Luận văn Khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia Solani gây bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam

DNA hoặc RNA) được tìm thấy ở những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành cặp, nằm tại vùng chromosom. Vùng này được biết đến như vùng tổ chức nhân (NORs). Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (có những gen rRNAs như 18S, 5,8S, và 26S và những vùng phiên mã bên ngoài như ETS1 và ETS2) và một vùng không phiên mã (NTS). Trong vùng phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2. 2.6.2. Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền rDNA chứa những vùng bảo tồn (18S, 28S, 5,8S) cũng như những vùng ít bảo tồn (ITS) và những vùng biến động hơn (IGS). Những vùng này có thể được sử dụng để phân tích sự đa dạng về di truyền và sự phát sinh loài của sinh vật. Trình tự của vùng này cũng được sử dụng để tìm ra và xác định sự biến thiên số lượng của nhiều loài hoặc nhóm nấm (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005). Vùng ITS1 và ITS2 được tìm thấy giữa gen của tiểu đơn vị ribosom nhỏ (18S) và tiểu đơn vị lớn (28S) chỉ ra sự biến thiên trong cùng loài. Khuếch đại vùng ITS này sau đó phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn, được sử dụng để phân tích sự khác nhau của các loại nấm. Vùng ITS2 khám phá sau vùng ITS1, và vùng ITS2 có tính bảo tồn cao hơn ở một vài vùng tương đồng của vùng 18S. Vùng IGS thậm chí cho thấy sự biến động lớn hơn và IGS-RFLP (giống với ITS-RFLP) đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng di truyền trong cùng loài. Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành tiểu đơn vị ribosom nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào). Trình tự của gen này thích hợp 16 là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân loại vi khuẩn. Gene rDNA được tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virus và prion). Các thành phần của trình tự rDNA từ những sinh vật có quan hệ với nhau được đánh dấu giống nhau. Điều này có nghĩa, trình tự của những sinh vật thân cận đã được sắp xếp, làm cho những khác biệt được dễ dàng đánh giá. Điều đó cũng có nghĩa là chỉ một vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gen rDNA từ bất cứ loài nấm nào. Trình tự rDNA của 16S đã được xác định cho nhiều loài. Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA được cho rằng là vùng tiến hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Những universal primer được thiết kế từ những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thước nhỏ (600- 700 bp) dễ dàng được khuếch đại bởi vì số bản sao lớn (lên tới 30.000 bản sao trên một tế bào (Dubouzed and Shinoda, 1999) của vùng lặp lại trên rDNA. Điều này làm cho vùng ITS trở thành một đề tài được quan tâm cho việc nghiên cứu về sự tiến hóa và phát sinh loài (Baldwin và ctv., 1995; Hershkovitz và ctv., 1996, 1999) cũng như những nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) (Baldwin, 1993; Suh và ctv., 1993; Hsiao và ctv., 1994; Dubouzed và Shinoda., 1999) (dẫn theo Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005). Dữ liệu về trình tự của vùng ITS cũng được nghiên cứu sớm hơn để đánh giá sự đa dạng di truyền ở lúa mạch (Petersen và Seberg., 1996). 2.7. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về sự đa dạng di truyền của nấm R. solani 2.7.1. Nghiên cứu trong nƣớc Nguyễn Thị Nghiêm (1997) bằng phương pháp đánh dấu phân tử với kỹ thuật PCR sử dụng hai primer chuyên biệt ERIC1 và ERIC2, đã chia 137 dòng nấm R. solani Kühn thu thập ở đồng bằng sông Cửu Long thành 33 nhóm nấm mang tính đa dạng di truyền khác nhau. Nguyễn Thị Huệ (2003), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng rDNA-ITS cho biết hai dòng nấm R. solani phân lập từ cây húng quế và cây bông cho các đoạn cắt giới hạn có kích thước khác nhau khi được cắt bởi enzyme MboI. Hồ Viết Thế (2005), khi cắt bằng enzyme HaeIII trên vùng rDNA-ITS của 4 dòng R. solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau, đều cho hai đoạn cắt giống 17 nhau. Do đó, không thể phân tích được tính đa hình về mặt di truyền của 4 dòng này khi cắt bằng enzyme HaeIII. Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), dựa trên kỹ thuật RFLP của vùng ITS-rDNA với việc sử dụng 3 enzyme cắt TaqI, AluI, HaeIII đã nhận thấy có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của 9 dòng R. solani phân lập từ các cây ký chủ khác nhau. 2.7.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc Liu và Sinclair. (1992), dựa trên phân tích sự đa hình isozyme và cắt giới hạn DNA, đã phân chia 70 dòng phân lập thuộc AG-2 thành 5 nhóm trong loài (ISGs) là ISG 2A, ISG 2B, ISG 2C, ISG 2D, và ISG 2E. Bản đồ giới hạn DNA đã chỉ ra rằng những nhóm này có cùng kiểu gen của rDNA ti thể và mức độ giống nhau cao trong rDNA nhân của vùng ITS, bao gồm gen RNA ribosom 5,8S. Phản ứng PCR đã khuếch đại những đoạn DNA có chiều dài khác nhau khác nhau giữa 5 nhóm. Vùng ITS của nhóm 2A và 2E có cùng chiều dài 690 bp nhưng khác nhau tại một vị trí cắt của EcoRI, nhóm 2B, 2C, và 2D có cùng chiều dài 740 bp nhưng khác nhau tại ít nhất một vị trí cắt giới hạn của MspI hoặc TaqI. Matsumoto và ctv. (1996), dựa trên phân tích RFLP của gen rDNA 28S đã chỉ ra sự khác nhau giữa 3 nhóm tiếp hợp AG-1, AG-2, và AG-4 khi cắt bằng các enzyme giới hạn BamHI, HaeIII, HhaI và HpaII. Kunigana và ctv. (1997), dựa trên phân tích trình tự vùng rDNA bao gồm vùng ITS và rDNA 5,8S , đã chỉ ra rằng tính tương đồng trong trình tự của vùng ITS là trên 96% đối với những dòng ở cùng tiểu nhóm, 66 – 100% đối với những dòng khác tiểu nhóm nhưng cùng một nhóm tiếp hợp, và từ 55 – 96% đối với những dòng khác nhóm tiếp hợp. Schneider và ctv. (1997), khi sử dụng 25 enzyme( AluI, BamHI, BglII, ClaI, DdeI, DraI, EcoRV, HaeIII, HincII, HinfI, HhaI, KpnI, MboI, MspI, PstI, PvuII, RsaI, Sau3AI, SstII, StyI, TaqI, XbaI, và XhoI) cắt đoạn rDNA-ITS được khuếch đại bằng 2 primer ITS1 và ITS4, đã xác định được 13 enzyme( MspI, HaeIII, HincII, EcoRI, ClaI, Hinf I, Sau3AI, DdeI, AluI, HhaI, DraI, StyI, và TaqI) có thể cho thấy sự đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm tiếp hợp của nấm R. solani. 