Khóa luận Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn và vi nấm có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô lạc ở mức độ cao

ch hợp. Môi trường có bổ sung nấm men hoặc pepton hoặc là các axit amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 28oC) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin. 2.2.2. Sự nhiễm aflatoxin trên ngô và lạc. Cho tới nay, sự có mặt của aflatoxin được phát hiện trên nhiều loại nông sản, thực phẩm của trên 50 nước ở hầu hết các châu lục. Aflatoxin đã làm thiệt hại kinh tế cho nghành trồng trọt và chăn nuôi rất lớn [9]. Theo đánh giá của FAO, hiện tại ước lượng có khoảng 25% tất cả các loại ngũ cốc bị ảnh hưởng bởi độc tố nấm mốc [10]. Mặc dù aflatoxin được tìm thấy trên nhiều loại lương thực, thực phẩm khác nhau nhưng hầu hết sự nhiễm tập trung được xác định trên lạc và trên ngô là chủ yếu. * Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc trên thế giới Những nghiên cứu của Ablas K. và cộng sự [13] cho thấy sự nhiễm aflatoxin trên ngô do nấm Aspergillus flavus gây nên là vấn đề nghiêm trọng ở các vùng trồng ngô của đồng bằng Missisipi của Mỹ. Trong 3 năm nghiên cứu từ 2000 đến 2002, các tác giả đã nghiên cứu mức nhiễm A.flavus trên ngô hạt năm 2000 dao động từ 0 -100% (trung bình là 15% hạt ngô bị nhiễm), hàm lượng aflatoxin trong ngô dao động từ 0 đến 1590 ppb (trung bình là 57ppb). Mức nhiễm aflatoxin phân bố ngẫu nhiên trong ngô ngoài đồng không tương quan với với sự nhiễm A.flavus. Tuy nhiên, 84% A.flavus phân lập từ các hạt ngô có khả năng tạo aflatoxin. Ở Thái Lan, 35% mẫu ngô nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 400μg/kg) trong khi 40% mẫu nhiễm aflatoxin B1 (mức trung bình 133μg/kg) đã được tìm thấy ở Uganda và 97% mẫu ở đảo Cebu, Philippin trung bình 213μg/kg [18]. Theo Goto và cộng sự [12], 80 -85% số mẫu ngô thu thập từ các kho bảo quản trong mùa mưa 1984 – 1985 ở Thái Lan đã nhiễm aflatoxin B1 với liều lượng 6,30 – 1310 ppb. Còn đối với lạc, trong năm 1973, nghiên cứu về lạc bóc vỏ ở nước Mĩ cho thấy 15% của 361 mẫu có aflatoxin giới hạn từ vết đến 50μg/kg. Stoloff, Krof và Hald đã tìm thấy aflatoxin ở 86,5% của 52 mẫu của các sản phẩm lạc nhập vào Đan Mạch làm thức ăn gia súc, một mẫu có 3,465μg/kg. Các aflatoxin đã tìm thấy ở 41% số mẫu của tất cẩ các mẫu bơ lạc được kiểm tra năm 1967-1968, có aflatoxin với giá trì 155μg/kg và giá trị trung bình 500μg/kg. * Tình hình nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở Việt Nam Ở nước ta cũng đã có một số tác giả nghiên cứu về mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự đã nghiên cứu và thấy rằng mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô miền Nam và miền Bắc Việt Nam là tương đối cao, từ 73,3% đến 95,8% trong đó hàm lượng aflatoxin trung bình cao nhất là 63,8 ppb và hàm lượng aflatoxin trung bình thấp nhất là 16,25% ppb đối với các tỉnh khác nhau [3]. Đậu Ngọc Hào [6] xác định tỉ lệ nhiễm aflatoxin B1 trong 168 mẫu nguyên liệu sản xuất thức ăn chăn nuôi, tỉ lệ nhiễm trên ngô hạt là 33%, ngô bột là 74,2%, khô lạc là 84,7%. Theo kết quả nghiên cứu của Viện y tế cộng đồng TPHCM gần 95% thức ăn gia súc có chứa aflatoxin B1, bên cạnh đó thực phẩm sử dụng cho con người cũng có chứa loại độc tố này (68% mẫu lạc và các sản phẩm từ lạc) [8]. Ngoài ra còn có Đặng Hồng Miên nghiên cứu sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc [5]. 2.2.3. Độc tính của aflatoxin Aflatoxin là một độc tố rất độc, nhất là aflatoxin B1. Cơ quan chịu tác động của aflatoxin lớn nhất là gan. Trong cơ thể động vật, aflatoxin gắn với ARN và AND thành dạng liên kết, cản trở việc sinh tổng hợp ADN, ARN và protein, gây đột biến dẫn đến ung thư và làm suy giảm hệ miễn dịch. Sự liên kết của aflatoxin với protein làm vô hoạt các enzym, thay đổi tính chất của ty thể, lạp thể, suy giảm quá trình hô hấp mô bào [11]. Tình trạng nhiễm độc mãn tính aflatoxin đã dẫn đến ung thư gan ở nhiều loài chuột, cá hồi, vịt và khỉ. Ngoài ra còn thấy u ở thận, túi mật, tụy, bọng đái, xương của động vật thí nghiệm [12]. Elis và Dipaolo đã chứng minh rằng việc tiêm aflatoxin B1 vào chuột theo đường bụng với liều 4μg/kg thể trọng đã gây cho thai chuột bị quái thai hoặc chết [báo cáo tổng kết]. Với những con vật bị nhiễm độc aflatoxin mãn tính chúng thường kém ăn, chậm lớn, có thể sút cân, tổn thương ở gan, gan bị tụ máu có vùng chảy máu và hoại tử, tăng sinh biểu mô ống dẫn mật. Ở hàm lượng thấp tuy không gây chết nhưng aflatoxin đã mở đường cho các bệnh truyền nhiễm xâm nhập do nó tác động làm suy giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, đáp ứng miễn dịch tế bào và cả sức đề kháng chung của cơ thể [27]. Aflatoxin có thể tác động tương hỗ với sự thiếu vitamin, thiếu protein, nhiệt độ không thuận lợi và các yếu tố truyền nhiễm để gây hại. 2.2.4. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe con người Hiện nay, vấn đề thực phẩm bị nhiễm aflatoxin đang là mối quan tâm của nhiều nhà khoa học vì nó đe dọa đến sức khỏe của con người. Aflatoxin liên quan tới bệnh ung thư gan nguyên phát ở người. Nhiều tài liệu nghiên cứu về ung thư tế bào gan chứng minh đó là bệnh chung của các vùng có lương thực bị nhiễm nấm mốc A.flavus mà chất độc là nhóm aflatoxin. Bảng 2.3 dưới đây cho thấy mối tương giữa tỉ lệ người bị mắc bệnh ung thư gan với hàm lượng aflatoxin có trên thực phẩm. Bảng 2.2. Tỉ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình có trên thực phẩm (Theo Alain Reilly, 1993) Tên nước hoặc vùng Hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm (μg/kg) Tỉ lệ người mắc ung thư gan trên 105 người/năm Vùng cao Kenya Songkha (Thái Lan) Thảo nguyên vùng cao (Thụy Sỹ) Vùng cao trung bình Kenya Thảo nguyên cao trung bình (Thụy Sỹ) Vùng thấp Kenya Thảo nguyên vùng thấp (Thụy Sỹ) MôZămbic 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 1,5 7,8 1,2 2,0 2,2 2,5 3,8 4,0 9,2 13,0 2.2.5. Giới hạn aflatoxin cho phép Trước thực trạng nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao cũng như tính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hưởng của nó đối với sức khỏe con người, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạn aflatoxin nhiễm trong lương thực, thực phẩm (bảng 2.4): Bảng 2.3. Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA Nước Giới hạn aflatoxin tối đa cho phép Loại thức ăn Mỹ 20 ppb Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau 20 ppb Hàm lượng tối đa cho phép trong thức ăn cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu bột ngô Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho người Canada 15 ppb Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số tất cả các loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 Úc 15 ppb Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tương và lạc Nhật 10 ppb Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1 100 ppb Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi Trung Quốc 5 – 20 ppb Ngũ cốc, đậu tương và dầu thực vật 10 – 50 ppb Trong các loại thực phẩm khác Châu Á 30 ppb Tất cả các loại lương thực, thực phẩm 120 ppb Trong các sản phẩm từ lạc Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy định về hàm lượng tối đa aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) được tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm (ppb). Bảng 2.4. Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam Loại vật nuôi Aflatoxin B1 Tổng số các aflatoxin Gà con từ 1 – 28 ngày tuổi < 20 <30 Nhóm gà còn lại <30 <50 Vịt con từ 1 – 28 ngày tuổi Không có <10 Nhóm vịt còn lại <10 <20 Heo con theo mẹ từ 1 – 20 ngày tuổi <10 <30 Nhóm heo còn lại <100 <200 Bò nuôi lấy sữa <20 <50 2.3. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin Vì sự nguy hiểm có thể liên quan tới sức khỏe của con người và cộng đồng do sự nhiễm các aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc, các nhà khoa học đã cố gắng tìm kiếm các phương pháp để loại trừ hay phá hủy các aflatoxin trong các sản phẩm bị nhiễm. Vấn đề phòng ngừa sự nhiễm aflatoxin có thể là đưa những biện pháp kiềm chế có lợi và có hiệu quả nhất. Nó có thể làm giảm số lớn những tổn thất lương thực do nấm mốc gây ra. Song những biện pháp như vậy là rất khó thực hiện trong thực tế vì nó phụ thuộc vào các điều kiện khí hậu và các thay đổi cần thiết trong thực tiễn bảo quản và thực tiễn nông nghiệp. Các thực nghiệm với lạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nông nghiệp về sự nhiễm aflatoxin. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến bộ đã cho thấy một thực tế là sự nhiễm aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là không thể tránh được. Vì những biện pháp phòng ngừa cực kỳ khó thực hiện trong thực tế, cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác để đạt được các thực phẩm và thức ăn gia không có aflatoxin có thể ăn được. Các phương pháp khử aflatoxin bao gồm phương pháp vật lí, phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. 2.3.1. Phương pháp vật lí * Các qui trình phân loại Phương pháp sử dụng rộng rãi nhất là loại trừ chọn lọc các phần bị nhiễm của sản phẩm. Nói rộng ra vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tính chất vật lý của sản phẩm. Các quy trình phân loại dựa trên các đặc tính như màu và kích thước của hạt… đã được sử dụng một cách khá thành công đối với lạc ăn. Phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của các hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận ra ở kích thước và hình dạng của hạt. Tuy nhiên, do cái gọi là tổn thất “lột vỏ” thì những biện pháp này không thể nói là hiệu quả 100%. * Các quy trình chiết suất bằng dung môi Việc chiết suất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện: - Aflatoxin có thể bị loại trừ hoàn toàn một cách căn bản trong điều kiện thuận lợi. - Ít có khả năng tạo những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạng từ aflatoxin. - Trong nhiều trường hợp, việc chiết suất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị mất mát chất dinh dưỡng. Nhưng việc chiết suất bằng dung môi có một số bất lợi: - Cần phải có thiết bị chiết suất dung môi đặc biệt; - Sẽ chiết suất luôn một số thành phần hòa tan cùng aflatoxin; - Giá thành của việc chiết suất cao; - Có thể mất mùi của sản phẩm xử lý. Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu suất thu hồi chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa, độc tính của dung môi, dư lượng của chúng và cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy dễ nổ và điểm sôi của dung môi. Các aflatoxin có thể được chiết suất bằng các dung môi như cloroform/nước, aceton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà không loại trừ dầu. Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hỏa/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nước, và hexan –aceton - nước. Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg. 2.3.2. Phương pháp khử độc tố bằng hóa chất Nhiều hóa chất có thể khử aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. Những hóa chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrochlorit và etanolamin. Các hóa chất dùng cho việc khử độc tố phải thỏa mãn các tiêu chuẩn sau: - Phải phá hủy hay khử aflatoxin; - Nó phải không tạo ra hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc tố hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng; - Phải phá hủy các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi chúng có thể tái nhiễm lại sản phẩm; - Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu. Tuy nhiên, nhiều hóa chất khảo sát đã không thỏa mãn tất cả những tiêu chuẩn trên, và mặc dầu chúng phá hủy các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Một số quá trình xử lý bằng hóa chất có hiệu quả trong việc phá hủy aflatoxin thỏa mãn những tiêu chuẩn trên. Những hóa chất này bao gồm hydrogen peroxit hay những hóa chất tương tự, hypochlorit, dimetylamin hay metylamin và amoniac. Trong số này, hydrogen peroxit , natri hydrixit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn. Trong khi đó, dimetylamin hay các amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu hay ngô. Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụng rộng rãi trong việc xử lý các thức ăn gia súc nhiễm aflatoxin ở nhiều nước. Về cơ chế, ở nhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biến aflatoxin B1 bởi amoniac. Ở nước ta, Nguyễn Thùy Châu đã nghiên cứu công nghệ khử độc tố aflatoxin B1 trên ngô và khô lạc bằng hóa chất. Kết quả cho thấy NH3 nồng độ 6% hoặc Ca(OH)2 có tác dụng khử 90% độc tố aflatoxin [1]. Nhưng giá xử lý bằng hóa chất này có giá thành cao, đặc biệt việc khử độc tố bằng amoniac đã để lại mùi khó chịu cho ngô và khô lạc nên khó áp dụng rộng rãi trong thực tế ở Việt Nam. 2.3.3 Khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzym hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc. 2.3.3.1. Khử nhiễm aflatoxin bằng Flavobacterium aurantiacum Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả như Claude Morro, Cotty Pitter đã cho thấy vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum có khả năng phân hủy aflatoxin. Nó có khả năng phân hủy aflatoxin một cách không trở lại cả ở môi trường rắn và môi trường lỏng. Khả năng loại trừ aflatoxin B1 của vi khuẩn này từ các thực phẩm đã được chứng minh ở các loại dầu thực vật, lạc, ngô, bơ lạc và sữa lạc. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng yếu tố có vai trò quan trọng việc phân giải alflatoxaflatoxinin B1 bằng chất chiết của Flavobacterium aurantiacum có thể là protein với các tính chất enzym. Khả năng sử dụng chất chiết protein thô từ Flavobacterium aurantiacum được tinh chế trong công nghiệp thực phẩm đã được Cộng đồng Châu Âu và cơ quan Quản lí thực phẩm và thuốc của Mĩ đề nghị như các biện pháp loại trừ aflatoxin từ các thực phẩm bị nhiễm. 2.3.3.2. Khử nhiễm aflatoxin bằng Rhizopus delemar Zhu C.R. và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng khử nhiễm aflatoxin của Rhizopus delemar bằng thực nghiệm trên chuột nhắt có nhiễm aflatoxin. Aflatoxin B1 được đưa và nước uống của chuột nhắt cái ở liều 126 μg trong một tuần và toàn thể liều thử là 3,4 mg trong thời gian 27 tuần. Chất chiết của Rhizopus delemar đã được đưa đồng thời vào nhóm chuột này bằng việc trộn dung dịch aflatoxin B1. Chuột được giết riêng biệt vào các tuần tuổi 18, 30, 38, và 52. Các ổ bệnh thay đổi tế bào gan và các mô ung thư đã được định lượng bằng kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử và bằng các phản ứng enzym. Ở nhóm chuột ăn thức ăn nhiễm aflatoxin B1, tai biến ung thư gan là 71%. Ở nhóm chuột ăn thức ăn có Rhizopus delemar cùng với aflatoxin B1, các ổ bệnh phát triển quá mức và các ổ bệnh có triệu chứng bệnh học enzym đã giảm ở tất cả các thời gian lấy mẫu chuột để thử và không có con chuột nào xuất hiện triệu chứng ung thư gan. Kết quả thực nghiệm này cho thấy rằng Rhizopus delemar có khả năng ức chế mạnh tác dụng độc và tính gây ung thư gan của aflatoxin B1. Nấm Rhizopus delemar có thể được sử dụng như biện pháp tiện lợi và hiệu quả để kiểm soát sự nhiễm độc do aflatoxin. Từ kết quả nghiên cứu này, Rhizopus delemar đã được Cộng đồng Châu Âu khuyến cáo sử dụng như một tác nhân sinh học để khử nhiễm aflatoxin trong thức ăn gia súc nói chung và khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc nói riêng. PHẦN 3 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Vật liệu * Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập 40 mẫu đất của các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Hà Tây, Hưng Yên để phân lập vi khuẩn Flavobacterium aurantiacum. * Để phân lập các chủng Rhizopus delemar có khả năng khử aflatoxin, chúng tôi đã thu thập: - 8 mẫu bánh men thuốc bắc tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Bắc Ninh - 7 mẫu xoài tại các chợ của Hà Nội - 6 mẫu quýt tại các chợ của Hà Nội - 4 mẫu gạo mốc 3.1.2. Môi trường * Môi trường M1: 5 gram pepton 2 gram cao thịt 0,2 gram cao nấm men 3 gram NaCl 20 gram aga 1000 ml nước máy pH = 7,2-7,4 Đun cho tan chảy aga, thử pH = 7,2-7,4 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. * Môi trường PDA: 200g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4500ml nước. Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây. 1000 ml dịch chiết khoai tây 20 gram glucoza 20 gram aga Đun cho tan chảy aga, thử pH = 6 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. * Môi trường Sabouraud: 40 gram glucoza 20 gram pepton 20 gram aga 1000 ml nước máy pH = 5,5 – 5,8 Đun cho tan chảy aga, thử pH = 5,5 – 5,8 rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1atm trong 30 phút. 3.1.3. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin * Na2SO4 khan (Trung Quốc) * NaHClO, Nhà máy hóa chất Việt Trì * Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc) * Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma) * Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức cho sắc ký lớp mỏng 3.1.4. Dụng cụ thí nghiệm * Buồng sắc ký lớp mỏng (chromatography tank ), Thụy Sỹ * Máy nghiền đồng thể polytron, Cộng hòa liên bang Đức * Giấy lọc Whatman No1, Chemapoli, Tiệp Khắc * Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh Nhật * Phễu chiết * Ống hút tự động 0,2ml và 0,1ml Trung Quốc * Bơm tiêm vi lượng Hamilton * Máy cô chân không * Đèn cực tím 254 nm – 366nm Camag (Thụy Sỹ) * Máy đánh sóng siêu âm * Các dụng cụ dùng cho nuôi cấy vi sinh * Máy cất quay chân không (Đức) * Tủ cấy vô trùng (Đức) * Nồi hấp tự động (Đài Loan) * Máy đánh vovtex 3.2. Phương pháp 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu đất Chọn những ruộng lúa hay ruộng rau có đất màu mỡ. Dùng dao gạt bỏ 10cm lớp đất bề mặt, lấy khoảng 20g đất cho vào túi nilon, buộc kín miệng túi. Mẫu đất phải được đánh số thứ tự, địa điểm lấy mẫu và ngày lấy mẫu. 3.2.2. Phương pháp phân lập 3.2.2.1. Phương pháp phân lập Flavobacterium aurantiacum Cân 1g đất cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9ml nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10-4 và 10-5 vào các hộp petri đã đổ môi trường M1. Dùng que chang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường M1 thạch nghiêng. 