Khóa luận Tổng quan về Legionella gây bệnh trong nước

aèng söï sinh soâi cuûa Legionella trong maøng sinh hoïc chæ coù ôû amip. 3.5.4. Nhöõng yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï hình thaønh maøng sinh hoïc Ngaên caûn söï hình thaønh maøng sinh hoïc laø moät bieän phaùp quan troïng choáng laïi söï gia taêng cuûa Legionella. Ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa maøng sinh hoïc laø quan troïng bôûi khi moät khi maøng sinh hoïc ñöôïc hình thaønh thì seõ gaây khoù khaên ñeå loaïi boû töø heä thoáng phöùc taïp cuûa ñöôøng oáng. Nhieàu yeáu toá laøm taêng khaû naêng hình thaønh maøng sinh hoïc: Söï hieän dieän cuûa caùc chaát dinh döôõng trong hai tröôøng hôïp laø trong nguoàn nöôùc vaø trong vaät lieäu cuûa heä thoáng. Quy moâ vaø aên moøn. Nhieät ñoä nöôùc aám. Löu löôïng nöôùc cuûa ñöôøng oáng vaø heä thoáng phaân phoái. Söï hieän dieän cuûa quy moâ vaø söï aên moøn trong moät heä thoáng seõ laøm taêng dieän tích beà maët coù saün vaø cho pheùp söï hình thaønh cuûa microniches ñöôïc baûo veä khoûi söï khöû truøng. Quy moâ vaø söï aên moøn cuõng laøm taêng noàng ñoä caùc chaát dinh döôõng vaø caùc yeáu toá taêng tröôûng, nhö saét trong heä thoáng nöôùc. Maøng sinh hoïc khoâng ñöôïc kieåm soaùt daãn ñeán söï gia taêng Legionella. Hôn nöõa, söï hieän dieän cuûa caû maøng sinh hoïc vaø ñoäng vaät nguyeân sinh coù hieäu quaû baûo veä vi khuaån gaáp ñoâi trong heä thoáng bôûi vì noù laøm taêng chaát höõu cô vaø baát hoaït caùc thuoác khöû truøng. Theâm vaøo ñoù, maøng sinh hoïc vaø vi khuaån (caû Legionella spp) ñöôïc taêng tröôûng trong ñoäng vaät nguyeân sinh coù theå chòu ñöôïc noàng ñoä chlorine vaø caùc chaát dieät khuaån ôû noàng ñoä cao hôn noàng ñoä thöôøng söû duïng trong caùc heä thoáng nöôùc. Caùc vaät lieäu cuûa heä thoáng cuõng aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa maøng sinh hoïc. Moät soá vaät lieäu nhö oáng nöôùc cuõng hoã trôï hoaëc taêng cöôøng söï gia taêng vi sinh vaät bao goàm Legionella spp. Caùc chaát töï nhieân nhö mieáng ñeäm cao su cuõng cung caáp cô chaát neàn giaøu dinh döôõng vaø ñöôïc vi sinh vaät söû duïng ñeå taêng tröôûng. Thaäm chí, vi sinh vaät seõ phaùt trieån treân beà maët cuûa heä thoáng baèng ñoàng maø baûn thaân heä thoáng naøy coù theå khaùng laïi söï hình thaønh taäp ñoaøn, moät khi beà maët ñöôïc ñieàu hoøa. 3.6. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa Legionella 3.6.1. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä Legionella ñaõ ñöôïc phaân laäp töø heä thoáng nöôùc noùng leân tôùi 660C. Tuy nhieân, ôû nhieät ñoä treân 700C thì Legionella gaàn nhö bò phaù huûy ngay laäp töùc. Kusnetsov vaø ctv (1996) thaáy raèng söï taêng tröôûng cuûa taát caû caùc chuûng thí nghieäm giaûm khi nhieät ñoä 44 - 450C, vôùi nhieät ñoä giôùi haïn cho söï taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät töø 48,40C ñeán 50,00C. Caùc chuûng Legionella saûn xuaát dioxide carbon leân tôùi 51,60C, cho thaáy raèng moät soá enzyme vaãn toàn taïi ôû nhieät ñoä naøy. Heä thoáng nöôùc phöùc taïp chaúng haïn nhö nöôùc aám, heä thoáng oáng nöôùc, ñieàu hoøa nhieät ñoä vaø boàn taém nöôùc noùng (coøn goïi laø beå spa) laø ñieàu kieän thuaän lôïi giuùp cho Legionella taêng tröôûng. Vì vaäy, ñeå ngaên ngöøa nhieãm Legionella thì phaûi giöõ nhieät ñoä trong nöôùc laø 250C vaø nhieät ñoä lyù töôûng nhaát laø 200C. Legionella seõ toàn taïi trong thôøi gian daøi ôû nhieät ñoä thaáp vaø sau ñoù sinh soâi naûy nôû khi nhieät ñoä taêng leân neáu caùc ñieàu kieän khaùc thích hôïp. L.pneumophila laø vi khuaån chòu nhieät vaø khaû naêng chòu ñöôïc nhieät ñoä töø 500C trong vaøi giôø. Nhieät ñoä nöôùc laø moät yeáu toá quan troïng trong söï phaùt trieån cuûa Legionella. Duy trì nhieät ñoä cuûa heä thoáng nöôùc noùng vaø nöôùc laïnh trong caùc toøa nhaø ñeå ngaên ngöøa hoaëc giaûm söï taêng tröôûng cuûa Legionellae laø moät bieän phaùp kieåm soaùt quan troïng ñeå ngaên chaën nguy cô nhieãm truøng Legionella. 3.6.2. AÛnh höôûng cuûa caùc vi sinh vaät khaùc 3.6.2.1.Yeâu caàu dinh döôõng Nguoàn nöôùc laø thaønh phaàn khoâng theå thieáu nhöng khoâng ñuû ñeå L.pneumophila sinh soâi naûy nôû, ví duï trong nghieân cöùu, baèng caùch söû duïng nöôùc caát voâ truøng vaø nöôùc maùy voâ truøng thì L.pneumophila soáng soùt trong thôøi gian daøi nhöng khoâng taêng tröôûng veà maët soá löôïng. Vaø Legionella caàn caùc vi sinh vaät khaùc ñeå taêng tröôûng. Ñeå khueách ñaïi Legionella, ví duï trong töï nhieân L.pneumophila coù theå soáng soùt nhôø caùc sinh vaät khaùc vaø nhaân leân trong nöôùc maùy khoâng voâ truøng. Keát quaû naøy cho thaáy taêng tröôûng cuûa Legionella ñoøi hoûi caùc chaát dinh döôõng ñaõ coù saün trong nöôùc maùy. Caùc chaát dinh döôõng coù theå ñöôïc cung caáp tröïc tieáp hoaëc giaùn tieáp hoaëc baèng caùc loaøi vi khuaån hoaëc caùc chuûng vi sinh vaät coù lieân quan ñeå taïo neân caùc chaát höõu cô hoøa tan. Caùc keát quaû naøy phuø hôïp vôùi nghieân cöùu cho thaáy axit amin laø nguoàn dinh döôõng chính caàn cho söï taêng tröôûng L.pneumophila. Söï keát hôïp cuûa L.pneumophila vôùi nhieàu sinh vaät khaùc nhau töø nguoàn lôïi thuûy saûn ñaõ ñöôïc chöùng minh, bao goàm ñoäng vaät nguyeân sinh, Fischerella spp vaø caùc vi khuaån khaùc. 3.6.2.2.Ñoäng vaät nguyeân sinh Drozanski (1963) moâ taû kyù sinh truøng vi khuaån cuûa amip ñaõ ñöôïc phaân laäp töø ñaát nhöng khoâng phaùt trieån treân caùc moâi tröôøng nhaân taïo. Ñieàu naøy chöùng toû caùc kyù sinh truøng vi khuaån naøy laø Legionella. Rowbotham (1980) laø ngöôøi ñaàu tieân phaùt hieän moái quan heä giöõa amip vaø L.pneumophila, ñieàu ñoù coù theå chöùng minh raèng Legionella laø kyù sinh truøng noäi baøo tuøy yù. Legionella coù theå sinh tröôûng trong 14 loaøi ñoäng vaät nguyeân sinh bao goàm: Acanthamoeba, Naegleria vaø Hartmanella spp Caùc Tetrahymena pyriformis, Tetrahymena vorax, Cyclidium coù loâng rung. Moät loaøi naám moác chaát nhôøn Hôn nöõa moät nghieân cöùu cuûa Vandenesch (1990) chöùng minh raèng L.pneumophila coù theå laây nhieãm vaø taùi saûn xuaát trong amip Acanthmoeba ngay caû khi tyû leä teá baøo Legionella thaáp. Gaàn ñaây Legionella ñaõ ñöôïc phaùt hieän laø coù theå phaùt trieån trong caùc teá baøo sinh vaät ñôn baøo. Ñoäng vaät nguyeân sinh laø yeáu toá quan troïng ñoái vôùi söï soáng coøn vaø phaùt trieån cuûa Legionella trong töï nhieân vaø moâi tröôøng nhaân taïo vaø ñaõ ñöôïc phaùt hieän trong caùc moâi tröôøng lieân quan ñeán beänh Legionellosis. Trong moâi tröôøng töï nhieân L.pneumophila phaùt trieân ôû ñoäng vaät nguyeân sinh beân trong phagosome, coù theå saûn xuaát proteases gaây ñoäc teá baøo vaø laø nguyeân nhaân gaây phaù huûy moâ. Moät khi noù haáp thuï bôûi amip, söï soáng coøn cuûa L. pneumophila phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä moâi tröôøng nöôùc. ÔÛ 220C, caùc vi khuaån naøy bò tieâu huûy bôûi amip trong khi ôû 350C chuùng coù theå sinh soâi naûy nôû trong caùc amip. Nhieät ñoä cuõng taùc ñoäng ñeán söï bieåu hieän cuûa tieân mao. Tieân mao coù moät vai troø quan troïng trong quaù trình sinh beänh cuûa nhieàu vi sinh vaät, bao goàm Salmonella vaø Pseudomonas aeruginosa. Ñieàu ñoù chöùng toû raèng Legionella khoâng coù tieân mao ít coù khaû naêng laây nhieãm treân ñoäng vaät nguyeân sinh vaø caùc ñaïi thöïc baøo hôn caùc chuûng hoang daïi coù tieân mao. Ñoäng vaät nguyeân sinh giuùp baûo veä Legionella töø nhöõng aûnh höôûng cuûa chaát dieät khuaån vaø nhieät khöû truøng. Legionella coù theå toàn taïi trong teá baøo amip vaø ñoù coù theå laø moät cô cheá maø Legionella pneumophila coù theå toàn taïi trong caùc ñieàu kieän baát lôïi veà moâi tröôøng vaø toàn taïi trong caùc haït khoâng khí . 3.6.3. Caùc yeáu toá moâi tröôøng vaø ñoäc tính Caùc yeáu toá ñoäc tính cuûa Legionella cuõng bò aûnh höôûng bôûi caùc yeáu toá moâi tröôøng chaúng haïn nhö nhieät ñoä, dinh döôõng vaø noàng ñoä Na. 3.7. Caùc nguoàn nhieãm Legionella. 3.7.1. Dòch beänh laây lan qua bình xòt vaø hít Vai troø cuûa aerosol töø heä thoáng phaân phoái nöôùc uoáng bò oâ nhieãm daãn ñeán legionellosis laø cuõng ñöôïc thaønh laäp. Caùc chöông trình thaûo luaän veà aerosol taïo heä thoáng ñaõ ñöôïc lieân keát vôùi truyeàn daãn chaúng haïn nhö thaùp laøm maùt, xaây döïng heä thoáng laøm maùt, xaây döïng heä thoáng nöôùc, thieát bò trò lieäu vaø boàn taém noùng. Möa raøo laø nguoàn duy nhaát cuûa bình xòt lieân keát vôùi nosocomial legionellosis. Tuy nhieân, caùc cöûa haøng nöôùc, thieát bò hoâ haáp vaø nebulizers ñaõ ñöôïc laáp ñaày hoaëc röûa saïch baèng nöôùc maùy cuõng coù theå laây lan Legionella vaø coù baùo caùo nhö moät nguoàn laây nhieãm trong moät vaøi tröôøng hôïp. Caùc dòch lôùn nhaát cuûa beänh cho ñeán nay coù taát caû ñöôïc keát hôïp vôùi söï truyeàn cuûa aerosol töø caùc loaïi thieát bò. Thaùp giaûi nhieät laø moät vaán ñeà cuï theå, vôùi moät baùo caùo cho raèng thaùp laøm maùt laø 28% cuûa taát caû caùc tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis. Caùc heä thoáng khaùc lieân quan ñeán söï laây lan cuûa legionellosis qua aerosol trong nöôùc bao goàm heä thoáng oáng nöôùc, phun söông caùc thieát bò lieân quan, nhöõng thöïc phaåm hieån thò trong nhöõng suoái nöôùc noùng vaø nhöõng suoái khoaùng töï nhieân. 3.7.2. Dòch beänh laây lan qua ñaát Caùc taøi lieäu veà tieâu chuaån Legionella 1985 baùo caùo raèng Legionella ñaõ ñöôïc phaân laäp töø buøn vaø caùt, ñaát aåm beân bôø suoái coù chöùa vi khuaån. Vaên baûn 1985 söï thieáu ñaát cuõng tham gia vaøo vieäc Legionella laây sang ngöôøi maëc duø coù söï roái loaïn vôùi moät soá dòch beänh Legionella veà ñaát. Taïi thôøi ñieåm ñoù, Legionella chæ ñöôïc phaân laäp töø buøn vaø ñaát aåm (EPA 1985). Trong moät soá tröôøng hôïp taøi lieäu veà beänh legionellosis do Legionella gaây ra thì nguyeân nhaân vaø khaû naêng maéc beänh ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong caùc chaäu ñaát. Haàu heát caùc baùo caùo veà nguoàn goác gaây beänh ñöôïc bieát ñeán töø naêm 1990. Gaàn ñaây, moät trong nhöõng loaøi ñaõ ñöôïc tìm thaáy thì L.longbeachae sinh soáng vaø phaùt trieån maïnh trong chaäu ñaát. Sau moät oå dòch legionellosis do L.longbeachae taïi Nam UÙc vaøo naêm 1988 vaø 1989 thì Steele et al.,1990 ñaõ phaân tích moät soá maãu nöôùc vaø caùc maãu ñaát ñeå tìm nguoàn goác L.longbeachae. Keát quaû laø L.longbeachae khoâng ñöôïc coâ laäp töø baát kyø maãu nöôùc naøo nhöng L.longbeachae laïi ñöôïc tìm thaáy töø ba maãu hoãn hôïp vaø töø ñaát troàng caây trong chaäu surroundingtwo. Qua ñoù, thì ngöôøi ta cuõng keát luaän raèng L.longbeachae coù thôøi gian soáng soùt keùo daøi baûy thaùng trong hai chaäu hoãn hôïp ñöôïc löu tröõ ôû nhieät ñoä phoøng. Trong moät soá taøi lieäu cuûa Legionellosis. Trong nhöõng tröôøng hôïp, caùc khaû naêng gaây beänh ñaõ ñöôïc phaùt hieän töø trong chaäu ñaát. Haàu heát caùc baùo caùo nhieãm beänh coù nguoàn goác töø ñaát ñöôïc xaùc ñònh töø naêm 1990 do L.longbeachae laø taùc nhaân truyeàn nhieãm. Phöông thöùc truyeàn nhieãm vaãn chöa bieát. Caùc dòch coù theå laø do söï phaân taùn cuûa buïi trong quaù trình hoaït ñoäng earthmoving, töø ñoù thaùp giaûi nhieät boå sung theâm chaát dinh döôõng vaø caùc beà maët cho vi khuaån phaùt trieån vaø cuõng gaây trôû ngaïi cho biocide. Ngoaøi ra caùc oå dòch coù theå laø do söï can thieät trong vieäc cung caáp nöôùc, oâ nhieãm do vi khuaån bao goàm caû legionella. 3.7.3. Legionella trong nöôùc maët töï nhieân Vi khuaån Legionella ñöôïc tìm thaáy trong moâi tröôøng nöôùc töï nhieân, vi khuaån naøy phaùt trieån toát nhaát trong moâi tröôøng nöôùc aám, ví duï nhö ñöôïc tìm thaáy trong boàn nöôùc noùng, beå chöùa nöôùc noùng, thaùp laøm maùt, caùc boä phaän cuûa heä thoáng ñieàu hoøa khoâng khí. Ngoaøi ra Legionella coøn coù trong nöôùc ngaàm, nöôùc uoáng, maët nöôùc bieån. Nhöõng vi khuaån naøy ñöôïc tìm thaáy trong caùc heä thoáng phaân phoái nöôùc cuûa beänh vieän, khaùch saïn, taøu, coâng trình, nhaø cöûa, nguoàn nöôùc khaùc trong ñoù Legionella ñöôïc tìm thaáy trong thaùp laøm maùt. Nhöõng vi khuaån naøy ñöôïc vaän chuyeån töø nöôùc saïch cho khoâng khí baèng voøi nöôùc, voøi sen, thaùp laøm maùt. Legionella coù theå taêng leân gaáp nhieàu laàn trong caùc thaùp laøm maùt, thaùp ngöng bay hôi, maùy giaët, khoâng khí, ñoä aåm, maùy ñun nöôùc noùng, ôû spa, ñaøi phun nöôùc vaø trong caùc oáng nöôùc. Trong thôøi haïn moät thaùng, Legionella coù theå nhaân leân töø 10/ml ñeán hôn 1.000/ml trong nöôùc aám cuûa caùc heä thoáng. Soá löôïng cao nhaát cuûa Legionella ñaõ tìm thaáy trong maãu nöôùc laø 150.000/ml nöôùc. Legionella laây nhieãm sang ngöôøi khi hoï hít caùc haït nhoû trong khoâng khí maø maét thöôøng khoâng thaáy ñöôïc. Legionella phaân taùn trong moâi tröôøng coù theå môû roäng treân moät khoaûng caùch ít nhaát laø 6km ( Theo taïp chí Beänh truyeàn nhieãm 193:102-11,2006). Legionella ñöôïc coi laø phoå bieán trong moâi tröôøng nöôùc, vaøi nghieân cöùu kieåm tra nonepidemic beà maët töï nhieân vuøng bieån cho söï hieän dieän cuûa hoï. Naêm 1985, tieâu chuaån trích daãn moät vaøi taøi lieäu nghieân cöùu chöùng minh roõ raøng söï xuaát hieän roäng raõi cuûa Legionella töø beà maët nöôùc ngoït töï nhieân ( ví duï nhö soâng, suoái) taïi Hoa Kyø. Theâm caùc nghieân cöùu gaàn ñaây chæ ra raèng Legionella laø khaù phoå bieán ôû vuøng bieån vaøo naêm 1993. 