18 Priyatmojo và ctv. (2001), đã phân tích RFLP trên vùng rDNA-ITS, RAPD, và về các acid béo của các dòng R. solani gây bệnh đốm hoại lá trên cà phê. Kết quả cho thấy đây là một quần thể AG-1 khác với các tiểu nhóm AG-1-IA, 1-IB, và 1-IC và các tác giả đã đề xuất rằng những dòng R. solani phân lập từ cây cà phê đại diện một tiểu nhóm mới trong AG-1 là AG-1-ID. Meinhardt và ctv. (2002), bằng phương pháp RFLP trên đoạn rDNA-ITS được khuếch đại bằng cặp primer ITS1 và ITS4 cho biết, khi cắt bằng 4 enzyme TaqI, HhaII, HaeIII và MseI cho ra những băng có kích thước khác nhau. MboI là enzyme duy nhất phân cắt sản phẩm khuếch đại thành 5 băng giống nhau ở tất cả các dòng được kiểm tra. Fenille và ctv. (2003), dựa trên việc giải trình tự rDNA vùng ITS, đã chỉ ra mức độ giống nhau của những trình tự nucleotide giữa những dòng AG-1 IA, nguyên nhân gây bệnh cháy lá trên đậu nành, là 95,1 – 100% trong vùng ITS1 và 98,5- 100% trong vùng ITS2. Mức độ giống nhau của trình tự nucleotide giữa các tiểu nhóm IA, IB, và IC từ 84,3 – 89% trong vùng ITS1 và từ 93,3 – 95,6% trong vùng ITS2. Mức độ giống nhau của trình tự nucleotide giữa những dòng AG-4 (gây bệnh thối trụ hạ diệp ở đậu nành) và tiểu nhóm chuẩn AG-4 HGI là 99,1% trong vùng ITS1 và 99,3 – 100% trong vùng ITS2. Mức độ giống nhau trong trình tự của vùng ITS-5,8S rDNA đã chứng minh rằng những dòng R. solani ở Brazil gây bệnh cháy lá ở đậu nành là AG-1 IA và những dòng gây triệu chứng thối trụ hạ diệp là AG-4 HGI. Kanematsu và Naito. (1994), sử dụng phương pháp PCR-RFLP trên vùng ITS- rDNA với cặp primer ITS1 và ITS4 để phân tích sự đa dạng di truyền của nấm R. solani dòng AG-2-3, nguyên nhân gây bệnh cháy lá trên cây đậu nành. Với 4 enzyme EcoRI, HaeIII, MspI, và TaqI đã xác định AG-2-3 là một phân nhóm mới của nhóm chính AG-2. 19 Phần III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm Thời gian: từ 13/ 02/ 2006 đến 15/ 08/ 2006. Địa điểm: Phòng thực tập Bệnh cây Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học, và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm, Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2. Nội dung đề tài Phân tích sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani bằng kỹ thuật RFLP (Restriction Frangment Length Polymorphism) trên đoạn rDNA-ITS được khuếch đại bằng cặp primer ITS4 - ITS5 thông qua phản ứng PCR. Đọc trình tự vùng rDNA- ITS từ sản phẩm PCR sau khi tinh sạch theo qui trình tinh sạch của Amersham với cặp primer đọc trình tự là ITS1 và ITS4. 3.3. Nguồn nấm Rhizoctonia solani Các dòng nấm R. solani do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học cung cấp. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Phục hồi và nhân sinh khối nấm R. solani  Hóa chất và vật liệu  Khoai tây.  Đường Glucose (C6H12O6).  Agar.  Cồn 96o và 70o .  Dụng cụ và thiết bị  Bếp điện.  Nồi hấp khử trùng (Autoclave).  Nồi nấu môi trường.  Tủ cấy vô trùng.  Đĩa peitri 9 mm.  Bình tam giác 250 ml.  Becher 100 ml.  Giấy thấm vô trùng. 20  Buồng lắc định ôn.  Tủ sấy 180oC.  Phục hồi nguồn nấm R. solani Các dòng nấm được giữ trong môi trường ống nghiệm lâu ngày có thể bị yếu đi hoặc bị nhiễm vi khuẩn hoặc các nấm lạ. Do đó trước khi nhân sinh khối, chúng tôi phải cấy chuyền từ ống nghiệm ra môi trường phục hồi trong các đĩa peitri, rồi từ đó cấy chuyền liên tiếp nhiều lần để cuối cùng thu được dòng thuần khiết. Môi trường hồi phục là môi trường PGA (Potato – Glucose - Agar). Thành phần nấu 1 lít môi trường PGA gồm:  Khoai tây: 200 g.  Glucose: 20 g.  Agar: 18 g.  Nước cất: 1 lít. Khoai tây được gọt vỏ, rửa sạch, thái mỏng rồi nấu trong 1 lít nước cất. Sau đó lọc lấy phần nước khoai tây, cho glucose và agar đã cân vào khuấy đều, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Môi trường được hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121oC trong 20 phút. Sau đó được đổ vào các đĩa peitri sạch đã được sấy khử trùng 180oC, 60 phút, khoảng 15 - 20 ml mỗi đĩa. Nấm từ các ống giống được cấy chuyền ra môi trường thạch đĩa và ủ ở nhiệt độ 25 - 27 oC trong vòng 1 - 2 ngày.  Nhân sinh khối các dòng nấm R. solani: Môi trường nhân sinh khối là môi trường PGB (Potato – Glucose - Broth). Thành phần 1 lít môi trường PGB:  Khoai tây: 200 g.  Glucose: 20g.  Nước cất: 1 lít. Tiến hành nuôi lắc 4 ngày ở nhiệt độ 27 - 28oC, và 120 - 150 vòng/ phút. Sợi nấm sau khi nuôi lắc được thu hoạch và cất giữ ở -80oC. 3.4.2. Ly trích DNA tổng số (isolation of DNA) của nấm R. solani Trước khi tiến hành ly trích DNA tổng số, mẫu nấm được nghiền mịn trong N2 lỏng. 21 Quy trình ly trích DNA tổng số: dựa trên quy trình được đề xuất bởi Lee và Taylor (1990), có sự thay đổi.  Các hóa chất đƣợc sử dụng để ly trích DNA  Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 50 mM EDTA, 3% SDS, 1% β_mercaptoethanol.  Hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol( 25:24:1).  Hỗn hợp chloroform:isoamyl alcohol( 24:1).  Isopropanol 100%.  Ethanol 70%.  TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.  Các dụng cụ và thiết bị dùng để ly trích DNA  Epffendorf 1,5 ml.  Micropipette các loại.  Bồn ủ nhiệt (water bath).  Máy vortex.  Máy ly tâm lạnh.  Tủ 4oC và -20oC. 22 . Mẫu (0,1- 0,3 g) Nghiền Epffendorf (1,5 ml) (1/3 epffendorf) Lysis buffer 700 µl Vortex đồng nhất (1500 vòng/1 phút) Ủ 65oC trong 1 giờ Lắc nhẹ nhanh (đảo nhẹ 2- 3 lần) Hỗn hợp phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) 700 µl Hút 350 µl dịch nổi Ly tâm 13.500 vòng/ phút trong 20 phút ở 25oC Epffendorf mới Hỗn hợp chloroform:isoamyl alcohol (24:1) 350 µl Hút 300 µl dịch nổi Đảo nhẹ, đều (khoảng 15 phút) Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 20 phút ở 28oC Epffendorf mới Isopropanol (0,6V ~ 180 µl) Thu kết tủa Đảo nhẹ 15 phút Ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 5 phút ở 4oC Làm khô kết tủa( khoảng 30- 60 phút) trong tủ cấy Rửa tủa bằng Ethanol 70% lạnh 700 µl Đảo nhẹ liên tục Bảo quản 4oC ( -20oC) Hòa tan kết tủa TE 1X 100 µl Quy trình ly trích DNA tổng số 23 Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA sau khi ly trích bằng cách điện di trên gel agarose. Từ đó chúng tôi tiến hành pha loãng DNA trong TE 1X để thực hiện phản ứng PCR. 3.4.3. Khuếch đại vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani  Các hóa chất cần thiết để thực hiện phản ứng PCR  Dung dịch đệm PCR 10X (amplification buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8.4), 500 mM KCl (Bio-rad).  