Khóa luận Phân lâp các dòng vi khuẩn có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, gây bệnh cho cá tra nuôi ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

ền phù. Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ, làm nguội que cấy trong không khí khoảng 15 giây. Mở nắp dụng cụ chứa vi khuẩn cần cấy, đưa nhẹ qua ngọn lửa đèn cồn. Cho que cấy vào ống huyền phù tế bào, chạm đầu que cấy vào thành ống để làm nguội tiếp. Nhúng đầu que cấy vào dịch huyền phù. Tay trái hé mở nắp đĩa thạch. Đặt đầu que cấy vào một góc đĩa thạch chấm nhẹ để loại bớt tế bào một lần nữa. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên mặt thạch theo đường zích zắc dày. Đậy nắp đĩa. Khử trùng đầu que cấy trên đèn cồn và làm nguội đầu que cấy. Hé mở nắp đĩa, đặt đầu que cấy lên phần thạch chưa ria cấy để làm nguội tiếp. Bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ nhất, ria đường zích zắc thứ hai có chiều khác với đường ban đầu. Đậy nắp đĩa lại. Khử trùng que cấy, làm nguội, bắt đầu từ một cạnh của đường zích zắc thứ hai, ria cấy đường zích zắc thứ ba có chiều khác với các đường thứ nhất và thứ hai trên khoảng trống còn lại. Đậy nắp đĩa, khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá. Ngoài kiểu ria cấy tạo thành ba đường zích zắc (hay còn gọi là ria cấy ba pha) có thể ria cấy bốn đường zích zắc (bốn pha) để thu nhận các khuẩn lạc sạch. Hình 3.2.3.2. Các cách ria cấy Hình 3.2.3.4. Các thao tác cấy truyền Cách cấy giống cấp một sang erlen + Chuẩn bị Đĩa giống cần cấy Erlen có pha sẵn môi trường đã được hấp tiệt trùng. Que cấy. Đèn cồn. + Tiến hành Cho các dụng cụ vào tủ cấy Rửa tay bằng cồn Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn đến khi đầu que cấy nóng đỏ. Hé mở nắp đĩa thạch, chạm đầu que cấy vào phần đĩa thạch không có vi khuẩn để làm nguội que cấy. Lấy một khuẩn lạc, nếu khuẩn lạc quá nhỏ thì lấy hai khuẩn lạc. Mở nút bông của erlen, hơ miệng erlen trên ngọn lửa đèn cồn. Cho que cấy vào ngập trong môi trường, chú ý không để đầu que cấy chạm vào vật gì. Lắc nhẹ đầu que cấy để vi khuẩn phân tán vào môi trường. Lấy que cấy ra, hơ miệng erlen trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nút bông lại. Hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để diệt khuẩn. Các erlen sau khi được cấy vi khuẩn cho vào tủ ấm lắc ở 30oC tốc độ lắc 120 vòng/phút, trong vòng 48 h. Phương pháp pha loãng + Chuẩn bị Erlen chứa mẫu cần pha loãng Ống nghiệm chứa 10ml nước muối sinh lý đã hấp tiệt trùng Máy khuấy ống nghiệm. Đèn cồn Micropiet, Hộp đầu tip đã hấp tiệt trùng, Bút Hình 3.2.3.5. Dụng cụ chuẩn bị trước khi pha loãng và tráng đĩa được đặt trong tủ cấy vô trùng. + Tiến hành: Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. Cho các dụng cụ trên vào bên trong tủ cấy. Rửa tay bằng cồn. Lắc đều bình chứa mẫu cần pha loãng bằng máy khuấy ống nghiệm trong 1 phút. Mở nút bông bình chứa mẫu, hơ nhanh miệng bình pha loãng trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 100 ml Mở nút bông ống nghiệm nước muối sinh lý, hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn. Cho 100 ml mẫu vào. Hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, đậy nhanh nút bông lại. Sơ đồ pha loãng: Hình 3.2.3.6. Cách pha loãng 100ml 100ml 100ml 10-2 10-6 10-4 Phương pháp tráng đĩa ( cấy trang) + Chuẩn bị Đĩa peptri Que cấy trang Hộp đầu tip Cồn 70o Cốc 450 ml Đèn cồn Máy vertex + Thao tác Lấy ống nghiệm đã pha loãng ở nồng độ 10-4 để tiến hành tráng đĩa. Vệ sinh bằng cồn khắp mặt trong của tủ cấy. Cho các dụng cụ trên vào tủ cấy (trừ máy khuấy ống nghiệm). Rửa tay bằng cồn. Lắc kỹ ống nghiệm bằng máy khuấy ống nghiệm trong 1 phút. Mở nút bông đậy ống nghiệm chứa mẫu, hơ nhanh trên ngọn đèn cồn. Dùng micropipet hút 50 ml dung dịch mẫu. Hơ nhanh miệng ống nghiệm trên ngọn đèn cồn, đậy nút bông lại. Tay trái hé mở nắp đĩa thạch, tay phải cầm micropipet cho vào 50 m mẫu. Dùng que gạt nhúng vào cồn, hơ trên ngọn đèn cồn, làm nguội trong không khí 15 giây, tiếp tục làm nguội que gạt trên phần thạch không có dung dịch vi khuẩn, khi que cấy đã nguội thì gạt giọt dịch trải đều khắp mặt thạch: tay trái hé mở nắp hộp, ngón út trái xoay nhẹ cho đĩa chuyển động tròn, tay phải liên tục gạt cho tới khi mặt thạch khô ráo. Thay đầu tip và tiếp tục với các ống còn lại Chú ý: Để các tế bào vi sinh vật tách rời nhau và phân bố đều trên mặt thạch, sau khi nhỏ dịch pha loãng cần tiến hành gạt ngay. Nếu để lâu giọt dịch sẽ bị khô, các tế bào gắn chặt vào mặt thạch, việc gạt dàn đều chúng sẽ rất khó khăn, dẫn đến kết quả sai lệch. Các đĩa thạch đã được tráng sẽ được dán parafilm và cho vào tủ ấm ở 30oC trong vòng 48 giờ. Phương pháp đếm khuẩn lạc Các đĩa thạch sau khi được tráng vi khuẩn và giữ trong tủ ấm ở 30oC sau 48 giờ được đem ra đếm khuẩn lạc bằng máy đếm khuẩn lạc. Cách đếm: Bật công tắc máy đếm. Úp sấp đĩa lên buồng đếm của máy. Nhấn nút đếm của máy để cho nó trở về số 0. Dùng bút chuyên dụng của máy chấm lên khuẩn lạc đã được đếm. Chỉ đếm những đĩa có khuẩn lạc trong khoảng 15 – 300. Nếu số lượng khuẩn lạc khá lớn, lớn hơn 300 thì dùng bút chia khuẩn lạc thành hai phần, hoặc bốn phần bằng nhau. Đếm số khuẩn lạc có trong từng phần đó cộng lại. Chú ý không bỏ sót khuẩn lạc bé hoặc khuẩn lạc mọc ở những chỗ khuất cũng như khuẩn lạc dính vào nhau. Trong quá trình đếm khuẩn lạc cũng cần ghi lại hình dạng của các chủng vi khuẩn. Có thể cùng một chủng vi khuẩn nhưng trong các môi trường nuôi cấy khác nhau sẽ cho hình dạng khuẩn lạc khác nhau. Hình 3.2.3.8. Đang đếm khuẩn lạc Hình 3.2.3.7. Các đĩa petri, máy đếm khuẩn lạc 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu và cố định mẫu Khi thu mẫu cá phải còn sống và không có dấu hiệu bệnh lý, ít bị tổn thương do đánh bắt. Đặt cá trong khay nhôm sạch, giữ ấm. Nếu cá quẫy mạnh thì làm chết ngay. Cân trọng lượng, đo chiều dài và chụp hình cá. Tiến hành giải phẫu cá. Dùng kéo nhọn cắt rời toàn bộ tiêu hóa (bao gồm thực quản, dạ dày , gan tụy, ruột trước và ruột giữa) cho vào túi nhựa vô trùng cùng với 10ml nước muối sinh lý (0,9%) vô trùng. Đồng nhất mẫu bằng máy đập mẫu trong 10 phút để phóng thích hệ vi sinh vật đường ruột, sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/ phút trong 5 