Khóa luận Tinh sạch enzyme bromelain từ thân dứa (Ananas comosus (L.) Merr.) bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

10 phút, đem đo OD tại bƣớc sóng 595nm. Từ đƣờng chuẩn suy ra hàm lƣợng protein cần phân tích (OD595 * Độ pha loãng của mẫu) b. Xác định hoạt tính protease theo phƣơng pháp Anson  Nguyên tắc Cho protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay các loại acid amin. Trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt tính enzyme protease theo định nghĩa: Hoạt tính protease đƣợc biểu thị là số micromol tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5o C, pH= 7,6) 40  Hóa chất Dung dịch Na2HPO4 1/15 M: hòa tan 2,967 g Na2HPO4.2H2O trong nƣớc thành 250 ml. Dung dịch KH2PO4 1/15 M: hòa tan 0,9072 g KH2PO4 trong nƣớc thành 100 ml. Dung dịch đệm Sorosen 1/15 M, pH 7,6: trộn 177 ml dung dịch Na2HPO4 1/15 M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15 M. Đo và chỉnh lại pH cho đúng. Dung dịch casein 1 %: đun sôi cách thủy 1 g casein trong đệm Sorensen cho đến tan hoàn toàn rồi định mức bằng Sorensen cho đủ 100 ml. Dung dịch TCA 10 %: hòa tan 10 g TCA trong nƣớc cho đủ 100 ml. Dung dịch NaOH 0,5 N: hòa tan 10g NaOH trong nƣớc cho đủ 500 ml. Dung dịch HCl 0,2 N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nƣớc cho đủ 250 ml. Dung dịch tyrosine 20 mM/l: khuấy nghiền 0,118 g tyrosine trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50 ml. Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l: pha loãng 5 ml tyrosine 20 mM/l trong HCl 0,2 N thành 100 ml.  Tiến hành Bảng 3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2 N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5 N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lƣợng tyrosine (µ mol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 660 nm. Vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo lƣợng tyrosine ở các ống. 41 Bảng 3.3 Xác định lƣợng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) casein 1% (ml) 5 5 TCA% (ml) 0 5 Dịch enzyme mẫu (ml) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,5oC, trong 30 phút TCA 10% (ml) 5 0 Dịch enzyme mẫu (ml) 0 1 Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bƣớc sóng 660nm  Cách tính Hoạt tính enzyme protease (UI) x: số µmol tyrosine suy ra từ đƣờng chuẩn V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng enzyme (11 ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1 ml) k: độ pha loãng mẫu t: thơì gian phản ứng 1UI (Anson)= 1 micromol tyrosine/ml/phút; hoặc = 1 micromol/mg/phút Hoạt tính đặc hiệu của enzyme protease (UI/mg) Từ kết quả hàm lƣợng protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (UI/ml). Tính hoạt đặc hiệu của enzyme (htđh): HT (UI) = (x.V.K)/(t.v) Số đơn vị hoạt tính mg protein enzyme HTĐH = 42 3.3.2.3. Thí nghiệm tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký trao đổi ion Hình 3.1 Hệ thống sắc ký tinh sạch protein áp suất cao BioLogic Duo-Flow (Xem chú thích các bộ phận và thông số chính của hệ thống BioLogic Duo-Flow ở phần phụ lục 3) a. Nguyên tắc Tách các phân tử dựa trên điện tích, cụ thể trong trƣờng hợp này là tách các phân tử protein dựa trên điểm đẳng điện của chúng. b. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm  Chuẩn bị cột Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng cột sắc ký trao đổi cation UNO- S nhồi sẵn do hãng Bio-rad (Mỹ) cung cấp. Nhƣ đã trình bày ở trên, điểm đẳng điện của bromelain thân khoảng 9,55 nên ta sử dụng loại cột với chất trao đổi cation. 43 UNO - S column đƣợc thiết kế phù hợp cho sắc ký sinh học với hiệu quả phân tách cao, tốc độ nhanh đối với các phân tử sinh học bao gồm protein, peptide, và polynucleotide. Chất trao đổi ion dƣơng trong cột UNO là –SO3 - . Đặc tính của cột UNO - S Thể tích cột: 1,3 ml Lƣợng protein bơm tối đa vào cột: 20 mg Tốc độ dòng khuyến cáo: 0,5-6,0 ml/phút Kích thƣớt cột: 7x35 mm Áp suất tối đa: 700/4,5/48 (psi/Mpa/bar)  Chuẩn bị dung dịch đệm Dung dịch A: dung dịch đệm acetate 50 mM, pH 5 gồm 2 thành phần amonium acetate và acid acetic. Dung dịch B: dung dịch A, bổ sung thêm lƣợng muối NaCl 1M Dung dịch đệm phải đƣợc lọc bởi màng lọc 0,2-0,45 µm trở lên và khử bọt khí ít nhất 15 phút trƣớc khi đƣa vào máy.  Chuẩn bị mẫu Lọc mẫu enzyme bromelain qua màng lọc 0,2-0,45 m sẽ làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng cột. Lƣu ý: khi bơm mẫu nên tránh bọt khí vì sẽ ảnh hƣởng đến sự phân tách của cột.  Lập quy trình các bƣớc cho máy thực hiện Muốn thiết kế một thí nghiệm tinh sạch protein trên hệ thống BioLogic DuoFlow thì phải thiết lập đƣợc quy trình các bƣớc cho máy thực hiện ổn định và có độ lặp lại cao. Phần quy trình cụ thể cho thí nghiệm tinh sạch enzyme bromelain chúng tôi trình bày ở phần kết quả và thảo luận.  Các bƣớc tiếp theo Sau khi kết nối các bộ phận của hệ thống và thiết lập quy trình xong, dùng syringe bơm mẫu vào valve AVR-7. Hệ thống sẽ thực hiện quá trình tinh 44 sạch, vẽ sắc ký đồ trên màn hình theo dõi, và tiến hành thu mẫu tự động bằng fraction collector. Kết thúc quy trình ta ghi nhận đƣợc tất cả các thông số về các peak tách ra đƣợc trên màn hình nhƣ là: độ dẫn điện; phần trăm dung dịch B; thời điểm xuất hiện các peak; OD ở các bƣớc sóng 280 nm, 260 nm. Nhƣng để thu đƣợc kết quả thống nhất chúng tôi gom các ống theo từng peak để xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính enzyme sau tinh sạch bằng phƣơng pháp Anson cải tiến. 3.3.2.4. Thí nghiệm điện di enzyme bromelain sau tinh sạch Hình 3.2 Thiết bị điện di đứng SDS-PAGE Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị hộp điện di: khuôn kính để đổ gel, lƣợc cài và hộp điện di phải đƣợc rửa sạch và lau khô bằng cồn. Sau đó ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10 % Nƣớc cất 4 ml Acrylamide 30 % 3.3 ml Tris-HCl, (pH 8,8) 2.5 ml SDS 10 % 100 μl APS 10 % 100 μl Dung dịch đƣợc trộn bằng máy khuấy từ, sau đó cho 4 μl TEMED vào dung dịch, khuấy đều và nhanh chóng dùng pipette 1000 ml cho vào khung kiếng đổ gel. Gel sẽ đƣợc bơm đến vạch cách lƣợc là 0,5 cm. Chú ý không bơm quá nhanh sẽ tạo bọt