MgCl2 50 mM (Bio-rad).  dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP) (Promega).  Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Bio-rad).  Primer ITS4 và ITS5 100 pmol.  Các dụng cụ, thiết bị đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR  Hộp đá khô -20oC.  Epffendorf 0,2 ml.  Micropipette 10 µl, 100 µl và các loại đầu típ tương ứng.  Tủ thao tác vô trùng.  Máy luân nhiệt.  Quy trình thực hiện phản ứng PCR Sử dụng hai primer ITS4 và ITS5 (White và ctv, 1990), để khuếch đại vùng ITS- rDNA của nấm R. solani có kích thước khoảng 700 bp. Trình tự hai primer: ITS4: 5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’. ITS5: 5’ GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 3’.  Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động 94oC 3 phút Chạy chu kỳ (33 chu kỳ)  Tách DNA khuôn 94oC 1 phút  Ủ bắt cặp 56oC 45 giây  Kéo dài 72oC 1 phút Giai đoạn kết thúc 72oC 7 phút 24  Hỗn hợp để thực hiện phản ứng PCR Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ cuối cùng PCR buffer 10X 1X MgCl2 50 mM 1,5 mM dNTP’s 2 mM 0,2 mM Primer ITS4 10 pmol/ 1 µl 0,4 pmol/ 1 µl Primer ITS5 10 pmol/ 1 µl 0,4 pmol/ 1µ Taq DNA polymerase 1UI 0,04 UI DNA khuôn < 100 ng Nước cất vô trùng Vừa đủ 25 µl 3.4.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose  Các hóa chất đƣợc sử dụng  Agarose.  TAE 0,5X.  Loading dye.  Ethidium bromide.  Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng  Cân kỹ thuật 4 số.  Lò viba.  Khay đổ gel.  Bồn và máy điện di (Bio-rad).  Ống đong.  Máy chụp gel (Gel doc).  Bao tay.  Micropipette 10 µl.  Giấy parafin.  Chai nấu gel.  Quy trình thực hiện Đong 12,5 ml TAE 0,5X cho vào chai nấu gel, đồng thời cân 0,1875 g agarose cho vào (nồng độ gel 1,5%). Đun sôi hỗn hợp trên trong lò viba ở 650W trong 2 phút. 25 Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng còn khoảng 50oC. Đổ gel vào khay và đặt lược tạo giếng, chú ý tránh tạo bọt khí khi đổ gel. Để gel đông đặc lại ở nhiệt độ phòng, nhẹ nhàng rút lược ra khỏi gel, cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TAE 0,5X. Trộn 3 µl sản phẩm PCR với 2 µl loading dye và cho vào giếng của gel. Chạy điện di ở hiệu điện thế 50 V trong thời gian 50- 60 phút.  Đọc kết quả điện di Sau khi điện di, gel được nhuộm trong ethidium bromide từ 15 - 30 phút. Vớt ra, rửa lại nhiều lần với nước và đọc kết quả dưới tia UV. DNA liên kết với ethidium bromide sẽ phát sáng dưới tia UV. Kết quả được ghi nhận và chụp ảnh lại bằng máy gel doc với phần mềm Quantity one. 3.4.5. Các bƣớc thực hiện phản ứng đọc trình tự 3.4.5.1. Chuẩn bị khuôn DNA Trước khi tiến hành đọc trình tự, sản phẩm PCR phải được tinh sạch hoàn toàn. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR bằng phƣơng pháp cắt gel  Tinh sạch sản phẩm PCR: dựa trên quy trình tinh sạch của Amersham. Mẫu cần được tinh sạch (thường là sản phẩm PCR) được đem chạy điện di trên gel agarose 0,8% tan ở nhiệt độ thấp. Gel sau khi chạy điện di, được nhuộm ngắn (1- 2 phút) trong ethidium bromide ở nồng độ thấp, sau đó rửa gel bằng nước sạch và rửa lại bằng nước cất vô trùng, gel được đặt trên máy chiếu UV đã được bọc kỹ bằng nylon và phủ lên trên bởi giấy bạc được cắt một lỗ có kích thước bằng miếng gel. Bật UV, định vị band cần lấy, dùng dao lam cắt gel chứa band DNA cần được tinh sạch, cho vào epffendorf 1,5 ml. Sử dụng cân phân tích để xác định trọng lượng gel chứa band vừa cắt ở trên. Dùng micropipette hút capture buffer theo mg/ thể tích (10 mg gel ~ 10 µl capture buffer), đậy nắp epffendorf, đem ủ trong bồn ủ nhiệt ở 60oC trong 5 phút; lấy ra vortex nhẹ và tiếp tục ủ ở 60oC cho đến khi gel tan hết (5 - 15 phút). Ly tâm 3000 vòng/ 30 giây để tập trung mẫu ở đáy epffendorf. Hút mẫu cho vào cột GFX; ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Đem ly tâm 10.000 vòng/ 30 giây. Cho vào cột 500 µl wash buffer, ly tâm 10.000 vòng/ 30 giây. 26 Lấy cột ra và đặt vào epffendorf 1,5 ml mới. Hút 20 µl elution buffer nhỏ vào cột GFX, ủ ở nhiệt độ phòng/ 1 phút. Ly tâm 10.000 vòng/ 1 phút, lấy cột GFX, đậy nắp epffendorf lại và giữ mẫu ở 4oC. 3.4.5.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)  Thiết bị và dụng cụ đƣợc sử dụng  Máy sequencer ABI PRISM 3100.  Epffendorf 0,2 ml.  Micropipette các loại  Đầu típ các loại tương ứng.  Máy luân nhiệt.  Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự Thành phần Lƣợng BDT mix 4 µl Buffer 2 µl Primer 1 µl DNA khuôn 1 µl Nước cất vô trùng Vừa đủ 10 µl  Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự Làm nóng các ống tube ở 96oC trong 1 phút. Bƣớc 1: 96oC trong 10 giây. Bƣớc 2: 50oC trong 10 giây. Bƣớc 3: 60oC trong 4 phút. Lặp lại 25 chu kỳ. Hạ nhiệt độ xuống 4oC và giữ nguyên cho tới khi tinh sạch. 3.4.5.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại Sản phẩm khuếch đại của phản ứng đọc trình tự được tinh sạch bằng phương pháp Ethanol/ EDTA precipitation:  Cho 5 µl EDTA vào mỗi epffendorf.  Thêm 60 µl ethanol 100% vào mỗi epffendorf.  Trộn lên xuống cẩn thận khoảng 4 lần. 27  Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút.  Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 30 phút.  Loại bỏ phần dịch nổi bên trên.  Thêm vào epffendorf 60 µl ethanol 70%.  Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở 4oC.  Loại bỏ ethanol, làm khô hoàn toàn DNA kết tủa ở nhiệt dộ phòng.  Hòa tan DNA trong Hidiformamide. 3.4.5.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer ABI PRISM 3100 Tiến hành biến tính sản phẩm PCR sequencing ở 95oC trong 5 phút. Sau đó, sản phẩm được load vào các cột mao dẫn chứa polymer để điện di phân tích kết quả, kết quả thu được từ tín hiệu huỳnh quang sẽ được ghi nhận bằng phần mềm của máy sequencer ABI PRISM 3100. 3.4.6. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Sản phẩm PCR được cắt bởi hai enzyme giới hạn Hae III, và Taq I để phát hiện hiện tượng đa hình trong phạm vi vùng ITS-rDNA đã được khuếch đại với cặp primer ITS4 và ITS5. Phản ứng cắt được thực hiện như sau: Ủ khoảng 1 µg DNA đã được khuếch đại với 1 U enzyme cắt dưới những điều kiện mà nhà sản xuất (Roche) đưa ra. Thành phần phản ứng gồm:  Thành phần phản ứng enzyme cắt Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Enzyme cắt buffer 10X 1X DNA 100- 150 ng Restriction enzyme 10 UI 1 UI Nước cất khử trùng Những đoạn DNA được cắt được phân tách bằng điện di trên gel agarose 2%, sau đó nhuộm ethidium bromide. Ghi nhận kết quả thông qua máy Gel doc. 28 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phục hồi và nhân sinh khối nấm Chúng tôi đã thành công trong việc phục hồi và nhân sinh khối 12 dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam. Lượng sinh khối thu được tương đối nhiều đủ để đáp ứng cho bước ly trích DNA. 4.2. Ly trích DNA tổng số của nấm Ly trích DNA là bước quan trọng đầu tiên để cho phép thực hiện phản ứng PCR, và từ đó thực hiện tiếp các bước tiếp theo. Với quy trình ly trích DNA tổng số của Lee và Taylor, có cải tiến được nêu ở mục 3.4.2, chúng tôi tiến hành ly trích DNA của nấm R. solani. Hình 4.1 Ảnh điện di DNA tổng số của 12 dòng nấm R. solani sau khi ly trích Sản phẩm sau khi ly trích được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%. Qua kết quả điện di kiểm tra (hình 4.1), thấy rằng chúng tôi đã thành công trong việc ly trích DNA tổng số của nấm R. solani. Tuy nhiên, do quy trình không sử dụng RNAse để 1. BV-50-01; 2. BV-50-02; 3. BV-61-01; 4. BV-61-02; 5. BV-61-04; 6. BV-61-05; 7. BV-61-06; 8. BV-62-01; 9. BV-62-02; 10. BV-62-03; 11. BV-71-01; 12. BV-71-02 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA tổng số Phần tạp 29 thủy phân RNA nên vẫn còn lẫn RNA trong mẫu ly trích nhưng điều này cũng không ảnh hưởng nhiều đến kết quả PCR vì DNA thu được tương đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Nguyễn Thị Huệ (2003), áp dụng quy trình ly trích DNA của Raeder và Broda (1985), đã thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Nhưng quy trình cần thêm 1 giờ để ly tâm loại bỏ cặn nấm và sử dụng RNAse để xử lý RNA. Như vậy, quy trình mà chúng tôi sử dụng là đơn giản, ít tốn kém, và tiết kiệm thời gian hơn so với phương pháp của Nguyễn Thị Huệ đã sử dụng. Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), khi áp dụng quy trình ly trích DNA của Lee và Taylor cũng thu được DNA tổng số của nấm R. solani. Tuy nhiên, trong quy trình này phải cần Natri acetate để kết tủa DNA. Trong quy trình của chúng tôi không cần sử dụng Natri acetate mà vẫn thu được lượng DNA tổng số, nên quy trình đơn giản hơn và tiết kiệm hóa chất, thời gian. 4.3. Pha loãng DNA tổng số Lượng DNA tối ưu để làm khuôn mẫu thực hiện phản ứng PCR khoảng từ 10 - 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn mẫu quá nhiều thì có thể dẫn đến ức chế phản ứng PCR làm cho phản ứng không thể xảy ra hoặc nếu phản ứng xảy ra thì có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Do đó, trước khi thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng DNA gốc trong TE 1X. Tùy vào lượng DNA tổng số mà các mẫu được pha loãng theo các nồng độ khác nhau (Vd: pha loãng 5 lần = 8 µl TE 1X + 2 µl DNA). DNA khuôn mẫu sau khi pha loãng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% và ghi nhận hình ảnh điện di thông qua máy chụp DNA bằng phần mềm Gel doc. 30 Hình 4.2 Ảnh điện di DNA tổng số của 12 dòng nấm R. solani sau khi pha loãng 4.4. Tiến hành phản ứng PCR Sau khi pha loãng DNA khuôn mẫu, chúng tôi bắt đầu tiến hành phản ứng PCR. Chúng tôi sử dụng lại chu trình nhiệt của Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), nhưng tăng thêm 3 chu kỳ để phản ứng xảy ra được hoàn toàn.  Chu trình nhiệt của phản ứng: Các bƣớc phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động 94oC 3 phút Chạy chu kỳ (33 chu kỳ)  Tách DNA khuôn 94oC 1 phút  Ủ bắt cặp 56oC 45 giây  Kéo dài 72oC 1 phút Giai đoạn kết thúc 72oC 7 phút 1. BV-50-01; 2. BV-50-02; 3. BV-61-01; 4. BV-61-02; 5. BV-61-04; 6. BV-61-05; 7. BV-61-06; 8. BV-62-01; 9. BV-62-02; 10. BV-62-03; 11. BV-71-01; 12. BV-71-02 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 DNA pha loãng Phần tạp 31 Vì chu trình nhiệt và nồng độ primer đã được Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), xác định ở mức tối ưu nên chúng tôi đã sử dụng lại các thông số này. Tuy nhiên, chúng tôi có khảo sát sự thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase theo hướng giảm nồng độ Taq. Kết quả, khi giảm nồng độ Taq DNA polymerase xuống 0,03 UI thì phản ứng PCR vẫn xảy ra, sản phẩm PCR có chất lượng tương tự khi sử dụng nồng độ 0,04 UI. Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng nồng độ này để tiết kiệm Taq.  Thành phần phản ứng PCR: Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR Buffer 10X 1X 2,5 µl MgCl2 50 mM 1,5 mM 0,75 µl dNTPs 2 mM 0,2 mM 2 µl Primer ITS4 10 pmol/µl 0,4 pmol/µl 1 µl Primer ITS5 10 pmol/µl 0,4 pmol/µl 1 µl Taq DNA polymerase 1 UI 0,03 UI 0,75 µl DNA khuôn < 100 ng 1 µl Nước cất vô trùng Vừa đủ 25 µl Tuy nhiên, do chúng tôi cần một lượng lớn sản phẩm PCR để phục vụ cho các phản ứng RFLP, và đặc biệt là cho quy trình tinh sạch sản phẩm PCR để đọc trình tự nên chúng tôi tiến hành khảo sát và thực hiện các phản ứng PCR với thể tích phản ứng là 50 µl. 32  Thành phần phản ứng PCR: Thành phần phản ứng Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích PCR Buffer 10X 1X 5 µl MgCl2 50 mM 1,5 mM 1,5 µl dNTPs 2 mM 0,2 mM 4 µl Primer ITS4 10 pmol/µl 0,4 pmol/µl 2 µl Primer ITS5 10 pmol/µl 0,4 pmol/µl 2 µl Taq DNA polymerase 1 UI 0,03 UI 1,5 µl DNA khuôn 2 µl Nước cất vô trùng Vừa đủ 50 µl Với cặp primer ITS4 và ITS5 là các universal primer được White và ctv. (1990), thiết kế để khuếch đại vùng ITS-rDNA của ti thể và nhân của nấm. Vùng ITS-rDNA (gồm ITS1-5,8S-ITS2) có chiều dài khoảng hơn 700 bp. Với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng được nêu ở trên, chúng tôi đã tiến hành khuếch đại đoạn ITS-rDNA của 12 dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành kiểm tra kết quả bằng cách điện di sản phẩm trên gel agarose 1,5% (3 µl sản phẩm PCR + 2 µl Loading dye; điện di ở hiệu điện thế 50V/ 60 phút). Kết quả điện di được thể hiện qua hình 4.3 và 4.4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 33 Hình 4.