Khóa luận Nghiên cứu về chủng Streptomyces 40.16

liều lượng chiếu cao hơn. -ánh sáng thường: Sau khi đột biến bằng tia tử ngoại, nếu đem chiếu ánh sáng thường (bước sóng =320-480nm) trở lại thì sẽ có khoảng 50-80% tế bào được phục hồi do tác dụng của men photolyase. Hiện tượng này gọi là quang phục hoạt. Ngoài ra, các yếu tố nhiệt độ, pH, môi trường nuôi cấy, trạng thái sinh lí của vi sinh vật cũng ảnh hưởng đến hiệu quả đột biến của ánh sáng UV. 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn. Các giống vi sinh vật rất rễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất. Vì vậy việc bảo quản giữ giống vi sinh vật là rất quan trọng không chỉ ở các trung tâm giữ giống quốc gia mà ngay cả ở phòng thí nghiệm cũng rất cần thiết. Nhiệm vụ của công tác giữ giống vi sinh vật là thực hiện các thao tác kĩ thuật cần thiết để giữ cho giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền ổn định và không bị tạp nhiễm bởi các VSV khác. Có rất nhiều phương pháp giữ giống VSV khác nhau. Tùy vào loại VSV để chúng ta chọn phương pháp giữ giống cho phù hợp. Đối với giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 20C. 1.4. Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy [5] Trong quá trình sống, tế bào VSV luôn luôn phải trao đổi chất với môi trường xung quanh. Tế bào VSV tuy rất nhỏ nhưng vì hấp thu các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm chất qua toàn bộ bề mặt, cho nên cường độ trao đổi chất của chúng là rất lớn. Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào và được chuyển hóa thành những chất riêng biệt cho việc xây dựng tế bào. Nhờ quá trình đồng hóa và dị hóa các tế bào mới có thể phát triển, sinh trưởng, đồng thời tạo ra các sản phẩm trao đổi chất. Những VSV dùng trong công nghiệp vi sinh kháng sinh đều là các VSV dị dưỡng. Để phát triển VSV cần một lượng đầy đủ các nguyên tố C, H, O, N, P và một trong những nguyên tố vi lượng là Mn, Mo, Zn, Cu Môi trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và tạo thành sản phẩm của VSV. Thông thường các môi trường nuôi cấy sử dụng nước máy thì không cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng vì các chất này đã có đủ trong các cơ chất dinh dưỡng ở dạng tạp chất. Trong quá trình lên men người ta có thể thêm một số nguyên tố vi lượng đặc biệt hoặc tiền chất là chất đặc hiệu cho sản phẩm tạo thành như tiền chất axít phenoxyacetic trong quá trình lên men sản xuất penicillin V. ở đây cũng cần lưu ý, một môi trường nuôi cấy thuận lợi cho sự phát triển của một VSV không nhất thiết sẽ là môi trường đảm bảo cho sản xuất sản phẩm trao đổi chất tốt nhất. Môi trường lên men tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn và chi phí thấp với chủng VSV cho trước. Thành phần môi trường và chế độ tối ưu hóa được xác định theo hai cách: tối ưu hóa kinh điển và sử dụng phương pháp toán học quy hoạch thực nghiệm. 1.5. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [2][5][8] 1.5.1. Bản chất của quá trình lên men Lên men thực chất là phản ứng ôxi hóa khử sinh học xảy ra nhờ xúc tác của các enzim do VSV tự tổng hợp với mục đích cung cấp năng lượng và tạo ra các sản phẩm trao đổi chất trong dịch lên men. 1.5.2. Giống vi sinh vật Trong lên men công nghiệp, kỹ thuật chỉ là công cụ tác động và điều khiển lên quá trình sinh học còn giống vẫn là khâu quan trọng, quyết định giá trị kinh tế của quá trình sản xuất. Giống VSV dùng trong quá trình lên men phải là các tế bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hóa vật chất cao nhất. Do đó trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống. Giống VSV được tạo ra qua các cấp nhân giống kế tiếp nhau, trên máy lắc tròn hoặc bình nón, rồi đến bình giống. 1.5.3. Các phương pháp lên men * Phương pháp lên men bề mặt: Lên men bề mặt là quá trình nuôi cấy VSV trên bề mặt môi trường rắn, đặc hay lỏng. VSV hấp thụ các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng ôxi không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì vậy yêu cầu của công nghệ lên men bề mặt là bề mặt môi trường phải đủ rộng, lớp môi trường không quá sâu (5-10cm), đồng thời phải giữ độ ẩm môi trường khoảng 60% (có trường hợp 90- 100%) để tránh khô bề mặt môi trường. Lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu thấp. Nhưng có nhược điểm là đòi hỏi mặt bằng lớn, hiệu xuất sử dụng thường thấp, khó cơ giới hóa và tự động hóa. Chính vì lý do đó mà ngày nay, công nghiệp kháng sinh không áp dụng lên men bề mặt trong sản xuất mà chỉ áp dụng trong các phòng thí nghiệm để chọn giống. * Phương pháp lên men chìm: Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong không gian 3 chiều của môi trường lỏng Trước khi lên men phải có giai đoạn tạo giống Giống cấp 1: Nuôi cấy trong bình nón trên máy lắc (100ml/500ml), Giống cấp 2: Nuôi cấy trong bình giống 80l, Giống cấp 3: Nuôi cấy trong bình 1-5m3. Tỷ lệ giống trong môi trường là 1-10%. Tỷ lệ giống phụ thuộc vào quy mô của bình lên men. Quá trình lên men có thể làm thay đổi các điều kiện ban đầu của môi trường: thay đổi pH, nồng độ các thành phần trong môi trường, các sản phẩm trao đổi chất, tạo bọt trên bề mặt môi trường. Để đảm bảo những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của VSV trong quá trình lên men người ta đã đưa ra một số biện pháp như: cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật, chất điều chỉnh pH hay dùng hệ đệm để ổn định pH). Cũng có thể lấy mẫu dịch lên men phân tích để đánh giá các tham số và có sự điều chỉnh (nếu cần) quá trình lên men . - ưu điểm của phương pháp lên men chìm là: + Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý của VSV, + Hệ số sử dụng không gian cao (3 chiều), hiệu suất lên men cao, + Các thiết bị dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tiết kiệm mặt bằng và tốn ít nhân công. - Nhược điểm: Đòi hỏi phải có trang thiết bị chuyên dùng (thiết bị chịu áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối) do đó chi phí đầu tư lớn. Lên men chìm chia thành 4 kiểu chính: - Lên men gián đoạn (lên men mẻ): Quá trình lên men gián đoạn được xem như một hệ thống kín. Trong suốt thời gian lên men không tác động hay bổ sung gì thêm vào môi trường lên men, trừ việc cung cấp ôxi (dưới dạng không khí nén), chất phá bọt (nếu cần), điều chỉnh pH. Trong quá trình lên men VSV phát triển qua 4 giai đoạn: Pha tiềm tàng, pha log (lũy thừa), pha dừng, pha suy tàn ( hình 3). lnx Pha dừng Pha log Pha suy tàn Pha tiềm tàng t(h) Hình 3: Đường cong biểu diễn các giai đoạn phát triển của VSV trong MT lỏng.Với: x: sinh khối khô VSV trong dịch lên men t: thời gian lên men. Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kì sinh trưởng của VSV hoặc khi việc sinh tổng hợp hoạt chất đã bị chậm lại, nếu tiếp tục lên men sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế. - Lên men có bổ sung: Lên men có bổ sung là biến tướng phát triển của lên men mẻ đống kín. Trong khi lên men, do nồng độ cao của một số chất (glucoza, các hợp chất nitơ) ức chế việc tạo ra sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Bởi vậy khi bắt đầu lên men các thành phần đó được đưa vào với một nồng độ thấp và được bổ sung vào hệ thống trong quá trình lên men. - Lên men liên tục: quá trình lên men môi trường dinh dưỡng được bổ sung liên tục vào bình lên men, đồng thời lúc đó lấy ra đồng thể tích dịch lên men. Quá trình này xem như một hệ mở. Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men việc bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng và rút bớt dịch lên men không xảy ra liên tục mà định kỳ sau những khoảng thời gian xác định. 1.6. Tách chiết và tinh chế [4][7] Trong hầu hết các trường hợp thì sản phẩm đích (kháng sinh) chỉ là một lượng rất nhỏ trong tổng số dịch lên men (0,2-30g/l). Kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, do đó kết thúc quá trình lên men kháng sinh có thể nằm trong sinh khối (ví dụ: gramicidin, nystatin) hoặc trong dịch lọc (ví dụ: penixilin, streptomycin) tùy thuộc vào đặc điểm của loài. Vì vậy phải chiết tách để lấy kháng sinh. Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào bản chất của kháng sinh. Một số phương pháp tách chiết hay được sử dụng: Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ, Phương pháp kết tủa, Phương pháp dùng nhựa trao đổi ion. Dù lựa chọn phương pháp nào thì mục đích cuối cùng vẫn là thu được một sản phẩm kháng sinh có độ tinh khiết cao. Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường áp dụng một số phương pháp chiết tách và tinh chế như: lọc, chiết, hấp thụ và sắc ký. 1.6.1. Chiết xuất * Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. * Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau. * Các phương pháp chiết lỏng – lỏng: - Chiết đơn (chiết 1 lần): Thường cho hiệu suất thấp nhưng đơn giản, tốn ít thời gian. - Chiết lặp (chiết nhiều lần): Hiệu suất chiết cao tuy nhiên tốn thời gian và công sức. - Chiết ngược dòng cho kết quả tốt hơn. 1.6.2. Tách sản phẩm * Định nghĩa: Là một nhóm các phương pháp hóa học, vật lý và hóa lý nhằm đi từ một hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đơn giản và từ hỗn hợp đơn giản tách riêng từng chất. * Các phương pháp tách hỗn hợp đồng nhất hay được dùng: - Phương pháp chia cắt pha: Là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất (một pha) tách thành hỗn hợp không đồng nhất (hai pha). - Phương pháp chuyển pha: Trong nhóm này có các phương pháp như là: chiết, thẩm thấu, các phương pháp sắc ký. * Sắc ký: Là một nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thành phần của hỗn hợp. Sự tách sắc kí được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động. Các phương pháp sắc ký: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Nguyên tắc: Là phương pháp tách các chất dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của chúng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ), ở đây pha tĩnh là chất rắn, pha động là dung môi. Chọn dung môi và chất hấp phụ tùy thuộc vào chất cần xác định, nếu chất cần xác định không phân cực thì chọn chất hấp phụ có hoạt tính cao (hấp phụ mạnh) và dung môi là không hay ít phân cực. Chất phân cực ta chọn ngược lại. - Sắc ký trao đổi ion: Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng trao đổi thuận nghịch giữa các ion trong dung dịch chất nghiên cứu với các ion trong một chất gọi chung là nhựa ionit. Nhựa có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, nhựa có khả năng trao đổi anion gọi là anionit. Quá trình trao đổi tuân theo định luật tác dụng khối lượng. - Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Nguyên tắc: Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha. Pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang có cỡ hạt nhỏ 10 mm) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. * Cô đặc: Sản phẩm trao đổi chất ở nồng độ thấp cần phải cô lại trong chân không trước khi kết tinh. * Kết tinh: Kết tinh ở nhiệt độ thấp trên cơ sở độ tan của các chất thường giảm theo nhiệt độ. * Sấy khô: Có nhiều phương pháp sấy trên cơ sở dùng nhiệt độ cao, độ thoáng khí hoặc hút. * Nghiền vỡ tế bào VSV: Trường hợp kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất nội bào, để thu được kháng sinh cần phá vỡ tế bào VSV, có thể dùng phương pháp vật lý, hóa học hoặc sinh học. 1.7. Một số nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh [12][13][16][17]. 1.7.1. Kháng sinh Boromycin chống HIV từ xạ khuẩn Boromycin là kháng sinh thuộc nhóm polyête-macrolit được STH từ Streptomyces sp. A-3376, là kháng sinh chống HIV. Boromycin có khả năng ngăn chặn sự phát triển HIV ở giai đoạn cuối và có thể ngăn cản quá trình sao chép của phân tử HIV trong tiến trình trưởng thành. Trong lên men Streptomyces sp. A-3376 tạo ra một chất ký hiệu là TMC-25, sau khi nghiên cứu đã chứng minh được TMC-25 có cấu trúc giống hệt của boromycin, kháng sinh có chứa một nguyên tử Bo. Lên men STH TMC-25 được tiến hành trên máy lắc ở 270C trong 5 ngày. Dịch lên men thu được lọc loại bỏ sinh khối sau đó chiết bằng n-butanol, dịch chiết được tinh chế bởi phân đoạn dung môi cho ta kháng sinh ở dạng tủa thô, tiếp tục tinh chế nhờ sắc ký cột đảo pha trên silicagel ODS và Sephadex LH-20. Sau đó sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để thu được TMC-25 dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Cứ 24,5 lít dịch lên men đã loại bỏ sinh khối sau quá trình chiết xuất và tinh chế sẽ thu được 24,5mg TMC-25. 