trong gel. Cẩn thận bơm tiếp một lớp nƣớc cất lên trên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel sẽ đông lại trong 20-30 phút. 45 Chuẩn bị mẫu protein Pha mẫu tỷ lệ 1:1. Cho vào ống eppendorf 100 μl mẫu protein và 100 μl dung dịch chuẩn bị mẫu nhƣ trên. Trong thí nghiệm này các mẫu protein/enzyme lấy từ dịch tủa thô acetone, peak 1 và peak 2 của quá trình tinh sạch của quy trình 1 và quy trình 3. Lắc đều và đun cách thủy ở 95oC, 5 phút. Để nguội Đổ gel tập trung Gel tập trung thƣờng đƣợc pha ở nồng độ 4 % và gel có thành phần nhƣ sau Nƣớc cất 2.7 ml Acrylamide 30 % 670 μl Tris-HCl (pH 6,8; 1 M) 2.5 ml SDS 10 % 40 μl APS 10 % 4 μl TEMED 4 μl Khuấy đều dung dịch trên máy khuấy từ. Trƣớc khi đổ gel tập trung, ta phải đổ bỏ phần nƣớc phía trên gel phân tích bằng cách nghiêng và dùng giấy thấm. Tƣơng tự gel phân tích, sau khi cho 4 μl TEMED vào, dung dịch phải đƣợc đƣa nhanh vào khung đổ gel. Dùng giấy thấm để loại hết nƣớc trên bề mặt gel phân tích. Cho gel tập trung vào, đƣa lƣợc vào lớp gel. Chú ý, lƣợc đƣợc đƣa vào cẩn thận để tránh tạo lớp bọt dƣới phía chân lƣợc. Gel tập trung sẽ đông tụ lại khoảng sau 20 phút. Đánh dấu lại các vị trí lỗ giếng. Đƣa mẫu vào các giếng Sau khi gel tập trung đông, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di. Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dƣới và bên trên bộ điện di. Cẩn thận lấy lƣợc ra và cho mẫu vào các giếng. 46 Lƣợng mẫu là 10 μl đƣa vào các lỗ giếng. Chú ý không để mẫu tràn qua các giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí các mẫu đƣa vào giếng để dễ thảo luận sau này. Chạy điện di Sau khi hoàn tất việc đƣa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại và cho dòng điện đi qua. Dòng điện chạy điện di là 25 mA / 80 V Thông thƣờng, thời gian để chạy điện di là 3 giờ. Ta có thể quan sát quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của Bromophenol Blue R-250. Nhuộm gel Gel đƣợc lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch nhuộm đã pha. Để làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ đƣợc đặt trên máy lắc. Thông thƣờng thời gian nhuộm khoảng 1 giờ. Tẩy màu Tẩy gel bằng dung dịch tẩy, ngâm gel trong dung dịch tẩy và đặt trên máy lắc 2 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu nền và các băng protein hiện rõ trên gel. Sau đó phân tích kết quả, chụp hình gel. 47 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát các tác nhân tủa Trong quá trình khảo sát các tác nhân kết tủa protein/enzyme chủ yếu dựa vào các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein và xác định hoạt tính enzyme. Vì vậy việc xây dựng đƣờng chuẩn chính xác cho các phƣơng pháp này là tối quan trọng vì nó có ảnh hƣởng rất lớn đến kết quả đo cuối cùng của sản phẩm. Sau đây là các kết quả xây dựng đƣờng chuẩn của chúng tôi. 4.1.1. Kết quả xây đƣờng chuẩn albumin theo phƣơng pháp Bradford Trong phƣơng pháp Bradford, albumin đƣợc chọn làm chất chuẩn để xác định hàm lƣợng protein tổng số của enzyme bromelain. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn albumin. Bảng 4.1 Kết quả xây đƣờng chuẩn dựa trên hàm lƣợng albumin Nồng độ albumin ( g/ml) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Độ hấp thụ OD595 0,199 0,136 0,390 0,526 0,693 0,837 0,824 0,930 0,974 Với kết quả này chúng tôi đã xây dựng đƣợc đồ thị đƣờng chuẩn nhƣ trình bày ở hình 4.1. Đồ thị cho thấy hệ số tƣơng quan R2 = 0,99472 cao (xem phần phụ lục 1) đáp ứng đƣợc yêu cầu để định lƣợng protein ở các thí nghiệm tiếp theo. Hình 4.1 Đồ thị đƣờng chuẩn albumin với hệ số tƣơng quan R2 = 0,99472 48 4.1.2. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine theo phƣơng pháp Anson Trong phƣơng pháp Anson, tyrosine đƣợc chọn làm chất chuẩn để xác định hoạt tính của enzyme bromelain. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine. Bảng 4.2. Số liệu kết quả xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine Nồng độ tyrosine ( mol) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Độ hấp thụ OD660 0,275 0,621 0,905 1,154 1,46 Với kết quả này chúng tôi đã xây dựng đƣợc đồ thị đƣờng chuẩn nhƣ trình bày ở hình 4.2. Đồ thị cho thấy hệ số tƣơng quan R2 = 0,99957 cao (xem phần phụ lục 1) đáp ứng đƣợc yêu cầu để xác định hoạt tính enzyme ở các thí nghiệm tiếp theo. Hình 4.2 Đồ thị đƣờng chuẩn tyrosine với hệ số tƣơng quan R2 = 0,99957 4.1.3. Kết quả xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme của dịch thô 97 g thân dứa đƣợc cắt lát nhỏ cho vào máy nghiền, xay nhuyễn, phá vỡ tổ chức mô  vắt, lọc bằng vải  ly tâm 4000 vòng/30 phút ở 4oC lấy dịch trong, bỏ phần cặn. Phần dịch trong sau đó bổ sung 20 mM cystein và 5 mM EDTA. Lấy 1 ml dịch thô xác định protein tổng số theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính enzyme theo phƣơng pháp Anson cải tiến. 49 Bảng 4.3 Kết quả xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme của dịch thô Lƣợng protein/1 ml (mg/ml) Hoạt tính enzyme/1 ml (UI/ml) Hoạt tính đặc hiệu (UI/mg) 0,81 9,02 11,12 (Xem kết quả đo phần phụ lục 1) Theo nghiên cứu về enzyme bromelain của quả dứa (Nguyễn Thị Thanh Mai, 1997) thì lƣợng protein/ml dịch dứa: 7,3 mg/ml. Nghiên cứu về enzyme bromelain từ phụ phẩm vỏ dứa (Dƣơng Thị Hƣơng Giang và ctv, 2002) thì lƣợng protein/ml dịch dứa: 0,39 mg/ml. Nhƣ vậy, hàm lƣợng protein/ml của enzyme bromelain thu nhận từ thân dứa cao hơn gấp 2 lần so với thu nhận từ phụ phẩm vỏ dứa nhƣng thấp hơn 9 lần thu nhận từ quả dứa. Về hoạt tính enzyme thì rất khó so sánh kết quả với các tác giả khác vì chƣa thống nhất về phƣơng pháp đo và tùy vào cơ chất tác động nhƣ casein hay gelatine. 