Luận văn Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng

ới cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-β-D-Glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid) và đem đo mật độ quang ở bước sóng 535nm.  Hóa chất * Dung dịch đệm phosphat 0,2M, pH 6,5 - Dung dịch NaH2PO4 0,2M: cân 31,2g NaH2PO4.2H2O hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml. - Dung dịch Na2HPO4 0,2M: cân 71,6g Na2HPO4.12H2O hòa tan và thêm nước cất đến 1000ml. * Thuốc thử DNS - Dung dịch A: hòa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào trong 500ml nước cất. - Dung dịch B: hòa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N. - Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh không khí.  Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1% Do chitin không hòa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hóa chitin: Lấy 5 gam chitin hòa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong vòng 3 phút ở 40C. Sau đó cho nước cất lạnh 5C từ từ tới 500ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa. Huyền phù sẽ được lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Rửa nước cất nhiều lần để pH đạt trung tính, bảo quản huyền phù ở tủ lạnh (2-6C).  Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamine Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ N-acetyl-β-D- Glucosamine 10µmol/ml chuẩn (µmol/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 Thể tích dung dịch N-acetyl-β- D-Glucosamine (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Thể tích nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 DNS (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 Lắc đều, đun sôi 5 phút H2O (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 Lắc đều, để yên 5 phút, đo OD ở bước sóng 535 nm Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-β-D-Glucosamine chuẩn 10µmol/ml: cân chính xác 0,0221g N- acetyl-β-D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 10ml. Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine và giá trị OD.  Xác định hoạt độ enzyme chitinase Nguyên tắc: hoạt độ enzyme chitinase được xác định đựa trên phương pháp định lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan. Tiến hành  Đối với enzyme làm thí nghiệm Chọn các ống nghiệm có cùng kích cỡ, cùng độ dày. Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml huyền phù chitin 1% và 1ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp này được ủ ở 50C trong vòng 60 phút. Ngừng phản ứng bằng 1ml NaOH 1N và đun sôi cách thủy trong 5 phút. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút hoặc lọc, thu dịch nổi. Cho 1ml dịch nổi và 1ml DNS 1%, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong bồn làm lạnh. Thêm 5ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sóng 535nm.  Đối với dịch enzyme làm đối chứng Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Cho 1ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1ml NaOH 1N, sau đó cho thêm 1ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên.  Cách tính [16] Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1g N-acetyl-β-D-Glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (500C). Tổng hoạt tính (đvht) = t Vna .. Hoạt tính chung (đvht/g.CP.E ) = mtv vna .. '.. Trong đó a: hàm lượng glucosamine (g /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng n: hệ số pha loãng V: thể tích dịch môi trường nuối cấy (ml) v’: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml) v : thể tích enzyme thí nghiệm (ml) t : thời gian phản ứng (phút) m : khối lượng enzyme (g) 2.3.6 Phương pháp khảo sát sự biến thiên hoạt độ của hệ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo các điều kiện nuôi cấy khác nhau (nhiệt độ, thời gian, chất cảm ứng) khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn [12, 23] Nguyên tắc Yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ môi trường nuôi, loại cơ chất cảm ứng ... Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuôi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase có hoạt độ cao nhất. 2.3.6.1. Xác định thời gian thích hợp để thu nhận chitinase có hoạt độ cao nhất ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (mục 2.3.3). Cấy các chủng nấm sợi. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Thu dịch chiết enzyme (mục 2.3.4) tại các thời điểm nuôi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ. Xác định sự biến thiên hoạt độ enzyme (mục 2.3.5) chitinase theo thời gian nuôi cấy các chủng nấm sợi nghiên cứu. 2.3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi đối với đối với khả năng sinh tổng hợp chitinase ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Sử dụng Môi trường 5 (mục 2.1.2), nuôi cấy trong thời gian tối ưu đã khảo sát ở trên ở các nhiệt độ môi trường 20OC, 25OC, 30OC, 35OC, 40OC, 450C. Tiến hành thu dịch chiết enzyme, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5) 2.3.6.3. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng (chitin) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng nấm sợi Sử dụng Môi trường 5 (mục 2.1.2), lần lượt bổ sung chitin ở các nồng độ 0,0%, 5%, 10%, 15%, 20%. Nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian tối ưu đã khảo sát ở mục 2.3.6.1 và 2.3.6.2. Tiến hành thu dịch chiết enzyme, xác định hoạt độ chitinase. 2.3.6.4. Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Sử dụng Môi trường 4 (mục 2.1.2), trong đó sử dụng thay thế lần lượt bột chitin, bột vỏ tôm, bột vỏ cua (tương ứng lượng chitin là 10%). Nuôi cấy trong thời gian và nhiệt độ tối ưu đã khảo sát ở trên, thu dịch enzyme thô, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5) 2.3.7 Phương pháp tối ưu điều kiện môi trường nuôi cấy nấm sợi bằng qui hoạch thực nghiệm [2] Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuôi cấy chủng nấm sợi chọn thu chế phẩm enzyme chitinase, chúng tôi dùng thực nghiệm yếu tố toàn phần. Từ các kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ từng yếu tố, chúng tôi chọn 3 yếu tố là thời gian nuôi cấy, nhiệt độ môi trường nuôi cấy và nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy để nghiên cứu tối ưu hóa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm. - Lập ma trận đầy đủ với số thí nghiệm N = 23 = 8. Vì không làm thí nghiệm song song nên để xác định phương sai tái hiện, chúng tôi làm 3 thí nghiệm ở tâm (mức cơ sở). Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Bảng 2.2. Ma trận qui hoạch thực nghiệm STT thí nghiệm x1 x2 x3 y 1 + + + y1 2 + + - y2 3 + - + y3 4 + - - y4 5 - + + y5 6 - + - y6 7 - - + y7 8 - - - y8 9 0 0 0 y0(1) 10 0 0 0 y0(2) 11 0 0 0 y0(3) - Dùng PTHQ tuyến tính dạng: ŷ = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 trong đó ŷ: hoạt độ chitinase theo phương trình hồi qui (PTHQ) - Tính b0, b1, b2, b3 ... bj - các hệ số của phương trình hồi qui bằng công thức:    N i ijij yxN b 1 1 N yxx b N i iilj jl   1 )( - Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số PTHQ theo tiêu chuẩn Student + Giá trị trung bình của thông số tối ưu hóa (hoạt độ chitinase) của 3 thí nghiệm tại tâm: ŷ0 = 3 3 1 )0(u uy + Phương sai tái hiện: Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1 )( 1 2 0)0( 2      n yy s n u u th với n: số thí nghiệm tại tâm (ở đây n=3)  sth + Sai số tính cho bi: N s s thbi  + Tính các giá trị t: tj = | |bj sbj với tlt: p=0,05; bậc tự do f = n-1 = 2 → t(0,05;2)= 4,3 (Tra bảng Student) Hệ số có ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện tj > tlt - Kiểm định sự tương thích của PTHQ theo tiêu chuẩn Fisher + Flt: giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0,05; f1 = N-l; f2 = n-1; trong đó N=8, l: số hệ số có ý nghĩa, n = 3. + Ftn: 2 2 th du tn s sF  với lN yy s i du     2 2 )ˆ( PTHQ thu được tương thích với thực nghiệm khi Ftn < Flt Từ PTHQ, nhận xét ảnh hưởng các yếu tố lên quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi chọn nghiên cứu. Sau đó tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm bằng phương pháp đường dốc nhất, bắt đầu từ điểm không, là mức cơ sở. Từ kết quả thu được chọn điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm sợi chọn nghiên cứu sinh trưởng và tạo chitinase có hoạt tính cao nhất. 2.3.8 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase thu nhận từ một số chủng nấm sợi nghiên cứu 2.3.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme chitinase Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ ủ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo nhiệt độ, tìm ra nhiệt độ hoạt động tối ưu của chế phẩm enzyme. 2.3.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme chitinase pH = 3,0 – 4,0: sử dụng đệm citrate Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 pH = 4,5 – 5,5: sử dụng đệm acetate pH = 6,0 – 9,0: sử dụng đệm phosphate Cân mỗi 0,1g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 5ml dung dịch đệm ở các pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong điều kiện nhiệt độ ủ tối ưu đã xác định ở mục 2.3.7a. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của lượng sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo pH, tìm ra pH tối ưu của hoạt động chế phẩm. 2.3.8.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên sản phẩm tạo thành của chế phẩm enzym chitinase Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu (mục 2.3.7a, b); thời gian phản ứng thay đổi từ 10 phút đến 90 phút, mỗi lần cách nhau 10 phút. Từ đó vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên hàm lượng glucosamine tạo ra theo thời gian phản ứng, tìm ra thời gian phản ứng tối ưu của chế phẩm enzyme chitinase. 2.3.9 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng bước đầu của chế phẩm chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi được chọn 2.3.9.1 Ứng dụng bước đầu trong diệt côn trùng sâu hại Chọn các đối tượng sâu khác nhau, xử lý dung dịch chế phẩm enzyme ở các nồng độ 0%, 1%, 2%. Theo dõi tỉ lệ sâu chết qua các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, thống kê số liệu. Đánh giá khả năng diệt côn trùng, sâu hại của chế phẩm enzyme. 2.3.9.2 Ứng dụng bước đầu trong sản xuất glucosamine Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hòa tan trong 10ml dung dịch đệm có pH tối ưu đã xác định ở mục 2.3.8.2. Sử dụng cơ chất chitin dạng bột 10% và chitin huyền phù 1%, tiến hành phản ứng enzyme trong nhiệt độ tối ưu, thời gian 70 phút. Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành, đánh giá hiệu suất tạo glucosamine. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT SƠ BỘ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI Chúng tôi tiến hành khảo sát sơ bộ (phương pháp định tính) khả năng tổng hợp chitinase của một số chủng nấm sợi gồm Trichoderma harzianum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus sp. (hình 3.1) qua việc xác định đường kính vòng phân giải (theo phương pháp đã giới thiệu ở mục 2.3.4). kết quả biểu thị ở bảng 3.1 và hình 3.2. Hình 3.1. Các chủng nấm được chọn nghiên cứu Th2: Trichoderma harzianum As: Aspergillus sp. AA: Aspergillus awamori AN: Aspergillus niger Bảng 3.1. Đường kính vòng tròn phân giải Chủng nấm Đường kính trung bình vòng enzyme phân giải D – d (mm) Aspergillus niger 19,8 20.9 19.7 20,13 Aspergillus awamori 24.6 24.5 24.8 24,60 Aspergillus sp. 21.6 21.3 21.2 21,36 Trichoderma harzianum 21,2 20,5 22,7 21,46 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Kết quả cho thấy cả bốn chủng chọn nghiên cứu đều có khả năng phân giải chitin, trong đó chủng Aspergillus niger có khả năng tổng hợp enzyme chitinase thấp nhất. Từ đó chúng tôi chọn ba chủng Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma harzianum tiếp tục nghiên cứu. Hình 3.2. Vòng phân giải enzyme chitinase của các chủng nấm sợi nghiên cứu 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN 3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Thí nghiệm tiến hành với mục đích xác định thời gian nuôi cấy thích hợp để thu enzym chitinase có hoạt độ cao nhất. Quá trình nuôi cấy các chủng tiến hành theo mục 2.3.3 nhằm thu nhận canh trường, tiến hành khảo sát hoạt độ hệ enzyme thủy phân của canh trường tại các thời điểm nuôi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, 108 giờ với điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ 300C, 10 gam môi trường/bình tam giác 250ml. Pha loãng dịch chiết enzyme 10 lần (hệ số pha loãng n=1) trước khi đem xác định hoạt độ chitinase theo mục 2.3.5. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.3 và đồ thị 3.1  Nhận xét: Asp. awamori Asp. niger T. harzianum Aspergillus. sp. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Từ kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy hệ enzyme chitinase của canh trường đối với chủng nấm sợi Aspergillus awamori có hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuôi cấy là 36 giờ, chitinase của Aspergillus sp. có hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuôi cấy là 72 giờ và Trichoderma harzianum có hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuối cấy là 60 giờ. Trong cả ba chủng thì Aspergillus awamori tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất trên môi trường nuôi cấy thí nghiệm, hoạt độ đạt 1,02 UI/gCT, ngoài ra thời gian thu nhận enzyme đạt hoạt độ cao ngắn (36 giờ), đây là ưu điểm cần chú ý đến vì sẽ nâng cao hiệu suất thu nhận enzyme nhờ tiết kiệm thời gian nuôi. Bảng 3.2. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo thời gian nuôi cấy Chủng Thời gian nuôi cấy (giờ) ∆OD‹535nm› Lượng Glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori 24 0,035 10,179 0,51 36 0,069 20,358 1,02 48 0,064 18,792 0,94 60 0,049 14,486 0,72 72 0,028 8,124 0,41 84 0,018 5,383 0,27 96 0,013 3,915 0,20 108 0,007 2,153 0,11 Aspergillus sp. 24 0,018 5,383 0,27 36 0,029 8,515 0,43 48 0,038 11,158 0,56 60 0,048 14,192 0,71 72 0,059 17,226 0,86 84 0,048 14,094 0,70 96 0,035 10,375 0,52 108 0,014 4,013 0,20 Trichoderma harzianum 24 0,012 3,426 0,17 36 0,024 7,145 0,36 48 0,043 12,626 0,63 60 0,061 18,009 0,90 72 0,056 16,541 0,83 84 0,048 13,996 0,70 96 0,040 11,647 0,58 108 0,028 8,124 0,41 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1.02 0.860.90 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 24 36 48 60 72 84 96 108 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ c hi tin as e (U I/g C T) A. awamori Aspergillus sp. T.harzianum Đồ thị 3.1. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường theo thời gian nuôi cấy 3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy Từ kết quả thu được ở mục 3.2.1, chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy đối với chủng Aspergillus awamori là 36 giờ, chủng Aspergillus sp. là 72 giờ và Trichoderma harzianum là 60 giờ để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của các chủng. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy (MT5) như phương pháp trình bày ở mục 2.3.3. Các bình tam giác nuôi cấy được đặt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C. Tùy từng chủng chúng tôi tiến hành thu nhận dịch enzyme thô từ canh trường nuôi cấy tại thời điểm thời gian tối ưu nêu trên, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase trong dịch enzyme thô. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.3 và đồ thị 3.2. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Bảng 3.3. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo nhiệt độ môi trường nuôi cấy Chủng Nhiệt độ (0C) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µG/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori 20 0,013 3,719 0,19 25 0,044 13,017 0,65 30 0,069 20,162 1,01 35 0,078 22,805 1,14 40 0,055 16,149 0,81 45 0,023 6,753 0,34 50 0,005 1,370 0,07 Aspergillus sp. 20 0,019 5,677 0,28 25 0,047 13,898 0,69 30 0,057 16,835 0,84 35 0,061 18,009 0,90 40 0,066 19,281 0,96 45 0,048 14,094 0,70 50 0,032 9,396 0,47 Trichoderma harzianum 20 0,015 4,502 0,23 25 0,040 11,843 0,59 30 0,064 18,890 0,94 35 0,057 16,639 0,83 40 0,039 11,549 0,58 45 0,025 7,439 0,37 50 0,012 3,426 0,17 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1.14 0.96 0.94 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 20 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ (độ C) H oạ t đ ộ c hi tin as e (U I/g C T) A. awamori Aspergillus. sp. T. harzianum Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo nhiệt độ nuôi cấy  Nhận xét: Khi nhiệt độ tăng dần trong khoảng 250C đến 350C, hoạt độ chitinase của các chủng nấm sợi cũng tăng, trong đó chủng Aspergilllus awamori đạt hoạt độ chitinase cao nhất (1,14UI/gCT) tại khoảng nhiệt độ 350C, nhưng cao hơn nhiệt độ này, tại khoảng nhiệt độ 400C, hoạt độ chitinase giảm đáng kể. Trong khi đó, chủng Aspergillus sp. thể hiện có khả năng chịu nhiệt, theo dõi quá trình sinh trưởng của nấm ở các khoảng nhiệt độ biến thiên ở trên, chúng tôi nhận thấy hệ sợi nấm phát triển tốt bám chặt cơ chất, tuy nhiên hoạt độ chitinase cao nhất tại nhiệt độ nuôi 400C là 0,96UI/gCT, thấp hơn so với Aspergilllus awamori. So sánh với nghiên cứu của Jin-Ian Xia và Jing Xiong (2009) trên nấm Aspergillus fumigatus thì nhiệt độ tối ưu cho nấm này sinh chitinase hoạt độ cao nhất (0,118UI/ml) là 550C. Tác giả Phakapob Setthakaset và cộng sự (2008) thu nhận chitin từ Aspergillus sp thì ở nhiệt độ tối ưu là 450C, hoạt độ chitinase cao nhất đạt 3,1UI/ml. Đối với Trichoderma harzianum, hoạt độ chitinase cao nhất ở khoảng nhiệt độ 300C, đạt 0,94UI/gCT, thấp nhất trong ba chủng nghiên cứu. 3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitin trong môi trường nuôi cấy Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với mục đích xác định hàm lượng chitin trong môi trường nuôi cấy thích hợp để thu enzyme chitinase có hoạt độ cao nhất. Quá trình nuôi cấy các chủng tiến hành theo mục 2.3.2 nhằm thu nhận canh trường tại thời điểm tối ưu tương ứng, tiến hành khảo sát Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 hoạt độ hệ enzyme thủy phân với các hàm lượng khác nhau của chitin trong môi trường nuôi cấy là 0,0%, 5%; 10%; 15%; 20% với 10 gam môi trường/bình tam giác 250ml. Pha loãng dịch chiết enzyme 10 lần (hệ số pha loãng n=1) trước khi đem xác định hoạt độ chitinase theo mục 2.3.5. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4 và đồ thị 3.3.  Nhận xét: Khi không có mặt chitin trong môi trường nuôi cấy, các chủng nấm sợi vẫn sinh tổng hợp chitinase nhưng hoạt độ thấp, sản lượng không đáng kể. Điều này thể hiện chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng. Khi bổ sung bột chitin vào môi trường bán rắn, chitin là chất cảm ứng kích thích nấm sợi sản sinh nhiều chitinase. Theo kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy, ở nồng độ chitin trên môi trường bán rắn là 10 – 15% hoạt độ chitinase đạt giá trị cao nhất, vượt qua nồng độ chitin 15%, hoạt độ enzyme chitinase có xu hướng giảm. Trong các chủng nấm sợi nghiên cứu, Aspergillus awamori vẫn thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase có hoạt tính cao, đạt 1,16UI/gCT ở nồng độ chitin là 15%, từ nồng độ chitin 10% đến 15%, hoạt độ chitinase tăng không đáng kể. Chủng Aspergillus sp. thể hiện nhu cầu chất cảm ứng chitin không cao, vượt qua tỉ lệ chitin bổ sung vào môi trường nuôi 10% thì hoạt độ enzyme giảm. Còn ở nấm sợi Trichoderma harzianum, khi môi trường không có chitin thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase cao hơn hẳn hai chủng nấm còn lại. Tuy nhiên khi nồng độ chitin tăng, hoạt độ enzyme tăng đáng kể và đạt giá trị cao nhất ở nồng độ chitin trong môi trường bán rắn là 1,04UI/gCT, vẫn thấp hơn so với Aspergillus awamori. Bảng 3.4. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo hàm lượng chitin trong môi trường nuôi cấy Chủng Hàm lượng chitin (%) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori 0 0,016 4,796 0,24 5 0,026 7,732 0,39 10 0,078 22,805 1,14 15 0,079 23,196 1,16 20 0,043 12,724 0,64 Aspergillus sp. 00 0,013 3,915 0,20 5 0,038 11,158 0,56 10 0,067 19,673 0,98 15 0,066 19,281 0,96 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 20 0,049 14,388 0,72 Trichoderma harzianum 0 0,027 8,026 0,40 5 0,052 15,171 0,76 10 0,065 19,086 0,95 15 0,071 20,847 1,04 20 0,054 15,856 0,79 1.16 0.98 1.04 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 0 5 10 15 20 Hàm lượng chitin (%) H oạ t đ ộ c hi tin as e (U I/g C T) A.awamori Aspergillus sp. T. harzianum Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo hàm lượng chất cảm ứng (chitin) trong môi trường nuôi cấy 3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng Aspergillus awamori Từ kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy Aspergillus awamori thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất trong ba chủng nghiên cứu, thời gian nuôi cấy ngắn (36 giờ). Do đó, chúng tôi quyết định chọn chủng Asprgillus awamori để nghiên cứu tiếp tục nhằm thu nhận enzyme. Trước hết, chúng tôi khảo sát chất cảm ứng phù hợp để chủng này sinh tổng hợp chitinase có hoạt độ cao nhất, chất cảm ứng được sử dụng gồm: bột chitin, bột vỏ tôm và bột vỏ cua, với hàm lượng chitin 16%, từ đó suy ra lượng chất cảm ứng cần bổ sung (phụ lục 2). Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5 và đồ thị 3.4. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Bảng 3.5. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori theo loại chất cảm ứng Chủng Chất cảm ứng ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori Bột chitin 0,079 23,196 1,16 Bột vỏ tôm 0,057 16,639 0,83 Bột vỏ cua 0,055 16,052 0,80 Chủng Aspergillus awamori 0.83 0.80 1.16 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 Bột chitin Bột vỏ tôm Bột vỏ cua Loại chất cảm ứng Ho ạt độ c hi tin as e (U I/g CT ) Biểu đồ 3.1. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường Asp. awamori theo loại chất cảm ứng bổ sung  Nhận xét Hoạt độ chitinase cao nhất (1,16UI/gCT) khi sử dụng chất cảm ứng là bột chitin. Như vậy, chất chitin dạng bột là chất cảm ứng tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của Aspergillus awamori. Điều này có thể giải thích do trong vỏ của tôm cua còn chứa nhiều khoáng, ảnh hưởng đến hoạt động sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi.  Thảo luận Từ các kết quả thu được, có thể thấy hoạt độ enzyme chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori cao nhất, ngoài ra thời gian nuôi cấy chủng này ngắn, thuận lợi cho việc thu nhận enzyme, do đó chúng tôi chọn chủng này nghiên cứu tối ưu bằng qui hoạch thực nghiệm Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 3.3 KẾT QUẢ QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM NHẰM TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ẢNH HƯỞNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA ASPERGILLUS AWAMORI Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành làm quy hoạch thực nghiệm, chọn các yếu tố ảnh hưởng với các giới hạn và miền khảo sát như ở bảng 3.6 Bảng 3.6. Các mức và khoảng biến thiên Yếu tố Các mức Khoảng biến thiên Mức dưới (-) Tâm (0) Mức trên (+) X1 : thời gian (giờ) 30 36 42 6 X2 : nhiệt độ (độ C) 30 35 40 5 X3 : nồng độ chitin (%) 10 15 20 5 Thiết lập ma trận thí nghiệm, ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo x0 = +1 và các hệ số tương tác. Thu được kết quả như bảng 3.7. Bảng 3.7. Ma trận mở rộng và kết quả quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme chitinase của canh trường Asp. awamori Các yếu tố theo tỉ lệ xích tự nhiên Các yếu tố trong hệ mã hóa STT thí nghiệm Z1 Z2 Z3 x1 x2 x3 y 1 42 40 20 + + + 1,64 2 42 40 10 + + - 0,67 3 42 30 20 + - + 1,20 4 42 30 10 + - - 0,20 5 30 40 20 - + + 0,58 6 30 40 10 - + - 0,10 7 30 30 20 - - + 1,27 8 30 30 10 - - - 0,92 9 36 35 10 0 0 0 1,31 10 36 35 10 0 0 0 1,34 11 36 35 10 0 0 0 1,31 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Ghi chú: Z1: Thời gian nuôi cấy (giờ) Z2: Nhiệt độ môi trường nuôi cấy (0C) Z3: Hàm lượng chitin trong môi trường nuôi cấy (%) x1, x2, x3: biến số mã hóa của biến thực Z1,Z2, Z3 (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. y là hoạt độ enzyme chitinase thu được sau đo OD535. Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng y = f (x1, x2, x3) Hàm mục tiêu có dạng: ŷ=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b12x1x2+b13x1x3+b23x2x3+b123x1x2x3 trong đó b0, b1,b2, b3, b12, b13, b23, b123 là các hệ số của phương trình hồi qui. ŷ là hoạt độ enzyme chitinase ước tính. Các hệ số trong PTHQ được xác định theo công thức mục 2.3.7. Kết quả tính được: b0 0,82 b1 0,11 b2 -0,08 b3 0,35 b12 0,30 b13 0,14 b23 0,01 b123 -0,02 Hệ số có ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện: tj > tlt tlt tính theo công thức ở mục 2.3.7 t0 147,60 t1 18,92 t2 13,64 t3 62,91 t12 54,33 t13 25,74 t23 2,42 t123 -3,52 So sánh các hệ số tj với tlí thuyết ta thấy các hệ số của phương trình đều có nghĩa, ngoại trừ hệ số t 23 và t123. Như vậy, sau khi giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05, số bậc tự do f = 3-1 = 2, chúng tôi thu được phương trình hồi quy Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3 Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher với Ftính = 6,19; F0.95(5;1;2) = 19,296. Do Ftính < F0.95(5;1;2) nên phương trình hồi quy thu được tương thích với thực nghiệm. Từ PTHQ thu được, ta thấy muốn tăng giá trị của thông số tối ưu hóa cần tăng giá trị x1 (thời gian) và x3 (hàm lượng chitin), giảm giá trị x2 (nhiệt độ). Từ đó chúng tôi tiến hành tối ưu hóa quá trình khảo sát hàm mục tiêu bằng phương pháp leo dốc (phương pháp Box-Wilson). Đối với thời gian nuôi, chúng tôi chọn bước nhảy là 2 giờ, đối với nhiệt độ, chúng tôi chọn bước nhảy (giảm dần) là 1, còn đối với hàm lượng chitin, chúng tôi chọn bước nhảy là 2 (tăng dần). Tiến hành bố trí thí nghiệm và kết quả thu được như bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả nuôi cấy Aspergillus awamori theo kế hoạch leo dốc STT TN Z1 Z2 Z3 y 1 36 35 10 1,15 2 38 34 12 1,38 3 40 33 14 1,42 4 42 32 16 1,69 5 44 31 18 1,41 6 46 30 20 1,23 7 48 29 22 1,19 Kết quả cho thấy, điều kiện nuôi cấy trên môi trường bán rắn thích hợp cho Aspergillus awamori sinh trưởng và tạo chitinase là chất cảm ứng là chitin, thời gian nuôi cấy 42 giờ, nhiệt độ môi trường nuôi cấy là 320C, hàm lượng chitin trong môi trường là khoảng 16%, ta tiếp tục nuôi cấy đồng loạt để thu enzyme chitinase. 3.4 THU NHẬN ENZYME CHITINASE 3.4.1 Nuôi Aspergillus awamori trên môi trường bán rắn Khối lượng môi trường vào bình tam giác lớn, khoảng 50-60gMT/bình (hoặc có thể sử dụng bịch nilon chịu nhiệt). Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 320C, bổ sung lượng chitin vào môi trường là 16%, sau 42 giờ thu chế phẩm. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Hình 3.3. Nuôi Asp. awamori trên môi trường bán rắn trong bình tam giác 1000ml để thu nhận enzyme  Nhận xét Trong ngày đầu tiên (sau 24 giờ) thì sự xuất hiện sợi nấm mốc chưa thấy rõ, sau đó xuất hiện những sợi trắng mờ mọc lan ra, chủ yếu là ở bề mặt, càng sâu vào trong môi trường thì càng ít. Sau đó sợi nấm lan ra mạnh, bám chặt cơ chất, thấy rõ màu trắng hơi đục của hệ sợi trên môi trường. Sau khoảng 36 giờ trở đi thì thấy rõ bào tử màu nâu xuất hiện khắp trên bề mặt môi trường. 3.4.2 Thu nhận chế phẩm enzyme chitinase Sau 42 giờ nuôi cấy trong bình tam giác 1000ml, ta tiến hành trích ly enzyme bằng nước cất với tỷ lệ môi trường/nước là ¼. Dịch chứa enzyme này sẽ được ly tâm lạnh để loại bỏ bào tử và tơ nấm, ta sẽ thu được dịch enzyme thô gồm có chitinase, nước và các chất hòa tan khác. Dịch trích ly enzyme Dịch enzyme sau ly tâm Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Hình 3.4. Dịch chiết enzyme chitinase Chọn ethanol làm tác nhân kết tủa trong thời gian 12 giờ. Ly tâm để thu tủa, đem sấy ở nhiệt độ thấp (dưới 300C) cho đến khô, lượng chế phẩm enzyme chitinase bán tinh sạch dạng bột khô được đóng gói và đem bảo quản trong tủ lạnh. Hình 3.5. Dịch enzyme khi tủa bằng cồn Bảng 3.9. Kết quả thu nhận chế phẩm enzyme chitinase dạng bột khi nuôi cấy Aspergillus awamori trên môi trường bán rắn Lần thí nghiệm Canh trường (gam) CPE (gam) Hoạt độ (UI/gCPE) 1 80 0,7 102,39 2 80 1,0 101,67 3 80 0,9 100,95 Trung bình 80 0,86 101,67 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Hình 3.6. Tủa enzyme thu được sau khi ly tâm (trái) và sau khi sấy khô (phải) Hình 3.7. Chế phẩm enzyme bán tinh sạch đem bảo quản trong tủ lạnh 3.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HOẠT ĐỘNG XÚC TÁC CỦA CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THU NHẬN TỪ ASPERGILLUS AWAMORI 3.5.1 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme chitinase Sau khi tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.8, xác định lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase, kết quả thể hiện trên bảng 3.10 và đồ thị 3.5. Bảng 3.10. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành dưới tác động chế phẩm chitinase Asp.awamori theo nhiệt độ phản ứng Chủng Nhiệt độ phản ứng (0C) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Aspergillus awamori 30 0,101 29,558 40 0,115 33,767 50 0,125 36,801 60 0,061 17,813 70 0,032 9,494 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 80 0,008 2,447 36.801 0 10 20 30 40 30 40 50 60 70 80 Nhiệt độ phản ứng (độ C) Lư ợn g gl uc os am in e (m ic ro ga m /m l) A. awamori Đồ thị 3.4. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành dưới tác động chế phẩm chitinase Asp. awamori theo nhiệt độ phản ứng  Nhận xét: Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ thích hợp cho chitinase của chủng Aspergillus awamori trong phản ứng thủy phân dao động từ 300C – 500C và nhiệt độ tối ưu là 500C. 3.5.2 Kết quả xác định pH thích hợp cho hoạt động của enzyme Sau khi chuẩn bị dung dịch đệm ở các pH khác nhau từ 3,0 đến 9,0 (xem phụ lục), chúng tôi hòa tan 0,1 gam chế phẩm trong 5 ml mỗi dung dịch đệm. Đem ủ với chitin huyền phù ở nhiệt độ tối thích ở mục 3.5.1 trong thời gian 60 phút. Kết quả xác định lượng glucosamine tạo thành thể hiện ở bảng 3.11 và đồ thị 3.6. Bảng 3.11. Sự biến thiên hoạt lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. awamori ở các pH khác nhau Chủng Giá trị pH ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Aspergillus awamori 3,0 0,097 28,384 3,5 0,088 25,741 4,0 0,157 46,197 4,5 0,118 34,746 5,0 0,130 38,073 5,5 0,100 29,265 6,0 0,073 21,533 6,5 0,066 19,252 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 7,0 0,036 10,668 46.197 0 10 20 30 40 50 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 pH Lư ợn g G lu co sa m in e (m ic ro ga m /m l) Asp. Awamori Đồ thị 3.5. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. awamori ở các pH khác nhau  Nhận xét Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy pH thích hợp cho chitinase của chủng Aspergillus awamori trong phản ứng thủy phân dao động từ 3,0 – 5,0 và pH tối ưu là 4,0. 3.5.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng lên lượng sản phẩm tạo thành Sau khi tiến hành thí nghiệm thủy phân chitin bằng CPE chitinase ở các thời gian khác nhau (mục 2.3.8.3) và tiến hành xác định lượng glucosamine tạo thành, chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.12 và đồ thị 3.7. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Bảng 3.12. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. Awamori theo thời gian phản ứng Chủng Thời gian phản ứng (phút) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Aspergillus awamori 10 0,036 10,473 20 0,073 21,533 30 0,118 34,746 40 0,148 43,554 50 0,164 48,252 60 0,170 49,818 70 0,169 49,721 80 0,169 49,525 90 0,168 49,427 49.818 0 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian phản ứng (phút) Lư ợn g G lu co sa m in e (m ic ro g/ m l) Đồ thị 3.6. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. awamori theo thời gian phản ứng  Nhận xét Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi nhận thấy trong giai đoạn đầu lượng glucosamine tạo ra tỉ lệ thuận với thời gian phản ứng, tại thời gian 60 phút đạt đạt lượng glucosamine là 49,818µg/ml. Tuy nhiên từ khoảng thời gian 70 phút trở lên, lượng glucosamine tạo ra hầu như không tăng. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 3.6 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THU NHẬN TỪ ASPERGILLUS AWAMORI 3.6.1 Ứng dụng bước đầu trong phòng trừ sâu Chúng tôi chọn hai loại sâu khác nhau để thử nghiệm khả năng phân giải chitin của chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori. Loại sâu chúng tôi chọn gồm sâu gạo (tên khoa học là Zoophobas mario) là loại sâu được dùng làm thức ăn cho chim cảnh trên thị trường; loại sâu thứ hai chúng tôi thử nghiệm là sâu trên lá cây lạc tiên (còn gọi là cây Chùm bao hay dây nhãn lồng Passiflora foetida). Mục đích sử dụng các loại sâu này nhằm bước đầu đánh giá tác động của chitinase lên sâu hại, đối tượng có lớp vỏ chitin bao bọc. Cho số lượng sâu 20 con/đĩa petri (đối với sâu 1) và 10 con/đĩa petri (đối với sâu 2), đĩa đối chứng chỉ cho lượng nước cất tương đương lượng dung dịch chế phẩm sử dụng thí nghiệm (1ml/đĩa petri). Cho mỗi đĩa thí nghiệm 1ml dịch CPE chitiase nồng độ 1% và 2%. Theo dõi số lượng sâu chết qua các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tính giá trị trung bình. So sánh kết quả với mẫu đối chứng, đánh giá sơ bộ khả năng diệt sâu của CPE. A-SÂU 1: Sâu gạo B-SÂU 2: Sâu cây lạc tiên C-Mẫu sâu 2 làm thí nghiệm D-Thí nghiệm đối chứng trên sâu 1 A B C D Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 E-Xử lý sâu 1 với dung dịch CPE 1% F-Xử lý sâu 1 với dung dịch CPE 2% G-Thí nghiệm trên sâu 2 H-Thí nghiệm đối chứng trên sâu 2 Hình 3.8. Thử nghiệm tác dụng CPE chitinase Asp. Awamori trên sâu Bảng 3.13. Sự biến thiên hoạt độ dịch chiết enzyme chitinase thu nhận từ chủng Asp. awamori theo thời gian phản ứng Loại sâu Nồng độ CPE (%) Thời gian tác động (phút) Tỉ lệ trung bình sâu chết (%) SÂU 1 0% 90 13,3 1% 90 78,3 2% 90 85,0 SÂU 2 0% 90 5,4 1% 90 70,0 2% 90 93,3  Nhận xét Qua bảng số liệu trích dẫn 3.13, chúng tôi nhận thấy CPE chitinase thu nhận từ Aspergillus awamori thể hiện khả năng tác động khá mạnh lên lớp vỏ chitin của sâu hại, côn trùng. Sau cùng E F G H Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 khoảng thời gian 90 phút, trung bình có khoảng trên 70% sâu chết khi xử lý dung dịch chế phẩm nồng độ 1% và trên 85% sâu chết khi xử lý dung dịch chế phẩm 2%, cao hơn nhiều so với tỉ lệ chết của thí nghiệm đối chứng (khoảng 5-13%). từ đó mở ra hướng ứng dụng sâu hơn của CPE chitinase thu nhận từ nấm Aspergillus awamori trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 3.6.2 Ứng dụng bước đầu trong sản xuất glucosamine Chúng tôi sử dụng hai loại nguyên liệu khác nhau là chitin dạng bột và chitin huyền phù để thử nghiệm ứng dụng bước đầu chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori trong sản xuất glucosamine. Điều kiện hoạt động chế phẩm là điều kiện tối ưu đã thu được từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.5 (pH = 4, nhiệt độ ủ là 500C, thời gian thủy phân là 70 phút), nồng độ CPE là 0,2%, bột chitin là 1,6g/10ml (16%) nước cất, chitin huyền phù 1%. Tỉ lệ dung dịch CPE và nguyên liệu là 1 : 1. Kết quả thu nhận được thể hiện trên bảng 3.13 Bảng 3.14. Hàm lượng glucosamine thu được từ phản ứng thủy phân chitin bằng CPE chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori Nguyên liệu ∆OD Lượng glucosamine (µg/ml) Hiệu suất Chitin dạng bột 0,041 11,79 Thấp Chitin huyền phù 0,123 35,55 Trung bình  Nhận xét Số liệu bảng 3.13 chỉ ra rằng, hiệu suất thủy phân chitin của chitinase ở nồng độ CPE 2%, nhiệt độ phản ứng 500C và thời gian phản ứng 70 phút cho hàm lượng glucosamin đạt 10,81µg/ml từ nguyên liệu chitin dạng bột và 35,55 µg/ml khi sử dụng nguyên liệu là chitin dạng huyền phù. Hiệu suất thủy phân của CPE thấp nhưng nguồn enzyme chitinase từ nấm sợi dễ thu nhận, chi phí thấp, cũng đáng để nghiên cứu sử dụng. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Đã nghiên cứu điều kiện môi trường tối ưu cho sự sinh tổng hợp chitinase của ba chủng nấm sợi là: Aspergillus awamori: nhiệt độ thích hợp nhất là 350C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 36-40 giờ. Aspergillus sp.: nhiệt độ thích hợp nhất là 400C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 72 giờ. Trichoderma harzianum: nhiệt độ thích hợp nhất: 300C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 60 giờ. - Chitin là chất cảm ứng tốt để nuôi cấy nấm sợi nhằm thu nhận chitinase - Đã tiến hành qui hoạch thực nghiệm, phương trình hồi qui thu được tương thích với thực nghiệm: ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3 Từ đó suy ra điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Aspergillus awamori là thời gian nuôi cấy 42 giờ, nhiệt độ nuôi là 320C, lượng chitin bổ sung thích hợp là 16%. - Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi Aspergillus awamori là nhiệt độ 500C, pH = 4,0. - Đã bước đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ Aspergillus awamori trong diệt trừ sâu hại và sản xuất glucosamine. 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của một số chủng nấm mốc khác. - Tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi enzyme này trong lĩnh vực sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh. [2]. Nguyễn Cảnh, Quy hoạch thực nghiệm. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [3]. Tạ Kim Chỉnh (1996), Tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt côn trùng gây hại ở Việt Nam và khả năng ứng dụng. Luận án Phó Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học. [4]. Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm của vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [5]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học. NXB Giáo dục. [6]. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả khác (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 2, tập 3). NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [7]. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [8]. Bùi Xuân Đồng (1982), Nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam (tập1). NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [9]. Bùi Xuân Đồng (1997), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [10]. Đinh Minh Hiệp (2004), Nghiên cứu quy trình tách chiết và ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (coprinus fimentarius). Báo cáo tổng kết nghiệm thu, Sở khoa học và công nghệ TP. HCM, tr153-160. [11]. Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase của Trichoderma và vai trò trong kiểm soát sinh học. Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. [12]. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Miền Đông Nam Bộ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 [13]. Tô Duy Khương (2004), Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh. [14]. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh (tập 2). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [15]. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm công nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [16]. Nguyễn Đức Lượng và các tác giả (2004), Công nghệ enzym. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [17]. Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn. Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh. [18]. Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh. NXB Giáo dục. [19]. Đặng Trung Thành (2008), Bước đầu nghiên cứu thu nhận enzym chitinase trong cây khoai lang (Ipomoea batatas) tại Khánh Hòa. Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản – số 03/2008. [20]. Đồng Thị Thanh Thu (2008), Sinh hóa ứng dụng. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [21]. Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, (1990-1995). Kết quả nghiên cứu bước đầu về nấm Trichoderma, Tuyển tập các công trình nghiên cứu bảo vệ thực vật, tr 202- 210. [22]. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học. NXB Giáo dục. [23]. Lê Ngọc Tú và các tác giả khác (1982), Enzym vi sinh vật (tập 1, tập 2). NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [24]. Nguyễn Văn Tuân (2009), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp Endo-β-1,4-Glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của Endo-β-1,4-Glucanase. Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên. [25]. Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh [26]. A. Kapat, T. Panda, S.K. Rakshit (1996), Parameters optimization of chitin hydrolysis by Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions. Bioprocess Engineering 14, p.275-279. [27]. A. A. Shubakov and P. S. Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi. Applied Biochemistry and Microbiology Vol. 40 No. 5, p.445-447. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 [28]. Azaliza Safarida Wasli, madihah Md. Salleh, Suraini Abd-Aziz, Osman Hassan and Nor Muhammad Mahadi (2009), Medium Optimization for Chitinase Production from Trichoderma virens using Central Composite Design. Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol. 14, No 6, p. 781-787. [29]. Brinda Mahadevan and Don L. Crawford (1997), Properties of the chitinase of the antifugal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108. Enzyme and Microbial Technology 20, p.489-493. [30]. Crispinus A. Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride. The Journal of Genaral anh Applied Microbiology Vol 47 No 2, p.53-61. [31]. Daizo Koga (2005), Application of Chitinase in Agriculture. Journal of Metals, Materials anh Minerals Vol. 15 No. 1, p.33-36. [32]. Jennifer L. Guthrie, Sagal Khalif, Alan J. Castle (2005), An improved method for detection anh quantification of chitinase activities. Canadian Journal of Microbiology Vol. 51 Iss. 6, p.491-495. [33]. Maria Swiontek-Brzezinska, Elzbieta Lalke-Porczyk, Wojciech Donderski (2007), Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons. International Journal of Oceanography and Hydrobiology Vol. XXXVI, No.3, p.101-111. [34]. Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Gurinder Singh Hoodal (2006), Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review. Applied Microbiology Biotechnology, p.773-782. [35]. N.N. Nawani, B.P. Kapadnis (2005), Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs. Process Biochemistry 40, p.651-660. [36]. Nopakarn Rattanakit, Abhinya Plikomol, Shigekazu Yano, Mamoru Wakayama, and TakashiTachiki (2002), Ultilization of Shrimp Shellfish Waste as a Substrate for Solid-State Cultivation of Aspergillus sp. S1-13: Evaluation of a Culture Based on Chitinase Formation Which is Necessary for Chitin-Assimilation. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 93, No. 6, p. 550-556. [37]. P. Arthur Felse, T. Panda (1999), Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode. Process Biochemistry 34, p.563-566. [38]. Reetarani S.Patil, Vandana ghormade, mukund V. Deshpande (1999), chitinolitic enzymes an exploration. [39]. Sahai and Manocha, (1993), Chitinase of fungi and plants their in morphogenesis and host parasite interattion. FEMS microbiol rev 11, p 317-338. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 [40]. S.M. Akhir, S. Abd-Aziz, M.M. Salleh, R.A. Rahman, R.M. Ilias and M.A. Hassan (2009), Medium Optimisation of Chitinase Enzyme Production from Shrimp Waste Using Bacillus licheniformis TH-1 by Responnse Surface Methods. Biotechnology 8 (1), p. 120-1205. [41]. Takuya Koseki, Shinji Furuse, Kimio Iwano, Hiroshi Sakai and Hiroshi Matsuzawa (1997), An Aspergillus awamori acetylesterase: purification of the enzym, and cloning and sequencing of the gene.Bio chem. J. 326, p.485-490. [42]. Zofia Olempska-Beer (2008), Asparaginase from Aspergillus niger expressed in A. Niger. Chemical and Technical Assessment. Internet [43]. www.coe.drexel.edu/.../researchfocus.html [44]. [45]. [46]. [47]. [48]. . [49]. [50]. [51]. [52]. [53]. [54]. [55]. [56]. [57]. [58]. [59]. [60]. [61]. [62]. [63]. [64]. [65]. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 [66]. [67]. [68]. [69]. center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1.1. PHỤ LỤC 1.2. PHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE Bảng P.1. Đường chuẩn Glucosamine có nồng độ từ 0-70µg/ml Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ Glucosamine (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 OD535nm 0,115 0,148 0,165 0,216 0,561 0,297 0,325 0,340 ∆OD 0,000 0,033 0,054 0,101 0,146 0,182 0,210 0,225 1.3. 1.4. y = 0.0344x - 0.0359 R2 = 0.9873 0.00 0.10 0.20 0.30 0 10 20 30 40 50 60 70 Nồng độ Glucosamine (micromol/ml) D el ta O D <5 35 nm > Đồ THị P.1-ĐƯờNG CHUẩN GLUCOSAMINE BIểU DIễN MốI TƯƠNG QUAN GIữA ∆OD VÀ HÀM LƯợNG GLUCOSAMINE Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 1.5. PHỤ LỤC 2 - THU NHẬN CHITIN TỪ VỎ TÔM Khối lượng vỏ tôm ban đầu là 100 gam, xay nhỏ và tiến hành thu nhận chitin theo các bước ở 2.4.5. Cân khối lượng chitin, xác định tỉ lệ chitin có trong vỏ tôm. Bảng P.2- Khối lượng chitin thu được từ vỏ tôm Số lần thí nghiệm Khối lượng chitin thu được (g/100g nguyên liệu) 1 18,65 2 19,25 2 18,95 Trung bình 18,95 Hình P.2. Chitin từ vỏ tôm  Nhận xét kết quả Khối lượng chitin thu được là 18,95/100 g vỏ tôm, tỷ lệ này có thể thấp hơn thực tế (khoảng 30%) do kỹ thuật tách chiết còn hạn chế, có sự mất mát trong quá trình lọc, rửa…; nguyên liệu còn lẫn tạp chất… Chitin trong vỏ tôm là 18,95 %, khoảng 81 % thành phần còn lại chủ yếu là khoáng và protein. Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 PHỤ LỤC 3 Hình P.3 - Huyền phù chitin Hình P.3 - Hiện màu thuốc thử DNS trên ống nghiệm thử thật và ống thử không của enzyme chitinase từ chủng Aspergillus awamori ống thử thật ống thử không Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 PHỤ LỤC 4 – PHA DUNG DỊCH ĐỆM [67] 4a. Dung dịch đệm acetate( pH= 3,6-5,6) a. Dung dịch acid acetic 0,2 M: 11,55 ml CH3COOH đặc, dẫn nước đến 1000ml. b. Dung dịch Natriacetate 0,2 M: 16,4g CH3COONa hoặc 27,2g CH3COONa.3H2O được hòa tan và dẫn nước đến 1000ml nước cất. Giá trị pH dung dịch đệm phụ thuộc vào số ml dung dịch a và số ml dung dịch (b) dẫn đến 100ml a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 46,3 3,7 3,6 25,5 24,5 4,6 44 6 3,8 20 30 4,8 4b. Dung dịch đệm Cacbonat (pH = 9,2- 10,7) a. Dung dịch Natricacbonate 0,2M: 21,2 g Na2CO3 được hòa tan và dẫn nước cất đến 1000ml. b. Dung dịch Natrihydrocacbonat 0,2M: 16,8 g NaHCO3 được hòa tan và dẫn nước đến 1000 ml. Dung dịch đệm cacbonat có pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) dẫn nước đến 200ml. a (ml) b (ml) pH a (ml) b (ml) pH 4 46 9,2 27,5 22,5 10 7,5 42,5 9,3 30 20 10,1 9,5 40,5 9,4 33 17 10,2 13 37 9,5 35,5 14,5 10,3 16 34 9,6 38,5 11,5 10,4 19,5 30,5 9,7 40,5 9,5 10,5 22 28 9,8 42,5 7,5 10,6 25 25 9,9 45 5 10,7 Luaän vaên thaïc só Cao hoïc K18 PHỤ LỤC 5 Bảng P.5 - KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM CHITINASE TRÊN SÂU LOẠI SÂU SỐ LƯỢNG SÂU TN (CON) NỒNG ĐỘ CPE (%) THỜI GIAN (PHÚ T) TỈ LỆ SÂU CHẾT TN1 TN2 TN3 TB SL % SL % SL % SL % SÂU 1 20 0 30 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 60 2 10 2 10 1 5 1,7 8,3 0 90 3 15 2 10 3 15 2,7 13,3 0 120 3 15 4 20 4 20 3,7 18,3 0 150 5 25 4 20 4 20 4,3 21,7 1 30 8 40,0 7 35,0 7 35 7,3 36,7 1 60 12 60,0 12 60,0 11 55 11,7 58,3 1 90 16 80,0 15 75,0 16 80 15,7 78,3 1 120 17 85,0 16 80,0 16 80 16,3 81,7 1 150 18 90,0 16 80,0 17 85 17,0 85,0 2 30 10 50,0 12 60,0 11 55 11,0 55,0 2 60 14 70,0 14 70,0 14 70 14,0 70,0 2 90 18 90,0 17 85,0 16 80 17,0 85,0 2 120 20 100 20 100 19 95 19,7 98,3 2 150 20 100 20 100 20 100 20,0 100 SÂU 2 10 CON/TN 0 30 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 60 0 0 0 0 0 0 0,0 0 0 90 1 10 0 0 1 10 0,7 6,7 0 120 2 20 3 30 1 10 2,0 20 0 150 4 40 4 40 3 30 3,7 36,7 1 30 3 30,0 4 40,0 4 40 3,7 36,7 1 60 6 60,0 6 60,0 7 70 6,3 63,3 1 90 7 70,0 6 60,0 8 80 7,0 70,0 1 120 7 70,0 8 80,0 8 80 7,7 76,7 1 150 9 90,0 10 100 9 90 9,3 93,3 2 30 6 60,0 7 70,0 7 70 6,7 66,7 2 60 7 70,0 8 80,0 9 90 8,0 80,0 2 90 9 90,0 10 100 9 90 9,3 93,3 2 120 10 100 10 100 10 100 10,0 100 2 150 10 100 10 100 10 100 10,0 100