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR của 12 dòng nấm R. solani với V=25 µl nồng độ Taq 0,03 UI. Hình 4.4 Ảnh điện di sản phẩm PCR của 12 dòng nấm R. solani với V=50 µl nồng độ Taq 0,03 UI. 1. BV-50-01; 2. BV-50-02; 3. BV-61-01; 4. BV-61-02; 5. BV-61-04; 6. BV-61-05; 7. BV-61-06; 8. BV-62-01; 9. BV-62-02; 10. BV-62-03; 11. BV-71-01; 12. BV-71-02 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1. BV-50-01; 2. BV-50-02; 3. BV-61-01; 4. BV-61-02; 5. BV-61-04; 6. BV-61-05; 7. BV-61-06; 8. BV-62-01; 9. BV-62-02; 10. BV-62-03; 11. BV-71-01; 12. BV-71-02 34 Kết quả điện di sản phẩm PCR của chúng tôi trên gel agarose cho thấy, chúng tôi đã thành công trong việc khuếch đại vùng ITS-rDNA của nấm R. solani. Đoạn sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng hơn 700 bp, và sản phẩm PCR có chất lượng tốt để thực hiện các bước tiếp theo. Với việc giảm nồng độ Taq DNA polymerase, tăng số chu kỳ phản ứng lên 33 chu kỳ để cho phản ứng xảy ra được triệt để hơn, và thực hiện phản ứng ở thể tích là 50 µl (thông thường là 25 µl), mà vẫn thu được sản phẩm có chất lượng tốt, chúng tôi đã tiết kiệm được hóa chất, thời gian. Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải có kích thước giống nhau. Không thấy có sự khác biệt về kích thước sản phẩm PCR của 12 dòng này. 4.5. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani Schneider và ctv. (1997), khi sử dụng kỹ thuật RFLP trên vùng ITS-rDNA của nấm R. solani đã xác định được 13 enzyme (MspI, HaeIII, HincII, EcoRI, ClaI, Hinf I, Sau3AI, DdeI, AluI, HhaI, DraI, StyI, và TaqI) có thể cho thấy sự đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm tiếp hợp của nấm R. solani. Tuy nhiên, trong điều kiện giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ tiến hành cắt vùng ITS-rDNA sau khi khuếch đại bằng phản ứng PCR với 2 enzyme là HaeIII, và TaqI đối với 12 dòng gây bệnh trên cây bông vải. Hai enzyme cắt giới hạn HaeIII, TaqI đều cắt vùng ITS-rDNA của nấm R. solani thành các phân đoạn DNA nhỏ hơn và cho các kiểu cắt khác nhau phụ thuộc vào vị trí cắt. Mỗi kiểu cắt khác nhau được tính là một kiểu RFLP. Các dòng nấm có bao nhiêu kiểu cắt khác nhau được tính là có bấy nhiêu kiểu RFLP. 35 Hình 4.5 Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng ITS-rDNA của 12 dòng R. solani bằng enzyme hạn chế TaqI. Với enzyme TaqI, vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải đều được cắt tại hai vị trí cắt và tạo thành 3 phân đoạn DNA. Kết quả, cả 12 dòng đều cho ra cùng một kiểu cắt với các đoạn DNA có kích thước khoảng 350 bp, 310 bp, và 60 bp (mờ không thấy rõ). C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M M. Ladder; C. Đối chứng 1. BV-50-01; 2. BV-50-02; 3. BV-61-01; 4. BV-61-02; 5. BV-61-04; 6. BV-61-05; 7. BV-61-06; 8. BV-62-01; 9. BV-62-02; 10. BV-62-03; 11. BV-71-01; 12. BV-71-02 36 Hình 4.6 Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng ITS-rDNA của 12 dòng R. solani bằng enzyme hạn chế HaeIII. Với enzyme HaeIII, vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải đều được cắt tại hai vị trí cắt và tạo ra các band có kích thước lần lượt là khoảng 510 bp, 120 bp, và 90 bp. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005), khi cắt hai dòng BV-61-02 và BV-62-03 bằng hai enzyme giới hạn TaqI. HaeIII. Như vậy khi cắt bằng 2 enzyme TaqI, HaeIII, chúng tôi nhận thấy không có sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm R. solani phân lập trên cây bông vải ở Việt Nam. Ảnh điện di cho kết quả không rõ ràng, các band DNA mờ kể cả band DNA sản phẩm PCR đối chứng so với hình 4.3 và 4.4, nguyên nhân có thể là do dung dịch điện di hoặc thuốc nhuộm đã cũ, điều này cũng ảnh hưởng lớn trong phân tích kết quả RFLP. C M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M C. Đối chứng; M. Ladder; 1. BV-50-01; 2. BV-50-02; 3. BV-61-01; 4. BV-61-02; 5. BV-61-04; 6. BV-61-05; 7. BV-61-06; 8. BV-62-01; 9. BV-62-02; 10.BV-62-03; 11. BV-71-01; 12. BV-71-02 37 Các dòng nấm trên đều cho các kiểu cắt RFLP giống nhau khi cắt bằng hai enzyme TaqI và HaeIII, điều này có thể là do các dòng này được thu thập trên cùng một đối tượng là cây bông vải nên không có sự khác biệt về mặt di truyền giữa các dòng, hoặc do kỹ thuật điện di ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Vì vậy, chúng tôi thực hiện bước đọc trình tự để khẳng định lại kết quả chính xác hơn. 4.6. Đọc trình tự sản phẩm PCR Trước khi tiến hành các bước đọc trình tự vùng ITS-rDNA của các dòng nấm R. solani, chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR. Việc tinh sạch phải đảm bảo thu nhận lại được lượng sản phẩm PCR có trong mẫu, mặt khác sản phẩm thu được phải có độ tinh sạch cao để đảm bảo cho việc đọc trình tự được tối ưu, tránh hiện tượng nhiễu khi đọc. Với quy trình tinh sạch bằng phương pháp cắt gel của Amersham, được nêu ở mục 3.4.5.1 chúng tôi đã thành công trong việc tinh sạch sản phẩm PCR của các dòng nấm R. solani. Sản phẩm sau khi tinh sạch được điện di kiểm tra lại trên gel agarose 1,5%. Trộn 3 µl sản phẩm tinh sạch + 2 µl loading dye Điện di ở 50 V/ 60 phút Hình 4.7 Ảnh điện di sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA của các dòng nấm R. solani sau khi tinh sạch 1. BV-61-01; 2. BV-61-04; 3. BV-61-05; 4. BV-61-06; M. Ladder; 5. BV-62-02; 6. BV-71-02; 7. BC-63 1 2 3 4 M 5 6 7 720 bp 38 Sau khi tinh sạch, các mẫu được gửi đọc trình tự bằng máy ABI PRISM 3100. Tuy nhiên, do chưa có hóa chất đọc trình tự mới nên chúng tôi chỉ mới đọc trình tự được tám dòng R. solani bằng cặp primer ITS1 và ITS4. Vùng ITS-rDNA của nấm thì bao gồm vùng bảo tồn 5,8S và các vùng kém bảo tồn là ITS1 và ITS2, phản ứng đọc trình tự với hai primer ITS1 và ITS4 sẽ đọc trình tự các vùng ITS1, 5,8S, ITS2. Vùng 5,8S là vùng bảo tồn, giống nhau giữa tất cả các dòng nấm, do đó nó không có ý nghĩa lớn trong việc phân tích sự đa dạng về mặt di truyền. Vùng ITS1 và ITS2 là những vùng biến động, chỉ ra sự biến thiên trong cùng loài, trong đó vùng ITS1 là vùng có sự biến động hơn so với vùng ITS2, cho nên chúng tôi quyết định so sánh trên vùng ITS1. Vùng ITS1 của dòng BV-50-01: aatgaggagt tgagttgttg ctggcctttt ctaccttaat ttggcaggag gggcatgtgc acaccttctc tttcatccat cacaccccct gtgcacttgt gagacagcaa tagttggtgg atttaattcc atcatccatt tgctgtctac ttaatttaca cacactcta cttaatttaa actgaatgta attgatgtaa cgcatctaat acta Vùng ITS1 của dòng BV-61-04: aatgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacactc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag ttacaaggnc attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatacta Vùng ITS1 của dòng BV-61-05: aatgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacactc ttctctttca tccacacacc cctgtgcacc tgtgagacag ttacaaggtc attttggagt ttgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatacta Vùng ITS1 của dòng BV-61-06: aatgaggagt agagttgtag ctggccattt ttctggcaat gtgcacactc ttctctttca tccacacacc ctgtgcacct gtgagacagt tacaaggtca ttttggagtt tgggcaagt gtggagcttc attgcaaaac ttttccctcc ttctcttggc ttttgctgtc tactcaatta acatacaaac tctattaaat ttaaaacgaa tgtaattgat gtaacgcatc taatacta Vùng ITS1 của dòng BV-62-01: aatgtaagag tttggttgta gctggcctct aattaacttg ggggcatgtg cacacctttc tctttcatcc catacacacc tgtgcacctg tgagacagat gttttctagg agggaaggaa ctttattgga cctactctcc ttggacttct gtctacttaa tctatataaa ctcaatttat tttaaaatga atgttatgga tgtaacacat ctaatacta 39 Vùng ITS1 của dòng BV-62-02: aatgtaagag tttggttgta gctggcctct aattaacttg ggggcatgtg cacacctttc tctttcatcc catacacacc tgtgcacctg tgagacagat gttttctagg agggaaggaa ctttattgga cctactctcc ttggacttct gtctacttaa tctatataaa ctcaatttat tttaaaatga atgtaatgga tgtaacacat ctaatacta Vùng ITS1 của dòng BV-62-03 aatgtagagt ttggttgtag ctggccccta attaacttgg gggcatgtgc acactctttc tctttcatcc catacacacc tgtgcacctg tgagacagat gttttctagg ggggaaggaa ctttattgga cctactctcc ttggactctc tgtctactta atctatataa actcaattta ttttaaaatg aatgtaatgg atgtaacaca tctaatacta Vùng ITS1 của dòng BV-71-02 atgaggagtt gagttgttgc tggccttttct accttaattt ggcagggagg ggcatgtgc acaccttctc tttcatccat cacaccccctg tgcacttgtg agacagcaat agttggtgg atttaattcc atcatccatt tgctgtctact taatttacac acactctact taatttaaa ctgaatgtaa ttgatgtaac gcatctaatac ta Chúng tôi sử dụng chương trình ClustalX, trong gói phần mềm Clustal 1.83 để tiến hành so sánh trình tự vùng ITS1 của tám dòng trên, từ kết quả so sánh này bằng phương pháp Bootstrap N – J Tree chúng tôi dựng cây phả hệ xác định mối quan hệ di truyền giữa 8 dòng này. BV-50-1-ITS1 AATG-AGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGG-AGGGGCAT-- BV-71-02-ITS1 -ATG-AGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGGAGGGGCAT-- BV-61-06-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-62-01-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-61-05-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-61-04-ITS1 AATG-AGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCAATGTGCACACTCTTCTCTTTC BV-62-02-ITS1 AATGTAAGAGTTTGGTTGTAGCTGGCCTCTAAT----TAACTTGG-------GGGCAT-- BV-62-03I-TS1 AATGTA-GAGTTTGGTTGTAGCTGGCCCCTAAT----TAACTTGG-------GGGCAT-- *** * **** ***** ******* * * ** ** * * BV-50-1-ITS1 GTGCACACCTT-CTCTTTCATCCATCACAC---CCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATA BV-71-02-ITS1 GTGCACACCTT-CTCTTTCATCCATCACAC---CCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATA BV-61-06-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGTCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-62-01-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGTCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-61-05-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGTCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-61-04-ITS1 ATCCACACACC-CCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGGNCATTTTGGAGTTTGGGCAA BV-62-02-ITS1 GTGCACACCTTTCTCTTTCATCCCATACAC----ACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTT BV-62-03I-TS1 GTGCACACCTTTCTCTTTCATCCCATACAC----ACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTT * ***** * * ** * * ** * * ** * *** * BV-50-1-ITS1 GTTGGTGGATTTAAT----------TCCATCATCCA-------TTTGCTGTCTACTTAAT 40 BV-71-02-ITS1 GTTGGTGGATTTAAT----------TCCATCATCCA-------TTTGCTGTCTACTTAAT BV-61-06-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-62-01-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-61-05-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-61-04-ITS1 GTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTGGCTTTTGCTGTCTACTCAAT BV-62-02-ITS1 TTCTAGGAGGGAAGGAACTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACT-T-CTGTCTACTTAAT BV-62-03I-TS1 TTCTAGGGGGGAAGGAACTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACTCT-CTGTCTACTTAAT * * * * * * * ********* *** BV-50-1-ITS1 TTACACACA--CTCTACTTAATTTAAACTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACT- BV-71-02-ITS1 TTACACACA--CTCTACTTAATTTAAACTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-61-06-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-62-01-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-61-05-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-61-04-ITS1 TAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA BV-62-02-ITS1 CTATATAAA--CTCAATTTATTTTAAAATGAATGTTATGGATGTAACACATCTAATACTA BV-62-03I-TS1 CTATATAAA--CTCAATTTATTTTAAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTAATACTA * * * * *** * * * ****** ****** ** ******** *********** Dấu * biểu thị sự tương đồng của tám dòng được so sánh. Tiến hành vẽ cây phân nhánh di truyền của tám dòng được so sánh theo phương pháp Bootstrap Neighbor-Joining: Hình 4.8 Cây Neighbor – Joining thể hiện mối quan hệ di truyền của 8 dòng so sánh 41 Số bên cạnh các nhánh là phần trăm (%) về sự tương đồng (congruent) giữa các nhóm trên 1000 lần phân tích (bootstrap) thử nghiệm Dựa vào kết quả so sánh trình tự vùng ITS1 và cây phân nhánh di truyền, chúng tôi xác định phần trăm mức độ tương đồng giữa các dòng so sánh. Mức độ tương đồng giữa 8 dòng được thể hiện trong bảng 4.1 Dòng 1 2 3 4 5 6 7 8 1: BV-50-1-ITS1 100 100 67 67 67 67 76 77 2: BV-71-02-ITS1 100 100 67 67 67 67 76 77 3: BV-61-06-ITS1 67 67 100 100 100 100 60 61 4: BV-62-01-ITS1 67 67 100 100 100 100 60 61 5: BV-61-05-ITS1 67 67 100 100 100 100 60 61 6: BV-61-04-ITS1 67 67 100 100 100 100 60 61 7: BV-62-02-ITS1 76 76 60 60 60 60 100 99 8: BV-62-03I-TS1 77 77 61 61 61 61 99 100 Bảng 4.1 Phần trăm mức độ tƣơng đồng giữa các dòng so sánh Dựa trên các kết quả phân tích ở trên và cây phân nhánh di truyền, chúng tôi thấy rằng 8 dòng này được chia làm ba nhóm:  Nhóm 1: BV-50-01 và BV-71-02 với độ tương đồng trong vùng ITS1 là 100 %  Nhóm 2: BV-62-02 và BV-62-03 với độ tương đồng trong vùng ITS1 là 99 %.  