4.1.4. Kết quả xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme của dịch tủa 4.1.4.1. Tủa với tác nhân amonium sulfate Lấy 50 ml dịch trong có bổ sung 20 mM cystein - 5 mM EDTA + 23,6 g amonium sulfate (70% bão hòa), để yên trong tủ mát 4oC khoảng 1 giờ  ly tâm 4000 vòng/30 phút ở 4oC, lấy tủa ƣớt  cân và hòa tan tủa trở lại trong đệm acetate 50 mM, pH 5. Bảng 4.4 Kết quả xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme của dịch tủa với tác nhân amonium sulfate Lƣợng tủa ƣớt thu đƣợc (g) Thể tích hòa tan tủa ƣớt (ml) Lƣợng protein/1ml (mg/ml) Hoạt tính enzyme/1ml (UI/ml) Hoạt tính đặc hiệu (UI/mg) 5,08 6,5 4,108 63,8 15,53 (Xem kết quả đo phần phụ lục 1) 50 Qua bảng 4.4 ta thấy hàm lƣợng protein/ml, hoạt tính enzyme/ml của protein – enzyme sau kết tủa (4,108 mg/ml; 63,8 UI/ml) tăng lên rõ rệt so với trƣớc khi kết tủa lần lƣợt là: 5 lần; 7 lần. Hoạt tính đặc hiệu của enzyme cũng tăng lên là 15,53 UI/mg. Lƣợng protein trên 1 ml dịch tủa amonium sulfate rất cao nhƣng hoạt tính đặc hiệu thấp điều này chứng tỏ trong dịch tủa còn lẫn nhiều muối. 4.1.4.2. Tủa với tác nhân acetone Lấy 50 ml dịch trong có bổ sung 20 mM cystein - 5 mM EDTA + 100 ml acetone lạnh (tỉ lệ 1:2), để yên trong tủ mát 4oC khoảng 1 giờ  ly tâm 4000 vòng/30 phút ở 4oC, lấy tủa ƣớt  cân và hòa tan tủa trở lại trong đệm acetate 50 mM, pH 5. Bảng 4.5 Kết quả xác định hàm lƣợng và hoạt tính protein của dịch tủa với tác nhân acetone Lƣợng protein thu đƣợc (g) Thể tích hòa tan tủa ƣớt (ml) Lƣợng protein/1ml (mg/ml) Hoạt tính enzyme/1ml (UI/ml) Hoạt tính đặc hiệu (UI/mg) 3,27 9 1,24 44,88 36,19 (Xem kết quả đo phần phụ lục 1) Qua bảng 4.5 ta thấy hàm lƣợng protein/ml, hoạt tính enzyme/ml của protein – enzyme sau kết tủa (1,24 mg/ml; 44,88 UI/ml) có tăng lên so với trƣớc khi kết tủa lần lƣợt là: 1,5 lần; 3 lần. Hoạt tính đặc hiệu của enzyme tăng lên là 36,19 UI/mg: gấp 3 lần so với trƣớc khi kết tủa. Lƣợng protein trên 1 ml dịch tủa acetone thấp nhƣng hoạt tính đặc hiệu tƣơng đối cao điều này chứng tỏ trong dịch tủa ít lẫn các protein không quan tâm. 51 4.1.4.3. Hiệu suất thu nhận enzyme bromelain thân bằng tác nhân tủa amonium sulfate và acetone ở 4oC Bảng 4.6 Hiệu suất thu nhận enzyme bromelain thân bằng tác nhân tủa amonium sulfate và acetone ở 4oC Lƣợng tủa ƣớt (mg) Lƣợng protein/1ml (mg/ml) Protein (mg) Hoạt tính trên 1 ml dịch (UI/ml) Tổng hoạt tính (UI) Hoạt tính đặc hiệu (UI/mg) Dịch thân dứa thô (50ml) 0,81 40,5 9,02 451 (100%) 11,12 Dịch tủa amonium sulfate 5080 4,108 26,7 63,8 414,7 (92%) 15,53 Dịch tủa acetone 3270 1,24 11,16 44,88 403,92 (89,56%) 36,19 Về cơ bản hai phƣơng pháp tủa amonium sulfate và acetone trải qua các giai đoạn tƣơng tự nhau. Đầu tiên xử lý nguyên liệu, phá vỡ tổ chức mô bằng cách dùng máy nghiền, rồi vắt lọc để thu dịch chiết thô có chứa bromelain, thêm vào chất bảo vệ hoạt tính và chất khử các ion kim loại nặng lần lƣợt là cystein và EDTA. Sau đó dùng 2 tác nhân amonium sulfate và acetone để gây kết tủa protein ở điều kiện 4oC. Qua bảng 4.6 cho thấy: Lƣợng tủa ƣớt thu đƣợc khi dùng tác nhân tủa là muối amonium sulfate (5,08 g) thì cao hơn khi dùng với acetone (3,27 g) đƣợc giải thích dựa trên tác nhân gây kết tủa. Với tác nhân kết tủa là dung môi hữu cơ là acetone, khi cho vào dung dịch có protein chúng làm giảm hằng số lƣỡng điện đồng thời làm tăng lực hấp dẫn giữa các phân tử protein có điện tích trái dấu và do đó gây ra kết tủa protein. Mặt khác dung môi hữu cơ acetone còn gây kết tủa protein vì chúng hòa tan nhiều trong nƣớc, tƣơng tác với nƣớc, làm giảm lƣợng nƣớc hydrate hóa liên kết các phân tử protein làm các phân tử protein tụ lại với nhau và tủa xuống. Nhƣng dung môi hữu cơ acetone còn có tác động ngƣợc lại là có 52 thể hòa tan các protein. Nhƣ vậy acetone đồng thời gây kết tủa protein nhƣng cũng làm tăng tính hòa tan của nó trong những điều kiện nhất định, dẫn đến sự làm giảm hàm lƣợng kết tủa. Trong khi đó với tác nhân kết tủa là amonium sulfate (một muối trung tính) ở nồng độ cao tác dụng gây kết tủa protein của chúng tăng lên. Vì vậy hàm lƣợng protein tổng số thu đƣợc khi dùng tác nhân tủa là muối amonium sulfate (26,7 mg) thì cao hơn khi dùng với acetone (11,16 mg). Hoạt tính tổng của protein thu đƣợc khi dùng tác nhân tủa là muối amonium sulfate (414,7 UI) thì cao hơn khi dùng với acetone (403,92 UI). Điều này có thể giải thích nhƣ sau: dung môi hữu cơ luôn có khuynh hƣớng gây biến tính protein vì các tác động dehydrate hóa protein của chúng rất mạnh, dễ dàng làm các phân tử protein bị duỗi ra, biến đổi cấu hình dẫn đến sự biến tính. Do đó để hạn chế sự biến tính của protein chúng tôi đã tiến hành quá trình này ở nhiệt độ lạnh 4oC nhằm cải thiện sự mất hoạt tính của phƣơng pháp này. Nhƣng điều này lại cho thấy sự bất lợi của phƣơng pháp tủa bằng acetone so với phƣơng pháp tủa bằng amonium sulfate vì khi sản xuất ở qui mô công nghiệp, đòi hỏi phải có thiết bị làm lạnh từ 0-4oC, hoặc thậm chí – 20 oC. Việc dùng muối làm tác nhân gây kết tủa, nếu là muối kim loại nặng, cũng có nguy cơ gây biến tính protein. Nhƣng với muối amonium sulfate là một muối trung tính, thƣờng đƣợc sử dụng vì tính hòa tan tốt và ít gây biến tính protein ngay ở nhiệt độ thƣờng. Khi so sánh hoạt tính đặc hiệu của enzyme trên 1 mg protein thu đƣợc khi dùng với tác nhân tủa là acetone (36,19 UI/mg) thì cao hơn gấp hai lần khi dùng với muối amonium sulfate (15,53 UI/mg) trong điều kiện lạnh 4oC. Ta đã biết hoạt tính đặc hiệu của enzyme trên 1 mg protein quyết định hiệu quả tác động của enzyme đối với cơ chất. Vì vậy khi tủa với tác nhân gây kết tủa protein là acetone thì sẽ hiệu quả hơn là với tác nhân là muối amonium sulfate đặc biệt trong trƣờng hợp khi cần phải tinh sạch enzyme ở các bƣớc tiếp theo. 53 Theo những tính toán đơn giản ban đầu (xem phần phụ lục 5) của chúng tôi về giá thành sản phẩm để thu nhận enzyme bromelain thô thì phƣơng pháp dùng amonium sulfate có ƣu điểm hơn so với phƣơng pháp dùng acetone. Ngoài ra, điều kiện thu nhận lại đơn giản, không đòi hỏi phải thực hiện trong điều kiện lạnh mà amonium sulfate lại là hóa chất tƣơng đối dễ kiếm, rẻ tiền. Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi đề nghị quy trình đơn giản sản xuất enzyme bromelain thô từ thân dứa: Sơ đồ 4.1 Quy trình đơn giản sản xuất enzyme bromelain thô từ thân dứa Quy trình này có thể đƣợc tính toán cho quy mô lớn hơn với lƣợng muối amonium sulfate dùng để kết tủa protein bằng 1/5 lƣợng mẫu thân dứa. Thí dụ: 2 kg thân dứa thì lƣợng muối amonium sulfate cần dùng là 0,4 kg. Sản phẩm bromelain thu đƣợc theo sơ đồ 4.1 có thể đƣợc dùng ngay để thủy phân thịt cá hoặc tinh sạch tiếp để dùng trong công nghiệp Y – Dƣợc. Tuy nhiên việc sử dụng muối amonium sulfate để thu nhận bromelain trong sản xuất quy mô lớn lại gặp hạn chế do việc rất khó tách hoàn toàn muối amonium sulfate ra khỏi tủa protein. Do đó, việc tinh sạch enzyme bromelain trong trƣờng hợp này cơ bản là loại muối. Có các phƣơng pháp loại muối có thể dùng nhƣ: thẩm tích thì diễn ra chậm (khoảng 24 giờ) và dễ bị mất hoạt tính; phƣơng pháp lọc gel thì diễn ra nhanh hơn nhƣng sản phẩm thu nhận sau 97 g thân dứa Thêm 23,6 g amonium sulfate (70% bão hòa) vào 50 ml dịch thô, để yên khoảng 1 giờ ở 4oC Ly tâm 4000 vòng/30 phút ở 4oC, lấy tủa, rửa tủa với 10 ml acetone lạnh Xay, phá vỡ tổ chức mô Vắt, lọc, ly tâm 4000 vòng/30 phút ở 4oC da Dịch thô Sản phẩm enzyme thô 54 quá trình này bị pha loãng gấp 3 – 4 lần. Ngoài ra dung dịch amonium sulfate còn gây rỉ sét kim loại và phá hủy bê tông, do đó xuất hiện vấn đề phải giải quyết phế thải. Xuất phát từ nhu cầu muốn có enzyme bromelain tinh sạch cho các ứng dụng Y- Dƣợc và do phòng thí nghiệm thuộc Trung Tâm Phân Tích – Đại Học Nông Lâm có điều kiện về thiết bị làm lạnh, hệ thống tinh sạch BioLogic DuoFlow với cột sắc ký trao đổi ion UNO-S nên chúng tôi chọn tác nhân tủa là acetone (vì không cần phải loại muối, cho hoạt tính enzyme đặc hiệu cao hơn), và tiến hành tinh sạch tiếp theo bằng sắc ký trao đổi ion. 4.2. Kết quả tinh sạch enzyme bromelain bằng hệ thống tinh sạch BioLogic DuoFlow. Các phƣơng pháp thƣờng dùng để tinh sạch enzyme bromelain phù hợp với điều kiện kinh tế cho phép nhƣ: thẩm tích loại muối, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion. Trong đó, quá trình thẩm tích diễn ra khá chậm (khoảng 24 giờ) và hiệu quả không cao, sắc ký lọc gel thì nhanh hơn nhƣng cũng phải mất hàng giờ và sản phẩm thu đƣợc sau quá trình này bị pha loãng gấp 3 – 4 lần rất khó khăn khi thu nhận sản phẩm. Đặc biệt phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích, có thể sử dụng bất kỳ lúc nào trong suốt quy trình, thƣờng dùng để tinh sạch sau cùng. Với cột trao đổi ion UNO-S chỉ mất khoảng 15 đến 30 phút để thực hiện xong quy trình. 4.2.1. Kết quả thiết lập qui trình các bƣớc cho máy BioLogic DuoFlow thực hiện. Trƣớc khi đƣa ra kết quả của quá trình sắc ký chúng tôi muốn bàn về một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tinh sạch, và bàn về kết quả thu đƣợc cho mục đích phát hiện và mục đích thu hồi. Tốc độ dòng Theo khuyến cáo của nhà sản xuất tốc độ dòng tối đa của cột là 4 ml/phút tuy nhiên theo kinh nghiệm của chúng tôi thì tốc độ dòng từ 1-2 ml/phút cho sẽ cho kết quả tốt nhất. Nếu tốc độ dòng quá nhanh thì quá trình phân tách các peak (phân đoạn) sẽ không tốt vì các protein bám sẽ rửa giải rất nhanh. Tuy nhiên, nếu chạy với tốc độ quá chậm thì thời gian của quy trình sẽ tăng lên nhiều lần. 55 Hàm lƣợng mẫu Hàm lƣợng mẫu cho vào cột cũng là 1 yếu tố quan trọng và cũng tùy vào mục đích phát hiện hay hay mục đích thu hồi sản phẩm. Xác định thể tích đƣờng gradient tuyến tính và nồng độ muối cho việc rửa giải các peak Sau đây là một số thông số đề nghị khi bắt đầu tiến hành thí nghiệm với cột UNO-S ( thể tích 1,3 ml) Rửa protein không bám (unbound protein) với 4 thể tích cột của buffer A (buffer không muối) Sự rửa giải: sử dụng gradient với 10 lần thể tích cột ở nồng độ 50 % muối của buffer B. Sau đó là sự gia tăng đồ thị gradient bởi sự tăng gradient nồng độ muối đến 100 % của buffer B với 4 thể tích cột và sau đó giữ đoạn gradient này với nồng độ muối 100 % ở 4 thể tích cột trƣớc khi cân bằng cột với 5 thể tích buffer A. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã mạnh dạn tiến hành nhiều sự thay đổi xung quanh những yếu tố đã bàn nhƣ trên. Nhƣng trong phạm vi đề tài này chúng tôi chỉ nêu ra 3 cột mốc quan trọng để đi đến kết quả của quá trình tinh sạch. Giải thích một số bƣớc của các quy trình tinh sạch Bƣớc 1: Thiết lập thu mẫu tự động 2 ml trên 1 ống nghiệm trong suốt quá trình tinh sạch bằng Fraction Collector. Bƣớc 2: Cân bằng cột với 100 % buffer A Bƣớc 3: Tự động chỉnh các thông số đo của đầu dò Quadtec-UV Vis về vị trí zero Bƣớc 4: Bơm mẫu vào vị trí valve AVR7-3 Bƣớc 5: Rửa giải protein không bám với 100 % buffer A Bƣớc 6+7: Thiết lập đƣờng gradient tuyến tính, protein „quan tâm‟ đƣợc rửa giải trong vùng này. Sự tăng giảm buffer A hay B tùy theo thiết kế thí nghiệm. Bƣớc 8+9: Cân bằng lại cột 56 Trong thí nghiệm này: Buffer A: đệm acetate 50 mM, pH 5 Buffer B: đệm acetate 50 mM, pH 5, và muối NaCl 0,5 M Ban đầu chúng tôi tiến hành thí nghiệm với quy trình sau: Quy trình 1. Nồng độ muối 0,5 M NaCl của buffer B Thể tích bơm mẫu: 0,5 ml dịch tủa acetone ứng với 0,62 mg protein cho vào cột Tốc độ dòng : 2 ml/phút Thể tích gradient: 14V cột ứng với 18,2 ml Bảng 4.7 Qui trình 1: Các bƣớc cho máy BioLogic DuoFlow thực hiện Hình 4.3 Sắc ký đồ tinh sạch enzyme bromelain thân của quy trình 1 57 Qua sắc ký đồ: Bƣớc đầu xác định đƣợc sản phẩm tinh sạch của enzyme bromelain thân thu đƣợc gồm 2 peak phân tách tốt. Nhƣng khi đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 của 2 peak này rất thấp, hàm lƣợng protein trên 1 ml thấp nên lƣợng protein thu đƣợc không đáng kể. Ở tốc độ dòng 2 ml/phút thì các peak đƣợc rửa giải ra từ ống thứ 8 đến ống 13. Vì vậy, quy trình này bƣớc đầu xác định đƣợc 2 peak tinh sạch của enzyme bromelain thân nhƣng chƣa đủ lƣợng để thu hồi sản phẩm. Điều này là do lƣợng protein đƣa vào cột còn thấp làm cho các peak thu đƣợc chỉ ở mức độ phát hiện không đủ lƣợng để làm các thí nghiệm tiếp theo. Quy trình 2 Nhận thấy lƣợng protein phát hiện quá thấp chúng tôi tăng lƣợng protein cho vào cột là 1,24 mg tƣơng ứng với thể tích cho vào cột là 1 ml dịch tủa acetone. Giảm tốc độ dòng xuống còn 1 ml/phút Tăng thể tích gradient lên 18 thể tích cột ứng với 23,4 ml vì thể tích mẫu bơm vào tăng. Bảng 4.8 Qui trình 2: Các bƣớc cho máy BioLogic DuoFlow thực hiện 58 Hình 4.4 Sắc ký đồ tinh sạch enzyme bromelain thân của quy trình 2. Qua sắc ký đồ thu đƣợc cho thấy Quá trình tinh sạch cũng thu