1.7.2. Tinh chế và đặc trưng của serine proteinaza thuỷ phân Keratin từ Streptomyces albidoflavus. Streptomyces albidoflavus là một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzym serine proteinaza có tác dụng thuỷ phân keratin. Streptomyces albidoflavus khi nuôi cấy ở môi trường chứa thịt- da có thể sinh ít nhất 6 loại proteinaza ngoại bào. Dịch lên men chủng Streptomyces albidoflavus được ly tâm, lọc sơ bộ để loại bỏ sinh khối, sau đó được lọc qua màng lọc có kích thước 0,45mm( Milipore Corp., Bedford, Mass), rồi được cô đặc 10 lần bằng máy cất đặc chủng. Khi so sánh độ nhạy để ức chế enzym, các đặc trưng cơ chất với Streptomyces griseus proteinaza B (SGPB) đã cho thấy đây là một enzym mới được đặt tên là SAKaza, khá tương đồng với SGPB. 1.7.3. Sản xuất 8-Demethylgeldanamycin và 4,5-Epoxy-8- demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus Geldanamycin thuộc họ kháng sinh benzoquinon gần đây đã được sự thu hút bởi những đặc tính dược lý học của nó như: ức chế tạo thành tiểu cầu, ức chế enzym sao mã ngược, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng ung thư với nồng độ ức chế tối thiểu (IC50) là 13nM khi tiến hành test với dòng tế bào NCI. Đặc tính kháng ung thư của geldanamycin do ức chế mạnh ATP, làm bất hoạt sinh tổng hợp protein của tế bào gây ung thư. Các nghiên cứu cũng cho thấy sử dụng geldanamycin để điều trị ung thư sẽ tăng tính hiệu quả của phương pháp điều trị đồng thời, ví dụ: xạ trị. Hiện nay, gendanamycin đang ở trong giai đoạn 2 giám sát lâm sàng. Gendanamycin được sinh tổng hợp bởi Streptomyces hygroscopicus var.geldanus, trong quá trình sinh tổng hợp còn tạo ra 4,5-Epoxy-8-demethyl geldanamycin, được tinh chế từ dịch lên men bằng sắc ký cột và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Streptomyces hygroscopicus var.geldanus được lên men trên môi trường YPD, pH được điều chỉnh ở 6,5 bằng H2SO4 2,5N hoặc NaOH 2,5N, cấp khí bằng hỗn hợp khí chứa oxy hoà tan là 30%. Tinh chế hai thành phần trên bằng phơng pháp sắc ký cột HP20, dịch rửa giải là MeOH. Gendanamycin và 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin là những kháng sinh có khả năng ứng dụng cao đối với mô hình bệnh tật hiện nay được sinh tổng hợp từ Streptomyces sp. 1.7.4. Nghiên cứu hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase từ Streptomyces sp. Nhóm các hoạt chất có tác dụng ức chế enzym Lipoxygenase gồm tetrapetalone B (2, C28H35NO9), C (3, C26H34NO8), D(4, C28H36NO10) từ Streptomyces sp. USF – 4227, một chủng đồng thời cũng sinh tổng hợp tetrapetalone A. HLO (Human Lipoxygenase) và COX (cyclooxygenase) là những enzym xúc tác đầu tiên tương ứng tạo acid arachidonic, là sản phẩm sinh ra một loạt các chất gây bệnh cho người như leukotrien, lipoxin, prostaglandin. Nghiên cứu được tiến hành trên Lipoxygenase của đậu nành (SBL: Soybean Lipoxygenase) Streptomyces sp. USF – 4727 được nuôi cấy trong môi trường thích hợp, dịch lọc sau nuôi cấy 10 ngày ở 300C được tinh chế bằng cột Diaion HP20, rửa giải bằng MeOH và Aceton được gộp lại và làm bốc hơi dưới áp suất giảm, sau đó tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, dung môi rửa giả là n-hexan (1), n-hexan: ethylacetate =3:7 (2), n-hexan: acetone = 3:7 (3), và acetone (4). Tetrapetalone B được tìm thấy ở phân đoạn dung môi (1) và (2) , sau đó sắc khí trao đổi ion bằng cột Sephadex LH – 20, dung môi rửa giả là MeOH, tinh chế phân đoạn dung môi (1) thu được 10mg bột từ 7,2l môi trường Tetrapetalone A có IC50 là 190 (M) Phần 2 Nguyên liệu và phương pháp 2.1.Nguyên liệu 2.1.1.Giống vi sinh vật *Chủng xạ khuẩn: Giống xạ khuẩn Streptomyces 40.16 phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng, đặc tính di truyền ổn định, do phòng thí nghiệm Vi sinh Kháng sinh bộ môn Vi sinh và Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. *Chủng vi sinh vật kiểm định: Giống VSV kiểm định do Bộ môn Vi sinh và sinh học trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp: -Vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922 (E.coli) Proteus mirabilis BV 108 (P.mirabilis) Shigella flexneri DT 112 (S. flexneri) Salmonella typhi DT220 (S.typhi) Pseudomonas aeruginosa VM 201 (P.aeruginosa) -Vi khuẩn Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC1128 (S.aureus) Bacillus pumilus subtilis ATCC 10241 (B.pumilus) Bacillus subtilis ATCC 6633 (B.subtilis) Bacillus creus ATCC 9946 (B.creus) Sarcina lutea ATCC 9341 (S.lutea) -Các loại nấm mốc: Mốc đen 1, Mốc xanh 1, Cadida, Asp.niger 2.1.2.Các môi trường nuôi cấy *Môi trường phân lập: Chủng xạ khuẩn 40.16 được phân lập trên môi trường 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nước vừa đủ 100ml. *Môi trường nuôi cấy và khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh: +Môi trường 1 (MT1): Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Thạch 1,8g; Nước vừa đủ 100ml; pH=6,8-7,2. +Môi trường 2 (MT2): Tinh bột 2g; KCl 0,05g; NaNO3 0,2g; K2HPO4 0,1g; MgSO4,7H2O 0,01g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường3 (MT3): Lactoza 3g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; NH4NO3 0,2g; MgSO4,7H2O 0,01g; Na2SO4 0,05g; Cao ngô 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 4 (MT4): Glucoza 2g; Cao ngô 0,5g; NH4NO3 0,2g; CaCO3 0,4g; K2HPO4 0,5g; MgSO4,7H2O 0,15g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 5 (MT5): Bột đậu tương 1g; Cao thịt 2g; CaCO3 0,2g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 6 (MT6): Bột ngô 2g; CaCO3 0,2g; NaCl 0,1g; CoCl2,H2O 0,002g; K2HPO4 0,05g; Bột đậu tương 1,5g; Cao nấm men 0,5g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. +Môi trường 7 (MT7): Sacaroza 3g; Bột đậu tương 1g; CaCO3 0,2g; CoCl2,H2O 0,002g; (NH4)2SO4 0,2g; NaCl 0,1g; Thạch 1,8g; pH=7,0-7,2; Nước vừa đủ 100ml. *Môi trường lên men là các môi trường trên ở dạng dung dịch (không có thạch), ví dụ MT1dd: Tinh bột khoai tây 2g; K2HPO4 0,05g; MgSO4 0,05g; KNO3 0,1g; NaCl 0,05g; Nước vừa đủ 100ml *Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định Các môi trường sử dụng nuôi cấy VSV kiểm định được giới thiệu tại bảng sau: Bảng các môi trường kiểm định Thành phần Môi trường NaCl (%) Cao thịt (%) Pepton (%) Glucoza (%) Thạch (%) pH Canh thang 0,5 0,3 0,5 - - Thạch thường 0,5 0,3 0,5 - 1,8 7,0-7,4 