3.8. Tình hình nhieãm Legionella treân theá giôùi vaø Vieät Nam hieän nay. 3.8.1.. Tình hình nhieãm Legionella treân theá giôùi Naêm 1996 coù 201 tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis . Caùc tröôøng hôïp lieân keát vôùi nguoàn laây nhieãm laø : 101 tröôøng hôïp chieám 50% do ñi laïi hoaëc ôû nöôùc ngoaøi hoaëc ôû Anh vaø 98 tröôøng hôïp 49% do mua laïi coäng ñoàng. Soá löôïng caùc tröôøng hôïp lieân quan ñeán dòch hoaëc cuïm ñaõ ñöôïc 55 chieám 27% vaø 146 tröôøng hôïp coøn laïi laø 73% ñaõ ñöôïc baùo caùo laø tröôøng hôïp duy nhaát. Toång coäng coù 3005 tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis trong cö daân Anh vaø xöù Wales ñaõ ñöôïc baùo caùo trong giai ñoaïn 1980 – 1996 vaøo naêm 1997. Nhìn chung, du lòch vaø communitycases töøng chieám 46%. Töø naêm 1993 soá ngöôøi maéc beänh do legionella ngaøy caøng taêng vaø coù moät gia taêng maïnh soá löôïng caùc tröôøng hôïp nhieãm legionella trong naêm 1996 (201 tröôøng hôïp) so vôùi 160 tröôøng hôïp naêm 1995. Naêm 1993, 24 nöôùc chaâu Aâu ñaõ göûi ñöôïc thoâng tin veà tröôøng hôïp beänh legionellosis ôû chaâu Aâu thoâng qua caùc hình thöùc hoaøn thaønh baùo caùo haøng naêm taïi London. Keát quaû haøng naêm cho naêm 1996 ñaõ ñöôïc baùo caùo trong dòch teã hoïc haøng tuaàn. Legionella have been detected recently that are able to grow intracellularly in protozoan cells evenNaêm 1996 coù 1566 tröôøng hôïp veà beänh legionellosis ñaõ ñöôïc baùo caùo taïi 24 nöôùc Chaâu Aâu bao goàm Anh, Wales vaø Scotland. Boán quoác gia baùo caùo coù hôn 100 tröôøng hôïp moãi naêm : Taây Ban Nha 430, Phaùp 294, Anh vaø xöù Wales 200 vaø Ñöùc (Baéc vaø Ñoâng Nam) 181. Naêm 1996 ñaõ coù hôn 300 tröôøng hôïp hôn so vôùi naêm 1995 vaø hôn 400 tröôøng hôïp so vôùi naêm 1994. Söï gia taêng naøy chuû yeáu laø do moät oå dòch lôùn trong coäng ñoàng Taây Ban Nha 1996. Ngoaøi ra tyû leä trung bình ôû caùc nöôùc Chaâu Aâu coù tyû leä 4,45 tröôøng hôïp treân moät trieäu daân vaøo naêm 1996. Ña soá caùc tröôøng hôïp ôû caùc nöôùc chaâu AÂu baùo caùo vaøo naêm 1996 veà beänh legionellosis gaây ra bôûi L.pneumophilaserogroup 1 chieám 75 %, chöa xaùc ñònh nhoùm naøo chieám 18% vaø coøn laïi 7% laø khoâng roõ loaøi Legionella. Caùc tröôøng hôïp legionellosis taïi Australia vaø New Zealand thì phaûi khai baùo cho caùc nhaø chöùc traùch bieát veà heä thoáng giaùm saùt beänh. Naêm 1991 thì ñaõ coù 1.041 thoâng baùo cuûa legionellosis taïi UÙc. Naêm 1995 caùc tröôøng hôïp gaây ra do L.pneumophila chieám 41%, L.longbeachae chieám 22%, coù 2% tröôøng hôïp thuoäc caùc loaøi khaùc vaø 35% tröôøng hôïp khoâng coù speciated. Baùo caùo naøy cho raèng nhöõng soá lieäu naøy coù moät söï khaùc bieät vi sinh vaät trong tyû leä maéc legionellosis taïi UÙc vì L.pneumophila ñaõ ñöôïc baùo caùo laø chòu traùch nhieäm ít nhaát 90% trong nhieãm truøng legionellosis cuûa caùc quoác gia khaùc. Theo Trung Taâm kieåm soaùt dòch beänh (CDC) giöõa 8.000 vaø 18.000 tröôøng hôïp nhaäp vieän vôùi legionellosis taïi Hoa Kyø moãi naêm vôùi tyû leä töû vong cuûa noù trong moät oå dòch chieám töø 5- 30% ôû nhöõng ngöôøi maéc beänh. Trong soá 2.400.000 tröôøng hôïp vieâm phoåi xaûy ra moãi naêm ôû Hoa Kyø, öôùc tính khoaûng 10.000 ñeán 25.000 tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis chieám 5%-15% bò töû vong. Caùc tröôøng hôïp legionellosis do Legionella gaây ra ñaõ ñöôïc baùo caùo ôû Baéc vaø Nam Myõ, Chaâu AÙ, Australia, New Zealand, Chaâu Aâu vaø Nam Phi. 3.8.2. Tình hình nhieãm Legionella ôû Vieät Nam hieän nay Beân caïnh vi khuaån gaây beänh cho ñöôøng hoâ haáp aån truù thöôøng xuyeân trong maùy laïnh, môùi ñaây caùc nhaø khoa hoïc tieáp tuïc phaùt hieän theâm hai loaïi virus nguy hieåm khaùc cuõng ñang choïn maùy laïnh laøm “ nhaø”. Theo ñaùnh giaù cuûa beänh vieän ñaïi hoïc Y döôïc TP.HCM vaø beänh vieän Phaïm Ngoïc Thaïch, soá beänh nhaân bò hen suyeãn, caùc beänh veà ñöôøng hoâ haáp do aûnh höôûng cuûa moâi tröôøng laøm vieäc ñang ngaøy caøng taêng. Trung bình moät tuaàn, beänh vieän ñaïi hoïc Y döôïc TP.HCM tieáp nhaän haøng chuïc ca ñeán khaùm trong ñoù raát nhieàu ca bò vieâm phoåi keøm theo ñau khôùp, nhöùc ñaàu ,tieâu chaûy do vi khuaån Legionella pneumophila gaây ra. Phaàn ñoâng ngöôøi lao ñoäng ñang laøm vieäc taïi caùc cao oác, nhaø cao taàng. Trong ñoù cuõng coù moät soá tröôøng hôïp laø treû em vaø hoïc sinh, sinh vieân. Taïi beänh vieän Phaïm Ngoïc Thaïch, hoà sô beänh aùn cuõng ñaõ ghi nhaän töøng coù ca söng phoåi töû vong lieân quan ñeán Legionella pneumophila. Haàu heát caùc tröôøng hôïp phaùt beänh ñeàu ngoä nhaän do aûnh höôûng cuûa caùc taùc nhaân beân ngoaøi ( oâ nhieãm khoùi buïi ngoaøi ñöôøng, huùt thuoác laù, uoáng röôïu bia) maø khoâng maáy ai nghi ngôø maàm beänh ñang truù aån ngay trong phoøng laøm vieäc cuûa mình : caùc chaát voâ cô, höõu cô, naám moác xng quanh vaø trong maùy laïnh. Theá giôùi ñaõ caûnh baùo taùc haïi cuûa vi khuaån legionella pneumophila töø nhieàu thaäp kyû tröôùc do chuùng raát nguy hieåm vaø thöôøng gaëp. Choã truù aån ngon laønh nhaát cuûa vi khuaån naøy khoâng ñaâu khaùc laø ñöôøng oáng nöôùc cuûa maùy laïnh. Lgionella pneumophila coù theå laøm cho beänh nhaân khôûi phaùt raát nhanh beänh söng phoåi vaø töû vong chæ trong vaøi ngaøy neáu keát quaû ñieàu trò khoâng nhaän dieän ra chuùng sôùm. CHÖÔNG 4 : CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT HIEÄN LEGIONELLA Caùc trieäu chöùng laâm saøng khi nhieãm Legionella vaø caùc trieäu chöùng cuûa beänh vieâm phoåi laø khoâng theå phaân bieät ñöôïc. Do ñoù phöông phaùp chaån ñoaùn chính xaùc laø caàn thieát ñeå xaùc ñònh Legionella vaø ñeå ñieàu trò kòp thôøi, phuø hôïp. Ñeå caûi thieän cho vieäc chaån ñoaùn thì chuyeân ngaønh phoøng thí nghieäm phaûi ñöôïc kieåm tra vaø tieán haønh ngay. Caùc xeùt nghieäm cho beänh lyù phaûi ñöôïc thöïc hieän treân taát caû caùc beänh nhaân coù nguy cô bò