phút. Dịch nồi được giữ lại và bảo quản trong glycerol 20% ở nhiệt độ -80% để sử dụng cho bước phân lập tiếp theo. Đối với mẫu nước ao: dùng xuồng bơi cách bờ 2-3m, mở nắp chai 1000ml, dốc ngược chai, ấn mạnh xuống nước ở độ sâu 50 cm. Nghiên chai cho nước vào khoảng 2/3 chai. Lấy chai lên, đậy nắp kín , ghi đầy đủ thông tin ( tên mẫu, ngày lấy mẫu, địa chỉ nơi lấy) lên nhãn. Lấy 1ml mẫu nước ao tăng sinh trên môi trường MRS broth (như mô tả ở Sơ đồ mục 3.2.2). Đối với mẫu sữa và dưa chua lên men: sử dụng 1ml dịch huyền phù tăng sinh trong môi trường MRS (như mô tả ở Sơ đồ mục 3.2.2). Hệ tiêu hóa, nước ao nuôi cá tra Nguyên liệu khác: các loại dưa chua lên men tự nhiên, sữa tươi 1ml dịch mẫu tăng sinh trên MRS broth 48h, 30oC, 120rpm Trải trên môi trường MRS agar (pha loãng 10-4, 10-5, 10-6) Ủ 48h, 30oC Chọn các khuẩn lạc riêng lẻ, tăng sinh trên 5ml MRS broth Ủ 48h, 30oC Test phân hủy C6-HHL Test đối kháng với Edwardsiella ictaluri Mô tả hình thái và nhộm gram Giữ giống -80oC trong glycerol 40% 3.3.2 Phương pháp sàng lọc vi khuẩn lactic Hình 3.3.2.1. Sơ đồ sàng lọc nhóm vi khuẩn lactic acid trên môi trường MRS. 3.3.3. Khảo sát khả năng phân hủy phân tử C6-HHL của các chủng vi khuẩn phân lập được ở điều kiện in vitro 3.3.3.1. Xây dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ C6-HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein - Giống vi khuẩn Chromobacterium violaceum CV026 lưu giữ ở -80oC được cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường BHIA. Sau đó ủ ở 30oC trong 24 giờ để tạo giống cấp 1. - Từ giống cấp 1, chọn một khuẩn lạc cấy chuyền sang erlen chứa 10ml môi trường BHI có bổ sung 20 ppm kanamycin. Sau đó ủ trong tủ ấm lắc ở 30o C trong 24 giờ để tạo giống cấp 2 (được sử dụng trong thí nghiệm). - Tiến hành pha loãng dung dịch C6-HHL (N-hexanoyl homoserine lactone) từ nồng độ 2500 mg/l thành các nồng độ 10; 5; 2,5; 1; 0,5 ppm trong môi trường BHI. - Trải 50µl canh khuẩn CV026 (tương ứng với nồng độ 109 CFU/ml) lên mỗi đĩa BHIA. Dùng que cấy tam giác trải đều dịch khuẩn trên đĩa và để khô khoảng 15 phút. - Dung dịch C6-HHL các nồng độ khác nhau, sử dụng 3 x 10µl dung dịch C6-HHL nhỏ vào 3 vị trí trên đĩa BHIA đã trang sẵn dịch khuẩn CV026. Để trong box cấy vô trùng cho đến khi khô, sau đó dán parafilm và ủ trong 24h ở nhiệt độ 30oC. - Sau khi ủ trong 24h, trên đĩa xuất hiện 3 vòng tròn sắc tố violacein tương ứng tại 3 vị trí đã nhỏ dung dịch C6-HHL (Hình 3.3). Tiến hành đo đường kính của các vòng tròn này, và xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa ln[C6-HHL] và đường kính đường tròn sắc tố violacein (mm) (lấy giá trị trung bình của 3 giá trị đo được). Hình 3.3.3.1.1. Các vòng tròn sắc tố violacein tiết ra bởi vi khuẩn CV026 khi có sự hiện diện của phân tử C6-HHL. 3.3.3.2 Khảo sát khả năng phân hủy phân tử C6-HHL Cấy giống vi khuẩn Chromobacterium violaceum CV026: tương tự phần 3.3.3.1. Các chủng vi khuẩn phân lập được bảo quản ở – 80oC, được cấy chuyền sang đĩa MRSA và ủ ở 30oC trong 48h để tạo giống cấp 1. Chọn một khuẩn lạc trên đĩa MRSA (đối với mỗi chủng), cấy chuyền sang các erlen chứa 5ml dung dịch MRS, ủ trong 48 giờ để tạo giống cấp 2. Từ các giống cấp 2 này, tiến hành pha loãng 10 lần và đo mật độ quang ở bước sóng 600nm (OD600). Mật độ vi khuẩn được xác định theo công thức: 1,02 x 109 x OD600 (CFU/ml) (công thức Mc Fahrland). Từ mật độ vi khuẩn xác định được, tính toán thể tích cần thiết cấy vào các erlen chứa 5ml dung dịch MRS để đạt mật độ 2x107 CFU/ml. Hình 3.3.3.2.1 Khảo sát khả năng phân hủy C6-HHL của các chủng vi khuẩn phân lập và từ ngân hàng. Bổ sung vào mỗi erlen 5ppm dung dịch C6-HHL. Sử dụng một erlen đối chứng, chỉ chứa C6-HHL và môi trường MRS mà không bổ sung vi khuẩn. Tất cả erlen được đặt trong tủ ấm lắc ở tốc độ 120 vòng/phút trong 12 giờ. Sau đó lấy 3 x 10µl dịch nổi nhỏ lên bề mặt đĩa BHIA đã tráng sẵn 50µl dịch vi khuẩn CV026 đã chuẩn bị trước đó 24h. Sau đó ủ ở 30oC trong 24h. Sau thời gian ủ, đo đường kính các vòng tròn violacein và dựa vào đường chuẩn đã thiết lập để tính toán nồng độ C6-HHL còn lại trong môi trường. 3.3.4 Khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn phân lập với Edwardsiella ictaluri ở in vitro 3.3.4.1 Khảo sát đường cong tăng trưởng của E. ictaluri Edwardsiella ictaluri được phân lập từ mẫu cá tra bệnh gan thận mủ được nhận từ Trung Tâm Quan Trắc, thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. E. ictaluri được nuôi trên môi trường BHI broth. Tiến hành thu mẫu ở các thời điểm 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 36, 42, 48 giờ sau khi ủ ở 30oC, 120 rpm. Các mẫu thu ở mỗi thời điểm tiến thành pha loãng bậc 10, trải 50 µl dịch khuẩn trên môi trường BHIA, ủ 30oC, sau 24 giờ tiến hành điếm khuẩn lạc (nằm trong khoảng từ 25-300 khuẩn lạc trong 1 đĩa), mỗi nồng độ lập lại 3 lần. 3.3.4.2 Phương pháp đục lỗ trên thạch Các chủng vi khuẩn phân lập được bảo quản ở – 80oC, được cấy chuyền sang đĩa MRSA và ủ ở 30oC trong 48h để tạo giống cấp 1. Chọn một khuẩn lạc trên đĩa MRSA (đối với mỗi chủng), cấy chuyền sang các erlen chứa 5ml dung dịch MRSB, ủ trong 48h để tạo giống cấp 2. Từ các giống cấp 2 này, tiến hành pha loãng 10 lần và đo mật độ quang ở bước sóng 600nm (OD600). Điều chỉnh về mật độ vi khuẩn là 2×107 CFU/ml, dùng 50 µl dịch vi khuẩn tráng trên đĩa thạch, ủ trong 48h ở nhiệt độ 300C. Đục lấy khối thạch chứa các khuẩn lạc của vi khuẩn lactic đặt vào giếng của môi trường BHIA đã trải vi khuẩn gây bệnh E. ictaluri. Hình 3.3.4.2.1 Phương pháp đục lỗ thạch. Tương tự với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri được bảo quản ở -800C, được cấy chuyền và tạo giống cấp 1 trong đĩa thạch máu. Chọn khuẩn lạc để nuôi cấy trong 10ml BHI ,ủ trong 48h để tạo giống cấp 2. Đo OD, điều chỉnh nồng độ vi khuẩn về mật độ vi khuẩn 2×108CFU/ml. Dùng 50 µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấp 2 tráng lên môi trường BHIA. Sau khi tráng đĩa lật úp đĩa và để trong tủ cấy khoảng 15 phút cho khô. Sau đó dùng ống sắt hình trụ (tiệt trùng bằng cách nhúng còn rồi hơ trên lửa nguội thật kỹ) khoan 3 lỗ trên đĩa thạch (đường kính 9mm). Các khối thạch sau khi đục được lấy ra và bỏ đi. Ghi tên kí hiệu các chủng vi khuẩn cần khảo sát lên nắp đĩa. Các đĩa tráng vi khuẩn cần khảo sát đã ủ trong 48h trước, trong tủ ấm. chọ những vùng khuẩn lạc mọc dày và đều, dùng ống sắt hình trụ (tiệt trùng bằng cách nhúng còn rồi hơ trên lửa nguội thật kỹ) khoan 3 khối thạch từ mỗi đĩa (mỗi lần qua chung khác phải tiệt trùng kỹ ống sắt và để nguội). Dùng nhíp tiệt trùng, khéo léo gắp các khối thạch và đặt vào các lỗ đã đục sẵn (tránh đụng đầu nhíp vào mặt thạch đã tráng Edwardsiella ictaluri). 