đƣợc hai peak nhƣng chƣa rõ ràng. Điều này có thể là do lƣợng mẫu đƣa vào cột tăng thêm gấp đôi nhƣng thể tích gradient chỉ tăng lên 4 thể tích thì chƣa đủ để 2 peak phân tách hoàn toàn. Ở tốc độ dòng 1ml/phút thì các peak đƣợc rửa giải ra từ ống thứ 11 đến ống 15. Điều này cho thấy 2 peak thu đƣợc trễ hơn so với ở tốc độ dòng 2 ml/phút. Các peak có độ hấp thụ OD 280 tăng lên rõ rệt dựa vào sắc ký đồ do lƣợng mẫu đƣa vào cột tăng lên. Dựa vào đồ thị trên, chúng tôi tiếp tục tiến hành thay đổi để tách 2 peak ra rõ hơn bằng cách gia tăng thể tích rửa giải gradient lên 22 thể tích cột tƣơng ứng với 28,6 ml. Quy trình 3 Nồng độ muối 0,5 M NaCl của buffer B Thể tích bơm mẫu: 1ml dịch tủa acetone ứng với 1,24 mg protein cho vào cột Tốc độ dòng : 1 ml/phút Thể tích gradient: 22 thể tích cột ứng với 28,6 ml 59 Bảng 4.9 Qui trình 3: Các bƣớc cho máy BioLogic DuoFlow thực hiện. Hình 4.5 Sắc ký đồ tinh sạch enzyme bromelain thân của quy trình 3 Dựa vào sắc ký đồ: Quá trình tinh sạch cũng thu đƣợc hai peak rõ ràng hơn quy trình 2 Ở tốc độ dòng 1 ml/phút thì các peak đƣợc rửa giải ra từ ống thứ 11 đến ống 18. Cũng dựa vào sắc ký đồ chúng tôi tiến hành kéo dài thêm thể tích rửa giải gradient lên thành 24 thể tích cột (tƣơng ứng với 31,2 ml) nhƣng thấy rằng sự phân tách cũng giống nhƣ hình quy trình 3 nhƣng khi tiến hành gom các ống của peak 2 thì bị mất hoạt tính có lẽ là do các ống cuối cùng không phải là enzyme quan tâm nên nó ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt tính trung bình của peak 2. 60 Vì vậy chúng tôi đã chọn quy trình 3 với thể tích gradient là 22V ứng với 28,6 ml, tốc độ dòng 1 ml/phút để tiến hành nhiều lần chạy lặp lại và cho kết quả ổn định nhƣ sắc ký đồ trên. Dựa vào sắc ký đồ của quy trình 3 chúng tôi chỉ thu 12 ml enzyme tinh sạch gồm các ống của peak 1 và 2. Cụ thể là: Peak I gồm ống 13; 14; 15 với thể tích 6 ml Peak II gồm ống 16; 17; 18 với thể tích 6 ml Sau đó gom các ống thuộc cùng 1 peak đem đi xác định protein tổng số và hoạt tính enzyme sau tinh sạch. Các nghiên cứu tham khảo Kết quả nghiên cứu của Alfonso (1994) cũng chỉ ra hai phân đoạn chính của enzyme bromelain thân đƣợc tinh sạch bởi sắc ký lọc gel trên cột TSK HW-50 và sắc ký trao đổi ion trên cột TSK-SP5PW (Merck). Tiếp sau đó Andrew (1994) cũng đã tinh sạch đƣợc từ thân dứa hai phân đoạn chính của bromelain và hai phân đoạn phụ là ananain và comosain phát hiện với nồng độ rất thấp trên cột trao đổi ion Pharmacia HR 5/5 Mono S. Sau đó tiếp tục chạy sắc ký trên cột thứ hai là S-Sepharose thì phát hiện hai phân đoạn phụ rõ ràng hơn. Vì vậy thí nghiệm của chúng tôi cho kết quả phù hợp với các nghiên cứu trƣớc. 4.2.2. Kết quả của quá trình tinh sạch a. Hàm lƣợng protein và hoạt tính bromelain trƣớc tinh sạch Bảng 4.10 Hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme của dịch tủa acetone trƣớc tinh sạch Lƣợng protein/1ml (mg/ml) Hoạt tính enzyme/1ml (UI/ml) Hoạt tính đặc hiệu (UI/mg) 1,24 44,88 36.19 (Xem kết quả đo phần phụ lục 1) Các kết quả ở bảng 4.10 trích từ kết quả của bảng 4.4 do thể tích protein/enzyme đƣa vào cột UNO-S là 1 ml. 61 b. Hàm lƣợng protein và hoạt tính bromelain sau tinh sạch Bảng 4.11 Hàm lƣợng protein và hoạt tính bromelain của hai peak sau tinh sạch Lƣợng protein thu đƣợc (mg) Hoạt tính thu đƣợc (UI) Hoạt tính riêng thu đƣợc (UI/mg) Hiệu suất tinh sạch Peak I 0,3 20,06 61,84 1,71 Peak II 0,232 12,84 (Xem kết quả đo phần phụ lục 1) Nhận xét: Sau khi tinh sạch hàm lƣợng protein và hoạt tính thu đƣợc (lần lƣợt là 0,53 mg, 32,9 UI) đều giảm so với trƣớc tinh sạch (1,24 mg, 44,88 UI) nhƣng hoạt tính enzyme đặc hiệu tăng (61,84 UI/mg so với 36,19 UI/mg). Hiệu quả tinh sạch của cột ở giai đoạn này là hoạt tính đặc hiệu tăng lên 1,71 lần. Đến đây enzyme sau tinh sạch có hoạt tính đặc hiệu cao nhất chứng tỏ quy trình tinh sạch này đã đạt yêu cầu. c. Hiệu suất tinh sạch qua các giai đoạn Bảng 4.12 Hiệu suất tinh sạch qua các giai đoạn Lƣợng protein tổng (mg) Hoạt tính tổng (UI) Hoạt tính đặc hiệu (UI/mg) Dịch thô (50ml) 40,5 (100 %) 451 (100 %) 11.12 (100 %) Dịch tủa (9ml) 11,16 (27,6 %) 403,92 (89,56 %) 36.19 (323 %) Enzyme tinh sạch 4,77 (11,7 %) 296,1 (65,65 %) 61,84 (556 %) Qua bảng trên Lƣợng enzyme bromelain thu hồi đƣợc là 4,77 mg chiếm 11,7 % so với hàm lƣợng protein tổng của dịch thô ban đầu. Hoạt tính enzyme bromelain thu đƣợc là 296,1 UI chiếm 65,65 % so với tổng hoạt tính của dịch thô ban đầu. Hoạt tính đặc hiệu của enzyme bromelain thu đƣợc là 61,84 UI/mg tăng lên 5,56 lần so với hoạt tính đặc hiệu của dịch thô ban đầu. 62 Tóm lƣợc kết quả của bảng 4.12 Từ 97 gam thân dứa nhận đƣợc đƣợc 50 ml dịch thô, sau khi tủa bằng acetone thu đƣợc 9 ml dịch tủa, sau khi qua cột sắc ký nhận đƣợc 108ml dịch enzyme tinh khiết với nồng độ là 0,53 mg/ml (chiếm 11,7% protein tổng số), hiệu suất thu hồi hoạt tính 65,65 % và hoạt tính đặc hiệu của enzyme bromelain thân tăng lên 5,56 lần so với dịch thô ban đầu. Qua từng bƣớc của quá trình tinh sạch thì hoạt tính đặc hiệu của enzyme đƣợc tăng lên cho thấy của quy trình tinh sạch do chúng tôi xây dựng có hiệu quả. Tuy nhiên, cũng qua từng bƣớc của quy trình ta thấy lƣợng protein giảm đáng kể chỉ còn lại 11,7% nên ảnh hƣởng lớn đến năng suất thu hồi sản phẩm. Do đó quy trình cần đƣợc cải thiện hơn nữa để giảm sự mất mát protein và đồng thời tăng tổng hoạt tính của enzyme để hoạt tính đặc hiệu sau cùng tăng đƣợc cải thiện. 