vieâm phoåi cao, keå caû nhöõng ngöôøi bò oám naëng (coù hoaëc khoâng coù tính naêng laâm saøng cuûa beänh legionellosis). Ñaëc bieät, caùc xeùt nghieäm cho beänh neân ñöôïc tìm ra treân beänh nhaân ñaõ bò beänh tröôùc ñoù, öùc cheá mieãn dòch hoaëc khoâng ñaùp öùng vôùi khaùng sinh beta – lactam hoaëc nhöõng ngöôøi coù theå tieáp xuùc vôùi Legionella trong moät oå dòch . Maëc duø söï saün coù cuûa phaân töû mieãn dòch vaø phöông phaùp di truyeàn thì chaån ñoaùn beänh Legionellosis noùi chung thì nguyeân nhaân chuû yeáu laø L.pneumophila serogroup1. Töø naêm 1995 thì caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn cho legionellosis ñaõ thay ñoåi ñaùng keå. Caùc phoøng thí nghieäm ñang söû duïng moät soá phöông phaùp ñeå chaån ñoaùn nhieãm truøng Legionella : - Söï coâ laäp cuûa vi khuaån treân phöông tieän truyeàn thoâng vaên hoùa. - Xaùc ñònh caùc vi khuaån baèng caùch söû duïng serology. - Phaùt hieän khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. - Phaùt hieän caùc vi khuaån trong moâ hoaëc chaát dòch trong cô theå baèng kính hieån vi immunofluorescent ( Ví duï : Khaûo nghieäm tröïc tieáp immunofluorescent Dfa). - Phaùt hieän DNA cuûa vi khuaån baèng caùch söû duïng phaûn öùng daây chuyeàn polymerase (PCR). 4.1. Phöông phaùp truyeàn thoáng 4.1.1. Maãu Maãu nöôùc ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích laø maãu nöôùc töø caùc maùy laïnh trong caùc nhaø cao taàng. 4.1.2. Phöông phaùp Kyõ thuaät xöû lyù nhieät ñöôïc söû duïng ñeå phaân laäp Legionella caùc maãu töø moâi tröôøng. Quy trình naøy thöïc hieän ñôn giaûn, khoân ñaét tieàn, khoâng yeâu caàu trang thieát bò phöùc taïp. Moâi tröôøng söû duïng bao goàm moâi tröôøng MWY agar, moâi tröôøng alpha – BCYE vaø blood agar. Caû moâi tröôøng MWY agar vaø alpha – BCYE agar chöùa L – cystein vaø ferric pyrophosphate. Cystein laø moät acid amin caàn cho quaù trình taêng tröôûng Legionella pneumophila. Moâi tröôøng MWY agar laø moät moâi tröôøng coù chöùa glycine ñeå naâng cao söï taêng tröôûng cuûa Legionella trong moâi tröôøng. Noù cuõng chöùa khaùng sinh öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc vi khuaån khaùc trong moâi tröôøng. Maãu nöôùc ñöôïc ly taâm ôû 4000 voøng/phuùt trong 30 phuùt. Phaàn noåi treân maët loaïi boû vaø thu 10ml phaàn caën. Ñeå loaïi boû phaàn caën neân thöïc hieän caån thaän ñeå traùnh laøm loaïn phaàn caën. Laáy 1ml caën ñem gia nhieät ôû 500C trong 30 phuùt. Coøn 9ml ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä 200C ñeå sau naøy söû duïng. Laáy 50µl maãu nöôùc ñöôïc gia nhieät caáy traûi treân moâi tröôøng MWY agar uû nhieät ñoä 350C trong khoâng khí aåm trong 3 – 4 ngaøy. Ñeám taát caû nhöõng khuaån laïc nghi ngôø treân moâi tröôøng MWY agar, sau ñoù caáy chuyeån sang moâi tröôøng alpha – BCYE vaø blood agar vaø uû trong 35 – 370C töø 3 – 4 ngaøy. Söï hieän dieän cuûa söï taêng tröôûng vi sinh vaät treân moâi tröôøng alpha – BCYE agar vaø söï khoâng taêng tröôûng treân moâi tröôøng Blood agar chöùng toû coù söï hieän dieän cuûa Legionella. Nhöõng vi khuaån giaû ñònh coù kích côõ töø 1 – 4 mm vaø xuaát hieän aùnh saùng laáp laùnh, loài vaø coù nhöõng ñoám nhoû. Tieán haønh caùc thöû nghieäm sinh hoùa : oxidase, catalase, gelatin, β – lactamase vaø thuûy phaân hippurate. Caùc chuûng Legionella giaû ñònh bò nhuõ hoùa trong 0.05ml khaùng huyeát thanh. Baát cöù söï ngöng keát naøo xaûy ra trong 1 phuùt ñöôïc xem laø Legionella döông tính. Quy trình phaân tích : Nöôùc maãu (400ml) 3500- 4000 voøng/trong 30 phuùt Traàm tích (10ml) ` Nhieät khí 1ml maãu ôû 500C/30 phuùt Caáy 50 µl maãu leân MWY agar UÛ 350C – 370C trong 3 – 4 ngaøy Nhaän vaø caáy vaøo caùc thuoäc ñòa Legionella Thaïch BCYE Blood agar trung bình Legionella spp Khoâng coù Legionella spp BCYE khoâng coù L-cysteine Khoâng phaûi kieåm tra huyeát thanh loïc Legionella 4.2. Caùc phöông phaùp hieän ñaïi 4.2.1. Phaùt hieän Legionella pneumophila trong heä thoáng nöôùc laïnh baèng phöông phaùp PCR. Legionella pneumophila tham gia vaøo hôn 95% tröôøng hôïp vieâm phoåi chuû yeáu laø nhieãm truøng do hít phaûi caùc bình xòt thoâng qua caùc heä thoáng nöôùc laøm maùt. Trong ñoù ta coù theå phaùt hieän moät soá chuûng Legionella baèng phöông phaùp Taq polymerase, khueách ñaïi DNA vaø PCR ñeå phaùt hieän Legionella cuï theå treân trình töï 16S-rDNA. Trong soá 77 maãu nöôùc ñaõ ñöôïc thöû nghieäm bôûi PCR thì coù 30 maãu chieám 39% coù lieân quan ñeán Legionella. Tuy nhieân, L.pneumophila ñaõ ñöôïc phaùt hieän vaø chieám 18,2% töø caùc maãu nöôùc laøm maùt baèng phöông phaùp PCR. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp PCR - Phöông phaùp PCR cung caáp keát quaû trong 24 giôø so vôùi quay voøng 10 ngaøy cuûa phöông phaùp vaên hoùa. - Keát quaû cuûa Legionella ñöôïc xaùc ñònh baét ñaàu taïi thôøi ñieåm laáy maãu. - Phöông phaùp PCR coù thôøi gian phaùt hieän nhanh hôn nhieàu so vôùi phöông phaùp truyeàn thoáng do söï nhaïy caûm cao hôn trong quaù trình PCR. - Quùa trình phaùt hieän ôû caáp ñoä DNA gaây cho Legionella bò maéc keït trong LMS biofi vaø trong caùc sinh vaät khaùc nhö amip. - Söï hieän dieän cuûa caùc sinh vaät khoâng phaûi laø muïc tieâu loaïi boû trong quaù trình xaùc ñònh Legionella baèng phöông phaùp PCR. - Xaùc ñònh cation ôû möùc ñoä DNA thì PCR laø phöông phaùp khoâng chính xaùc do caùc phaûn öùng cheùo, vôùi boä duïng cuï chính xaùc hôn laø huyeát thanh loïc coù theå khoâng nhaém muïc tieâu vôùi sinh vaät. 4.2.2. Caùc phaùt hieän Legionella trong maãu moâi tröôøng vaø sinh hoïc Caùc xeùt nghieäm huyeát thanh hoïc ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän Legionella trong nöôùc, ñôøm, maùu. Kohler (1986) baùo caùo raèng caùc khaùng nguyeân coù theå ñöôïc phaùt hieän trong nöôùc tieåu cuûa beänh nhaân bò vieâm phoåi chieám 80% vaø ñaëc tröng cuûa caùc khaûo nghieäm chieám 99%. Haàu heát caùc xeùt nghieäm treân ñöôøng hoâ haáp, cuï theå laø moâ pheá quaûn vaø khí quaûn, ñôøm. Caùc xeùt nghieäm huyeát thanh hoïc ñöôïc thöïc hieän treân vi khuaån laø tröïc tieáp vaø giaùn tieáp baèng phöông phaùp huyønh quang ñöôïc aùp duïng ñoái vôùi caû hai moâi tröôøng. Huyønh quang laø nhöõng hôïp chaát höõu cô thuoäc caùc phaân töû khaùng theå ñöôïc gaén vaøo moät teá baøo hoaëc khaùng nguyeân treân beà maët teá baøo. Khaûo nghieäm immunofluorescence bao goàm khaûo nghieäm tröïc tieáp (Dfa) vaø giaùn tieáp (IFA).Caùc xeùt