3 khối thạch được đặt vào mỗi đĩa Edwardsiella ictaluri. Ủ trong tủ ấm nhiệt độ 28-320C trong 24h, 48h thì xem vòng kháng khuẩn. Nếu chủng vi khuẩn tạo vòng kháng khuẩn có đường kính >17mm được cho là đối kháng mạnh. 3.3.4.3 Phương pháp giếng khuếch tán (Well Diffusion method) - Dùng 50 µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấp 2 có mật độ vi khuẩn là 2x108CFU/ml để tráng trên đĩa BHIA. Sau khi tráng đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. Sau đó dùng cây đục lỗ đã hấp khử trùng. Rồi đục 3 lỗ mỗi đĩa thạch, dùng nhíp đã hấp tiệt trùng gấp các khối thạch ra bỏ. - Dùng 80µl dịch vi khuẩn cần khảo sát, nhỏ vào mỗi lỗ trên đĩa thạch vừa tráng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, sau đó dán parafilm. - Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28-300C trong 24h và 48h thì xem xét vòng kháng khuẩn. Cấy ria lên BA Đo OD 600nm, điều chỉnh về 2x108 tb/ml 50 µl trải trên BHIA, để khô 15 min và đục lỗ 5 mm (3 lỗ/đĩa) Ủ 24h, 30oC Đo vòng vô khuẩn E. ictaluri (-80oC) Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên BHI (10ml) Ủ 30oC, 48h Ủ 30oC, 24h Vi khuẩn sàn lọc (-80oC) Cấy ria lên MRSA Ủ 30oC, 48h Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên MRS (10ml) Đo OD 600nm, điều chỉnh về 2x107 tb/ml (Hút 80 µl nhỏ vào giếng) Ủ 30oC, 48h Hình 3.3.4.3.1. Phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) Vi khuẩn đã sàng lọc (-80oC) Cấy ria lên BHIA Ủ 30oC, 48h Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên BHI (5ml) Ủ 30oC, 48h Ngâm paper disc vào dịch treo (15min) E. ictaluri (-80oC) Cấy ria lên BA Chọn 1 khuẩn lạc, tăng sinh trên BHI (10ml) 50 µl trải trên BHIA để khô 15 min Ủ 24h, 48h, 30oC Đo vòng vô khuẩn Ủ 30oC, 48h Ủ 30oC, 24h Ly tâm 13.000rpm, 10 phút, lấy dịch treo 3.3.4.4 Phương pháp đĩa giấy (đặt trên môi trường thạch đã trải Ed.) Hình 3.3.4.4.1 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán (disc-paper diffusion method) - Dùng 50 µl dịch vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cấp 2 có mật độ vi khuẩn là 2x108CFU/ml để tráng trên đĩa BHIA. Sau khi tráng đĩa, lật úp đĩa trong vòng 15 phút đợi đĩa khô. - Dùng 1000 µl cho vào eppendorf đem ly tâm 10000 vòng/10 phút. Thu dịch nổi cho vào eppendorf khác, loại bỏ sinh khối. - Đặt vào dịch nổi mỗi chủng vi khuẩn 3 đĩa giấy, ngâm trong 15 phút cho các vi khuẩn thấm vào đĩa giấy. - Sau đó dùng nhíp gắp các đĩa giấy ra và đặt lên 3 vị trí khác nhau của mỗi đĩa đả tráng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri . Để cho vi khuẩn khô trong vòng 15 phút,dán parafilm lại và ủ trong tủ lạnh khảo sát vòng kháng khuẩn ở 24h và 48h. 3.3.5 Phương pháp nhuộm Gram và mô tả hình thái a. Phân biệt Gram Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm Gram dương và Gram âm dựa trên các đặc tính hóa lý của thành tế bào. Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dầy, dạng lưới cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thế _iot. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thừng có thêm lớp màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài. Sau khi nhuộm với phức hợp tím tinh thể-iot, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím tinh thể-iot bên trong tế bào. Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu. Khử màu là bước quan trọng và cần kĩ năng nhất định vì khả năng bắt màu Gram dương không phải là "tất cả hoặc không." b. Vật liệu nhuộm Gram - Crystal viole - Lugo - Alcohol 95% - Safranine c. Cách tiến hành: - Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lây một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí Cố định tế bào: Hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 2 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhỏ dịch tẩy màu, giử khoảng 30 giây ( cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. - Soi kính : dùng vật kính dầu 100x 3.4 Xử lý số liệu Sử dụng phần mền SPSS 13.00 for Window số liệu thống kê các giá trị trung bình. Sử dụng phép kiểm định t đối với hai mẫu độc lập (Independent – Sample T Test) để so sánh giá trị trung bình giữa các nhóm với p < 0,05. CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn lactic acid Môi trường MRS là môi trường chuyên biệt cho vi khuẩn lactic acid. Vi khuẩn lactic mọc trên môi trường này tạo nên các khuẩn lạc màu trắng trong, màu trắng sữa đục. Rìa khuẩn lạc có các dạng như rìa tròn đều. Bề mặt khuẩn lạc có các dạng bề mặt trơn. Khi nuôi các chủng trong môi trường MRS, giá trị pH trung bình dao động (pH: 4,58-5,07) của các loại mẫu (Hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước ao nuôi cá tra thịt và giống, sữa tươi và yoghurt, rau chua) không có sự khác biệt (p > 0,05). Nhìn chung các mẫu khi tăng sinh trong môi trường MRS, hệ vi sinh chủ yếu là vi khuẩn thuộc nhóm lactic do đó chúng sản sinh ra acid lactic làm cho pH của môi trường giảm và mang tính acid. Vi khuẩn lactic hiện diện chủ yếu trong hệ tiêu hóa của các loài cá nước ngọt như cá mè (Hypophthalmichthys molitrix), cá chép (Cyprinus carpio), channel catfish (Ictalurus punctatus) và Carassius cuvieri. Chủ yếu là các loài Lactococcus lactis và Lactococcus raffinolactis (Hagi et al., 2004). Ngoài ra, theo (Vaughan et al., 1994) đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn lactic từ nhiều nguồn nguyên vật liệu khác nhau như các loại trái cây, rau, phó mát, sữa và thịt. Tác giả thu được 28.000 khuẩn lạc chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn lactic và tiến hành sàng lọc các vi khuẩn lactic có khả năng ức chế sự phát triển của một vi khuẩn gây bệnh. Nhiều tác giả khác cũng chứng minh rằng, vi khuẩn lactic acid bao gồm các loài thuộc giống Lactobacillus, Carnobacterium, Streptococcus, Leuconostoc, và Lactococcus, hiện diện chủ yếu