4.3. Đông khô sản phẩm - Trong khi phƣơng pháp sản xuất enzyme bromelain thô dạng bột ( bằng cách tủa dịch protein thô với muối amonium sulfate, sau đó rửa tủa hút ẩm hay sấy khô) thì lẫn amonium Sulfat nhƣng dạng này dễ vận chuyển, tồn trữ còn enzyme thu đƣợc từ cột sắc ký thì khá tinh sạch, hoạt tính cao nhƣng sản phẩm ở dạng lỏng khó cho bảo quản, vận chuyển. Xuất phát từ các ƣu, nhƣợc điểm trên và mong muốn có đƣợc sản phẩm bromelain dạng bột tinh sạch có hoạt tính cao, dễ vận chuyển, bảo quản đồng thời tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu từ phụ phẩm thân dứa chúng tôi đã mang sản phẩm sau tinh sạch bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion đông khô. - Qua 60 giờ đông khô lƣợng enzyme tinh sạch là 108 ml bằng máy Lyopro 6000 thì thu đƣợc 4,6 g enzyme dạng bột (chiếm 4,7% so với trọng lƣợng thân dứa ban đầu làm thí nghiệm) 63 Hình 4.6 Sản phẩm enzyme bromelain thân đông khô Qua khảo sát sau 4 tuần đầu hàm lƣợng và hoạt tính ban đầu của sản phẩm đông khô là không thay đổi nếu bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Cụ thể nhƣ sau: 4.3.1. Kết quả đo hàm lƣợng protein enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần. Bảng 4.13. Hàm lƣợng protein enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần. Lƣợng protein trên 1ml enzyme (mg/ml) Enzyme đông khô sau 2 tuần 0,527 Enzyme đông khô sau 4 tuần 0,531 (Xem kết quả đo phần phụ lục 1) 4.3.2. Kết quả hoạt tính enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần Bảng 4.14 Hoạt tính enzyme sau đông khô 2 tuần; 4 tuần Hoạt tính enzyme trên 1ml (UI/ml) Enzyme đông khô sau 2 tuần 32,164 Enzyme đông khô sau 4 tuần 32,322 (Xem kết quả đo phần phụ lục 1) Hoạt tính đặc hiệu của enzyme sau khi đông khô 2 tuần là 61,03 UI/mg. Hoạt tính đặc hiệu của enzyme sau khi đông khô 4 tuần là 60,87 UI/mg. Nhận xét Nhƣ vậy qua khảo sát ban đầu hàm lƣợng và hoạt tính enzyme tinh sạch sau 4 tuần đông khô là không thay đổi. 64 Do enzyme rất dễ bị mất hoạt tính trong thời gian tồn trữ và để bảo bảo vệ hoạt tính của enzyme sau này nên chúng tôi cần phải tiến hành kiểm tra thƣờng xuyên hàm lƣợng và hoạt tính của chúng cứ 2 tuần một lần trong thời gian dài. Do giới hạn về thời gian của đề tài chúng tôi chỉ khảo sát hàm lƣợng và hoạt tính enzyme tinh sạch sau 4 tuần đông khô. 4.4. Kết quả điện di xác định trọng lƣợng phân tử và độ tinh sạch Muốn biết sản phẩm sau khi thực hiện bằng phƣơng pháp sắc ký có tinh sạch hay không thì phải đƣa lên điện di SDS-PAGE để xác định trọng lƣợng phân tử và độ tinh sạch của chúng. Hình 4.7 Kết quả điện di SDS-PAGE Giếng 1 : Thang protein chuẩn Giếng 2 : Enzyme bromelain từ dịch Cayenne thân tủa acetone Giếng 3 : Enzyme bromelain từ Cayenne thân tinh sạch peakI (quy trình 1) Giếng 4 : Enzyme bromelain từ Cayenne thân tinh sạch peakII (quy trình 1) Giếng 5 : Enzyme bromelain từ Cayenne thân tinh sạch peakI (quy trình 3) Giếng 6: Enzyme bromelain từ Cayenne thân tinh sạch peakII (quy trình 3) Giếng 7 : Enzyme bromelain từ dịch Queen thân tủa acetone Giếng 8 : Enzyme bromelain từ Queen thân tinh sạch peak I Giếng 9: Enzyme bromelain từ Queen thân tinh sạch peak II 116 66.2 45.0 35.0 25.0 2 3 4 5 6 8 7 9 18.4 Ladder (kD) Các vệt bị phân giải có MW thấp 65 Bảng 4.15 Trọng lƣợng phân tử các protein chuẩn của hãng Fermentas Protein Nguồn Trọng lƣợng phân tử, kD -galactosidase E.coli 116.0 Bovine serum albumin Bovine plasma 66.2 Ovalbumin Chicken egg white 45.0 Lactate dehydrogenase Porcine muscle 35.0 Restriction endonucleaseBsp981 E.coli 25.0 -lactoglobulin Bovine milk 18.4 Trƣớc khi đƣa ra nhận xét chúng ta lƣợc khảo qua một số tài liệu nói về thành phần các phân đoạn của enzyme bromelain thân và cũng cần nhắc lại enzyme bromelain thân là tên gọi của một nhóm cystein protease đƣợc ly trích từ thân. Thành phần của bromelain thân khá phức tạp, có đến 6 loại cystein protease khác nhau đƣợc tìm thấy trong bromelain thân (Collins, 1960; Rowan và Buttle, 1994). Trong khi đó, theo Nguyễn Đức Lƣợng (2004) thì hiện tại ngƣời ta ghi nhận đƣợc trong thân dứa có tám thành phần cơ bản có hoạt tính thủy phân protein, hai phân đoạn chính đƣợc gọi là F4 và F5 đã đƣợc tinh sạch qua sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 với hoạt tính xúc tác phân giải BAEE, casein và glucagon. Theo Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme bromelain trích từ thân cây dứa và cho rằng trọng lƣợng phân tử của chúng là: 33.200-33.500 Da. Nhƣng theo Alfonso A.R. và cộng sự 1994 qua nghiên cứu thực nghiệm đã chỉ ra bromelain thân có trọng lƣợng phân tử 25.400 Da. Trong đề tài này qua sắc ký trao đổi ion âm trên cột UNO S chúng tôi cũng thu đƣợc hai phân đoạn chính có trọng lƣợng phân tử khoảng 25 kD và có hoạt tính phân giải casein mà chúng tôi đã tiến hành xác định trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cũng do giới hạn của đề tài nên chúng tôi không đi sâu vào nghiên cứu cấu trúc, phân loại các phân đoạn của enzyme bromelain từ thân. 66 Nhận xét Dựa vào điện di đồ và các protein chuẩn có trọng lƣợng phân tử đã biết ta dễ dàng nhận thấy dải băng protein duy nhất có trọng lƣợng phân tử của bromelain thân khoảng 25 kD. Các vệt có trọng lƣợng phân tử thấp có thể là do quá trình tự phân giải của enzyme bromelain khi chúng không đƣợc bổ sung chất bảo vệ hoạt tính phenylmercuric acetate (ngăn chặn sự tự phân giải trong điện di). Phenylmercuric acetate là một chất cực độc, do đó chúng tôi không sử dụng chất này khi bổ sung vào enzyme vì rất khó loại bỏ chúng. Dựa vào điện di đồ rất khó xác định cụ thể sự khác nhau giữa các band của mẫu tủa acetone và mẫu tinh sạch qua cột trao đổi ion vì phƣơng pháp điện di SDS-PAGE còn nhiều giới hạn khi áp dụng với mẫu protein. Để có thể xác định rõ hơn sự khác biệt giữa mẫu thô, mẫu tinh sạch; phát hiện một số phân đoạn bromelain khác thì cần phải nghiên cứu sâu hơn trên hệ thống điện di hai chiều. Qua các kết quả vừa trình bày nhƣ trên, chúng tôi đề nghị quy trình tinh sạch enzyme bromelain từ thân bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion theo sơ đồ nhƣ sau: 67 Sơ đồ 4.2 Quy trình tinh sạch enzyme bromelain thân bằng sắc ký trao đổi ion. Chúng tôi cũng đã tính giá tham khảo của 1 gam enzyme bromelain thân tinh sạch nhƣ sơ đồ 4.2 và so sánh với các sản phẩm enzyme của các hãng khác (xem phần phụ lục 3). Xay, phá vỡ tổ chức mô, vắt, lọc Ly tâm 4000 vòng /30 phút, ở 4oC Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme Sắc ký trao đổi ion trên cột UNO-S thể tích 1,3 ml Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme Bổ sung 20 mM cystein + 5 mM EDTA Tủa acetone với tỷ lệ 1 dịch : 2 acetone Ly tâm 4000 vòng / 30 phút, ở 4oC Lấy tủa và hòa tan trong đệm acetate 50mM, pH = 5 Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme Đông khô sau 60 giờ bằng máy Lyopro 6000 Xác định hàm lƣợng và hoạt tính enzyme hai tuần một lần Bảo quản ở nhiệt độ âm 20oC 97g thân dứa Dịch thô Dịch tủa Dịch enzyme tinh sạch 4,6 g enzyme tinh sạch dạng bột Sản phẩm enzyme dạng bột 68 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu đƣợc qua các thí nghiệm, chúng tôi đã xây dựng đƣợc 2 quy trình sản xuất enzyme bromelain thân: - Quy trình đơn giản sản xuất enzyme bromelain thô từ thân dứa bằng tác nhân tủa amonium sulfate (sơ đồ 4.1): từ 97 gam thân dứa thu đƣợc 5,08 gam sản phẩm enzyme dạng thô với hàm lƣợng protein là 26,7 mg và tổng hoạt tính enzyme là 414,7 UI và hoạt tính đặc hiệu là 15,53 UI/mg. - Quy trình tinh sạch enzyme bromelain thân bằng tác nhân tủa acetone và sắc ký trao đổi ion trên cột trao đổi ion dƣơng UNO-S (sơ đồ 4.2): Từ 97 gam thân dứa thu đƣợc 4,6 gam enzyme bromelain thân tinh khiết dạng bột với hàm lƣợng protein là 4,77 mg và tổng hoạt tính enzyme là 296,1 UI và hoạt tính đặc hiệu là 61,84 UI không thay đổi sau 4 tuần đầu đông khô. Hiệu suất tinh sạch của cột UNO đối với enzyme bromelain thân trong thí nghiệm của chúng tôi là 1,71; hoạt tính đặc hiệu của enzyme bromelain thân thu đƣợc là 61,84 UI/mg tăng lên 5,56 lần so với hoạt tính đặc hiệu ban đầu trong dịch thô là 11,12 UI/mg. Nhƣ vậy, tùy vào mục đích sản xuất, thiết bị sẵn có mà chọn tác nhân tủa cho phù hợp: - Nếu chỉ tinh sạch ở mức độ ban đầu: dịch thô đƣợc kết tủa protein sau đó rửa tủa, hút ẩm hoặc sấy khô cho sản phẩm dạng thô thì chọn tác nhân tủa là amonium sulfate - Nếu tinh sạch ở các mức độ tiếp theo: dịch thô đƣợc kết tủa protein, dịch tủa cho qua cột sắc ký, đông khô sản phẩm thì nên chọn tác nhân tủa là acetone (tinh sạch bằng hệ thống sắc ký áp suất cao BioLogic DuoFlow, đông khô bằng máy Lyopro 6000). 69 5.2. Đề nghị Tiếp tục tiến hành các thí nghiệm để nâng cao hiệu quả tinh sạch của enzyme bromelain trên cột UNO-S và các loại cột khác. Từ quy trình tinh sạch enzyme enzyme bromelain bằng phƣơng pháp trao đổi ion trên qui mô nhỏ làm cơ sở cho việc mở rộng ở quy mô lớn hơn. Muốn vậy phải kiểm tra những chỉ tiêu an toàn trong ngành dƣợc về độ tinh sạch của sản phẩm nhƣ: hàm lƣợng Pb-carbonize, arsenic, cyanure. Khảo sát các điều kiện bảo quản, các chất bảo vệ hoạt tính trong quá trình từ tủa protein, tinh sạch, đông khô sản phẩm đến tồn trữ. Trong thí nghiệm của chúng tôi với mục đích tạo enzyme tinh khiết dùng trong y dƣợc thì dùng chất bảo vệ hoạt tính là cystein . Nhƣng khi đƣa lên quy mô sản xuất lớn hơn thì nên chọn những chất dễ kiếm, rẻ tiền, và an toàn nhƣ là các đƣờng: trehalose, lactose, maltose, sucrose, fructose, glucose. Khảo sát khả năng thủy phân của enzyme sau tinh sạch trên đối tƣợng đề nghị là bánh dầu đậu nành. Kiểm định lại sản phẩm xem có đúng là enzyme bromelain thân không bởi kỹ thuật khối phổ, xem đặc tính enzyme có giống các enzyme đã nghiên cứu trƣớc đây hay có biến đổi nào không. 70 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tiến Hoà và Nguyễn Thị Bảo, 1987. Thành phần và một số tính chất của chế phẩm bromelain chồi ngọn Dứa tây (Ananas comosus L.- Group Queen). Tạp chí sinh học, 9(4), tr.3-9. 2. Dƣơng Thị Hƣơng Giang, 2004. Giáo trình thực tập công nghệ enzyme. Trƣờng Đại Học Cần Thơ. 3. Dƣơng Thị Hƣơng Giang, Lê Thanh Hùng, Võ Văn Song Toàn, Sonia Beeckmans, Edilbert Van Driessche và Trần Phƣớc Đƣờng, 2002. Đánh giá các phương pháp ly trích enzyme bromelain từ nước khóm thô. Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học, Trƣờng Đại Học Cần Thơ. 4. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.HCM. 5. Nguyễn Văn Kế, 2001. Cây ăn quả nhiệt đới, tập 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh 6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2004. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM. 7. Lê Thị Thanh Mai, 1997. Nghiên cứu về bromelain và con đường ứng dụng của chúng, luận án phó tiến sĩ sinh học. Trƣờng đại học khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia TP.HCM. 8. Trần Văn Phú, 2001. Tính toán và thiết kế hệ thống sấy. Nhà xuất bản Giáo Dục. 9. Nguyễn Tiến Thắng, 2004. Giáo trình Công nghệ enzyme. Tủ sách trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM. 10. Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Tủ sách Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 11. Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải, 2000. Kỹ thuật trồng dứa. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 71 Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 12. Alfonso A.R., Roberto A.E. 1994. Circular dichroism of stem bromelain: a third spectral class with the family of cysteine proteinases. Biochem. J. (1994) 300, 107-110. 13. Anthony J. and Cichoke D.C, 1998. bromelain. Keats Publising, Inc. New Canaan, Connecticut. 14. Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248- 254, 1976. 15. Chandler D.S and Mynott T.L, 1998. bromelain protects piglets from diarrhea caused by oral challenge with K88 positive enterotoxigenic Escherichia Coli. Gut. 43 (2): 196- 202. 16. Clive Dennison, A Guide to Protein Isolation. Kluwer Academic Publisher, New York, 2002. 17. Collins J.L. 1960. The pineapple. New York: Interscience 18. Hames, P.D.,1998. Gel electrophoresis of proteins. Apractical approad. 3thed. Oxford 19. Liang H. H., Huang H. H., Kwok K. C, 1999. Properties of tea-polyphenol-complexed bromelain. Food Research International 32, pp. 545-551. 20. Morton, J. F., Pineapple in: Major Medicinal Plants: “Botany, Culture and Uses” 21. Murachi, T., 1970. Method enzymol. 19, 273-284. 22. Nielsen P. M., Petersen D., Dambmanm C, 2001. Improved Method forDetermining Food Protein Degree of Hyrolysis. Journal of food science, Vol. 66, No. 2, pp. 642-646 23. Rajni, H.K. The workshop 2005 “ Enzyme Technology and Biosensors”. Hanoi, 03/2005. 24. Salem F. M. A., Somaya M. A. A., Seliem E. I, 1995. Manufacturing of fish sauce by proteolytic enzymes. Department of food technology in national research centre, Dokki, Cairo, Egypt. 