nghieäm huyeát thanh khaùc nhau chuû yeáu ôû ñoä nhaïy, ñaëc tính cuûa Legionella. Khaûo nghieäm tröïc tieáp immunofluorescence (Dfa) Tröïc tieáp khaûo nghieäm immunofluorescence(DFAs) caàn 2-3 giôø ñeå nhuoäm khi söû duïng khaùng theå keát hôïp vôùi moät fluorochrome. DFAs cuûa ñôøm cho keát quaû döông tính sau 2-4 ngaøy sau khi baét ñaàu ñieàu trò baèng khaùng sinh vaø thöôøng cho khoaûng thôøi gian trong tröôøng hôïp cuûa beänh vieâm phoåi. DFA ñaõ ñöôïc söû duïng thaøng coâng vôùi ñôøm vaø dòch maøng phoåi. Dòch chaát loûng ñöôïc kieåm tra trong beänh nhaân vieâm phoåi baèng Dfa hieám khi mang laïi keát quaû tích cöïc. Giöõa beänh nhaân legionellosis ñaõ ñöôïc chöùng minh vôùi Dfa cho L.pneumophila tôùi 25%-70% vaø ñaëc tröng cuûa thöû nghieäm laø cao hôn 99,9%. Phaûi caån troïng ñeå ngaên ngöøa keát quaû döông tính giaû cuûa Dfa. Khaûo nghieäm giaùn tieáp immunofluorescence (IFA) Vi khuaån Legionella vaø khaùng theå trong huyeát thanh beänh nhaân bò vieâm phoåi ñöôïc phaùt hieän qua IFA. Nhieät coá ñònh khaùng nguyeân thöôøng ñöôïc söû duïng taïi Hoa Kyø nhöng khaùng nguyeân formolized ñöôïc söû duïng chuû yeáu ôû Chaâu Aâu. Bôûi vì chuyeån ñoåi huyeát thanh chæ xaûy ra sau moät thôøi gian daøi ôû ngöôøi, caùc thöû nghieäm IFA thöôøng ñöôïc söû duïng cuøng vôùi caùc xeùt nghieäm khaùc vaø moät loaït caùc xeùt nghieäm huyeát thanh hoïc ñöôïc tieán haønh ñeå kieåm tra khaùng theå vaø thöôøng keát hôïp vôùi IFA. Hieän nay tröôøng hôïp veà legionellosis ñöôïc xaùc ñònh thoâng qua phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu. Nhö moät heä quaû cuûa söï chuyeån ñoåi thì phaùt hieän L.pneumophila serogroup 1 gaây legionellosis ñang gia taêng vaø taát caû caùc serogroup khaùc coù leõ underdiagnosed. Theo baùo caùo cuûa caùc nöôùc chaâu Aâu vaøo naêm 1999 thì beänh legionellosis xaûy ra raát cao. Phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu laø phöông phaùp phoå bieán nhaát trong ñieàu trò beänh legionellosis. Caùc xeùt nghieäm phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu laø nhaïy caûm ñaùng keå hôn cho communityacquired vaø chaêm soùc söùc khoûe nhieãm truøng mua laïi. Khaùng nguyeân tieát nieäu Enzyme immunoassays. Vieäc söû duïng Enzyme immunoassays (EIAs) ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân L.pneumophila trong nöôùc tieåu cho pheùp chaån ñoaùn beänh legionellosis sôùm trong quaù trình laây nhieãm. Söû duïng EIAs giuùp thöû nghieäm nhanh choùng caùc ñaëc tröng vaø söï nhaïy caûm ñoái vôùi L.pneumophila 1. Caùc khaùng nguyeân ñöôïc phaùt hieän trong haàu heát caùc beänh nhaân töø moät ñeán ba ngaøy sau khi baét ñaàu xuaát hieän caùc trieäu chöùng vaø coù theå keùo daøi vaøi tuaàn hay vaøi thaùng ngay khi caùc xeùt nghieäm khaùc khoâng phaùt hieän khaùng nguyeân. Caùc xeùt nghieäm nöôùc tieåu söû duïng EIAs thì coù maët khaùng nguyeân tôùi 80 -85%. Do ñoù söû duïng EIA ñeå phaùt hieän L.pneumophila 1 khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. Ngoaøi ra söû duïng Enzyme immunoassays ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu laø phöông phaùp ñöôïc löïa choïn cho L.pneumophila 1. So vôùi caùc phöông phaùp chaån ñoaùn khaùc thì lôïi theá cuûa khaùng nguyeân tieát nieäu ñaït hieäu quaû cao hôn. Vì maãu vaät thu ñöôïc deã daøng, khaùng nguyeân ñöôïc phaùt hieän töø raát sôùm trong quaù trình nhieãm, thöû nghieäm nhanh choùng...Caùc khaùng nguyeân cuõng ñöôïc phaùt hieän trong beänh vieâm phoåi maø khoâng coù khaùng sinh ñieàu trò . Khaûo nghieäm Immunochromatographic Khaûo nghieäm Immunochromatographic giuùp phaùt hieän nhanh choùng L.pneumophila 1 khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. Khaûo nghieäm naøy giuùp phaùt hieän khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu trong thôøi gian raát ngaén vaø khoâng yeâu caàu trang thieát bò phoøng thí nghieäm . Moâ khaùng nguyeân Söû duïng kính hieån vi immunofluorescence ñeå phaùt hieän Legionella trong caùc maãu thuoäc ñöôøng hoâ haáp nhö phoåi vaø dòch maøng phoåi. Söû duïng caùc kyõ thuaät giaùn tieáp immunofluorescence (IEAT) ñöôïc söû duïng haàu heát trong caùc phoøng thí nghieäm ñeå phaùt hieän caùc khaùng theå huyeát thanh. Ñaõ chöùng minh ñöôïc L.pneumophila 1 gaây beänh legionellosis xuaát hieän caùc trieäu chöùng trong voøng 1-9 tuaàn sau. Trung bình beänh nhaân phaùt trieån caùc khaùng theå (seroconvert) trong voøng 2 tuaàn. Tuy nhieân, coù khi leân ñeán 25% cuûa seroconversions laø khoâng bò phaùt hieän bôûi vì huyeát thanh thu ñöôïc hôn 8 tuaàn sau khi beänh khôûi phaùt. Maëc duø phaùt hieän chaån ñoaùn baèng khaùng theå töø moâ vaãn coøn höõu ích cho caùc nghieân cöùu dòch teã hoïc taïi oå dòch, thöôøng bò thay theá baèng caùc xeùt nghieäm khaùng nguyeân tieát nieäu. Söû duïng giaùn tieáp IFAT ñeå chaån ñoaùn beänh legionellosis . Ñoä nhaïy vaø ñaëc tính cuûa IFAT chæ ñöôïc ñaùnh giaù baèng caùch söû duïng khaùng nguyeân cho L.pneumophila 1, ñoä nhaïy vaø ñaëc tính cho caùc nhoùm vaø loaøi khaùc thì khoâng ñöôïc bieát ñeán. Khaûo nghieäm Enzyme Linked Immunoabsorbent (ELISA) Khaûo nghieäm Enzyme Linked Immunoabsorbent (ELISA) cuøng vôùi radioimmunoassay (RIA) duøng ñeå phaùt hieän khaùng theå Legionella. Nhöõng phöông phaùp naøy söû duïng caùc enzyme vaø ñoàng vò phoùng xaï ñeå phaùt hieän caùc phaân töû khaùng theå. Caùc phöông phaùp ELISA ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän khaùng theå Legionella trong huyeát thanh beänh nhaân, nhöng noù cuõng ñöôïc duøng ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. Vôùi phöông phaùp ELISA thì phaûi saáy sô boä maãu laø caàn thieát ñeå traùnh döông tính giaû. Phöông phaùp RIA cuõng ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän caùc Legionella khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu nhöng khoâng coøn thöông maïi vaø phoå bieán. Khaùng theå ñôn doøng Khaùng theå ñôn doøng ñöôïc kieåm tra, thöû nghieäm vôùi caùc khaùng theå hình thaønh töø baûn sao duy nhaát cuûa caùc teá baøo, ñöôïc tìm thaáy chính xaùc hôn xeùt nghieäm polyclonal do söï ñaøn aùp cuûa neàn huyønh quang. Ngoaøi ra, keát quaû sai töø caùc phaûn öùng cheùo vôùi caùc sinh vaät khoâng coù Legionella ñöôïc loaïi boû. Khaùng theå ñôn doøng coù theå ñöôïc saûn xuaát ñeå phaûn öùng vôùi moät loaøi cuï theå. Theo Kohler (1986) ôû phoøng thí nghieäm khaúng ñònh raèng coù nhieàu khaùng theå cho L.pneumophila ñaõ ñöôïc phaùt trieån ôû caùc loaøi cuï theå vaø thaäm chí laø cuï theå ôû caùc nhoùm. 