trong ruột cá khỏe mạnh (Gatesoupe, 2008; Ringø and Gatesoupe, 1998). Lactobacillus plantarum là chủng vi khuẩn lactic hiện hiện ở trong hệ tiêu hóa của cá Pollachius virens, cá hồi Salmo salar (Gildberg et al., 1995), cá Salvelinus alpinus (Ringø et al., 1998), và cá salmonid (Balcázar et al., 2007). Bảng 4.1.1 Giá trị pH của dịch khuẩn trong quá trình phân lập Loại mẫu Giá trị pH của dịch khuẩn khi nuôi trong môi trường MRS broth Hệ tiêu hóa cá thịt (n=19) 4,62 ± 0,67a Hệ tiêu hóa cá giống (n=14) 4,44 ± 0,25a Nước ao nuôi cá tra (n=14) 4,47 ± 1,24a Sữa tươi và yoghurt (n=3) 5,07 ± 0,55a Rau chua (n=9) 4,58 ± 0,59a (*) Giá trị pH Trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SD) của các mẫu khác nhau, chữ cái thường trong một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) giữa các loại mẫu. 4.3 Khảo sát đường cong tăng trưởng của E. ictaluri Hình 4.3.1. Đường cong tăng trưởng của E. ictaluri khi nuôi trên môi trường BHI. Qua Hình 4.3.1 cho thấy rằng đường cong tăng trưởng của E. ictaluri bao gồm pha tiềm tàn (lap phase) từ 0-12 giờ, pha tăng trưởng (log phase) từ 12-27 giờ, và pha ổn định từ 27-48 giờ. Từ kết quả trên chúng tôi chọn thời điểm 24 giờ sau khi tăng sinh E. ictaluri dùng cho các thí nghiệm đối kháng tiếp theo. Kết quả này phù hợp với nhóm nghiên cứu đề tài “Heat shock protein” thuộc Trung Tâm Quan Trắc (thông tin qua trao đổi cá nhân). 4.4 Dựng đường chuẩn tương quan giữa nồng độ C6-HHL và vòng tròn sắc tố Xác lập được đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử C6-HHL (một loại phân tử AHL được tiết ra và tiếp nhận bởi chủng vi khuẩn chỉ thị CV026) và đường kính vòng tròn sắc tố violacein. Phương trình đường tương quan tuyến tính được xác định ở hình 4.4. Hình 4.4.1 Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ phân tử HHL và đường kính vòng tròn sắc tố violacein. 4.5 Kết quả kiểm tra nhanh tốc độ phân hủy HHL và khả năng đối kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri bằng phương pháp đục lỗ. 4.5.1 Khả năng phân hủy HHL của các khuẩn lạc được phân lập Dựa vào đường chuẩn đã thiết lập y = 0,6589x + 2,3762 để quy đổi từ đường kính vòng tròn violacein sang nồng độ HHL (N-Hexanoyl homoserine lactone) còn lại trong môi trường. Trong đó: x: nồng độ ln[HHL] còn lại trong môi trường y: đường kính vòng tròn violacein (mm) Bảng 4.5.1.1 Kết quả sàng lọc nhanh khả năng phân hủy C6-HHL của các chủng vi khuẩn phân lập Kí hiệu khuẩn lạc Y (cm) X (Ln[HHL]) Nồng độ [HHL] còn lại sau 12h (ppm) % HHL còn lại trong môi trường Mức độ phân huỷ HHL ĐC 2,5 0,19 1,21 T.VL1.1 2,4 0,04 1,04 86,0 + T.VL1.4 0 -3,61 0,03 2,5 +++ T.VL1.5 2,1 -0,42 0,66 54,5 + T.VL4.1 0 -3,61 0,03 2,5 +++ T.VL4.2 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ T.TG1.1 0 -3,61 0,03 2,5 +++ T.TG1.4 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ T.TG1.5 0 -3,61 0,03 2,5 +++ T.DT1.3 2,3 -0,12 0,89 73,6 + T.DT1.2.1 0 -3,61 0,03 2,5 +++ T.DT1.2.2 0 -3,61 0,03 2,5 +++ T.DT1.1.1 2,2 -0,27 0,76 62,8 + T.DT1.1.2 0 -3,61 0,03 2,5 +++ T.DT1.1 1,9 -0,72 0,49 40,5 ++ T.DT1.2 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ T.DT2.1 2,4 0,04 1,04 86,0 + T.DT2.2 2,3 -0,12 0,89 73,6 + T.DT3.1 2 -0,57 0,57 47,1 ++ T.DT3.2 2,3 -0,12 0,89 73,6 + T.DT3.3 2 -0,57 0,57 47,1 ++ G.VL1.5 2 -0,57 0,57 47,1 ++ G.VL1.7 2,3 -0,12 0,89 73,6 + G.VL1.9 0 -3,61 0,03 2,5 +++ G.VL1.10.1 2,3 -0,12 0,89 73,6 + G.VL1.10.2 2 -0,57 0,57 47,1 ++ G.TG1.1 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ G.TG1.3 0 -3,61 0,03 2,5 +++ G.TG1.4 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ G.TG1.5 2,2 -0,27 0,76 62,8 + G.DT 1.1 2 -0,57 0,57 47,1 ++ G.DT1.2 1,5 -1,33 0,26 21,5 ++ G.DT2.2 2,4 0,04 1,04 86,0 + G.DT3.1 2,2 -0,27 0,76 62,8 + G.DT3.2 0 -3,61 0,03 2,5 +++ G.DT5.1 2 -0,57 0,57 47,1 ++ N.T1D5 2,2 -0,27 0,76 62,8 + N.T1D6 2,2 -0,27 0,76 62,8 + N.T3D1 1,5 -1,33 0,26 21,5 ++ N.T3D3 2,4 0,04 1,04 86,0 + N.G.TG1.1 2,4 0,04 1,04 86,0 + N.G.TG1.2 2,1 -0,42 0,66 54,5 + N.G.TG1.3 2 -0,57 0,57 47,1 ++ N.G.TG.3.1 0 -3,61 0,03 2,5 +++ N.G.TG3.2 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ N.G.TG1.1 2,1 -0,42 0,66 54,5 + N.G.TG1.2 0 -3,61 0,03 2,5 +++ N.G.TG2.1 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ N.G.TG2.2 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ N.G.TG3.1 2,4 0,04 1,04 86,0 + N.G.TG3.2 2,3 -0,12 0,89 73,6 + YA1 2,2 -0,27 0,76 62,8 + CM2 2 -0,57 0,57 47,1 ++ CM3 2,3 -0,12 0,89 73,6 + CM1 2,1 -0,42 0,66 54,5 + DC3 1,8 -0,87 0,42 34,7 ++ DC4 2,4 0,04 1,04 86,0 + DC1 0 -3,61 0,03 2,5 +++ RG2 2,1 -0,42 0,66 54,5 + RG4 2,4 0,04 1,04 86,0 + RG3 2 -0,57 0,57 47,1 ++ KF1 1,9 -0,72 0,49 40,5 ++ CF1 0 -3,61 0,03 2,5 +++ CF2 2,2 -0,27 0,76 62,8 + Trong đó: (+) tương ứng với mức độ phân huỷ huỷ HHL yếu (51%-99% HHL còn lại) (++) tương ứng với mức độ phân huỷ huỷ HHL trung (11%-50% HHL còn lại) (+++) tương ứng với mức độ phân huỷ huỷ HHL yếu (0-10% HHL còn lại) Dựa vào kết quả từ bảng số liệu thu thập được chúng tôi nhận thấy: Tốc độ phân hủy C6-HHL sau 12 giờ ở các khuẩn lạc khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Trong 63 khuẩn lạc phân lập được, có 14 khuẩn lạc có khả năng phân hủy mạnh (+++), 22 khuẩn lạc có khả năng phân hủy ở mức trung bình (++), 27 khuẩn lạc có khả năng phân hủy yếu (+). 4.5.2 Sàng lọc nhanh khả năng đối kháng của các vi khuẩn phân lập với E. ictaluri Sử dụng phương pháp đục lỗ để sàng lọc nhanh khả năng đối kháng với E. ictaluri của 63 khuẩn lạc. Kết quả thu được 14 chủng vi khuẩn có tính chất đối kháng với Edwardsiella ictaluri (Bảng 4.5.2.1). Trong đó có 7 chủng vi khuẩn phân lập từ hệ tiêu hóa thịt cá tra (với đường kính vòng kháng khuẩn là 15,5mm), 2 chủng từ hệ tiêu hóa cá giống (có đường kính vòng kháng khuẩn là 19mm), 5 chủng từ các loại dưa chua (có đường kính vòng kháng khuẩn là 15,6mm). Trong đó có 04 chủng có vòng đối kháng ≥ 17mm, tức là có khả năng đối kháng mạnh, bao gồm các chủng như T.VL1.5 (17mm), G.VL1.5 (23mm), T.TG1.3 (18mm), DC (17mm). Bảng 4.5.2.1 Kết quả đối kháng của các khuẩn lạc phân lập Kí hiệu mẫu Tên mẫu Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 24h 48h 1.1 T.DT1.1 17 14 1.2 T.DT1.2 17 15 13 T.VL1.5 21 17 17 G.VL1.9 19 15 20 G.VL1.5 25 23 23 T.TG1.4 17,5 15 