Mirkov T. Erik, 2003. Need for improved detection of Ratoon Stunting Disease in sugarcane in South Texas. Subtropical Plant Science 55: 68 – 71. 38. Young A. J., Brumbley S. M., 2004. Ratoon stungting disease: history, management and current research. Sugarcane pathology. Vol III: Bacterial and nematode diseases. (Eds Rao G. P., Saumtally A. S., Rott P.). Science Publishers, Inc.: Enfield, NH. p 97 – 124. 64 39. Young A. J., Petrasovits L. A., Croft B. J., Gillings M. and Brumbley S. M., 2006. Genetic uniformity of international isolates of Leifsonia xyli subsp. xily, causal agent of ratoon stunting disease of sugarcane. Australasian Plant Pathology 35: 503 – 511. Tài liệu Internet 40. 41. 42. 65 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Môi trường SC Cho 1 lít môi trường Thành phần hấp Thành phần lọc Cornmeal = 15 g Agar = 15 g Soytone = 8 g K2HPO4 = 1 g KH2PO4 = 1 g MgSO4.7H2O = 0,2 g Bovine hemine chloride = 15 mg H2O = 800 ml Bovine serum albumine = 2 g Glucose = 0,5 g Cystein = 0,5 g H2O = 200 ml Hòa tan các thành phần hấp trong nước và điều chỉnh pH môi trường về giá trị pH = 6,6 với NaOH 1N hoặc HCl 1N. Hòa tan các thành phần lọc trong nước cất vô trùng. Hấp tiệt trùng môi trường, để nguội đến khoảng 55 C; sau đó, cho các thành phần lọc và nalidixic acid 10 g/ml vào qua màng lọc vô trùng (Davis và ctv., 1980). Phụ lục 2: Môi trường MSC Cho 1 lít môi trường Thành phần hấp Thành phần lọc Corn meal agar = 17 g Bacto – agar = 4 g Bacto – peptone = 8 g Bovine hemine chloride = 30 ml (Dung dịch 0,1% trong NaOH 0,05N) MgSO4. 7H2O = 0,2 g K2HPO4 (0,1 M) = 13 ml KH2PO4 (0,1 M) = 87 ml H2O = 800 ml Glucose = 2 g Cystein = 0,5 g Bovine serum albumine = 2 g H2O = 100 ml Hòa tan các thành phần hấp trong nước và điều chỉnh pH môi trường về giá trị pH = 7,5 với NaOH 5N. Các bước tiếp theo được tiến hành tương tự như cách chuẩn bị môi trường SC (Brumbley và ctv, 2006). 66 Phụ lục 3: Môi trường lỏng S8 Cho 1 lít môi trường Thành phần hấp Thành phần lọc Bacto – Soytone = 8 g Hemin chloride = 15 ml (Dung dịch 0,1% trong NaOH 0,05 N) MgSO4. 7H2O = 0,2 g K2HPO4 = 0,35 g KH2PO4 = 1,1 g H2O = 885 ml Glucose = 2 g Cystein = 0,5 g Bovine serum albumine = 2 g H2O = 100 ml Hòa tan các thành phần hấp trong nước và điều chỉnh pH môi trường về giá trị pH = 6,6 với NaOH 5N. Hòa tan các thành phần lọc trong nước; sau đó cho vào môi trường hấp đã nguội bằng một màng lọc vô trùng (Brumbley và ctv., 2006). Phụ lục 4: Môi trường Phenol Red Carbohyrate Broth (Trần Linh Thước, 2003) Cho 1 lít môi trường Trypticase hoặc proteone peptone No. 3 NaCl Beef extract Phenol red Nước cất Carbohydrate 10 g 5 g 1 g 0,018 g 1 lít : tùy nguồn carbon cần kiểm định ( manitol, sorbitol,...), thường được sử dụng ở nồng độ 1% Phụ lục 5: Môi trường Starch Cho 1 lít môi trường Peptone Beef extract Starch Agar 5 g 3 g 2 g 15 g (Trích dẫn bởi Schaad, 1994) 67 Phụ lục 6: Bảng sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx Thử nghiệm Kết quả Oxydase Catalase + Sản xuất H2S từ peptone Thử nghiệm V – P Thử nghiệm Methyl red Khả năng sử dụng: Citrate Gluconate Propionate Acetate Lactate Succinate Khả năng phân giải: Tinh bột Casein Gelatin Tạo acid từ Inulin Manitol Mannose Melezitose Sorbitol + +W (Phản ứng yếu) (Trích dẫn bởi Evtushenko và ctv., 2000; Schaad, 1994) 68