4.2.3. Phöông phaùp Enzyme – linked Immunosorbent Assay (ELISA). Ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän ñoäc toá hoaït tính sinh hoïc vaø söï doø tìm ñoäc toá khoâng tích cöïc. Nhöõng tieán boä kyõ thuaät trong vaøi thaäp nieân vöøa qua thuùc ñaåy söï phaùt trieån cuûa nhieàu kyõ thuaät chuaån ñoaùn huyeát thanh hoïc nhanh nhaïy, chính xaùc caùc beänh truyeàn nhieãm. Maët khaùc, söï phaùt trieån cuûa nhöõng kyõ thuaät töï ñoäng hoùa cho pheùp ñôn giaûn hoùa thao taùc thöïc hieän. Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp mieãn dòch laø phaûn öùng keát hôïp giöõa moät teá baøo (khaùng nguyeân) vôùi moät khaùng khaùng theå ñaëc hieäu. Tính hieäu cuûa phaûn öùng mieãn dòch laø coù theå nhaän bieát thoâng qua söï ngöng tuûa hay keát dính cuûa khaùng nguyeân – khaùng theå. Nguyeân taéc cuûa kyõ thuaät ELISA laø söû duïng khaùng theå ñôn doøng phuû beân ngoaøi ñóa gieáng. Neáu coù söï hieän dieän cuûa khaùng nguyeân muïc tieâu trong maãu, khaùng nguyeân naøy seõ giöõ laïi treân beà maët gieáng. Caùc khaùng nguyeân naøy seõ ñöôïc phaùt hieän baèng caùch söû duïng khaùng theå thöù caáp coù gaén vôùi enzyme nhö alkaline phosphate. Khi boå sung moät cô chaát ñaëc hieäu cuûa enzyme vaøo gieáng, enzyme xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân cô chaát ñeå taïo ra caùc saûn phaåm coù maøu hay phaùt saùng. Baèng caùch theo doõi söï ñoåi maøu coù theå phaùt hieän söï hieän dieän vaø ñònh löôïng khaùng nguyeân. ELISA ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi döôùi daïng caùc boä kit thöông maïi vaø coù theå ñöôïc caûi tieán ñeå töï ñoäng hoùa. ELISA coù theå ñöôïc söû duïng phaùt hieän vaø ñònh löôïng vi sinh vaät trong thöïc phaåm trong thôøi gian vaøi giôø sau khi taêng sinh. 4.2.4. Phöông phaùp PCR Phöông phaùp PCR (Polymerase chain reaction) laø phöông phaùp invitro ñeå toång hôïp DNA döïa treân khuoân laø moät trình töï DNA ban ñaàu, khueách ñaïi, nhaân soá löôïng baûn sao thaønh haøng trieäu baûn sao nhôø hoaït ñoäng cuûa enzyme polymerase vaø moät caëp moài ñaëc hieäu cho ñoaïn DNA naøy. Hieän nay, kyõ thuaät naøy ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå phaùt hieän taïo ra caùc ñoät bieán gen, chaån ñoaùn beänh, phaùt hieän caùc maàm beänh vi sinh vaät coù trong thöïc phaåm… Taát caû caùc DNA polymerase ñeàu caàn nhöõng moài chuyeân nghieäp ñeå toång hôïp moät maïch DNA môùi töø maïch khuoân. Maïch khuoân thöôøng laø moät trình töï DNA cuûa gen ñaëc tröng cho loaøi vi sinh vaät muïc tieâu hoaëc laø gen quy ñònh vieäc toång hôïp moät loaïi ñoäc toá chuyeân bieät cuûa vi sinh vaät naøy. Moài laø nhöõng ñoaïn DNA ngaén, coù khaû naêng baét caëp boå sung vôùi moät ñaàu cuûa ñoaïn maïch khuoân vaø nhôø hoaït ñoäng cuûa DNA polymerase ñöôïc noái daøi ñeå hình thaønh maïch môùi. Phöông phaùp PCR ñöôïc hình thaønh döïa treân ñaëc tính cuûa DNA polymerase. Khi coù söï hieän dieän cuûa hai moài chuyeân nghieäp baét caëp boå sung vôùi hai ñaàu cuûa moät trình töï DNA trong phaûn öùng PCR, ôû ñieàu kieän ñaûm baûo hoaït ñoäng cuûa DNA polymerase, ñoaïn DNA naèm giöõa hai moài seõ ñöôïc khueách ñaïi thaønh soá löôïng lôùn baûn sao ñeán möùc coù theå thaáy sau khi nhuoäm baèng ethidium bromide vaø coù theå thu nhaän ñöôïc ñoaïn DNA naøy cho caùc muïc ñích thao taùc treân gen. Nhö vaäy, khueách ñaïi moät trình töï DNA xaùc ñònh caàn phaûi coù nhöõng thoâng tin toái thieåu veà trình töï cuûa DNA, ñaëc bieät laø trình töï caùc base ôû hai ñaàu ñoaïn ñuû ñeå taïo caùc moài boå sung chuyeân bieät. Phaûn öùng PCR goàm nhieàu chu kyø laëp laïi noái tieáp nhau. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc : a) Böôùc 1 : Trong moät dung dòch phaûn öùng bao goàm caùc thaønh phaàn caàn thieát cho söï sao cheùp, phaân töû DNA bieán tính ôû nhieät ñoä cao, thöôøng laø 94 – 950C trong 30 – 60 giaây. Maïch ñoâi DNA taùch ra thaønh daïng maïch ñôn. b) Böôùc 2 : Nhieät ñoä ñöôïc haï thaáp hôn Tm cuûa caùc moài cho pheùp caùc moài baét caëp vôùi maïch khuoân, nhieät ñoä naøy khoaûng 40 – 700C, trong khoaûng 30 – 60 giaây. c) Böôùc 3 : Toång hôïp. Nhieät ñoä ñöôïc taêng leân ñeán 720C giuùp cho DNA polymerase hoaït ñoäng toát nhaát. Thôøi gian cuûa böôùc naøy tuøy thuoäc vaøo ñoä daøi trình töï DNA caàn khueách ñaïi, thöôøng 30 giaây ñeán nhieàu phuùt. Quy trình chung cho vieäc phaùt hieän vi khuaån gaây beänh trong maãu nhö sau : Böôùc 1 : Taêng sinh treân moâi tröôøng khoâng hoaëc ít choïn loïc trong thôøi gian töø 10 – 20 giôø. Böôùc 2 : Thu dòch nuoâi caáy, ly taâm boû maûnh vuïn, ly taâm goäp sinh khoái teá baø vi khuaån, huyeàn phuø teá baøo TE (10Mm Tris – HCl, pH =8,0, 1Mm EDTA) vôùi theå tích baèng 1/10 teå tích dòch nuoâi caáy ban ñaàu, xöû lyù nhieät ôû 1000C trong 10 phuùt, ly taâm loaïi boû taïp chaát khoâng tan öùc cheá phaûn öùng PCR. Böôùc 3 : Thöïc hieän phaûn öùng PCR Böôùc 4 : Ñieän di gel agarose 1,5% xem keát quaû treân ñeøn UV. 4.3. Caùc bieän phaùp kieåm soaùt Legionella trong thöïc phaåm Coù nhieàu phöông phaùp khöû truøng lieân quan ñeán vaät lyù (ví duï nhö maøng loïc), nhieät (ví duï nhö nhieät khöû truøng) vaø hoùa hoïc (ví duï nhö chlor hoùa). Ñoái vôùi vieäc khöû truøng nöôùc thì phöông phaùp ñöôïc söû duïng laø thuoác khöû truøng (chlor laø phoå bieán nhaát) ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát. Thuoác khöû truøng ñöôïc söû duïng cho nöôùc uoáng phaûi ñöôïc an toaøn cho con ngöôøi tieâu thuï veà maët hoùa hoïc laãn tính chaát. Taát caû nhöõng phöông phaùp vaø thuoác khöû truøng phaûi ñöôïc aùp duïng ñeå cung caáp cho caùc heä thoáng taïi caùc cô sôû coâng nghieäp. Ñoái vôùi heä thoáng nöôùc khoâng saïch thì caàn boå sung chaát khöû truøng vaø khoâng cho con ngöôøi söû duïng. Nhieät khöû truøng ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi ñaëc bieätø cho caùc heä thoáng nöôùc vì Legionella ñaõ ñöôïc tìm thaáy gaàn nhö ngay laäp töùc ñöôïc baát hoaït ôû 700C. Trong xem xeùt naøy thì thoâng tin veà phöông phaùp hoùa hoïc vaø phöông phaùp nhieät ñöôïc tìm thaáy. Vì vaäy coù nhieàu loaïi thuoác khöû truøng coù saün, xem xeùt laïi ñaõ ñöôïc duøng daønh cho caùc phöông phaùp hoùa hoïc. 4.3.1. Hieäu löïc cuûa maøng sinh hoïc vaø caùc yeáu toá khöû truøng khaùc Caùc khaùng cuûa vi khuaån ñeå khöû truøng Legionella phuï thuoäc vaøo caùc ñieàu kieän vaên hoùa. Ngoaøi ra