24.1 T.TG1.3 20 18 35.1 T.VL4 16 14,7 38 T.TG1 18 15 44 KC 19 16 50.3 DC 14 12 50.4 DC 19 16,3 50.1.1 DC 19,5 16,5 50.1.2 DC 20 17 4.6 Khảo sát khả năng phân hủy C6-HHL trong điều kiện in vitro 4.6.1 Nhóm vi khuẩn lactic phân lập Trong quá trình sàng lọc nhanh 63 khuẩn lạc vi khuẩn lactic của hệ tiêu hóa cá tra và thực phẩm lên men truyền thống. Chọn ra 14 khuẩn lạc kiểm tra lại khả năng phân hủy C6-HHL một mẫu lập lại 3 lần mỗi. Dựa vào đường chuẩn đã thiết lập y = 0,6589x + 2,3762 để quy đổi từ đường kính vòng tròn violacein sang nồng độ HHL (N-Hexanoyl homoserine lactone). Trong đó: x: ln[HHL] còn lại trong môi trường y: đường kính vòng tròn violacein (mm) Bảng 4.6.1.1 Phân hủy của C6-HHL của các khuẩn lạc phân lập trên cá tra và vi sinh vật trong thực phẩm lên men truyền thống trong điều kiện in vitro Kí hiệu khuẩn lạc Y (mm) X (ln[HHL]) [HHL] còn lại sau 12h (ppm) % HHL còn lại sau 12 giờ Mức độ phân hủy [HHL] Đối chứng 30 ± 0.6 0.95 2.59 T.DT1.1 28 ± 1 0,64 1,9 73,4 + T.DT1.2 23 ± 2,1 -0,12 0,89 34,4 ++ T.VL1.5 26 ± 1,2 0,34 1,4 54,1 + G.VL1.9 22 ± 0,6 -0,27 0,76 29,3 ++ G.VL1.5 21 ± 2,1 -0,42 0,66 25,5 ++ T.TG1.4 22 ± 0,6 -0,27 0,76 29,3 ++ T.TG1.3 27 ± 1,5 0,49 1,63 62,9 + T.VL4 25 ± 3,6 0,19 1,21 46,7 ++ T.TG1 25 ± 2,6 0,19 1,21 46,7 ++ KC 14 ± 1,5 -1,48 0,23 8,9 +++ DC 18 ± 1,2 -0,87 0,42 16,2 ++ DC 0 ± 0,0 -3,61 0,03 1,2 +++ DC 26 ± 2,9 0,34 1,4 54,1 + DC 24 ± 1,2 0,04 1,04 40,2 ++ Trong đó: (+) tương ứng với mức độ phân huỷ huỷ HHL yếu (51%-99% HHL còn lại) (++) tương ứng với mức độ phân huỷ huỷ HHL trung (11%-50% HHL còn lại) (+++) tương ứng với mức độ phân huỷ huỷ HHL yếu (0-10% HHL còn lại) Dựa vào kết quả từ Bảng 4.6.1.1. số liệu thu thập được chúng tôi nhận thấy: Lượng HHL còn lại sau 12 giờ ở các khuẩn lạc khác nhau có sự khác biệt rõ rệt. Trong 14 khuẩn lạc phân lập được, có 2 khuẩn lạc có khả năng phân hủy mạnh (+++), 8 khuẩn lạc có khả năng phân hủy ở mức trung bình (++), 4 khuẩn lạc có khả năng phân hủy yếu (+). 4.6.2 Nhóm vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh Bảng 4.6.2.1 Phân hủy C6-HHL của các chủng vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh vật Kí hiệu Loài vi khuẩn pH Y Đường kính vòng sắc tố (mm) X ln(HHL) Nồng độ HHL còn lại (ppm) % HHL còn lại sau 12 giờ Mức độ phânhủy VTCC-B-804 Bacillus thuringiensis 8,75 0 ± 0 -3,61 0,03 4,8 +++ VTCC-B-614 Bacillus megaterium 8,75 0 ± 0 -3,61 0,03 4,8 +++ VTCC-B-701 Lactobacillus plantarum 4,14 0 ± 0 -3,61 0,03 4,8 +++ VTCC-B-871 Lactobacillus acidophilus 4,09 22,0 ± 2,0 -0,57 0,57 100,0 - VTCC-B-800 Pediococcus acidilactici 4,15 0 ± 0 -3,61 0,03 4,8 +++ VTCC-Y-0011 Saccharomyces cerevisiae 6,32 18,7 ± 1,2 -1,85 0,16 27,7 ++ ĐC Đối chứng 6,44 22,0 ± 2,0 -0,57 0,57 100,0 Từ kết quả ở Bảng 4.6.2.1 cho thấy rằng 02 giống B. thuringiensis và B. megaterium có khả năng phân hủy mạnh C6-HHL. Tuy nhiên giá trị pH của dịch khuẩn cao (pH: 8,75) có thể là nguyên nhân gây phân hủy hóa học C6-HHL. Do đó để biết chính xác khả năng phân hủy phân tử tín hiệu C6-HHL cần điều chỉnh pH về giá trị trung tính. Lactobacillus plantarum và Pediococcus acidilactici có khả năng phân hủy mạnh C6-HHL với dư lượng C6-HHL còn lại trong môi trường chiếm 4,8% so với đối chứng. Nhìn chung qua sàng lọc khả năng phân hủy C6-HHL, đa số các chủng vi khuẩn lactic (phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, các sản phẩm rau chua lên men truyền thống) và các chủng vi khuẩn lactic từ ngân hàng vi sinh có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu Quorum sensing C6-HHL của vi khuẩn gây bệnh E. ictaluri. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng quá trình ức chế thật sự các hợp chất tín hiệu có thể được xúc tác bởi hai lọai enzyme: AHL lactonase và AHL acylase (Xu et al., 2003). Molina et al. (2003) (Molina et al., 2003) thử nghiệm hiệu quả của việc sử dụng một chủng Bacillus phân hủy AHL trong việc kiểm sóat sinh học đối với bệnh ở thực vật. Chủng Bacillus này có thể làm giảm bệnh thối củ gây ra bởi E. carotovora xuống còn 15% và bệnh mụn cây ở cà chua gây ra bởi Agrobacterium tumefaciens xuống còn 10%. Việc phân hủy phân tử AHL bởi chủng Bacillus mang lại một sự bảo vệ hiệu quả tương đương hoặc tốt hơn so với việc sản xuất kháng sinh bởi một chủng kiểm sóat sinh học Pseudomonas chlororaphis. Hơn nữa, việc phân hủy các phân tử AHL không chỉ có tác dụng phòng bệnh mà còn có tác dụng trị bệnh. Gần đây, những kết quả tương tự đã đạt được với chủng Bacillus thuringiensis (Dong et al., 2004). 4.7 Khảo sát khả năng đối kháng của các khuẩn lạc phân lập bằng các phương pháp khác nhau 4.7.1 Nhóm vi khuẩn phân lập Tiến hành kiểm tra lại khả năng đối kháng của các khuẩn lạc phân lập với E. ictaluri lại bằng 4 phương pháp khác nhau: Đục lỗ thạch, đĩa giấy (disc-diffusion method), phương pháp Cross streak, giếng khuếch tán (Well-diffusion method). 4.7.1.1 Phương pháp đục lỗ thạch 14 chủng vi khuẩn kiểm tra đối kháng trong đó có 13 chủng có vòng đối kháng ở 24h và 48h. Kính thước vòng kháng khuẩn sau khi ủ 24 giờ có kính thước lớn hơn và khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với đường kính lúc 48 giờ. Bao gồm các khuẩn lạc như T.VL1.5, G.VL1.9, T.TG1.3 và DC. Hình 4.7.1.1.2. Khuẩn lạc DC Hình 4.7.1.1.1. Khuẩn lạc G.VL1.2 Bảng 4.7.1.1.1. Kích thước vòng kháng khuẩn (trung bình ± sai số chuẩn, n=3) của các chủng vi khuẩn phân lập với E. ictaluri sau 24 và 48 giờ bằng phương pháp đục lỗ Kí hiệu mẫu Thời gian Tên mẫu Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 24h 48h 1.1 T.DT1.1 15,7 ± 1,2a 14,0 ± 1a 1.2 T.DT1.2 16,3 ± 0,6a 16,3 ± 1,5a 13 T.VL1.5 19,3 ± 1,5a 16,0 ± 1b 17 G.VL1.9 19,7 ± 0,6a 14,3 ± 0,6b 20 G.VL1.5 25,7 ± 1,2a 22,8 ± 2a 23 T.TG1.4 17,3 ± 2,3a 15,7 ± 2,1a 24.1 T.TG1.3 18,3 ± 1,5a 14,2 ± 0,8b 35.1 T.VL4 15,0 ± 1,7a 12,2 ± 0,8a 38 T.TG1 17,7 ± 0,6a 12,5 ± 0,5b 44 KC 17,7 ± 1,5a 14,0 ± 1b 50.3 DC 0 ± 0 0 ± 0 50.4 DC 19,0 ± 1a 16,3 ± 0,6b 50.1.1 DC 19,0 ± 1,7a 15,3 ± 0,6b 50.1.2 DC 20,0 ± 0a 13,8 ± 1,9b 4.7.1.2 Phương pháp đĩa giấy (Disc-diffusion method) Trong 14 chủng thì nhận thấy có 1 chủng vi khuẩn có vòng đối kháng, còn các chủng còn lại không nhận thấy vòng kháng khuẩn. Hình 4.7.1.2.2. Khuẩn lạc DC Hình 4.7.1.2.1. Khuẩn lạc G.VL1.2 Bảng 