3.2.2.2.Phương pháp phân lập Rhizopus delemar - Phân lập Rhizopus delemar từ bánh men thuốc bắc: mẫu bánh men thuốc bắc được nghiền nhỏ. Cân 1g mẫu đã được nghiền nhỏ cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10-4 và 10-5 vào các hộp petri đã đổ môi trường PDA hoặc Sabouraud. Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc môi trường Saubauraud) thạch nghiêng. - Phân lập Rhizopus delemar từ các mẫu hoa quả: vỏ hoa quả được cắt thành những mảnh nhỏ. Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước cất đã khử trùng. Đánh tan trên máy đánh Vovtex 200 vòng/phút trong 30 phút. Dùng pipet hút 1ml lần lượt sang các ống nghiệm khác cũng có 9ml nước cất đã khử trùng để độ pha loãng đạt 10-5 thì dừng lại. Lấy 200 μl ở độ pha loãng 10-4 và 10-5 vào các hộp petri đã đổ môi trường PDA (hoặc môi trường Sabouraud). Dùng que trang thủy tinh trang đều cho tới khi mặt thạch khô thì dừng. Các hộp lồng được đặt vào tủ ấm 30oC, sau 2 ngày lấy ra quan sát và bắt các khuẩn lạc lẻ cấy sang môi trường PDA (hoặc môi trường Saubauraud) thạch nghiêng. 3.2.3. Phương pháp định loại Flavobacterium aurantiacum Để định loại F.aurantiacum chúng tôi dựa vào khóa phân loại của Bergey [14]. Chúng tôi tiến hành các phản ứng sinh lý như xác định khả năng di động, sắc tố tế bào, khả năng chịu muối, nhu cầu về NaCl; các phản ứng sinh hóa như khả năng thủy phân gelatin, khả năng thủy phân casein, khả năng thủy phân tinh bột, khả năng thủy phân celluloza, các khả năng lên men đường glucoza, lactoza, saccaroza, maltoza. 3.2.4. Phương pháp định loại Rhizopus delemar Để định loại các R.delemar, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng Rhizopus phân lập trên môi trường Sabouraud trong 24 giờ, sau đó tiến hành xác định các đặc điểm hình thái và cấu trúc vi học của R.delemar theo khóa phân loại của Laurone [26]. 3.2.5. Phương pháp làm tiêu bản quan sát F.aurantiacum Sử dụng phương pháp nhuộm Gram. Lấy một giọt nước cất vô trùng nhỏ lên lam kính. Dùng que cấy vòng bắt khuẩn lạc để lấy mẫu. Hòa mẫu vào giọt nước và dàn đều mẫu trên lam kính. Hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn cho khô tiêu bản sau đó nhuộm màu. Nhỏ tím gential, giữ 2 phút rồi rửa nước. Nhỏ lugol, giữ 2 phút sau đó hất đi. Tẩy màu tiêu bản bằng cồn 96o trong 30 giây sau đó rửa nhẹ qua nước. Nhỏ fushin, giữ 30 giây, rửa nước, hơ khô. Nhỏ dầu lên tiêu bản và đem quan sát dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 100. Vi khuẩn Gram dương có màu tím. Vi khuẩn Gram âm có màu hồng. 3.2.6. Phương pháp làm tiêu quan sát nấm mốc Nhỏ một giọt cồn : nước theo tỉ kệ 2 : 1 lên lam kính, dùng que cấy mốc, lấy mốc trong ống thạch nghiêng. Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên sau đó nhỏ một xanhmetylen, đậy lamen lên sau đó quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính 40. 3.2.7. Phương pháp phân tích aflatoxin Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko [18] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC) [13] có cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25 g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê (50 ml bột ngô, bột lạc lỏng) chiết suất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100 ml) và dung dịch NaCl 10% (25ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman No1. Lấy 50 ml dịch lọc và kết tủa bằng chì axetat 10% (50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman No1. 80 ml dịch lọc được chuyển vào phễu chiết để chiết suất bằng hai pha lỏng - lỏng với 40ml hexan (2 lần). Lớp nước aceton được chiết suất với 40 ml cloroform (3 lần), loại bỏ lớp nước aceton. Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100μl cloroform, giữ ở 4oC cho đến khi tiến hành định tính và định lượng aflatoxin. 25g mẫu ngô, lạc (50ml bột ngô, bột lạc lỏng 25 g mẫu ngô, lạc (50 ml bột ngô, bột lạc lỏng) Nghiền nhỏ 25ml NaCl 10% 100ml aceton Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể 50ml chì axetat 10% Lọc lấy 50ml dịch Na2SO4 khan Lọc 80ml dịch Bỏ phần dịch nổi trên Chloroform (nhắc lại 3 lần) 40 ml n-hexan (nhắc lại 2 lần) Lấy pha trên cho vào bình cầu Phễu chiết Lấy phần dịch trong Cô chân không lấy 3 ml cặn Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 4oC Ống nhót để bay hơi lấy 3 ml cặn Sơ đồ Quy trình chiết tách aflatoxin * Định tính aflatoxin : Dùng bơm tiêm vi lượng (mycrosyring) nhỏ lên sắc ký lớp mỏng 2μl, 6μl và 10 μl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép dưới 2 cm và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho đường kính ở các vết nhỏ không vượt quá 5 mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2 μl, 6 μl, 10 μl chuẩn alflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10 μl) như chuẩn trong. Hệ dung môi cho sắc ký bản mỏng một chiều là cloroform : aceton tỉ lệ 9:1. Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 4 μg alflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3 - 0,5. Phát hiện alflatoxin bằng cách phát hiện sự phát huỳnh quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối đưới đèn cực tím sóng dài ( có bước sóng 356 nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết, cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng alflatoxin. Thử xác minh alflatoxin + Thử với axit vô cơ: phun lên bản mỏng dung dịch axit H2SO4 trong nước tỉ lệ 1: 2. Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có alflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử alflatoxin ứng với độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng điều có thể xem như có alflatoxin trong mẫu thử. + Thử với axit trifluoroaxetic: chỉ áp dụng với aflatoxin B1, G1, M1. Sau khi nhỏ các vết của các mẫu thử và chuẩn aflatoxin, nhỏ lên các vết chấm của chuẩn và mẫu thử 30 μl axit trifluoroaxetic. Để phản ứng xảy ra trong 10 phút, tránh ánh sáng, sau đó chạy sắc ký trên hệ dung môi thích hợp. Aflatoxin sau khi kết hợp với axit trifluoroaxetic tạo thành một hợp chất phân cực hơn nên có Rf thấp hơn so với aflatoxin không có axit chỉ thị. Mẫu có aflatoxin sẽ tụt ngang với Rf của chuẩn so với chuẩn không chấm axit trifluoroaxetic. Đây là phản ứng chính thức được dùng để làm phản ứng thử xác minh aflatoxin của các phòng thí nghiệm trên thế giới. * Định lượng alflatoxin: Nếu alflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau: Nhỏ 10μl chất chiết với đường kính của vết không quá 5 mm, ở góc dưới bên phải của bản mỏng và cách mép 1,5 cm. Ở góc dưới bên trái cách mép 1, 2, 3 cm và 1,5 cm từ mép dưới của bản mỏng nhở 2 μl,4 μl, 6 μl theo thứ tự dung dịch chuẩn alflatoxin. Thực hiện sắc ký bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton (9:1). So sánh cường độ phát quang của các chuẩn alflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử. Bằng mắt thường định lượng alflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau: V1 . V3 .V5 . m C = —————— V2 . V4 . V6 . M Trong đó: C là nồng độ alflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phân tích ng/g (ppb) V1 là thể tích hỗn hợp nước – aceton (ml) V2 là thể tích hỗn hợp nước – aceton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – aceton và chì acetat (ml) V4 là thể tích dịch lọc sau khi làm sạch bằng chì acetat (ml) V5 là thể tích dịch chiết đã bay hơi làm sạch ở cloroform trước khi làm sắc ký bản mỏng (μl) V6 là thể tích dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (μl) m là lượng alfatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g) 3.2.6. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar 3.2.6.1. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng các chủng Flavobacterium aurantiacum Để xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc của các chủng F.aurantiacum phân lập được, chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thùy Châu, các bước tiến hành như sau: bổ sung một lượng hỗn dịch tế bào F.aurantiacum sao cho có nồng độ là 106 tế bào trên 1ml môi trường bột ngô lỏng (hoặc môi trường bột lạc lỏng) có bổ sung các chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200 ppb và tiến hành nuôi cấy ở 25oC trong 9 ngày. Ngày thứ 9 của quá trình nuôi, chúng tôi tiến hành lấy mẫu để xác định hiệu quả khử aflatoxin trên ngô (lạc) của các chủng F.aurantiacum thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin của mẫu xử lý. 3.2.6.2. Phương pháp xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng các chủng Rhizopus delemar Để xác định hiệu quả khử nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc của các chủng R.delemar phân lập được, chúng tôi tiến hành theo phương pháp của Nguyễn Thùy Châu, các bước tiến hành như sau: Bổ sung một lượng R.delemar với mật độ 106 bào tử/g vào 250 g ngô (lạc) có bổ sung các chất khoáng và một lượng aflatoxin là 200 ppb. Tiến hành nuôi cấy chủng R.delemar trên ngô hạt (lạc hạt) ở nhiệt độ …oC trong 9 ngày. Ngày thứ 9 của quá trình nuôi, chúng tôi tiến hành lấy mẫu để xác định hiệu quả khử aflatoxin trên ngô (lạc) của các chủng R.delemar thông qua việc xác định hàm lượng aflatoxin của mẫu xử lý. PHẦN 4 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập các chủng Flavobacterium aurantiacum và Rhizopus delemar 4.1.1. Phân lập các chủng F.aurantiacum từ mẫu đất ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam Từ 40 mẫu đất thu thập ở các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình và Hà Tây, dựa trên các đặc điểm sinh lý của F.aurantiacum trong khóa phân loại của Bergey, chúng tôi đã tuyển chọn sơ bộ được 12 chủng F.aurantiacum, kí hiệu từ F1 đến F12. Để có thể khẳng định 10 chủng này đúng là F.aurantiacum, dựa vào khóa phân loại của Bergey, chúng tôi tiếp tục tiến hành thử một số phản ứng sinh hóa đối với 12 chủng F.aurantiacum đã tuyển chọn sơ bộ ở trên. Bảng 4.1. Khả năng thủy phân của các chủng F.aurantiacum phân lập từ đất của một số tỉnh miền Bắc Việt Nam Tên chủng được thử Khả năng thủy phân Gelatin Casein Tinh bột Aga Celluloza F.aurantiacum F1 + + _ _ _ F.aurantiacum F2 + + _ _ + F.aurantiacum F3 _ + _ _ _ F.aurantiacum F4 + + _ _ _ F.aurantiacum F5 + + _ _ _ F.aurantiacum F6 + + _ _ + F.aurantiacum F7 + + + _ _ F.aurantiacum F8 + + _ _ _ F.aurantiacum F9 + + _ _ _ F.aurantiacum F10 + + _ _ _ F.aurantiacum F11 + + _ _ + F.aurantiacum F12 + + _ _ _ Chú thích: +: có khả năng thủy phân - : không có khả năng thủy phân Bảng 4.1 cho thấy, trong số 12 chủng F.aurantiacum được thử chúng tôi thấy có 7 chủng F.aurantiacum có khả năng thuỷ phân gelatin, casein, và không có khả năng thuỷ phân tinh bột, aga và celluloza. Điều này phù hợp với khoá phân loại của Bergey. Để việc định loại được chính xác hơn, chúng tôi tiếp tục thử khả năng lên men của các chủng này. Bảng 4.2. Khả năng lên men một số loại đường của một số chủng F.aurantiacum đã được phân lập sơ bộ Tên chủng được thử Khả năng lên men một số loại đường Glucoza Lactoza Saccaroza Maltoza F.aurantiacum F1 + _ + + F.aurantiacum F3 + _ + + F.aurantiacum F5 + _ + + F.aurantiacum F8 + _ + + F.aurantiacum F9 + _ + + F.aurantiacum F10 + _ + + F.aurantiacum F12 + + + + Chú thích: + : có khả có khả năng lên men - : không có khả năng lên men Trong số 7 chủng được thử khả năng lên men, chúng tôi nhận thấy có 6 chủng phù có đặc điểm phù hợp với đặc điểm của loài F.aurantiacum như đã miêu tả trong khóa phân loại của Bergey. Như vậy, trong tổng số 12 chủng được thử các phản ứng sinh hóa, có 6 chủng là có các đặc điểm sinh hóa phù hợp với các đặc điểm sinh hóa của loài F.aurantiacum được miêu tả trong khóa phân loại của Bergey. 