Nhóm 3: BV-61-04, BV-61-05, BV-61-06, và BV-62-01 với độ tương đồng trong vùng ITS1 là 100 %. Sử dụng chương trình DNAPARS (DNA Parsimony) trong gói phần mềm Phylip 3.64, chúng tôi xác định được cây phân nhánh di truyền tốt nhất, xác định được khoảng cách di truyền giữa các nhóm, và giữa các nhóm với từng dòng. Khoảng cách di truyền được thể hiện trong bảng 4.2. 42 One most parsimonious tree found (một cây phân nhánh di truyền tốt nhất được xác định). +BV-62-03I- +------------4 | +BV-62-02-I +--------3 | | +BV-61-04-I | | | | +----------------2-BV-61-05-I | | | +BV-62-01-I | | | +BV-61-06-I | 1-BV-71-02-I | +BV-50-1-IT Nhóm Nhóm/ Dòng Khoảng cách 1 3 0.155556 3 4 0.206944 4 BV-62-03I- 0.009722 4 BV-62-02-I 0.013889 3 2 0.280556 2 BV-61-04-I 0.000000 2 BV-61-05-I 0.000000 2 BV-62-01-I 0.000000 2 BV-61-06-I 0.000000 1 BV-71-02-I 0.008333 1 BV-50-1-IT 0.004167 Bảng 4.2 Khoảng cách di truyền giữa các dòng Để xác định nhóm tiếp hợp (AG) của 8 dòng này, chúng tôi so sánh trình tự vùng ITS1 của 8 dòng này với trình tự vùng ITS1 của các dòng AG chuẩn trên cơ sở dữ liệu NCBI trên website ( Tuy nhiên, chúng tôi chỉ mới xác định được nhóm tiếp hợp của 2 dòng BV-50-01 và BV-62-02. Dòng BV-50-01 có sự tương đồng cao (100 %) trong vùng ITS1 đối với các dòng mang mã số AB 122135, AF 308631. 43 BV-50-01-ITS1 AATGAGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGAGGGGCATGTGC AF308631 AATGAGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGAGGGGCATGTGC AB122135 AATGAGGAGTTGAGTTGTTGCTGGCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGGAGGGGCATGTGC ************************************************************ BV-50-01-ITS1 ACACCTTCTCTTTCATCCATCACACCCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATAGTTGGTGG AF308631 ACACCTTCTCTTTCATCCATCACACCCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATAGTTGGTGG AB122135 ACACCTTCTCTTTCATCCATCACACCCCCTGTGCACTTGTGAGACAGCAATAGTTGGTGG ************************************************************ BV-50-01-ITS1 ATTTAATTCCATCATCCATTTGCTGTCTACTTAATTTACACACACTCTACTTAATTTAAA AF308631 ATTTAATTCCATCATCCATTTGCTGTCTACTTAATTTACACACACTCTACTTAATTTAAA AB122135 ATTTAATTCCATCATCCATTTGCTGTCTACTTAATTTACACACACTCTACTTAATTTAAA ************************************************************ BV-50-01-ITS1 CTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA AF308631 CTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA AB122135 CTGAATGTAATTGATGTAACGCATCTAATACTA ********************************* Dấu * biểu thị sự tương đồng giữa các dòng so sánh. Hai dòng này thuộc nhóm AG-1-IA, vì vậy dòng BV-50-01 thuộc nhóm tiếp hợp AG-1-IA. Dòng BV-62-02 có sự tương đồng cao trong vùng ITS1 đối với dòng mang mã số DQ 102448. Đây là dòng thuộc nhóm AG-4, do đó dòng BV-62-02 thuộc nhóm tiếp hợp AG-4. BV-62-02-ITS1 AATGTAAGAGTTTGGTTGTAGCTGG-CCTCTAATTAACTTGGGGGCATGTGCACACCTTT DQ102448 AATGTA-GAGGTTGGTTGTAGCTGGGCCCCTAATTAACTTGGGGGCATGTGCACACCTTT ****** *** ************** ** ******************************* BV-62-02-ITS1 CTCTTTCATCCCATACACACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTTTTCTAGGAGGGAAGGA DQ102448 CTCTTTCATCCCATACACACCTGTGCACCTGTGAGACAGATGTTTTCTAGGGGGGAAGGA *************************************************** ******** BV-62-02-ITS1 CTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACTTCTGTCTACTTAATCTATATAAACTCAATTTTA DQ102448 ACTTTATTGGACCTACTCTCCTTGGACTTCTGTCTACTTAATCTATATAAACTCAATTTA ************************************************************ BV-62-02-ITS1 TTTTAAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTAATACTA DQ102448 TTTTAAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTAATACTA **************************************** Dấu * thể hiện sự tương đồng giữa các dòng so sánh Các kết quả trên cho thấy đã có sự đa dạng về di truyền giữa các dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam. Kết quả này khác với kết quả mà chúng tôi có được khi phân tích RFLP đối với 12 dòng nấm được nêu ở mục 4.5. Tuy nhiên, có thể do chúng tôi chỉ mới sử dụng hai enzyme cắt là TaqI, HaeIII, trong khi Schneider và ctv. (1997), đã xác định có 13 enzyme có thể cho thấy sự đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm tiếp hợp của nấm R. solani, nên cho kết quả chưa chính xác. 44 Hạn chế: chúng tôi chỉ mới so sánh trình tự trên vùng ITS1, trong khi vùng ITS- rDNA của nấm bao gồm vùng ITS1, 5,8S và ITS2. Ngoài vùng 5,8S khá bảo tồn trên tất cả các dòng nấm nên không có ý nghĩa lớn trong phân tích sự đa dạng di truyền, còn vùng ITS2 là vùng biến động nên vùng này có thể gây nên sự khác biệt về mặt di truyền giữa các dòng nấm, do đó kết quả của chúng tôi chưa chính xác hoàn toàn. Chúng tôi đã bước đầu thành công trong việc phân nhóm 8 dòng nấm trên, từ đó tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc áp dụng các biện pháp phòng trừ thích hợp đối với các dòng nấm này để hạn chế sự gây hại của chúng đối với các cánh đồng trồng bông vải ở Việt Nam. 45 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Có thể giảm nồng độ Taq DNA polymerase xuống 0,03 UI, và thực hiện phản ứng PCR với thể tích 50 µl để tiết kiệm hóa chất và thời gian mà vẫn thu được sản phẩm PCR có chất lượng tốt. Đã khuếch đại thành công vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm R. solani thu thập trên cây bông vải với cặp primer ITS4 và ITS5, sản phẩm PCR của 12 dòng không có sự khác biệt và có kích thước khoảng 720 bp. Không nhận thấy có sự đa hình của 12 dòng nấm trên khi cắt sản phẩm PCR vùng ITS-rDNA bằng hai enzyme cắt giới hạn TaqI, HaeIII. Đã phân nhóm được 8 dòng nấm gây bệnh thành ba nhóm, và xác định được nhóm tiếp hợp (AG) của hai dòng BV-50-01, BV-62-02 là thuộc nhóm AG-1-IA và AG- 4. 5.2. Đề nghị Hoàn thiện quá trình điện di để quá trình điện di được ổn định hơn, từ đó xác định được kết quả RFLP một cách chính xác hơn. Thực hiện phản ứng cắt vùng ITS-rDNA của 12 dòng nấm trên với các enzyme hạn chế khác theo đề nghị của Schneider và ctv. (1997), để có thể đánh giá được chính xác hơn sự đa dạng về di truyền của 12 dòng nấm R. solani gây bệnh trên cây bông vải ở Việt Nam. Đọc trình tự lại tất cả các dòng, kể cả 8 dòng đã phân tích ở trên, rồi phân tích kết quả đọc trình tự trên toàn vùng ITS-rDNA nhằm thu được kết quả chính xác hơn. Do 12 dòng nấm R. solani này gây bệnh trên cùng một đối tượng là cây bông vải, nên có sự tương đồng về mặt di truyền cao. Do đó, để có thể xác định được sự đa dạng về di truyền giữa các dòng này một cách chính xác hơn ta có thể sử dụng các phương pháp có sự chính xác cao để xây dựng cây phả hệ như phương pháp Maximum Parsimony Methods…. 