4.7.1.2.1. Kích thước vòng kháng khuẩn (trung bình ± sai số chuẩn, n=3) của các chủng vi khuẩn phân lập với E. ictaluri sau 24 và 48 giờ bằng phương pháp đĩa giấy Kí hiệu mẫu Thời gian Tên mẫu Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 24h 48h 1.1 T.DT1.1 0 ± 0 0 ± 0 1.2 T.DT1.2 0 ± 0 0 ± 0 13 T.VL1.5 0 ± 0 0 ± 0 17 G.VL1.9 0 ± 0 0 ± 0 20 G.VL1.5 0 ± 0 0 ± 0 23 T.TG1.4 0 ± 0 0 ± 0 24.1 T.TG1.3 0 ± 0 0 ± 0 35.1 T.VL4 0 ± 0 0 ± 0 38 T.TG1 0 ± 0 0 ± 0 44 KC 0 ± 0 0 ± 0 50.3 DC 0 ± 0 0 ± 0 50.4 DC 16 ± 3a 16 ± 3a 50.1.1 DC 0 ± 0 0 ± 0 50.1.2 DC 0 ± 0 0 ± 0 4.7.1.3 Phương pháp giếng khuếch tán (Well-Diffusion method) Trong 14 chủng thì có 1 chủng vi khuẩn có vòng đối kháng, 13 khuẩn lạc không có vòng kháng khuẩn. Điều này có thể giải thích là dịch khuẩn sau khi pha loãng 2x107 tế bào/ml trong môi trường BHI nên hàm lượng các chất ức chế thấp, không đủ liều để ức chế sự phát triển của E. ictaluri. Hình 4.7.1.3.2. Khuẩn lạc T.TG1.4 Hình 4.7.1.3.1. Khuẩn lạc G.VL1.2 Bảng 4.7.1.3.1. Kích thước vòng kháng khuẩn (trung bình ± sai số chuẩn, n=3) của các chủng vi khuẩn phân lập với E. ictaluri sau 24 và 48 giờ bằng phương pháp giếng khuếch tán Kí hiệu mẫu Thời gian Tên mẫu Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) 24h 48h 1.1 T.DT1.1 0 ± 0 0 ± 0 1.2 T.DT1.2 0 ± 0 0 ± 0 13 T.VL1.5 0 ± 0 0 ± 0 17 G.VL1.9 0 ± 0 0 ± 0 20 G.VL1.5 0 ± 0 0 ± 0 23 T.TG1.4 15,0 ± 0a 13,7 ± 1,2a 24.1 T.TG1.3 0 ± 0 0 ± 0 35.1 T.VL4 0 ± 0 0 ± 0 38 T.TG1 0 ± 0 0 ± 0 44 KC 0 ± 0 0 ± 0 50.3 DC 0 ± 0 0 ± 0 50.4 DC 0 ± 0 0 ± 0 50.1.1 DC 0 ± 0 0 ± 0 50.1.2 DC 0 ± 0 0 ± 0 4.7.1.4 Độ nhạy của các phương pháp kiểm tra đối kháng Bảng 3.7.1.4.1. Kích thước vòng kháng khuẩn của 14 chủng vi khuẩn phân lập bằng các phương pháp khác nhau Tên mẫu Mức độ phân hủy C6-HHL Đối kháng E. ictaluri* Đục lỗ Đĩa giấy Well-Difusion 24h 48h 24h 48h 24h 48h T.DT1.1 + 15,7 ± 1,2a 14,0 ± 1a - - - - T.DT1.2 ++ 16,3 ± 0,6a 16,3 ± 1,5a - - - - T.VL1.5 + 19,3 ± 1,5a 16,0 ± 1b - - - - G.VL1.9 ++ 19,7 ± 0,6a 14,3 ± 0,6b - - - - G.VL1.5 ++ 25,7 ± 1,2a 22,8 ± 2a - - 15,0 ± 0a 13,7 ± 1,2a T.TG1.4 ++ 17,3 ± 2,3a 15,7 ± 2,1a - - - - T.TG1.3 + 17,7 ± 1,5a 14,2 ± 0,8b - - - - T.VL4 ++ 15,0 ± 1,7a 12,2 ± 0,8a - - - - T.TG1 ++ 17,7 ± 0,6a 12,5 ± 0,5b - - - - KC +++ 18,3 ± 1,5a 14,0 ± 1b - - - - DC ++ 0 ± 0 0 ± 0 - - - - DC +++ 19,0 ± 1a 16,3 ± 0,6b 16 ± 3a 16 ± 3a - - DC + 19,0 ± 1,7a 15,3 ± 0,6b - - - - DC ++ 20,0 ± 0a 13,8 ± 1,9b - - 18,7 ± 1,2a 17,3 ± 1,5a (*) Số liệu biểu thị trên 1 cột là của 3 lần lặp lại kích thước vòng kháng khuẩn. Chữ cái thường (a, b) của cùng 1 dòng biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) giữa hai thời gian ủ 24 và 48 giờ. Từ kết quả ở Bảng 3.7.1.4.1 có thể kết luận rằng trong 3 phương pháp kiểm tra khả năng đối kháng, phương pháp đục lỗ thạch là cho kết quả có vòng đối kháng cao nhất và có độ nhạy nhất so với phương pháp đĩa giấy và giếng khuếch tán. Theo Hải và ctv. (2007) (Hai et al., 2007) đã khảo sát các phương pháp (BLIS, BLIS cải tiến, giếng khuếch tán Well-diffusion, đĩa giấy Disc-diffusion, nuôi kết hợp co-culture) khác nhau để kiểm tra khả năng đối kháng của chủng probiotic Pseudomonas synxantha đối với Vibrio spp., kết quả cho thấy rằng phương pháp Cross-streak cho độ nhạy cao nhất, tiếp theo là phương pháp giếng khuếch tán và đĩa giấy. Tuy nhiên theo tác giả (Chythanya et al., 2002) sử dụng phương pháp giếng khuếch tán (well-diffusion method) và phương pháp đĩa giấy (disc-diffusion method) để thử khả năng đối kháng với Pseudomonas I-2, kết quả cho thấy rằng phương pháp đĩa giấy có độ nhạy tốt hơn phương pháp well-diffusion đối với tất cả các mẫu vi khuẩn gây bệnh Vibrio spp. 4.7.2 Nhóm vi khuẩn từ ngân hàng vi sinh vật Bảng 4.7.2.1 Đường kính vòng kháng khuẩn sau khi ủ 24 và 48 giờ bằng phương pháp đục lỗ thạch Kí hiệu Loài vi khuẩn pH Đường kính vòng kháng khuẩn (Trung bình ± SD, n=3) Sau 24 giờ Sau 48 giờ VTCC-B-804 Bacillus thuringiensis 8,75 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 VTCC-B-614 Bacillus megaterium 8,75 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 VTCC-B-701 Lactobacillus plantarum 4,14 22,0 ± 2,0 24,7 ± 4,6 VTCC-B-871 Lactobacillus acidophilus 4,09 21,3 ± 2,3 22,0 ± 2,0 VTCC-B-800 Pediococcus acidilactici 4,15 26,0 ± 2,0 26,0 ± 2,0 VTCC-Y-0011 Saccharomyces cerevisiae 6,32 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Kết quả ở Bảng 4.7.2.1 cho thấy rằng các chủng thuộc vi khuẩn lactic có khả năng ức chế sự phát triển của E. ictaluri sau 24 và 48 giờ ủ. Kích thước vòng kháng khuẩn giao động từ 21-26mm sau 24 giờ và từ 22-26mm sau 48 giờ. Trong khi đó các chủng thuộc giống Bacillus spp. và Sacchromyces cerevisiae không có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh E. ictaluri. Vi khuẩn lactic acid có thể sản sinh ra các chất như: bacteriocins, nisin, H2O2, acid hữu cơ và chúng có khả năng ứng chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh (Ringo and Gatesoupe, 1998). (Schrøder et al., 1980) Schrøder et al. (1980) chúng minh rằng L. plantarum phân lập từ hệ tiêu hóa cá Pollachius virens, có khả năng sản sinh ra chất ức chế kháng lại Vibrio sp.. Nhiều vi khuẩn lactic (L. plantarum, Carnobacterium sp., C. divergens, và Lactococcus lactis) được phân lập từ hệ tiêu hóa của cá, chúng có thể sản sinh ra các hợp chất ức chế chuống lại nhiều loài vi khuẩn gây bệnh ở in vivo và/hay in vitro như Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Pasteurella piscida, Edwardsiella tarda, Flavobacterium psychrophilum, Photobacterium damselae subsp. piscicida, Streptococcus milleri, Vibrio anguillarum, V. ordali (Byun et al., 1997; Gildberg and Mikkelsen, 1998; Jöborn et al., 1997; Robertson et al., 2000; Schrøder et al., 1980; Villamil et al., 2002). Theo (Yermolenko et al., 2006) đã nghiên cứu Enterococcus faecium L3 tiết ra bacteriocins A và B (enterocins) ức chế sự phát triển streptococci. L. platarum 7-40 (NTU102) có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa (trong thực phẩm) ở in vitro (có vòng kháng khuẩn là 7.7 mm) (Pan et al., 2002). Cũng thí nghiệm khả năng đối kháng của L. plantarum 7-40 (NTU102) với các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản như Streptococcus spp., Aeromonas hydrophila, Lactococcus garvieae, V. alginolyticus*, V. alginolyticus**, Photobacterium damsela subsp. damselae (Son et al., 2009). 