6 chủng F.aurantiacum đã được định loại đó là các chủng F.aurantiacum F1, F.aurantiacum F3, F.aurantiacum F5, F.aurantiacum F6, F8 và F.aurantiacum F10. Hình 1: pHẢI THAY 4.1.2. Phân lập các chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản, thực phẩm 4.1.2.1. Kết quả phân lập các chủng R.delemar từ một số mẫu nông sản và thực phẩm thu thập ở một số tỉnh miền Bắc Kết quả phân lập một số chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản và thực phẩm thu thập tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Bắc Ninh được trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả phân lập các chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản, thực phẩm STT Loại nông sản, thực phẩm Số lượng mẫu Số chủng R.delemar phân lập được Tỉ lệ chủng R.delemar phân lập được / số mẫu (%) 1 Bánh men thuốc bắc 8 7 87,5 2 Xoài 7 4 57 3 Quýt 6 4 6 7 4 Gạo mốc 4 3 75 Tổng số 4 25 20 80 Kết quả ở bảng 4.3 cho thấy trong số 25 mẫu nông sản và thực phẩm thu thập ở chợ của một số tỉnh đã phân lập được 20 chủng Rhizopus delemar . Trong đó, từ bánh men thuốc bắc phân lập được 7 chủng, chiếm chiếm 87,5%. Từ 7 mẫu xoài phân lập được 4 chủng R.delemar , chiếm 57%. Từ quýt, số chủng R.delemar phân lập được trên tổng số mẫu là 4/6, chiếm 67%. Số chủng R.delemar phân lập được từ 4 mẫu gạo mốc là 3 chủng, chiếm 75% và tỉ lệ chủng R.delemar phân lập được / tổng số mẫu nông sản và thực phẩm thu thập được là trung bình là 80%. Mặc dù các mẫu nông sản và thực phẩm được sử dụng để phân lập R.delemar còn kém đa dạng nhưng có thể nói rằng tần suất xuất hiện của R.delemar trên nông sản và thực phẩm là rất cao, đặc biệt là trên bánh men thuốc bắc (87,5%). Để có thể khẳng định những chủng phân lập được đúng là Rhizopus delemar, chúng tôi tiến hành phân loại chủng R.delemar phân lập được. 4.1.2.2. Đặc điểm phân loại chủng R.delemar được tuyển chọn Trong số 25 mẫu nông sản và thực phẩm được khảo sát, chúng tôi phân lập được 15 chủng R.delemar. Để xác định đặc điểm phát triển của các chủng nấm mốc phân lập được đúng là của chủng R.delemar, chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng này trên môi trường Sabauroud ở nhiệt độ 28 – 30oC. Hình thái khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, bề mặt khuẩn lạc xốp, có dạng như sợi bông vải, màu trắng. Sau 28h nuôi xuất hiện các khối bào tử chín màu nâu chuyển sang màu đen. Khuẩn ty khí sinh chuyển từ màu trắng sang màu xám hoặc màu xám hơi vàng. Mặt trái khuẩn lạc màu trắng nhờ. Cấu trúc vi học của chủng R.delemar được quan sát dưới kính hiển vi điện có gắn máy chụp ảnh với độ phóng đại 100, 400 và 1000 lần. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, thành cuống nhẵn, đường kính 6 – 15 µm. Bọng bào tử có kích thước lớn, đường kính 40 – 350 µm. Bọng đỉnh giá hình cầu. bào tử nội sinh, hình tròn hoặc hình trứng, bề mặt trơn, đường kính 4-11 µm. Kết quả nghiên cứu về đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm hình thái và cấu trúc vi học của chủng nấm mốc này và đối chiếu với khóa phân loại của Larone, chúng tôi nhận thấy những chủng này giống loài R.delemar. Chúng tôi khẳng định những chủng này đúng là chủng R.delemar để thuận thuận tiện cho những nghiên cứu về sau. Chúng tôi đã tuyển chọn 10 chủng R.delemar đại diện cho 25 chủng đã phân loại ở trên. Đặc điểm hình thái và cấu trúc vi của 10 chủng R.delemar được miêu tả dưới đây. - Chủng R. delemar R1: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, khuẩn lạc màu trắng, màu xám. Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 4-5μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 70 - 75μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 4-6μm. - Chủng R. delemar R2: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, màu xám. Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 4-5μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 70 - 80μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 9-10μm. - Chủng R. delemar R3: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, màu xám. Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 4-5μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 80 - 85μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 9-10μm. - Chủng R. delemar R4: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, màu xám hơi vàng . Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 4-5μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 90 - 95μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 9-11μm. - Chủng R. delemar R5: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, khuẩn lạc màu xám . Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 4-5μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 70 - 75μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 4-7μm. - Chủng R. delemar R6: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, màu xám. Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 4-5μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 60 - 70μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 5-17μm. - Chủng R.delemar R7: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, màu xám hơi vàng. Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 3-6μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 50 - 60μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 9-10μm. - Chủng R.delemar R8: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, khuẩn lạc màu trắng, màu xám. Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 5-6μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 60 - 80μm. Bào tử nội sinh, hình cầu, kích thước 9- 11μm. - Chủng R.delemar R9: Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, khuẩn lạc màu trắng, màu xám . Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 3-5μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 60 - 65μm. Bào tử nội sinh, hình cầu, kích thước 11-12μm. - Chủng R.delemar 10 : Khuẩn lạc trên môi trường Sabouroud sau 5 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC , khuẩn lạc mọc kín đĩa Petri, màu xám hơi vàng. Mặt trái khuẩn lạc có màu trắng nhợt. Cuống sinh bào tử nhẵn, đường kính 5-6μm. Túi mang bào tử lớn, hình cầu, kích thước 70 - 80μm. Bào tử nội sinh, hình cầu hay hình trứng, kích thước 8-10μm. Hình 2: Đặc điểm hình thái của chủng R.delemar phân lập được từ mẫu bánh men thuốc bắc Hình 3: Cấu trúc vi học của chủng R.delemar R1 phân lập được từ mẫu bánh men thuốc bắc Hình 4.:Hình ảnh bào tử của chủng R.delemar phân lập được từ mẫu bánh men thuốc bắc 4.2.3. Khả năng khử aflatoxin trên ngô của một số chủng F.aurantiacum và R.delemar đã phân lập Việc sử dụng các chủng vi khuẩn F. auratiacum và vi nấm R.delemar không có hại cho con người mà lại có khả năng khử nhiễm aflatoxin trên ngô lạc ở mức độ cao là biện pháp lý tưởng. Biện pháp này thành công sẽ giúp làm giảm tổn thất nông sản sau thu hoạch , tăng giá trị nông sản, từ đó đẩy mạnh sản xuất trong nước và tăng khả năng cạnh tranh các mặt hàng nông sản của nước ta trên thị trường quốc tế. Các chủng F.aurantiacum và R.delemar có khả năng khử aflatoxin này cần đảm bảo tính an toàn cho thực phẩm đồng thời không gây độc hại với con người. 