Sabouraud lỏng 1 2 - Sabouraud đặc 1 2 1,8 6,0-6,5 *Các môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP1 đến ISP9): Dung dịch muối vi lượng của ISP: FeSO4,7H2O 0,01g; MnCl2,4 H2O 0,1g; ZnSO4, 7H2O 0,1g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH=7,0-7,2. -ISP1: Tryptone 5,0g; cao nấm men 3,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,2 trước khử trùng. -ISP2: Cao nấm men 40g; dịch chiết Malt 10,0g; glucoza 4,0g; nước cất 1000ml; pH=7,3; Thạch 20g. -ISP3: Bột yến mạch 20,0g; thạch 18,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. IPS4: Tinh bột 10,0g; K2HPO4 1,0g; MgSO4,7H2O 1,0g; NaCl 1,0g; (NH4)2SO4 2,0g; CaCO3 2,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. ISP5: L-asparagin 1,0g; glyxerin 10,0g; K2HPO4 1,0g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4.dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. ISP6: + Dung dịch A: Pepton 20g; sắt amoni xitrat 0,5g; Na2S2O3 0,08g; K2HPO4 1,0g; nước cất vừa đủ 1000ml. +ISP6: dung dịch A 36,0g, cao nấm men 1,0g; nước cất vừa đủ 1000ml; thạch 15g; pH=7,0-7,2. ISP7: Glycerin 15,0g; L-Tyrosin 0,5g; L- asparagin 1,0g; K2HPO4 0,5g. MgSO4, 7H2O 0,5g; NaCl 0,5g; FeSO4,7H2O 0,01g; dung dịch muối vi lượng 1,0ml; thạch 20,0g; nước cất 1000ml; pH=7,0-7,4. ISP9: + Các nguồn đường đã tiệt trùng (A): 1: Glucoza 4: Arabinoza 7: D-Fructoza 2: Sacaroza 5: Inositol 8: Rhamnoza 3: D-Xyloza 6: D-mannitol 9: Rafinoza + Dung dịch muối Pridham và Gottlieb (B) CuSO4,5H2O 0,69g; FeSO4,7 H2O 0,15g, nước cất 1000ml. + Môi trường thạch – muối khoáng (MTC): (NH4)2SO4 0,69g; K2HPO4 2,38g; MgSO4, 7H2O 1,0g; dung dịch B 1,00ml; thạch 15,0g; nước cất 1000ml; pH=6,8-7,0 + D*ISP9: MTC sau khi đã tiệt trùng để nguội tới 600C thì cho một trong các nguồn đường A vào từng MTC riêng rẽ sao cho nồng độ đường trong môi trường là 1%. 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất Dung môi Khối lượng riêng Nhiệt độ sôi Metanol 0,791 – 0,793 64,50C Etanol 0,789 – 0,791 78,30C Dimetylfocmamit 0,95 1530C Diclometan 1,32 400C Clorofoc 1,470 – 1,480 60 – 620C Butylaxetat 0,880 – 0,885 117 – 1180C n-Butanol 0,81 116 – 1180C Axeton 0,79 560C + Bản mỏng sắc ký : silicagel 60F254, Merck, + Dung môi chạy sắc ký: các dung môi trong bảng dung môi đã sử dụng. + Bình chạy sắc ký. *Máy móc thiết bị: +Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (= 254nm) nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V. + Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300LF, + Tủ ấm 300C,370C, + Kính hiển vi điện tử (Viện Vệ sinh Dịch tễ TW), + Cân kỹ thuật Scaltec 54, + Tủ cấy SanyoClean Bench, + Máy đo pH Mettler Toledo MP 220, + Máy ly tâm ROTOFIX 32, + Nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL 3030. 2.2. Các phương pháp thực nghiệm 2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và giữ giống Giống Streptomyces 40.16 cấy trên môi trường thạch nghiêng MT1, ủ cho phát triển ở 300C, trong 7-10 ngày. Giống Streptomyces 40.16 sau khi phát triển được cất giữ trong tủ lạnh 2-40C, định kỳ 3-6 tháng cấy truyền. 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn. Tiến hành: + Chuẩn bị môi trường cấy vi sinh vật kiểm định: Vi sinh vật kiểm định được cấy vào môi trường canh thang ủ ở 370C trong 18-24h. Chuẩn bị nhũ dịch VSV kiểm định có nồng độ 107-108 tế bào /ml, đưa nhũ dịch này vào môi trường thạch thường vô trùng ở 450C-500C. Lắc đều đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa. + Đưa mẫu thử vào đĩa petri có chứa môi trường đã cấy VSV kiểm định. Có 3 cách đưa mẫu thử vào môi trường chứa VSV kiểm định: - Khối thạch: Đặt khối thạch D = 6,0mm có chứa VSV sinh kháng sinh lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định - Giếng thạch: Đục các giếng trên môi trường đã cấy VSV kiểm định (D = 6,0mm) sau đó nhỏ mẫu thử vào, mỗi miếng nhỏ 0,05ml. - Khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc (D = 6,0mm) đã được tẩm ba lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử, sấy khô ở t0C Ê 500C, sau đó đặt lên bề mặt môi trường đã cấy VSV kiểm định. + Nuôi cấy: Các đĩa petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở t0C = 370C, trong 18-24h. + Đánh giá kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer có độ chính xác 0,02mm. Kết quả đo được đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn, xử lý theo công thức: = s = : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (vô nấm), Di: Đường kính vòng vô khuẩn (vô nấm) thứ i, s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song (nếu không xác định khác đi, thì số thí nghiệm song song ở đây là 3). 2.2.3. Phương pháp chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên + Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 40.16 cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước cất vô trùng, lắc cho bào tử phân tán đều, thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước cất vô trùng. + Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-4 đến 10-6, nhỏ lên bề mặt thạch của MT1 trong đĩa petri. Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch. Tiến hành trên 3 đĩa petri cho mỗi nồng độ pha loãng, cho các đĩa vào tủ ấm 300C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc. + Phép chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển tốt, mọc riêng rẽ sau 6 ngày, cấy zigzac lên bề mặt MT1 trong đĩa petri cho vào ủ ở 300C trong 6 ngày rồi lấy ra thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. 2.2.4. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV + Pha hỗn dịch bào tử: Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 40.16 cho vào 10ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước). Sau đó dùng 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được đưa vào đĩa petri vô trùng. Đột biến dưới tác dụng của ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10-1 trong đĩa petri được chiếu ánh sáng UV (=254nm) với khoảng cách và thời gian thích hợp (khoảng cách 60cm, thời gian: 5 phút), sau đó lấy ra để chỗ tối 2-3h, rồi dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5. + Cấy các bào tử sau đột biến: Dùng Pepit vô trùng hút chính xác 0,1ml mẫu chứng 106 và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các nồng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa petri có chứa MT1, sau đó dùng que trang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa, các đĩa petri sau khi cấy ủ ở nhiệt độ 300C trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc. Đếm các khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức: - Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau đột biến tương tự như phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên. - Làm song song mẫu chứng. - % biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức: % biến đổi hoạt tính = Với : là đường kính trung bình vòng vô khuẩn thứ i, : là đường kính trung bình vòng vô khuẩn mẫu chứng. Sau khi tiến hành đột biến, dựa vào kết quả thu được lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. 2.2.5 Phương pháp lên men gián đoạn + Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 40.16 khi nuôi cấy trên thạch nghiêng (MT1) đủ 6 ngày tuổi được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT1dd bằng 10ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 30±0,10C với tốc độ quay 145-150 vòng/phút trong 120h. 2.2.6. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH thích hợp rồi chiết với từng dung môi chiết. + Phương pháp chiết một lần: Dịch lọc, dung môi được cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc = 1:5, lắc 1 phút, để phân lớp trong 1h. Sau đó tách riêng dung môi và dịch lọc. + Phương pháp chiết nhiều lần: Dịch lọc, dung môi được cho lần lượt vào bình gạn theo tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc = 1:15, lắc 1 phút, để phân lớp trong 1h. Sau đó tách riêng dung môi và dịch lọc. Làm tiếp 2 lần với tỷ lệ dung môi trên. Hoạt tính kháng sinh của dung môi và dịch lọc sau mỗi lần chiết được kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy lọc và phương pháp giếng thạch. 2.2.7. Phương pháp xác định kháng sinh nội bào, ngoại bào Sau khi kết thúc quá trình lên men dịch lên men đem lọc được dịch lọc và sinh khối. - Xác định kháng sinh ngoại bào: Lấy dịch lọc đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, có hoạt tính thì đó là kháng sinh ngoại bào. Chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng phương pháp chiết tách. - Xác định kháng sinh nội bào: Sinh khối được rửa 3 lần bằng nước cất, sấy khô ở 45-500C trong 24 giờ. Nghiền vỡ sinh khối trong cối sứ với dung môi thích hợp (đã xác định được trong phần chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ). Xác định hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy lọc. 2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch lên men Dịch lọc được phân vào 5 ống nghiệm (mỗi ống 7ml) sau đó điều chỉnh pH trong các ống nghiệm lần lượt là 3, 5, 7, 9, 11, bảo quản trong tủ lạnh. Sau 4 ngày, chỉnh lại pH trong các ống nghiệm về pH trung tính. Thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch. Tiếp tục xác định ảnh hưởng của pH sau 10 ngày tương tự như trên. 2.2.9. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng + Bản mỏng sắc ký có kích thước thích hợp, được hoạt hóa ở 1100C trong vòng 30 phút. Dung môi được pha theo đúng tỷ lệ cho vào bình sắc ký (chiều dày lớp dung môi không quá 1cm). Chấm dịch chiết có chứa hoạt chất cần sắc ký lên bản mỏng (bằng micropipet) cách mép dưới 1,5cm. Sấy khô bản mỏng ở 40-500C, cho bản mỏng sắc ký đã chấm dịch chiết có chứa hoạt chất vào bình chạy sắc ký, khi dung môi chạy đến 3/4 bản mỏng bỏ ra đánh dấu vết dung môi chạy (Ddm), xác định vết bằng phương pháp: - Soi đèn tử ngoại: Bản mỏng sắc ký tráng sẵn được trộn với một chất có huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại, khi soi dưới đèn tử ngoại, nếu có vết thử sẽ cho màu thẫm dưới đèn tử ngoại. - Phương pháp hiện hình vi sinh vật: Đặt bản mỏng vào đĩa petri vô trùng đổ môi trường thạch thường vô trùng đã cấy VSV kiểm định, ủ ở 370C trong 24h. Vết kháng sinh được xác định bằng sự xuất hiện vòng vô khuẩn. + Tính Rf: Rf = Dv : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết ; Ddm: Khoảng cách dung môi chạy. - Phương pháp hiện hình bằng thuốc thử hóa học: Bản mỏng đã chạy sắc ký đem sấy khô rồi nhỏ Ninhydrin 1% lên mặt bản mỏng, sau 3 phút đưa sấy rồi quan sát bằng mắt thường, đo Rf. Nếu trùng với Rf của VSV thì kết luận kháng sinh phát hiện được bằng thuốc thử hóa học. 2.2.10. Phương pháp phân loại Streptomyces 40.16 theo ISP * Chuẩn bị giống: Giống Streptomyces 40.16 được nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đủ 6-10 ngày tuổi. * Xác định đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và đánh giá khả năng tạo thành sắc tố hòa tan: Các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5 được hấp tiệt trùng ở 1180C/30 phút, dùng pipet vô trùng hút 20ml vào đĩa vô trùng, mỗi môi trường làm 4 đĩa, cấy bào tử Streptomyces lên bề mặt thạch, ủ ở 300C. Tiến hành quan sát sau 7, 14, 21 ngày. - Hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử: + Dạng chuỗi bào tử: thẳng (R), thẳng hơi cong (RF), móc câu (RA), xoắn ốc (S). + Bề mặt bào tử có thể có các dạng sau: Phẳng, nhẵn (sm); sần sùi (wa); có gai (sp); có tóc (ha). - Màu của khuẩn ty khí sinh (màu của bề mặt khuẩn lạc): Có thể có các màu đỏ (R), vàng (Y), xanh lá cây (G), xanh lơ (B), tím (V), xám (Gy), trắng (W). Trường hợp có các màu xen lẫn thì ghi các ký hiệu liền nhau. - Màu của khuẩn ty cơ chất: Quan sát màu mặt sau khuẩn lạc (mặt dưới đĩa Petri) thường có các màu vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây. Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0). - Sắc tố hào tan nằm ngay trong môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím Nếu có ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0). * Xác định sắc tố melanoid (màu đen hay nâu): Nuôi cấy xạ khuẩn trên các MT ISP6, ISP7 đã hấp tiệt trùng, quan sát ở ngày thứ 2, ngày thứ 4. Nếu có ký hiệu là (1), ngược lại ký hiệu là (0). * Khả năng tiêu thụ nguồn cacbon: Nuôi cấy bào tử trên các môi trường chứa các nguồn cacbon khác nhau (ISP9) đánh giá ở ngày thứ 12, 16. Nếu bào tử phát triển mạnh hơn khi nuôi cấy trên môi trường ISP chứa chứng dương glucose thì ký hiệu là (++), nếu xạ khuẩn có phát triển tương tự như chứng dương thì ký hiệu là (+), nếu không phát triển ký hiệu là (-), nếu phát triển không rõ ràng ký hiệu là (±). Phần 3 Kết quả và thảo luận 3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces Xạ khuẩn Streptomyces 40.16 được nuôi cấy trên môi trường ISP sau 21 ngày thì đem đi quan sát hình thái chuỗi bào tử và hình dạng bề mặt baò tử dưới kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ 10.000-40.000 lần. Dựa vào kết quả nuôi cấy trên môi trường ISP chúng tôi đã xác định được đặc trưng của Streptomyces 40.16. Màu của khuẩn ty kí sinh: xám (Gy) Hình dạng chuỗi bào tử: dạng xoắn lò xo Đem đối chiếu với các đặc điểm của chủng xạ khuẩn Streptomyces 40.16 với các loài xạ khuẩn trong khóa phân loại ISP, chúng tôi thấy đại đa số các đặc điểm này trùng với đặc điểm của Streptomyces nigellus. Kết quả được trình bày ở bảng 3, hình 4 và 5. Bảng 3:So sánh đặc điểm của Streptomyces40.16 và Streptomyces nigellus Các đặc điểm phân loại Streptomyces 40.16 Streptomyces nigellus Màu khuẩn ty khí sinh Xám (Gy) Xám (Gy) Sắc tố melanoid 0 0 Màu khuẩn ty cơ chất 0 0 Sắc tố hòa tan 0 0 Chuỗi bào tử S (spiral) S (spiral) Bề mặt bào tử Nhẵn (Sm) Nhẵn (Sm) Arabinoza + + Xyloza + + Inositol + + Manitol + + Fructoza + + Rhamnoza + + Saccaroza + + Raffinoza + + Nhận xét: Như vậy có thể kết luận Streptomyces 40.16 có tên khoa học là Streptomyces nigellus. Hình 4: Bề mặt bào tử của Streptomyces 40.16 Nhận xét: Bề mặt bào tử chụp dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 15.000 lần thấy rõ bề mặt bào tử có dạng trơn nhẵn theo khóa phân loại ký hiệu (sm) Hình 5: Hình dạng chuỗi bào tử của Streptomyces 40.16 Nhận xét: Bào tử có dạng xoắn lò xo theo khóa phân loại ISP ký hiệu là (S). 3.2. Khả năng tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 40.16 trên môi trường phân lập (MT1) Nuôi cấy chủng Streptomyces 40.16 trên MT1 ở thạch đĩa, thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. Mỗi chủng vi khuẩn làm lọc 3 số liệu. Kết quả trình bày ở bảng 4. Bảng 4: Hoạt lực kháng sinh của chủng Streptomyces 40.16 trên các vi khuẩn kiểm định VSV kiểm định B. Creus B. pumilus B. subtilis S. typhi S. aureus E. coli P. mirabilis P. aeruginosa S. lutea S. flexneri Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 20,42 21,72 20,38 18,21 17,72 18,20 18,58 0,00 17,14 17,12 Dựa vào kết quả thử hoạt tính, chúng tôi quyết định chọn chủng Streptomyces 40.16 có phổ tác dụng mạnh với cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) trừ P.aeruginosa. 3.3. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy chủng Streptomyces 40.16 Mục đích của việc chọn môi trường nuôi cấy để đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất của chủng Streptomyces 40.16 và môi trường thích hợp cho quá trình lên men. Các MT sử dụng làm thí nghiệm là 7 MT đã trình bày ở phần trước. Xạ khuẩn Streptomyces 40.16 được cấy vào 7 MT trên, sau 6 ngày thì tiến hành thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch. Kích thước vòng vô khuẩn sẽ cho thấy được MT nào là tốt nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 5 và hình 6. Bảng 5: Hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces 40.16 trên các môi trường khác nhau. VK Tham số MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 S.aureus (mm) 27,99 26,07 22,42 23,05 24,13 27,03 19,13 s 0,29 0,08 0,38 0,19 0,10 0,25 0,32 B.pumilus (mm) 20,71 19,23 18,24 15,61 16,41 18,35 14,77 s 0,19 0,17 0,26 0,46 0,35 0,35 0,22 B.subtilis (mm) 18,12 18,02 14,45 14,21 15,32 16,57 10,42 s 0,13 0,14 0,22 0,15 0,22 0,29 0,33 B.creus (mm) 18,14 18,01 16,34 15,96 15,43 17,17 10,30 s 0,11 0,28 0,43 1,30 0,25 0,19 0,20 S.lutea (mm) 19,23 18,39 14,29 13,47 13,22 17,53 11,44 s 0,24 0,28 0,30 0,42 0,35 0,16 0,38 E.coli (mm) 25,11 23,57 50,33 19,04 17,48 23,34 10,29 s 0,46 0,30 0,23 0,11 0,41 0,34 0,18 P.mirabilis (mm) 18,38 17,27 16,46 13,36 16,31 17,15 11,28 s 0,10 0,33 0,31 0,37 0,21 0,09 0,28 S.flexneri (mm) 17,87 17,55 16,18 14,24 15,22 17,26 10,15 s 0,29 0,52 0,18 0,39 0,21 0,08 0,27 S.typhi (mm) 18,43 18,07 15,85 13,76 16,20 18,37 12,39 s 0,19 0,03 0,45 0,21 0,13 0,09 0,32 P.aeruginosa (mm) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 s 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Nhận xét: Chủng Streptomyces 40.16 đều sinh tổng hợp kháng sinh trên 7 môi trường nhưng MT1 cho kết quả tốt nhất do đó chúng tôi quyết định chọn MT1 vì MT1 cũng là môi trường phân lập. Vậy những nghiên cứư tiếp theo sẽ sử dụng MT1 làm môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces 40.16 Hình6: ảnh thử hoạt tính chủng Streptomyces 40.16 trên 7 MT 3.4. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên để chọn các dạng chủng có họat tính kháng sinh mạnh nhất và thuần khiết hóa các chủng giống để phục vụ cho nghiên cứu tiếp theo. Kết quả được trình bày ở bảng 6. Bảng6: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 40.16 Ký hiệu chủng Kết quả hoạt tính kháng sinh Bacillus pumilus Proteus mirabiliss (mm) s (mm) S 1 24,07 0,80 23,69 0,85 2 24,38 0,03 24,32 1,04 3 22,48 0,52 23,18 1,56 4 24,91 0,75 25,84 0,77 5 24,04 1,84 24,39 0,79 6 21,23 1,47 18,72 1,26 7 24,64 0,48 25,69 0,66 8 21,45 0,49 25,50 0,64 9 20,93 0,79 25,29 0,26 10 18,12 0,21 25,03 1,13 11 20,74 0,43 25,24 1,22 12 19,10 0,51 18,84 0,94 13 20,74 1,28 23,15 0,48 14 20,05 1,10 24,62 0,43 15 18,24 0,22 22,43 0,49 16 19,02 1,79 23,83 0,87 17 19,67 0,49 22,58 0,26 18 19,96 1,24 18,32 0,39 19 20,68 0,15 20,55 1,40 20 21,01 0,84 21,84 1,40 21 18,73 0,64 21,93 1,62 22 21,59 0,96 22,73 1,47 23 20,84 0,54 21,59 0,14 25 22,20 0,89 24,53 0,46 26 20,33 0,58 25,29 0,81 27 21,32 0,60 24,79 0,29 28 19,91 1,09 22,14 0,20 29 20,63 0,97 24,34 0,85 30 20,92 0,93 18,91 0,44 31 21,04 0,42 18,55 1,37 32 19,17 0,88 18,27 0,38 Nhận xét: Sau khi xử lý kết quả giữ lại các biến chủng tốt nhất 1, 2, 4, 7 để làm cơ sở cho các bước cải tạo giống tiếp theo. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên chỉ có ý nghĩa ban đầu vì chủng có hoạt tính cao sau chọn lọc ngẫu nhiên vẫn chưa phải là chủng tốt nhất cho quá trình lên men. Theo kết quả thì chủng số 4 có hoạt tính tốt nhất nên các nghiên cứu tiếp theo sẽ sử dụng chủng số 4. 