4.8 Nhuộm gram và đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập Hầu hết các chủng phân lập từ hệ tiêu hóa cá tra, nước và các sản phẩm lên men truyền thống là gram dương, có hình dạng tế bào là hình que và cầu khuẩn. Tế bào sắp xếp dạng đơn bào, dạng 2 tế bào hay dạng chuỗi, 4 tế bào hay nhiều tế bào bó lại (Bảng 4.8.1). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của (Ringo and Gatesoupe, 1998). Bảng 4.8.1. Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập Ký hiệu mẫu Tên mẫu Nhuộm gram Kiểu tế bào Cách sắp xếp tế bào 1.1 T.DT1.1 + Hình que Đơn, đôi 1.2 T.DT1.2 + Hình que Đôi, chuỗi 13 T.VL1.5 + 17 G.VL1.9 + Hình que Đơn, đôi 20 G.VL1.5 + Cầu khuẩn Đôi, chuỗi 23 T.TG1.4 + 24.1 T.TG1.3 + Hình que Đơn 35.1 T.VL4 + Cầu khuẩn Tetrad, cluster 38 T.TG1 + Cầu khuẩn Tetrad, cluster 44 KC + Hình que Đơn 50.3 DC + Hình que Đơn 50.4 DC + 50.1.1 DC + Hình que Đơn 50.1.2 DC + Hình que Đơn, đôi Hình 4.8.2. Mẫu 13 Hình 4.8.1. Mẫu 1.1 Hình 4.8.5. Mẫu 24.1 Hình 4.8.4. Mẫu 20 Hình 4.8.3. Mẫu 17 Hình 4.8.6. Mẫu 35.1 Hình 4.8.8. Mẫu 44 Hình 4.8.7. Mẫu 38 Hình 4.8.10. Mẫu 50.1.2 Hình 4.8.9. Mẫu 50.1.1 Hình 4.8.11. Mẫu Edwardsiella ictaluri Hình 4.8.11. Mẫu 50.3 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Sáng, N.V., N.V. Hảo, T.Đ. Trọng, N.C. Dân, Q.Đ. Thi, N.T.D. Thúy, Đ. Hùng, B.T.L. Hà, N. Điền, N.Q. Tâm, N.H. Ngân, and T.Q. Sơn. 2007. Chọn giống cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhằm tăng tỉ lệ phi lê bằng chọn lọc gia đình. Báo cáo khoa học. Hiền, N.T., N.D Thư, N.T.M. Hoàng, H.T.N. Nga, N.T.H. Vân, L.T. Tín, N.M. Thắng, L. Dupuis, N.V. Hảo (2009) Bước đầu sử dụng các chất bổ trợ khác nhau trong việc tạo vaccine bất hoạt phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra. Loan, L.T.T., Đ.Q.T. Vương, N.T. Trúc, T.N. Bảo, Đ.N. Thùy, L.D. Điền. 2007. Quan trắc, cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh một số vùng nuôi thủy sản ở các tỉnh phía nam - năm 2005. Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007. Thu, N.D., N.T.M. Hoang, L.T.B. Thuy, N.T. Hien, N.T.H. Van, N.M. Thang, and N.V. Hao. 2007. Producing test of vaccine for preventing white spot disease on tra-catfish (Pangasius hypophthalmus). Asian-Pacific Aquaculture 2007 - Meeting Abstract Bùi Quang Tề (2006), Bệnh học thủy sản.Nxb Nông Nghiệp Nguyễn Hữu Phúc, 2003. Khả năng phát triển và việc sử dụng chế phẩm vi sinh trong NTTS ở Việt Nam. Trong Tuyển tập nghề cá sông Cửu Long. Nxb Nông Nghiệp. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, Vũ Hồng Như Yến (2007) , Hổn hợp vi khuẩn phân hủy N-ACYL Hormoserine Lactone giúp nâng cao tỉ lệ sống của ấu trùng cá Turbot (Scophthalmus maximus L.)Tuyển tập nghề nuôi cá sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh, 2008. Chuyên đề 3: Các phương pháp xác định cơ chế tác động của vi khuẩn Probiotic. Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. Nguyễn Hữu Thịnh, 2007. Bài giảng môn Vi Sinh Ứng Dụng Trong NTTS. Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Văn Sáng (2009). Báo cáo hiện trạng sản xuất giống cá tra và giải pháp nâng cao chất lượng giống. Cục Nuôi Trồng Thủy Sản. Lý Thị Thanh Loan, Đỗ Quang Tiền Vương, Nguyễn Thanh Trúc, Thới Ngọc Bảo, Đặng Ngọc Thùy, Lưu Đức Điền(2007). Quan trắc, cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh một số vùng nuôi thủy sản ở các tỉnh phía nam – năm 2005. Tuyển tập Nghề Cá Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp 2007. Lương Đức Phẩm (2007), Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành. Công nghệ sinh học tập năm công nghệ vi sinh và môi trường. NXB Giáo dục, 2007 Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Trần Thạnh Phong, 2004. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm VEM dùng trong nuôi trồng thủy sản. Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về NC&ƯD KHCN trong nuôi trồng thủy sản.) Vũ Thị Thứ và cộng sự, 2004. Lên men chế phẩm sinh hoc BioF và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản. Tuyển tập Hội thảo tòan quốc về NC&ƯD KHCN trong nuôii trồng thủy sản. Nguyễn Hữu Phúc, 2003. Khả năng phát triển và việc sử dụng chế phẩm vi sinh trong NTTS ở Việt Nam. Trong Tuyển tập nghề cá sông Cửu Long. NXB Nông Nghiệp. Tài liệu Tiếng Anh Aditya Kesarcodi-Watson, Heinrich Kaspar, M.Josie Lategan, Lewis Gibson, 2008.Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes, Aquaculture 274 ( 1–14). Dong, Y.H., Gusti, A.R., Zhang, Q., Xu, J.L., Zhang, L.H., 2002.Identification of quorum-quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species. Appl. Environ. Microbiol. 68,1754– 1759. Fuqua, C., Parsek, M.R., Greenberg, E.P., 2001. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication. Annu. Rev. Genet.35, 439– 468. Gram, L., Løvold, T., Nielsen, J., Melchiorsen, J., Spanggaard, B.,2001. In vitro antagonism of the probiont Pseudomonas fluorescens strain AH2 against Aeromonas salmonicida does not confer protection of salmon against furunculosis. Aquaculture199, 1–11. Gibson, L.F., Woodworth, J., George, A.M., 1998. Probiotic activity of Aeromonasmedia on the Pacific oyster, Crassostrea gigas, when challenged with Vibrio tubiashii. Aquaculture 169, 111–120. Hansen, G.H., Sorheim, R., 1991. Improved method for phenotypical characterization of marine bacteria. J Microbiol. Methods 13, 231–241 Irianto, A., Austin, B., 2002. Use of probiotics to control furunculosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). J. Fish Dis. 25, 333–342. Maeda M (1994) Biocontrol of the larval rearing biotope in aquaculture. Bull Natl Res Inst Aquaculture 1: 71–74. Parker, R.B., 1974. Probiotics. The other half of the antibiotics story. Anim. Nutr. Health 29, 4–8. Ruiz-Ponte C, Samain JF, Sanchez JL & Nicolas JL (1999) The benefit of aRoseabacter species on the survival of scallop larvae. Mar Biotechnol 1 52 –59. Ruiz-Ponte, C., Samain, J.F., Nicolas, J.L., 1998. Antibacterial activity exhibited by the marine strain. Roseobacter sp. In: Le Gal, Y., Muller-Feuga, A. Eds., Marine Microorganisms for Industry. Proceedings of a Meeting, 17–19 September 1997, Brest, France. Actes Colloq. IFREMER No. 21, IFREMER, Plouzane, France, pp. 166–168. Verschuere, L., Rombaut, G., Sorgeloos, P., Verstraete, W., 2000.Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture.Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 655–671. Venkat HK, Sahu NP & Jain KK (2004) Effect of feeding Lactobacillus-based probiotics on the gut microflora, growth and survival of postlarvae of Macrobrachium rosenbergii (de Man). Aquaculture Res 35: 501–507. Villamil L, Figueras A, Planas M & Novoa B (2003) Control of Vibrio alginolyticus in Artemia culture by treatment with bacterial probiotics. Aquaculture 219: 43–56. Nguyen Thi Ngoc Tinh, Kristof Dierckens, Patric Sorgeloos, Petr Bossier, 2007. A Review of the Funtionality of Probiotics in the Larviculture Food Chain. Marine Biotechnology. Nguyen Thi Ngoc Tinh, R.A.Y.S. Asanka Gunasekara, Nico Boon, Kristof Diercken, Patrick Sorgeloos and Peter Boosier, 2007. N – acyl homoserime lactone – degrading microbial enrichment cultures isolated from Penaeus vannaemei shrimp gut and their Probiotic in Brachionus plicatilis culture. FEMS Microbiol Ecol 62. Balcázar, J.L., I. de Blas, I. Ruiz-Zarzuela, D. Vendrell, O. Girones, and J.L. Muzquiz. 2007. Sequencing of variable regions of the 16S rRNA gene for identification of lactic acid bacteria isolated from the intestinal microbiota of healthy salmonids. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 30:111-118. Byun, J.-W., S.-C. Park, Y. Benno, and T.-K. Oh. 1997. Probiotic effect of Lactobacillus sp. DS-12 in flounder (Paralichthys olivaceus). The Journal of General and Applied Microbiology 43:305-308. Chythanya, R., I. Karunasagar, and I. Karunasagar. 2002. Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture 208:1-10. FAO. 2008. Food and Agriculture Organization of the Unitied Nations. Fisheries Department, Fisherieds Information, Data and Statistisc Units. FISHSTATS Plus Version 2.30. Retrieved October 31, 2007 from the Word Wide Web: [Online]. Gatesoupe, F.-J. 2008. Updating the Importance of Lactic Acid Bacteria in Fish Farming: Natural Occurrence and Probiotic Treatments. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 14:107-114 Gildberg, A., and H. Mikkelsen. 1998. Effects of supplementing the feed to Atlantic cod (Gadus morhua) fry with lactic acid bacteria and immuno-stimulating peptides during a challenge trial with Vibrio anguillarum. Aquaculture 167:103-113. Gildberg, A., A. Johansen, and J. Bogwald. 1995. Growth and survival of Atlantic salmon (Salmo salar) fry given diets supplemented with fish protein hydrolysate and lactic acid bacteria during a challenge trial with Aeromonas salmonicida. Aquaculture 138:23-34. Hagi, T., D. Tanaka, Y. Iwamura, and T. Hoshino. 2004. Diversity and seasonal changes in lactic acid bacteria in the intestinal tract of cultured freshwater fish. Aquaculture 234:335-346. Hai, N.V., R. Fotedar, and N. Buller. 2007. Selection of probiotics by various inhibition test methods for use in the culture of western king prawns, Penaeus latisulcatus (Kishinouye). Aquaculture 272:231-239. Jöborn, A., J.C. Olsson, A. Westerdahl, P.L. Conway, and S. Kjelleberg. 1997. Colonization in the fish intestinal tract and production of inhibitory substances in intestinal mucus and faecal extracts by Carnobacterium sp. strain K1. Journal of Fish Diseases 20:383-392. Molina, L., F. Constantinescu, L. Michel, C. Reimmann, B. Duffy, and G. Defago. 2003. Degradation of pathogen quorum-sensing molecules by soil bacteria: a preventive and curative biological control mechanism. FEMS Microbiol Ecol 45:71-81. Pan, T.-M., C.-H. Chiu, and Y.-K. Cuu. 2002. Characterization of Lactobacillus isolates from pickled vegetables for use as dietary or pickle adjuncts. Foods Food Ingredients Journal of Japan 206:15-21. Ringo, E., and F.-J. Gatesoupe. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture 160:177-203. Ringø, E., and F.-J. Gatesoupe. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture 160:177-203. Ringø, E., H.R. Bendiksen, S.J. Gausen, A. Sundsfjord, and R.E. Olsen. 1998. The effect of dietary fatty acids on lactic acid bacteria associated with the epithelial mucosa and from faecalia of Arctic charr, Salvelinus alpinus (L.). Journal of Applied Microbiology 85:855-864. Robertson, P.A.W., C. O'Dowd, C. Burrells, P. Williams, and B. Austin. 2000. Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum). Aquaculture 185:235-243. Sáng, N.V., N.V. Hảo, T.Đ. Trọng, N.C. Dân, Q.Đ. Thi, N.T.D. Thúy, Đ. Hùng, B.T.L. Hà, N. Điền, N.Q. Tâm, N.H. Ngân, and T.Q. Sơn. 2007. Chọn giống cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhằm tăng tỉ lệ phi lê bằng chọn lọc gia đình. Báo cáo khoa học. Schrøder, K., E. Clausen, A.M. Sandberg, and J. Raa. 1980. Psychrotrophic Lactobacillus plantarum from fish and its ability to produce antibiotic substances. In: Connell, J.J. (ed), Advances in Fish Science and Technology. Fishing News Books, Farnham, Surrey, England, pp. 480–483. Son, V.M., C.C. Chang, M.C. Wu, Y.K. Guu, C.H. Chiu, and W. Cheng. 2009. Dietary administration of the probiotic, Lactobacillus plantarum, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper Epinephelus coioides. Fish Shellfish Immunol 26:691-698. Vaughan, E.E., E. Caplice, R. Looney, N. O’Rourke, H. Coveney, C. Daly, and G.F. Fitzgerald. 1994. Isolation from food sources, of lactic acid bacteria that produced antimicrobials. Journal of Applied Bacteriology 1994, 76, 11 13-1 23 76:118-123. Villamil, L., C. Tafalla, A. Figueras, and B. Novoa. 2002. Evaluation of Immunomodulatory Effects of Lactic Acid Bacteria in Turbot (Scophthalmus maximus). Clinical and Diagnostic laboratory immunology 9:1318-1323. Xu, F., T. Byun, H.-J. Dussen, and K.R. Duke. 2003. Degradation of N-acyl homoserine lactones, the bacterial quorum-sensing molecules, by acylase. Journal of Biotechnology 101:89-96. Yermolenko, E., A. Chernish, G. Aleshina, E. Cvetkova, I. Martsinkovskaya, V. Kolodjieva, and A. Suvorov. 2006. Antagonistic activity of Enterococcus faecium L3 against different groups of pathogenic streptococci. International Congress Series 1289:363-366.