soá nöôùc phaùt trieån neàn vaên hoùa, nhöõng lieân keát vôùi maøng sinh hoïc (vi khuaån khoâng cuoáng) ñaõ ñöôïc > 100 laàn khaùng iodine hôn nhöõng sinh vaät phuø du. Ñieàu naøy laøm taêng söùc ñeà khaùng cuûa Legionella do nhu caàu thuoác khöû truøng ñeå thaâm nhaäp vaøo maøng sinh hoïc ñeå tieáp caïnh vôùi vi khuaån. Green cho thaáy 1mg/l Chlor ñaõ töï do gieát cheát caùc sinh vaät phuø du, trong khi ñoù thì L.bozemanii taêng leân 4 laàn laø ñieàu caàn thieát ñeå thaâm nhaäp vaøo maøng sinh hoïc vaø Legionella gieát cheát vi khuaån khoâng cuoáng trong 24h. Cho moät noàng ñoä thuoác khöû truøng thì moät thôøi gian lieân laïc laâu hôn nöõa laø yeâu caàu voâ hieäu hoùa vi khuaån khoâng cuoáng hôn so vôùi sinh vaät phuø du. Theo Yabuuchi thì coù theå voâ hieäu hoùa sinh vaät phuø du trong voøng 15 phuùt ôû 0,4 mg/L Chlor. Tuy nhieân, khi noàng ñoä chlor >3mg/L laø caàn thieát ñeå voâ hieäu hoùa vaø ngaên chaën caùc vi khuaån coù lieân quan ñeán maøng sinh hoïc. Vi khuaån Legionella ñaõ ñöôïc bieát ñeán khi phaù hoaïi moät soá ñoäng vaät nguyeân sinh bao goàm caû amip. Ñaây laø khoù khaên trong vieäc tieâu dieät Legionella khi coù lieân quan vôùi amip vaø thaäm chí khoù khaên hôn khi chuùng coù lieân quan vôùi u nang amip. Ví duï, Hartmannellavermiformis moät amip phoå bieán trong nöôùc uoáng ñaõ khoâng laøm taêng tröôûng L.pneumophila taïi > 4mg/L chlor trong khi ñoù L.pneumophila coù theå chòu ñöôïc ít nhaát laø 50mg/L chlor töï do trong caùc u nang Acanthamoebapolyphage. Srikanth vaø Berk thaáy raèng caùc loaøi amip ñöôïc phaân laäp töø moät thaùp laøm maùt cuûa moät heä thoáng ñieàu hoøa khoâng khí vaø tieáp xuùc ñeå khöû truøng khoâng oxi hoùa. Sutherland vaø Berk cuõng ñaõ coâ laäp boán loaøi ñoäng vaät nguyeân sinh ñoù laø : - Hai loaøi ciliate : Tetrahymena sp vaø Colpoda sp - Hai loaøi amip : Vannella miroides vaø Acanthamoebahatchetti. Srikanth vaø Berk ñaõ tìm thaáy raèng söï tieáp xuùc cuûa moät loaøi ñoäng vaät nguyeân sinh vôùi moät chaát khöû truøng daãn ñeán söùc ñeà khaùng cuûa mình cho chaát khöû truøng khaùc. Ñieàu naøy coù theå laøm cho söï kieåm soaùt cuûa vi khuaån Legionella khoù khaên hôn. Tuy nhieân, traùi vôùi nhöõng phaùt trieån veà moái quan heä giöõa vi khuaån Legionella vaø amip thì McCallet baùo caùo raèng söï hieän dieän cuûa caùc amip khoâng lieân quan ñeán thuoäc ñaïi Legionella sau khi khöû truøng vì amoebae ñaõ ñöôïc phuïc hoài maø khoâng caàn söï taùi phaùt trieån nhanh choùng cuûa Legionella. 4.3.2. Söï khöû truøng baèng hoùa hoïc 4.3.2.1. Söï böùc xaï UV Böùc xaï UV coù böôùc soùng ngaén ñeå tieâu dieät sinh vaät, vôùi khaû naêng gieát maïnh nhaát ôûù böôùc soùng 254 nm vaø hoaït ñoäng bôûi söï saûn xuaát ra caùc dimer thymine trong phaân töû DNA ngaên caûn quaù trình taùi baûn DNA. Chieáu xaï tia cöïc tím chöa ñöôïc söû duïng roäng raõi trong khöû truøng nöôùc uoáng vì khoâng theå gieát cheát caùc maàm beänh vaøo cuoái quaù trình xöû lyù. Chieáu xaï tia cöïc tím ñöôïc söû duïng roäng raõi trong khöû truøng nöôùc thaûi bôûi vì mong muoán laø khoâng coøn soùt laïi nhöõng vi khuaån gaây oâ nhieãm, khoâng gaây baát lôïi hay taùc ñoäng ñeán ñôøi soáng thuûy saûn. Ñoái vôùi caùc öùng duïng cuûa tia cöïc tím chieáu xaï Legionella caàn nghieân cöùu laïi thoâng qua caùc nghieân cöùu khaùc nhau. Ví duï, tia cöïc tím chieáu xaï ñaõ ñöôïc aùp duïng ñeå xöû lyù caùc nguoàn nöôùc laïnh vaø nguoàn cung caáp nöôùc noùng taïi caùc beänh vieän nhö moät phaàn cuûa chöông trình ñeå kieåm soaùt vi khuaån Legionella. Ñeøn UV thöôøng ñöôïc caøi ñaët gaàn caùc cöûa haøng thieát bò ngoaïi vi. Keát quaû cuûa nhöõng nghieân cöùu naøy ñaõ chæ ra raèng chieáu xaï tia cöïc tím moät mình laø khoâng hieäu quaû ñeå kieåm soaùt Legionella vaø caùc bieän phaùp khaùc ñöôïc aùp duïng chaúng haïn nhö söû duïng chlorine hoaït tính maïnh ñònh kyø vaø nhieät ñoä khöû truøng seõ phaûi ñöôïc söû duïng chung vôùi chieáu xaï tia cöïc tím ñeå cho vieäc kieåm soaùt Legionella coù hieäu quaû hôn. Chieáu xaï tia cöïc tím coù theå gaây baát lôïi cho vieäc cung caáp nöôùc uoáng coâng coäng vaø caùc nguoàn nöôùc laïnh, noùng taïi caùc beänh vieän. Chæ söû duïng phöông phaùp chieáu xaï tia cöïc tím cuõng seõ khoâng hieäu quaû trong vieäc kieåm soaùt vi khuaån Legionella trong nöôùc vaø caùc chaát loûng khaùc. 4.3.2.2. Caùc ion kim loaïi Nhieàu nghieân cöùu ñaõ ñöôïc tieán haønh veà vieäc söû duïng keát hôïp ñoàng vaø caùc ion baïc ñeå khöû truøng caùc heä thoáng nöôùc noùng vaø nöôùc laïnh taïi caùc beänh vieän ñeå choáng laïi vi khuaån Legionella, vôùi caùc öùng duïng môùi nhaát treân heä thoáng nöôùc noùng tuaàn hoaøn. Nhöõng ion ngaên caûn cho caùc enzyme lieân quan ñeán hoâ haáp teá baøo vaø gaén leân phaân töû DNA ôû nhöõng vò trí chuyeân bieät, vì vaäy lieàu löôïng hieäu quaû cuûa caùc ion kim loaïi ñaõ ñöôïc laø moät phaàn traêm mg/L ñoái vôùi ñoàng vaø moät vaøi chuïc mg/L ñoái vôùi baïc. Caùc ion naøy coù theå ñöôïc theâm vaøo trong nöôùc hoaëc laø ñieän phaân caùc muoái kim loaïi. Haàu heát caùc nghieân cöùu ñeàu söû duïng keát hôïp cuûa hai loaïi ion kim loaïi. Tuy nhieân, Lin ñaõ tieán haønh nghieân cöùu trong phoøng thí nghieäm veà vieäc söû duïng keát hôïp hai ion kim loaïi ñoàng vaø ion kim loaïi baïc ñeå choáng laïi L.pneumophila. Hoï ñaõ baát hoaït hoaøn toaøn caùc sinh vaät trong 2,5 h vôùi caùc ion ñoàng ôû 0,1mg/L. Ion baïc cuõng coù hieäu quaû vaø söï keát hôïp cuûa hai ion cuõng ñaõ ñöôïc chöùng minh. Ñònh kyø giaùm saùt noàng ñoä ion kim loaïi cho nöôùc saïch ñeå ñaûm baûo noàng ñoä döôùi ngöôõng cuûa EPA (möùc ñoä gaây oâ nhieãm (MCLG) cuûa 1,3 mg/L cho ñoàng vaø 0,1mg/L cho baïc). Döïa teân nhöõng phaùt hieän khaû naêng khöû truøng cuûa caùc ion kim loaïi (ñoàng, baïc hay söï keát hôïp cuûa caû hai ion) laø moät söï löïa choïn khaû thi ñeå aùp duïng cho caùc heä thoáng tuaàn hoaøn nöôùc noùng. Khoâng coù coâng boá baùo caùo veà vieäc aùp duïng caùc ion kim loaïi ñeå laøm maùt heä thoáng nöôùc. Neáu phöông thöùc khöû truøng ñöôïc tìm thaáy coù hieäu quaû cho nöôùc laøm maùt, söû duïng caùc ion ñoàng coù theå thöïc hieän kieåm soaùt caû Legionella vaø taûo. Noàng ñoä cuûa caùc ion vaø caùc taùc ñoäng baát lôïi cuûa chuùng veà khaû naêng xöû lyù nöôùc thaûi ôû haï nguoàn phaûi ñöôïc kieåm tra, theo doõi thöôøng xuyeân. 