3.5.Kết quả đột biến cải tạo giống Để làm tăng hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 40.16 chúng tôi tiến hành đột biến bằng tia UV đối với dạng chủng số 4 có bước sóng 254nm với các tham số: + Khoảng cách chiếu: 60cm +Thời gian chiếu: 5phút Độ sống sót sau đột biến: 0,26% Kết quả được trình bày ở bảng 7 Bảng 7: Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 40.16 sau đột biến bằng ánh sáng UV Biến chủng Hoạt tính KS trên Bacillus pumilus Hoạt tính KS trên Proteus mirabiliss (mm) s % biến đổi hoạt tính (mm) s % biến đổi hoạt tính 1 27,10 0,91 107,58 23,55 1,41 113,22 2 27,15 0,58 107,78 23,07 0,85 110,91 3 27,63 1,24 109,69 21,83 0,48 104,95 4 27,14 1,66 107,74 21,58 0,42 103,75 5 27,85 1,36 110,56 22,13 0,82 106,39 6 28,69 1,86 113,89 21,89 1,17 105,24 7 24,62 0,88 97,74 20,51 0,15 94,61 8 27,52 1,11 109,25 22,01 0,43 105,82 9 26,71 1,15 106,03 22,03 0,56 105,91 10 27,97 1,35 111,04 21,85 1,44 105,05 11 28,19 1,33 119,91 22,06 0,39 106,36 12 27,78 1,49 110,28 22,11 0,77 106,29 13 25,52 0,92 101,31 22,80 1,32 109,62 14 25,79 1,27 102,38 22,64 1,29 108,85 15 25,47 0,51 101,11 22,07 1,53 106,11 16 24,88 0,52 98,77 21,82 1,69 104,90 17 25,05 1,05 94,44 22,87 1,53 109,95 18 24,78 0,39 98,37 21,74 1,32 104,52 19 24,27 1,99 96,35 20,88 0,57 100,38 20 25,71 0,65 102,06 21,45 1,11 103,13 21 23,63 1,50 93,81 21,35 1,17 102,64 22 24,11 0,66 95,71 21,45 0,84 103,13 23 23,89 0,70 94,84 20,18 0,14 97,02 24 25,34 0,94 100,59 21,21 0,77 101,97 25 23,77 0,60 94,36 20,43 0,15 98,22 26 24,02 0,66 95,36 19,13 0,78 95,82 27 25,99 0,89 103,18 19,62 0,84 94,32 28 25,38 1,38 100,75 19,22 0,22 94,40 29 24,59 1,50 97,62 19,94 0,70 95,87 30 24,68 1,28 97,98 19,47 0,71 93,61 31 27,32 1,26 108,46 21,81 0,76 104,86 32 23,43 0,98 93,01 100,44 0,10 93,47 MC 25,19 1,33 20,80 0,39 Nhận xét: Dựa vào kết quả đột biến nhận thấy các chủng sau đột biến có khả năng tổng hợp kháng sinh tương đối khác biệt so với mẫu chứng. Sau khi đột biến kết hợp với sàng lọc thu được các biến chủng dương cao nhất là 1*, 5*, 6*, 11*, 12*. 3.6. Kết quả dịch lọc thu được từ chủng Streptomyces 40.16 Các biến chủng thu được sau đột biến đem lọc thu được dịch lọc đem thử hoạt tính trên 2 vi khuẩn B.pumilus và P.mirabilis. Kết quả được trình bày ở bảng 8 và hình 7. Bảng 8: Kết quả thử hoạt tính dich lọc chủng Streptomyces 40.16 Vi khuẩn Dịch lọc Tham số Bacillus pumilus Proteus mirabilis Lần 1 (mm) 29,54 24,54 s 0,40 0,50 Lần 2 (mm) 28,37 22,35 s 1,38 0,56 Lần 3 (mm) 24,09 20,21 s 1,27 0,21 Hình 7: Kết quả thử hoạt tính dịch lọc. 3.7.Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh Từ các biến chủng được chọn sau sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến cải tạo giống tiến hành lên men trên quy mô phòng thí nghiệm với các tham số sau: Thời gian nhân giống cấp 1: 48h Thời gian lên men: 120h Tốc độ lắc: 145- 150 vòng/ phút Nhiệt độ lên men 300C, pH7,3 Sau quá trình lên men, dịch lọc lên men được lọc loại bỏ sinh khối thu dịch lọc đem thử hoạt tinh bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả giới thiệu ở bảng 9 Bảng 9: Kết quả lên men chìm các biến chủng Ký hiệu biến chủng Hoạt lực kháng sinh Bacillus pumilus Proteus mirabiliss (mm) s (mm) s 40.16 16,34 0,81 15,36 0,50 40.16.4 20,32 0,18 19,37 0,89 40.16.7 20,23 0,30 19,43 0,10 40.16.4.5 20,91 0,72 20,37 0,21 40.16.4.12 22,69 0,06 21,49 0,79 Nhận xét: Kết quả lên men chìm cho thấy các biến chủng sau đột biến sinh tổng hợp kháng sinh mạnh hơn các chủng sàng lọc ngẫu nhiên và gốc. Chứng tỏ hiệu quả đột biến làm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. 3.8. ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh Thử độ bền vững của kháng sinh trên các pH khác nhau, kết quả ở bảng 10 Bảng 10: ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trên VSV kiểm định là Proteus mirabiliss PH Hoạt lực kháng sinh Sau 4 ngày Sau 10 ngày (mm) s (mm) S 3 21,73 0,26 19,97 0,99 5 21,90 0,39 20,87 0,51 7 21,55 0,86 20,72 0,76 9 21,78 0,64 20,92 1,33 11 22,31 0,49 21,24 0,54 Nhận xét: Kháng sinh trong dịch lọc tương đối bền vững ở pH trung tính, ít bền vững ở pH acid và kiềm. Quá trình chiết tách và tinh chế nếu tiến hành nhanh có thể tiến hành ở mọi pH. Nhưng pH 7 - 9 được chọn làm pH bảo quản dung dịch kháng sinh, giữ dịch lên men để nghiên cứu tiếp. 3.9. Kết quả chiết xuất kháng sinh 3.9.1. Chiết bằng trao đổi ion Dịch lọc cho chạy qua cột trao đổi ion với nhựa cationid Amberlite IRC50 (dạng Na+), phản hấp phụ bằng dung dịch HCl0,75M, tốc độ chảy chung của các dịch qua cột là 4,5ml/phút.Thu lấy dịch ở các phân đoạn khác nhau điều chỉnh về pH7, đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch với VSV kiểm định là P.mirabilis. Kết quả không tách được kháng sinh bằng sử dụng cột trao đổi ion. 3.9.2.Chiết bằng dung môi hữu cơ Tiến hành chiết kháng sinh 1 lần bằng các dung môi khác nhau trên các pH khác nhau: 3, 7, 10 với tỷ lệ Vdm á Vdịch lọc = 1á 5. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của pha dung môi hữu cơ (dmhc) bằng phương pháp khoanh giấy lọc, pha dịch lọc (N) bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 11 và hình 8. Bảng 11: Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi khác nhau ở các pH khác nhau. Kếtquả PH Tham số Hoạt lực kháng sinh trên Bacillus pumilus Cloroform Butyl acetat Diclomethan n-Butanol N dmhc N dmhc N dmhc N dmhc 3 (mm) 25,71 20,57 22,19 20,06 26,36 23,54 8,26 22,89 s 1,02 0,20 1,24 0,72 1,97 0,73 7,25 1,47 7 (mm) 25,52 21,34 3,55 24,11 26,73 24,15 16,59 27,34 s 1,56 0,81 6,14 0,58 0,54 0,19 1,39 1,29 10 (mm) 24,36 22,72 0,00 25,12 26,72 24,94 0,00 24,66 s 0,68 0,56 0,00 1,45 0,50 0,49 0,00 1,32 Nhận xét: Cả hai dung môi Butyl acetat và n-Butanol chiết được hết kháng sinh từ dịch lọc ở pH10. Chọn n-Butanol để nghiên cứu tiếp. Hình 8 : ảnh chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 3.10.Kết quả sắc ký lớp mỏng Sau khi chiết kháng sinh từ dịch lên men sang n-Butanol ta tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác định thành phần kháng sinh và làm cơ sở cho việc tinh chế sau này. Kết quả sắc ký được giới thiệu ở bảng 12 và hình 9 . Vi khuẩn kiểm định là Proteus mirabilis. Bảng 12: Kết quả sắc ký lớp mỏng Kết quả Hệ dung môi Rf UV VSV Thuốc thử Hệ 1 0,87 0,87 - Hệ 2 0,89 0,89 - Hệ 3 0-0,81 0-0,81 - Hệ dung môi chạy sắc ký: -Hệ 