46 PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử: Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Ngô Việt Duy, 2005. Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải COKER312 và VN36P bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của các mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây ký chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 4. Lê Tuấn Kiệt, 2005. Bước đầu đọc trình tự vùng ITS-rDNA của nấm Rhizoctonia solani Kunh. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001. Công nghệ sinh học. NXB đại học quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 6. Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2002. Công nghệ gen. NXB đại học quốc gia, Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 7. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây Nông Nghiệp. NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam 8. Ou S. H., 1983. Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 9. Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005. Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Ngệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 10. Trần Thị Thủy Tiên, 2005. Xác định trình tự vùng ITS-rDNA của nấm Beauveria bassiana Vuille ký sinh trên côn trùng gây hại. Luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam. Tiếng Anh 11. Carling D.E., and Sumner D.R., 1992. Rhizoctonia pp 157-165. In: Singlton L., Mihail J.D. and Rush C.M. (eds), Methods for research on soilborne phyto- pathologenic fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota. 12. Carling D.E., Kuninaga., and Brainard K.A., 2001. Hyphal Anastomosis Reactions, rDNA-Internal Transcribed Spacer Sequences, and Virulence Levels Among Subsets of Rhizoctonia solani Anastomosis Group-2 (AG-2 ) and AG-BI. Phytopathology 92: 43-50. 47 13. Kanematsu., and Naito., 1994. Genetic Characterization of Rhizoctonia solani AG-2-3 by Analyzing Restriction Fragment Length Polymorphisms of Nuclear Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacers. Phytopathology 61: 18-21. 14. Kuninaga., Natsuaki., Takeuchi., and Yokosawa., 1997. Sequency variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in Rhizoctonia solani. Curr Genet (1997) 32: 237-234. 15. Kuninaga., Carling., Takeuchi., and Yokosawa., 1999. Comparison of rDNA- ITS Sequences between Potato and Tobaco Strains in Rhizoctonia solani AG-3. Plant Pathology 66: 2-11 (2000). 16. Lee S.B., and Taylor J.W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995, DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, London, Tokyo.p. 70-71. 17. Liu Z.L., and Sinclair J.B., 1992. Genetic Diversity of Rhizoctonia solani anastomosis group 2. Phytopathology 82: 778-787. 18. Liu Z.L., and Sinclair J.B., 1993. Differentiation of intraspecific groups within anastomosis 1 of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal transcribed spacer and isozymecompairisions. Can. J. Plant Phathol 15: 272-280. 19. Priyatmojo A., Escopalao V. E., Tangonan N. G., Pascual C. B., Suga H., Kageyama K., and Hyakumachi M., 2001. Characterization of new subgroup of Rhizoctonia solani Anastomosis Group 1 ( AG-1-ID), Causal agent of necrotic leaf spot on coffe. Phytopathology 91: 1054-1061. 20. Schneider., Salazar., Rubio., and Keijer., 1997. Identification of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS rDNA polymorphism and pectic zymograms. European Journal of Plant Pathology 103: 607-622. 21. White T.J., Bruns T., Lee S., and Taylor J., 1999. Amplification and direct sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics. P 315-322. In: Innis M. A., Gelfanhd D. H., White J. J. (eds) PCR protocols, a guide to methods and applications. Academic Press, New York. Trang Web 48 PHẦN VII PHỤ LỤC 7.1. Danh sách các dòng nấm Rhizoctonia solani đƣợc sử dụng trong đề tài Bảng 7.1. Danh sách các dòng nấm R. solani đƣợc sử dụng trong đề tài STT Tên dòng nấm Cây ký chủ Nơi thu thập 1 BV-50-01 Bông vải Cư M Nga, Daklak 2 BV-50-02 Bông vải Cư Jút, Daklak 3 BV-61-01 Bông vải Sông Trầu, Thống Nhất, Đồng Nai 4 BV-61-02 Bông vải Vĩnh Tân, Thống Nhất, Đồng Nai 5 BV-61-04 Bông vải Vĩnh Tâm, Vĩnh Cửu, Đồng Nai 6 BV-61-05 Bông vải Xã Lộ 25, Thống Nhất, Đồng Nai 7 BV-61-06 Bông vải Cẩm Đường, Long Thành, Đồng Nai 8 BV-62-01 Bông vải Bình Thuận 9 BV-62-02 Bông vải Ninh Thuận 10 BV-62-03 Bông vải Ninh Thuận 11 BV-71-01 Bông vải Ô Môn, Cần Thơ 12 BV-71-02 Bông vải Phụng Hiệp, Cần Thơ ( Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học, ĐHNL Tp. HCM cung cấp) 7.2. Danh sách các primer đƣợc sử dụng để nghiên cứu rDNA nhân của nấm Bảng 7.2. Những trình tự primer trên trên vùng ITS và 5,8S của rDNA Những trình tự primer trên vùng ITS và 5,8S của rDNA ITS1 (Whi) TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 1769-1787(ssu) 19 ITS1F (Gad) CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A 22 ITS2 (Whi) GCT GCG TTC TTC TTC ATC ATG C (sim. To 5.8S) 20 ITS3 (Whi) GCA TCG ATG AAG AAC GCA GC (sim. To 5.8SR) 20 ITS4 (Whi) TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 60-41(lsu) 20 49 ITS4B (Gad) CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG 23 ITS4S (Kre) CCT CCG CTT ATT GAT ATG CTT AAG 59-36(lsu) 24 ITS5 (Whi) GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G (sim. to SR6R) 1745- 1766(ssu) 22 ITS5R CCT TGT TAC GAC TTT TAC TTC C 1766-1745(ssu) 22 5.8S (Vil0) CGC TGC GTT CTT CAT CG 17 5.8SR (Vil0) TCG ATG AAG AAC GCA GC 18 SR6R (Vilu) AAG TAP AAG TCG TAA CAA GG 1747-1766(ssu) 20 LR1 (Vil0) GGT TGG TTT CTT TTC CT 73-57(lsu) 17 SLG-1 (Gro) TTG CGC AAC CTG CGG AAG GAT 1773-1793(ssu) 21 NS24R TAA AAG TCG TAA CAA GGT TT 1750-1769(ssu) 20 Ssu ref. Mankin et al., 1986. Gene 44:143-145 Lsu ref. Lapeyre et al., 1993. Nucleic Acids Res. 21:3322-3322 7.3. Kết quả giải trình tự vùng ITS1 dƣới dạng peak Hình 7.1 Trình tự dạng peak với primer ITS1 của dòng BV-62-02 50 Hình 7.2 Trình tự dạng peak với primer ITS1 của dòng BV-71-02