4.3.2.3. Nhöõng chaát oxi hoùa Nhieàu taùc nhaân oxy hoùa ñöôïc söû duïng roäng raõi vaø thaønh coâng ñeå khöû truøng nöôùc uoáng. Nhöõng chaát ñoù laø nhöõng halogen (chlor, brom, iode), chlodrine dioxide, nhöõng chloramine, ozone, hydroxy peroxide vaø thuoác tím kali. Taát caû nhöõng taùc nhaân naøy cuõng ñaõ ñöôïc söû duïng trong nhöõng heä thoáng caáp nöôùc khaùc nhö nguoàn nöôùc laïnh vaø nhöõng hoà taém. Moät chaát höõu cô khaùc nhö 1-Brom-3-chlor-5,5-dimethylhydantoin (BCDMH) coù chöùa brom vaø chlor cuõng ñöôïc söû duïng ñeå kieåm soaùt Legionella trong nöôùc laïnh. Trong soá caùc taùc nhaân oxy hoùa, chlor ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát trong thuoác khöû truøng ôû Myõ. Do lo ngaïi taùc haïi cuûa chaát khöû truøng lieân quan ñeán chlor (ví duï nhö trihalomethanes, chlorform ), thuoác khöû truøng khaùc (ví duï nhö ozone, caùc hôïp chaát khöû trung chlor khaùc vôùi saûn phaåm phuï ít ñoäc haïi hôn) vaø lieàu löôïng chlor thaáp ñöôïc söû duïng cho vieäc khöû truøng nöôùc uoáng. Chlor cuõng ñaõ ñöôïc söû duïng trong hoà bôi vaø nöôùc laïnh. Ñeå kieåm soaùt L.pneumophila thì noàng ñoä cuûa chlor ñöôïc söû duïng laø 2-6mg/L. McCall baùo caùo laø ôû noàng ñoä 2 mg/L chlor thì löôïng vi khuaån Legionella trong töï nhieân giaûm (caû sinh vaät phuø du vaø maøng sinh hoïc) trong voøng 1 h. Chlor coù hieäu quaû choáng laïi L.pneumophila ôû nhieät ñoä cao laø 250C so vôùi 430C. Coù ba vaán ñeà chính lieân quan ñeán quaù trình chlor hoùa : aûnh höôûng trong thôøi gian daøi, khaû naêng phaân huûy, vaø caùc saûn phaåm phuï trong quaù trình chlor hoùa vaø tính ñoäc cuûa chlorine. Tröôùc tieân chlor hoùa coù theå ngaên chaën Legionella nhöng hieám khi loaïi boû Legionella. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích bôûi söï hieän dieän cuûa Legionella trong amip, coù theå chòu ñöôïc chlorine hay chlor khoâng thaâm nhaäp vaøo maøng sinh hoïc. Thöù hai, söùc aên moøn cuûa chlor phaûi ñöôïc xem xeùt ñoái vôùi nhöõng caùi oáng vaø nguyeân lieäu xaây döïng ñöôïc duøng trong nhöõng heä thoáng caáp nöôùc coù chlor neân ñöôïc baûo veä baèng caùch phuû natri silicat. Cuoái cuøng, keå töø khi phaùt hieän caùc saûn phaåm cuûa chlor hoùa (ví duï nhö chlor höõu cô) trong nöôùc uoáng naêm 1970, moái quan taâm lôùn laø taùc ñoäng xaáu ñaán söùc khoûe, ñaëc bieät laø gaây ung thö. Nöôùc chlor thaûi ra coù theå gaây ñoäc haïi ñoái vôùi caùc vi sinh vaät trong xöû lyù sinh hoïc nöôùc thaûi cuûa heä thoáng. Ngoaøi ra, brom ñaõ ñöôïc söû duïng trong hoà bôi vaø nöôùc laøm maùt, nhöng khoâng ñöôïc ñeà nghò trong vieäc xöû lyù nöôùc saïch. Töông töï nhö chlor, brom toàn taïi nhö acid hypobromous trong nöôùc trong hai hình thöùc laø HOBr vaø OBr- tuøy thuoäc vaøo pH. Thomas chæ ra raèng brom laø ít hieäu quaû hôn chlorine ñeå choáng laïi L.pneumophila, nhöng ôû noàng ñoä 0,1 – 1,5mg/L thì giaûm kieåm soaùt cuûa L.pneumophila. Ñeå loaïi boû caùc chaát phenol thì khí chlor ñöôïc öa thích hôn chlor vì chlor coù theå chuyeån ñoåi phenol thaønh chlorophenols gaây muøi nhieàu. Chlorine dioxide ñaõ ñöôïc baùo caùo ñeå phaù vôõ söï toång hôïp protein cuûa vi khuaån. Ozone ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi ôû chaâu AÂu. Ozone phaûn öùng nhanh choùng vaø do ñoù coù theå baát hoaït xaûy ra bôûi caû khí ozone (qua tieáp xuùc vaät lyù) vaø giaûi theå ozone. Ozone coù hieäu quaû trong phoøng thí nghieäm, ôû noàng ñoä 0,1 – 0,3mg/L thì Ozone ñaït ñöôïc 99% gieát cheát trong 5 phuùt, trong khi ñoù chlor vaø hydrogen peroxide ôû noàng ñoä 0,3 – 1mg/L trong 30 phuùt. Hydrogen peroxide vaø permanganat kali laø chaát khöû truøng yeáu hôn chlor vaø ozone vaø khoâng ñöôïc söû duïng roäng raõi. Yahya tieán haønh nghieân cöùu trong phoøng thí nghieäm veà vieäc söû duïng permanganat kali treân L.pneumophila vaø baùo caùo raèng ñaõ gieát cheát 99% trong 10 phuùt ôû pH =6, noàng ñoä laø 5mg/L. CHÖÔNG 5 : KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ 5.1. Keát luaän Legionella laø vi khuaån soáng phoå bieán trong moâi tröôøng nöôùc töï nhieân vaø ñöôïc tìm thaáy deã daøng trong moâi tröôøng thuûy saûn. Legionella toàn taïi trong moät ñieàu kieän nhaát ñònh vôùi nhieät ñoä töø 0 – 630C, pH = 5,0 – 8,5. Legionella phaùt trieån toát ôû nöôùc aám. Nhieät ñoä laø yeáu toá quan troïng quyeát ñònh söï phaùt trieån cuûa Legionella. Nhieàu nghieân cöùu ñaõ chöùng minh raèng ñoäc toá cuûa Legionella gaây ra caùc beänh lieân quan ñeán vieâm phoåi. Legionella cuõng laø nguyeân nhaân chính gaây ra caùc beänh legionellosis, soát Pontiac, Legionnaire. Caùc cô cheá gaây beänh vaø ñoäc toá cuûa Legionella raát phöùc taïp. Ñoäc toá cuûa Legionella laø moät yeáu toá quan troïng trong vieäc xaâm nhieãm vaøo vaät chuû. Legionella xaâm nhieãm vaøo caùc ñaïi thöïc baøo vaø sau ñoù soá löôïng vi khuaån taêng leân trong teá baøo raát nhanh. Ngoaøi ra, caùc yeáu khaùc cuõng laøm taêng ñoäc toá Legionella nhö : cytotoxins, endotoxin, shork nhieät vaø caùc hôïp chaát lieân quan ñeán söï haáp thu saét. Legionella ñöôïc coâ laäp töø caùc maãu coù lieân quan ñeán dòch maøng phoåi cuûa caùc ñoäng vaät. Keát quaû thu ñöôïc thì nhieãm truøng khoâng chæ gaây ra bôûi ñoäc toá cuûa Legionella maø coøn phuï thuoäc vaøo tính nhaïy caûm cuûa vaät chuû. 5.2. Kieán nghò Ñeå tìm hieåu saâu hôn veà Legionella gaây beänh trong nöôùc vaø caùc vaán ñeà lieân quan ñeán Legionella thì tröôùc tieân phaûi trang bò ñaày ñuû caùc thieát bò kyõ thuaät, duïng cuï, moâi tröôøng ñeå coù theå thao taùc, thöïc hieän nhanh hôn trong quaù trình laøm. Caàn nghieân cöùu saâu hôn caùc thöïc nghieäm lieân quan ñeán Legionella ñeå coù caùc bieän phaùp ngaên ngöøa, kieåm soaùt Legionella. Beänh vieän caàn trang bò theâm caùc duïng cuï kyõ thuaät chaát löôïng cao ñeå phaùt hieän nhanh choùng Legionella khi coù nghi ngôø ngöôøi beänh nhieãm Legionella. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO M. M. Aslani, M. Poummansour, M. Motavalian, “ Isolation of Legionella pneumophila from Tehran Hospital water samples” Iranian Biochemical Journal, 1997, PDF. P.Edelstein, S.Finegold, J.Clin Microbiol, Use of a semi – selective medium to medium to culture Legionella pneumophila from contaminated lung specimens.1979. A. Rafael Garduno, Life Cycle, Growth Cycles and Developmental Cycles of Legionella pneumophila. Legionella isolation. PDF. Lgonella Nested PCR. PDF. Legionella Immunochromatographic Assay. PDF. Legionella 15PCR.PDF. Legionella ScanVIT.PDF. www.genesystem.fr www.legionella.org