1: Clorofoc: Metanol: amonihytroxyd(25%) (2:2:1) -Hệ 2: n-Butanol: Etanol: dimetylformamid (3:1:1) -Hệ 3: Butylaxetat: axeton: trietylamin (1:2:1) Không phát hiện được bằng thuốc thử hóa học (-) Nhận xét: Kháng sinh phát hiện được bằng ánh sáng tử ngoại nhưng không phát hiện được bằng một số loại thuốc thử hóa học (như Ninhydrin 1% trong cồn 96o). -Sơ bộ kết luận trong dịch lọc của Streptomyces 40.16 có ít nhất 2 thành phần kháng sinh (một thành phần có hoạt tính mạnh và một thành phần có hoạt tính yếu hơn). Hình 9 : Sắc ký lớp mỏng dịch kháng sinh 3.11. Kết quả thử độ bền của kháng sinh Dịch lọc kháng sinh đem đun sôi ở 1000C, đun sôi 1000C trong 30 phút và đun cách thủy 30 phút. Lấy dịch lọc đem thử hoạt tính bằng phương pháp giếng thạch, kết quả ở bảng 13. Bảng 13: Kết quả bền nhiệt của kháng sinh VSV kiểm định Độ bền nhiệt của kháng sinh 1000C Sôi 30 phút Cách thủy B.pumilus (mm) s (mm) s (mm) s 24,44 0,61 27,04 0,24 24,41 0,20 P.mirabilis (mm) s (mm) s (mm) s 20,78 0,35 22,98 0,31 20,49 0,42 Nhận xét: Kháng sinh do chủng Streptomyces 40.16 tổng hợp rất bền với nhiệt, có thể thuận lợi khi nghiên cứu tinh chế kháng sinh với quy mô lớn hơn. 3.12. Kết qủa thử khả năng chống nấm: Tác dụng chống nấm của kháng sinh do Streptomyces 40.16 tạo ra được khảo sát bằng phương pháp khuyếch tán sử dụng khối thạch đối với Candida albicans, mốc đen 1, mốc xanh 1 và Aspergillus niger. Các kết quả được giới thiệu ở bảng 14. Bảng 14. Kết quả thử tác dụng chống nấm của hỗn hợp kháng sinh Chủng Nấm mốc Tham số 40.16.4.1 40.16.4.5 40.16.4.6 40.16.4.11 40.16.4.12 Asp.niger (mm) 17,22 18,97 18,73 17,97 19,03 s 1,39 0,59 1,42 0,39 1,29 Mốc đen 1 (mm) 14,36 13,79 13,53 14,29 13,92 s 0,48 1,52 0,72 0,92 1,59 Mốc xanh 1 (mm) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 s 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Cadida (mm) 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 s 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 Nhận xét: Chủng Streptomyces 40.16 có khả năng chống được Asp.niger và mốc đen 1. Hình 10: Kết quả thử hoạt tính trên Asp.niger Phần 4 Kết luận và đề xuất 4.1. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu cơ bản chúng tôi đã hoàn thành được mục tiêu của khóa luận tốt nghiệp và rút ra một số kết luận sau: - Xác định chủng Streptomyces 40.16 có nhiều đặc điểm trùng với chủng Streptomyces nigellus. Vì vậy về cơ bản có thể khẳng định Streptomyces 40.16 có tên khoa học là Streptomyces nigellus. - Streptomyces 40.16 là xạ khuẩn được phân lập từ cơ chất Việt Nam trong quá trình nuôi cấy tạo ra kháng sinh phổ rộng có tác dụng tốt trên các vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). - Chủng đã được cải tạo cho hoạt tính kháng sinh cao, môi trường nuôi cấy bề mặt tốt nhất là MT1 và môi trường lên men tốt nhất là MT1dd. - Qua quá trình cải tạo và chọn giống đã thu được biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt hơn chủng gốc. Kháng sinh do chủng Streptomyces 40.16 sinh tổng hợp có một số đặc điểm: + Tan trong các dung môi hữu cơ thông thường + Chiết được bằng phương pháp chiết sử dụng dung môi hữu cơ + Khá bền với nhiệt, chịu được mọi pH và pH tối ưu là pH 7 – 9 + Kháng sinh có 2 thành phần hoạt động. 4.2. Đề xuất - Tiếp tục cải tạo giống bằng các phương pháp truyền thống và các kỹ thuật di truyền hiện đại để thu được chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh ngày càng tốt hơn. - Tiếp tục nghiên cứu các phương pháp chiết tách nhằm thu được sản phẩm tinh khiết với hiệu suất cao. - Nghiên cứu khả năng ứng dụng thực tế của kháng sinh do chủng 0treptomyces 40.16 tạo ra. - Lên men trên quy mô lớn sau đó chiết xuất và tinh chế nhằm thu được một lượng kháng sinh đủ để tiến hành xác định cấu trúc, tính chất lý hóa và tiến hành thử tiền lâm sàng đối với chất kháng sinh này nếu điều kiện cho phép. Tài liệu tham khảo *Tài Liệu Tiếng Việt [1]. Bộ môn Vi sinh (1999), Vi sinh học, Trường Đại học Dược Hà Nội. [2]. Kiều Hữu ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh vật học công nghiệp, NXB khoa học kĩ thuật. [3]. Bộ môn Hoá Dược (1998), Hoá Dược II, Trường Đại học Dược Hà Nội. [4]. Bộ môn Hoá phân tích (1998), Hoá phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội. [5]. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở Công Nghệ Sinh Học và sản xuất Dược phẩm, NXB Y Học Hà Nội. [6]. Nguyễn Khang (2005), Kháng sinh học ứng dụng, NXB Y Học Hà Nội. [7]. Hồ Viết Quý (2002), Chiết tách, phân chia, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ, lý thuyết- thực hành- ứng dụng, tập 1, NXB Khoa học kĩ thuật. [8]. Cao Văn Thu (9/2000), Bài giảng kháng sinh và vitamin. [9]. Lã Thị Thảo (2005), “Nghiên cứu sự lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 23.245”. Khóa luận văn tốt nghiệp năm 2001-2005. [10]. Khuất Hữu Thanh, Cơ sở di truyền phân tử, NXB Khoa học kĩ thuật Hà Nội 2003. [11]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục. *Tài Liệu Tiếng Anh [12]. Greg O.Buchanan, Rika Regentin, Misty Piagentini, Andreas Rascher, Robert McDaniel, Jorge L.Galazzo, and Peter J.Licori (2005), “ Production of 8-Demethylgeldanamycin and 4,5-Epoxy-8- demethylgeldanamycin from a Recombinat Strain of Streptomyces hygroscopicus”,J. Nat. Prod, No. 68, P. 607-610. [13]. Toshikazu Komoda, Madoka Kishi, Naoki Abe, Yasumase Sugiyama, and Akira Hirota (2004), “Novel Lipoxygenase Inhibitors, Tetrapetalone B, C, and D from Streptomyces sp.”, Biosi. Biotechnol. Biochem, No. 68 [14]. E. B Shirling, D. Gottlieb (1996), Method for characterozation of Streptomyces species, Int, J, Syst, Bacteriol, Vol. 16.. [15]. Selman A. Waksman (1959), The Actinomyces, Vol I, London 2002. [16].Philippe Bressollier, Francois Letourman, Maria Urdaci and Bernard Verneuil (1999), “Purification and Characterization of Keratinolytic Serine Proteinase from Streptomyces albidoflavus”. Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, No 6, p. 2570- 2576 [17]. Jun Kono, Takuya Kawahata, Toru Otake, Motoko Morimoto, Haruyo Mori, Noboru Ueba, Maki Nishio, Akio Kinumaki, Saburo Komaisubara and Keisuke Kawashima (1996), "Boromycin, an anti-HIV Antibiotic", Biosci. Biotech. Biochem., vol. 60, No3, p. 1036-1037. Mục lục