25. Stein Ivar Aspmo, Svein Jarie Horn, Vincent G. H. Eijsink, 2004. Enzymatic hydrolysis of Atlantic cod (Gadus morhua L.) viscera. Process Biochemistry. 72 Tài liệu internet 26. ọ_Dứa 27. 28. 29. science research/chromatography 73 PHỤ LỤC 1 Các hình, bảng kết quả xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme qua các giai đoạn tinh sạch. Hình: đƣờng chuẩn albumin Hình: đƣờng chuẩn tyrosine 74 Hình: kết quả đo protein tổng số Hình: kết quả đo hoạt tính enzyme 75 Hình: đo protein tổng số của enzyme sau khi đông khô Hình: đo hoạt tính enzyme sau đông khô 76 PHỤ LỤC 2 Hình sắc ký đồ trao đổi ion trên hệ thống BioLogic DuoFlow Hình: sắc ký đồ enzyme bromelain thân trên cột UNO-S (quy trình 3) PHỤ LỤC 3 Giới thiệu hệ thống máy sắc ký Biologic Duo-Flow Hệ thống sắc ký cột lỏng tinh sạch protein BioLogic DuoFlow của hãng Bio-rad bao gồm: 1. Đầu dò QuadTec UV/Vis 2. Valve SV5-4 3. Mixers 4. Valve AVR9-8 stream select 5. Hệ thống trộn buffer BioLogic maximizer 6. Đầu dò pH 77 7. Hệ thống đầu bơm gradient kép F40 Duo Flow Workstation 8. Hệ thống thu mẫu phân đoạn BioFrac Collection 9. Valve bơm mẫu AVR 7-3 10. Cột UNO S1 11. BioLogic Rack 12. Phần mềm xử lý 13. Bộ phận nối USB Bitbus 14. Bộ điều khiển Dell Trong phạm vi giới hạn của đề tài chúng tôi chỉ đề cập đến các thông số chính của các bộ phận sử dụng: Phần mềm xử lý Hệ thống điều khiển chạy trên phần mềm BioLogic DuoFlow phiên bản 4.0 trong giao diện Window XP. Valve bơm mẫu AVR 7-3 Đây là một valve áp suất cao, nó có thể nâng áp suất lên tới 3500 psi (233 bar).Chúng tôi dùng xy lanh để bơm mẫu vào valve này. Cột UNO S1 Đây là loại cột trao đổi cation đƣợc thiết kế sẵn cho sự phân tách ở tốc độ dòng cao với áp suất ngƣợc thấp (low back pressure). Cột này đƣợc nhồi với chất nền polymer là continuous bed matrix để cải thiện sự phân giải, tốc độ và khả năng bám. Thể tích của cột là 1,3 ml. Hệ thống đầu bơm gradient kép F40 Duo Flow Workstation Tốc độ dòng: 0.01-80 ml/phút, bƣớc điều chỉnh 0.01 ml Áp lực tối đa: 3500 psi Ở đây chúng tôi sử dụng tốc độ dòng: 1 - 4 ml/phút; áp lực tối đa: 20-700 psi tƣơng thích với các thông số của cột UNO-S. Đầu dò QuadTec UV/Vis (Model Biologic Quadtec UV/Vis Detector) Chúng tôi điều chỉnh để đầu dò có thể đọc mẫu vừa ra khỏi cột đồng thời ở 4 bƣớc sóng : 214 nm, 260 nm, 280 nm, 405 nm. 78 Hệ thống thu mẫu phân đoạn BioFrac Collection Tự động thu mẫu khi kết nối với DuoFlow đƣợc điều khiển bằng phần mềm. PHỤ LỤC 4 Một số công thức pha hóa chất cho điện di SDS-PAGE 1 lit dung dịch chạy điện di có chứa 6 g Tris 28.8 g Glycerol 1 g SDS 20ml dung dịch chuẩn bị mẫu có chứa 0.6 M Tris-HCl, pH 6.8 5 ml SDS 10 % 4 ml Glycerol 98 % 2 ml -mercapthoethanol 1 ml H2O 8 ml Bromophenol blue 0.5 % 100 ml dung dịch nhuộm gel 0.1 g coomassie R-250 50 ml methanol 40 ml nhƣớc cất 10 ml acid acetic 100 % 1 lit dung dịch rửa gel 100 ml methanol 70 ml acid acetic 100 %. 830 ml nƣớc PHỤ LỤC 5 Một số tính toán giá thành sản phẩm Bảng giá hóa chất Amonium sulfate 520.000 đ/kg 79 Acetone 150.000 đ/l EDTA 376.000 đ/100g Cystein 710.000 đ/100g Amonium acetate 320.000 đ/500g Acid acetic 250.000 đ/l NaCl 245.000 đ/kg CBB G250 920.000 đ/25g Ethanol 285.000 đ/l Acid phosphoric 780.000 đ/l Albumin 1.085.000 đ/25g Na2HPO4.2H2O 265.000 đ/500g KH2PO4 280.000 đ/250g Casein 1.095.000 đ/kg NaOH 245.000 đ/kg HCl 220.000 đ/l Tyrosine 344.000 đ/25g Folin 340.000 đ/100ml Bromelain 360.000 đ/25g Giá tham khảo của enzyme bromelain của 2 quy trình enzyme thô và tinh sạch (chƣa tính khấu hao thiết bị và công lao động) Theo tính toán đơn giản ban đầu của chúng tôi giá tham khảo của 1 gam enzyme bromelain thô khi dùng với amonium sulfate là 5.200 đồng/1gam với hoạt tính đặc hiệu 15,53 UI/mg trong khi đó với acetone là 8.500 đồng/1gam với hoạt tính đặc hiệu 36,19 UI/mg. Giá tham khảo của 1 gam enzyme bromelain thân tinh sạch nhƣ sơ đồ 4.2 vào khoảng 49.700 đồng với hoạt tính đặc hiệu 61,84 UI/mg. Trong khi đó 25 gam enzyme bromelain của hãng Merck có giá 360.000 đồng với hoạt tính đặc hiệu là 2 UI/mg, nhƣ vậy tính ra 1 gam enzyme của hãng này có giá 14.000 đồng. Các tính toán cụ thể nhƣ sau: 80  Tính giá cho 1 phản ứng xác định hàm lƣợng protein tổng số -Hóa chất cho 250 phản ứng xác định hàm lƣợng protein tổng số 50 mg coomassie brilliant blue G250: 1.840 đ 23,5 g ethanol 96 o : 6.700 đ 42,5 g H3PO4 85: 33.150 đ 10 mg albumin: 434 đ -Điện, nƣớc: 8.000 đ -Tổng cộng: 50.000 đ Nhƣ vậy 1 phản ứng xác định hàm lƣợng protein tổng số có giá 200 đ.  Tính giá cho 1 phản ứng xác định hoạt tính enzyme -Hóa chất cho 20 phản ứng xác hoạt tính enzyme 2,967 g Na2HPO4.2H2O: 1.572 đ 0,9072 g KH2PO4: 1.016 đ 1 g casein: 1.095 đ 10 g TCA : 1.610 đ 10g NaOH: 2.450đ 4,25 ml HCl đậm đặc: 935 đ 0,118 g tyrosine: 1.624 đ 12ml Folin: 40.800 đ -Điện, nƣớc: 8.000 đ -Tổng cộng: 59.000 đ Nhƣ vậy 1 phản ứng xác hoạt tính enzyme có giá 2.950 đồng  Quy trình tủa enzyme thô bằng tác nhân tủa amonium sulfate (thu đƣợc 5,08g) -Hóa chất 23,6 g amonium sulfate: 12.272 đ 10ml acetone: 1500 đ 0,1 g EDTA: 376 đ 0,175 g cystein: 1.242 đ 81 -Xác định hàm lƣợng và hoạt tính: 3.150 đ -Điện, nƣớc : 8000 đ -Tổng cộng: 26.540 đ Nhƣ vậy 1 g enzyme bromelain thô đƣợc tính là: 5.200 đồng.  Quy trình tủa enzyme thô bằng tác nhân tủa acetone (thu đƣợc 3,27g) -Hóa chất 100 ml acetone: 15.000 đ 0,1 g EDTA: 376 đ 0,175 g cystein: 1.242 đ Xác định hàm lƣợng và hoạt tính: 3150 đ Hao phí điện: 8000 đ Tổng cộng: 27.768 Nhƣ vậy 1 g enzyme bromelain thô đƣợc tính là: 8.500 đồng  Quy trình tinh sạch và đông khô enzyme (thu đƣợc 4,6g) Đệm amonium acetate 0.05 M, pH 5 100 ml đệm amonium acetate đƣợc tính: 35,2 ml amonium acetate: 86,4 đ 14,8 ml acid acetic: 3.700 đ 2,925 g NaCl: 716 đ Giá tiền 100ml đệm: 4502,4 đ 1 quy trình chạy tốn 37,5 ml đệm 9 quy trình chạy tốn 337,5 ml đệm Nhƣ vậy toàn bộ chạy 9 lần chạy tốn: 14.466 đ Xác định hàm lƣợng và hoạt tính: 5*2.700= 13500 đ Hóa chất 100 ml acetone: 15.000 đ 0,1 g EDTA: 376 đ 0,175 g cystein: 1.242 đ Hao phí điện: 4000 đ + 180.000 đ(60 giờ đông khô): 184.000 đ Tổng cộng: 228.584 đ Nhƣ vậy 1g enzyme tinh sạch có giá : 49.700 đồng.