4.2.4. Khả năng khử aflatoxin trên ngô của một số chủng Flavobacterium được tuyển chọn Từ 7 chủng F.aurantiacum đã được định loại ở trên, chúng tôi đã tuyển chọn được 4 chủng F.aurantiacum có khả năng khử nhiễm aflatoxin trên ngô ở mức độ cao. Bảng 4.4 dưới đây thể hiện khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô ở mức độ cao của 4 chủng này. Bảng 4.4. Hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng các chủng F.aurantiacum đã tuyển chọn STT chủng Kí hiệu chủng F.aurantiacum Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lí bằng chủng F.aurantiacum (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lí bằng chủng F.aurantiacum (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin (%) 1 F1 200 20 90 2 F8 200 40 80 3 F9 200 74 63 4 F12 200 60 70 Kết quả ở các bảng trên cho thấy việc sử dụng các chủng F.aurantiacum đã khử được lượng aflatoxin nhiễm trên ngô một cách đáng kể. Hàm lượng aflatoxin trong mẫu từ 200ppb trước khi xử lý giảm xuống còn 20ppb sau khi xử lý, tức là hiệu quả khử aflatoxin đạt từ 63 đến 90%. Trong số các chủng tuyển chọn có chủng F.aurantiacum F1 đã có tác dụng khử aflatoxin rõ rệt nhất, hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô của chủng này lên tới 90%. 4.2.5. Khả năng khử aflatoxin trên ngô của một số chủng Rhizopus delemar được tuyển chọn Bảng 4.6. Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng các chủng R.delemar đã tuyển chọn STT chủng Kí hiệu chủng R.delemar Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lí bằng chủng R.delemar (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lí bằng chủng R.delemar (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin (%) 1 R1 200 50 75 2 R2 200 16 92 3 R3 200 60 70 4 R4 200 44 78 5 R5 200 42 79 6 R6 200 62 69 Từ 6 chủng R.delemar đã tuyển chọn có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên ngô ở mức độ cao đó là cacs chủng R1, R2, R3, R4, R5, R6 . Kết quả ở các bảng 4.5 cho thấy việc sử dụng các chủng R.delemar đã khử được lượng aflatoxin nhiễm trên ngô một cách đáng kể. Hàm lượng aflatoxin trong mẫu giảm từ 200ppb trước xử lý xuống còn 22ppb sau xử lý, tức là hiệu quả khử aflatoxin đạt từ 69 đến 92%. Trong số các chủng khảo sát có chủng R.delemar R2 có tác dụng khử aflatoxin trên ngô rõ rệt nhất, hiệu quả khử là 92%. 4.2.6. Khả năng khử aflatoxin trên lạc của một số chủng Flavobacterium aurantiacum Bảng 4.6. Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng các chủng F.aurantiacum đã tuyển chọn STT chủng Kí hiệu chủng F.aurantiacum Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc trước khi xử lí bằng chủng F.aurantiacum (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu lạc sau khi xử lí bằng chủng F.aurantiacum (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin (%) 1 F1 200 28 86 2 F4 200 34 83 3 F5 200 80 60 Từ 6 chủng F.aurantiacum đã được định loại, chúng tôi đã tuyển chọn được 3 chủng F.aurantiacum có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên lạc ở mức độ cao. Kết quả ở các bảng 4.6 cho thấy việc sử dụng các chủng F.aurantiacum đã khử được lượng aflatoxin nhiễm trên lạc một cách đáng kể. Hàm lượng aflatoxin trong mẫu giảm từ 200ppb trước khi xử lý xuống còn 28ppb sau khi sử lý, tức là hiệu quả khử aflatoxin đạt từ 60 đến 86%. Trong số các chủng khảo sát có 1 chủng đã có tác dụng khử aflatoxin rõ rệt là chủng F.aurantiacum F1, hiệu quả khử aflatoxin của các chủng này là 86% Bảng 4.10. Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng các chủng R.delemar đã tuyển chọn STT chủng Kí hiệu chủng R.delemar Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô trước khi xử lí bằng chủng R.delemar (ppb) Hàm lượng aflatoxin trong mẫu ngô sau khi xử lí bằng chủng R.delemar (ppb) Hiệu quả khử aflatoxin (%) 1 R1 200 36 82 2 R2 200 22 89 3 R3 200 64 68 4 R4 200 46 77 5 R5 200 54 73 6 R6 200 48 76 Kết quả ở các bảng trên cho thấy việc sử dụng các chủng R.delemar đã khử được lượng aflatoxin nhiễm trên ngô một cách đáng kể từ 200ppb trước xử lý xuống còn 22 ppb sau, tức là hiệu quả khử aflatoxin đạt từ 68 đến 89%. Trong số các chủng khảo sát có chủng R.delemar R2 có tác dụng khử aflatoxin trên ngô rõ rệt nhất, hiệu quả khử là 89 %. PHẦN 5 - KẾT LUẬN Từ 80 mẫu đất thu thập từ một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, chúng tôi đã phân lập và định loại được 6 chủng Flavobacterium aurantiacum. Đã tuyển chọn được 4 chủng Flavobacterium aurantiacum có khả năng khử nhiễm aflatoxin trên ngô ở mức độ cao, trong đó chủng F.aurantiacum F1 có tác dụng khử aflatoxin nhiễm trên ngô rõ rệt nhất, đạt 90%. Tuyển chọn được 3 chủng F.aurantiacum có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên lạc ở mức độ cao, trong đó chủng F.aurantiacum F1 có tác dụng khử nhiễm aflatoxin trên lạc rõ rệt nhất, hiệu quả khử 86%. Từ 25 mẫu nông sản và thực phẩm thu thập thu thập tại các chợ của các tỉnh Hà Nội, Hưng Yên, Nam Định, Bắc Ninh đã phân lập được 20 chủng Rhizopus delemar. Tuyển chọn được 6 chủng R.delemar có khả năng khử aflatoxin trên ngô ở mức độ cao, trong đó chủng R.delemar R1 có tác dụng khử rõ rệt nhất, hiệu quả khử 92%. Tuyển chọn được 6 chủng R.delemar có khả năng khử aflatoxin nhiễm trên lạc ở mức độ cao, trong đó chủng R.delemar R1* có tác dụng khử rõ rệt nhất, hiệu quả khử 89%. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Thùy Châu và cộng sự (1997). Nghiên cứu mức độ nhiễm mốc aflatoxin trên ngô - Biện pháp khử độc tố. Kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp 1994 -1995. NXB Nông Nghiệp và phát triển nông thôn. Nguyễn Thùy Châu (1996). Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố (Mycotoxin) trên ngô, gạo ở Việt Nam và biện pháp phòng trừ. Luận án Phó tiến sĩ khoa học sinh học. Bộ giáo dục và đào tạo, Trường đại học Khoa học và tự nhiên. Nguyễn Thùy Châu và cộng sự (1995). Mức độ nhiễm aflatoxin trên ngô ở một số tỉnh Việt Nam. Sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học để bảo quản chế biến nông sản thu hoạch. NXB Nông nghiệp. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Đặng Hồng Miên (1982). Nấm mốc trên một số sản phẩm công nông nghiệp. Phương pháp khử và biện pháp phòng chống. NXB Khoa học và Kỹ thuật. Đậu Ngọc Hào (1992). “Thức ăn nhiễm nấm mốc và độc tố aflatoxin của chúng với gà công nghiệp”. Tạp chí Nông nghiệp và công nghệ thực phẩm Số 9. Đậu Ngọc Hào (1993). Sử dụng các hợp chất amin và NaHSO3 làm giảm hoạt tính aflatoxin B1 trong ngô hạt và dầu lạc bị nhiễm nấm mốc. Kết quả nghiên cứu khoa học chăn nuôi thú y. Độc tố nấm mốc Afflatoxin B1 trong một số loại thức ăn gia súc và thực phẩm cho người, Báo Người Lao Động, 9/1/2002. Nguyễn Phùng Tiến (1983). Nấm mốc trên một số sản phẩm thực phẩm. Luận án tiến sĩ y học. Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội. Phạm Văn Tất (1996), tác hại của Aflatoxin. Tạp chí thuốc và sức khỏe số 79 (1- 11 - 1996). Tiêu chuẩn Việt Nam 5617 – 1991. Phương pháp xác định aflatoxin ở ngũ cốc. Tiếng Anh Anderson, H. W., E. W. Nehring, and W. R. Wichser. 1973. Aflatoxin Contamination of Corn in the Field. Journal of Agriculture and Food Chemistry 23:775 - 782. AOAC (1990). Official method of analysis. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., vol.1 (The Archaea and the deeply branching and phototrophic Bacteria) (D.R. Boone and R.W. Castenholz, eds.), Springer- Verlag, New York (2001). Pp. 465 – 466. Bhat, R.V(1991), Aflatoxin Successes and Fairlures of three Decades of Research Fungi and Mycotoxins in Stored Products, ACIAR. Proceedings No 36. 1991, p80. Bryden, W. L. W. Burgess (1985), Palantpathogens and mycotoxins, pp 35 – 56. The University of Sydney, February - 1985. Butler, W.H (1964) Acute toxicity of aflatoxin Bl in rats. B. J . Cancer 18:756. Doronina, O. and Makshimenko, K. (1984). Analytical methods of detection, indentification, quantitive determination of aflatoxin in foodstuff ang fodder, FAO/ UNEP/ USSR. International training course “Training activities on food contamination control and monitoring with special reference ti mycotoxin”. Moscow. Dawson, R. J (1991), A Global view of the Mycotoxin Problame Fungi and mycotoxins, in stored prpducts ACIAR Proceedings N,.36 1991.[28tk] FAO (1990), Control of Aflatoxin in Asia, regional workshop ChengMai, Thai Lan, 2nd Feb, 1990, food ang Agricuture organization of United Nations , Rome, 51 p. FAO (2005), the State of World Fisheries and Aquaculture, 159pp pp. FAO Fhisers Deparment, Rome Italy, Rome. FAO(1995), Woldwide regulations for mycotoxins, 1995,. A mpendium FAO, Rome, Italia. Goto, T., Kawasugi S.,Tsuzuta., Okazaki H., Siriach P., Buangsawon D., ang Manabe M. (5/1986) “Aflatoxin contamination of maize in Thailand 2. Aflatoxin cotamination of maize harvested in the raining seasons of 1984 and 1985”. Proc. Jpn. Assoc. Mycotoxincol, 24, pp.53. H. K. Ablas, R.M. Zablotowicz, and M.A. Locke, Spatial variability of Aspergillus flavus soil populations under different crops and corn grain colonization and aflatoxins Can.J.Bot 82 (12); 1768-1775 (2004). Kawamura, O., et aflatoxin (1989) “Asensitive enzyme linked immunosorbent assay of ochratoxin A based on monoclonal antinbodies”. Toxicol, 27, pp.887 – 897. Larone, D. H. 1995. medically Important Fungi – A Guide to Indentification Washington, D.C. Sigrid, P (1994), Mycotoxins in animals husbandry, Biomin, Austria, P.P. 1- 28. Stoloff, L (1976), Occurrence of mycotoxis in foods and feeds. American Chemical Society, pp 23 - 43. Widstson N.W., Wilson D.M., Mc Millian W (1981). “Aflatoxin contamination of preharvest corn as influenced by timing and method of inoculation”, Envinronmental microbiology, 27, pp.249 – 251. Tài liệu từ internet Dương Thanh Liêm(2003). Vệ sinh an toàn thực phẩm (2006). Độc tố aflatoxin. LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thùy Châu - Nguyên chủ nhiệm bộ môn vi sinh Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình em thực tập để có thể hoàn thành tốt khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các bộ, kĩ thuật viên của phòng Vi sinh Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã giúp đỡ em trong thời gian vừa qua. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy, Cô của Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em tham gia thực tập và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 19 tháng 5 năm 2008 Sinh viên Nguyễn Thị Minh Châu MỤC LỤC Trang DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Tính chất hóa lý của một số aflatoxin 7 Bảng 2.2. Tỉ lệ dân số bị ung thư gan và hàm lượng aflatoxin trung bình có trên thực phẩm (Theo Alain Reilly, 1993) 11 Bảng 2.3. Giới hạn aflatoxin ở một số nước theo tiêu chuẩn của FDA 12 Bảng 2.4. Quy định về độc tố aflatoxin B1 và aflatoxin tổng số của Việt Nam 13 Bảng 4.1. Khả năng thủy phân một số cơ chất của các chủng F.aurantiacum phân lập từ đất của một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 28 Bảng 4.2. Khả năng lên men một số loại đường của một số chủng F.aurantiacum đã được phân lập sơ bộ 29 Bảng 4.3. Kết quả phân lập các chủng Rhizopus delemar từ một số mẫu nông sản, thực phẩm 31 Bảng 4.4. Hiệu quả khử aflatoxin nhiễm trên ngô bằng các chủng F.aurantiacum đã tuyển chọn 36 Bảng 4.6. Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng các chủng R.delemar đã tuyển chọn 37 Bảng 4.6. Hiệu quả khử aflatoxin trên lạc bằng các chủng F.aurantiacum đã tuyển chọn 38 Bảng 4.10. Hiệu quả khử aflatoxin trên ngô bằng các chủng R.delemar đã tuyển chọn 39