Luận văn Nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh sử dụng trong phân tích ure

oøn khaû naêng phaùt hieän söï coù maët cuûa NH4OH nghóa laø cho maøu saéc gioáng vôùi maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc caát (pH = 6.5). CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 64 Baûng 3.1: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa caùc loaïi chaát chæ thò Noàng đoä NH4OH (M) 10-3 0.5×10-3 0.25×10-3 0.125×10-3 0.0625×10-3 0.03125×10-3 Khaû naêng phaùt hieän cuûa BP + + + + + + Khaû naêng phaùt hieän cuûa BB + + + + + - Khaû naêng phaùt hieän cuûa NR + + + + - - Khaû naêng phaùt hieän cuûa PR + + + + - - pH dd NH4OH 9.09 8.75 8.43 8.07 7.78 7.46 + : coù, - : khoâng BP: Bromocresol purple, BB: Bromothymol blue, NR: Neutral Red, PR: Phenol red Keát quaû ño pH dung dòch NH4OH khoâng phuø hôïp vôùi coâng thöùc pH = 14 – ½ (pKb – lgCb). Nguyeân nhaân laø do dung dòch naøy coù tính chaát bay hôi. Ngoaøi ra, ta coù keát quaû thí nghieäm maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc caát vaø nöôùc maùy: Hình 3.1: Maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc caát (pH = 6.5) Töø traùi qua phaûi: PR, NR, BB, BP Hình 3.2: Maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc maùy (pH = 6.8) Töø traùi qua phaûi: PR, NR, BB, BP CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 65 Vì trong thöïc teá ngöôøi ta coù theå pha urea trong nöôùc maùy (pH = 6.8) nhö nöôùc duøng ñeå öôùp caù, thuûy saûn…neân ta choïn chaát thò coù khoaûng chuyeån maøu lôùn hôn 6.8 đeå deã daøng phaân bieät maøu saéc cuûa chaát chæ thò ôû moâi tröôøng acid vaø base. Khoaûng chuyeån maøu vaø maøu saéc cuûa caùc loaïi chaát chæ thò nhö sau: Baûng 3.1: Khoaûng chuyeån maøu vaø maøu saéc cuûa caùc chaát chæ thò Chaát chæ thò Khoaûng chuyeån maøu Maøu acid Maøu base Bromocresol purple 5.2 – 6.8 Vaøng Tím Bromothymol blue 6.0 – 7.6 Vaøng Xanh Neutral red 6.8 – 8.0 Ñoû Vaøng Phenol red 6.8 – 8.4 Vaøng Ñoû Töø 4 chaát chæ thò đeà ra ban đaàu, ta loaïi Bromocresol purple vaø Bromothymol Blue vì khoaûng chuyeån maøu khoâng lôùn hôn 6.8. Khoaûng chuyeån maøu cuûa Neutral red vaø Phenol red gaàn gioáng nhau, tuy nhieân Neutral red trong moâi tröôøng kieàm vaø trung tính coù maøu saéc khoù phaân bieät (vaøng vaø cam nhaït), trong khi đoù Phenol red laïi coù maøu saéc trong 2 moâi tröôøng naøy raát deã phaân bieät (hoàng/đoû vaø vaøng). Theo keát quaû thöïc nghieäm töø baûng 3.1, ta choïn chaát chæ thò toái öu söû duïng cho kit laø Phenol red. 3.2. Khaûo saùt löôïng chaát chæ thò thích hôïp cho leân kit  Tröôùc khi nhuùng dung dòch urea: Chuaån bò caùc giaáy kit FNo3 kích thöôùc 1.5cm × 6cm coù 10µl chaát chæ thò vaø 20µl dung dòch urease 4%. Vò trí daûi chæ thò neân ôû gaàn ñaàu kit, khoâng neân chaïm meùp treân cuûa giaáy kit ñeå coù khoaûng troáng cho tay caàm khi ñaët kit töïa vaøo thaønh trong cuûa duïng cuï chöùa dung dòch urea. Vò trí cuûa dung dòch urease naèm ôû nöûa döôùi cuûa giaáy kit vaø cuõng khoâng neân chaïm meùp döôùi cuûa kit vì ñaây laø nôi tieáp xuùc vôùi dung dòch urea, urease coù theå bò keùo troâi, hoøa tan trong dung dòch urea daãn tôùi laøm giaûm löôïng urease cuõng nhö hoaït tính enzyme treân kit. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 66 Hình 3.3: Vò trí chaát chæ thò vaø enzyme urease treân kit Maøu saéc cuûa daûi chæ thò treân kit thöû sau khi chaám leân đaäm daàn theo chieàu taêng cuûa noàng đoä phenol red nhö hình sau: 1 2 3 4 Hình 3.4: Kit thöû vôùi caùc noàng ñoä phenol red khaùc nhau tröôùc khi nhuùng dung dòch urea Noàng đoä PR: 1 – 0.05%, 2 – 0.1%, 3 – 0.2%, 4 – 0.5%  Sau khi nhuùng dung dòch urea: a b c Hình 3.5: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò PR treân kit sau khi nhuùng urea a: Doøng chaát loûng chöa chaïm daûi chæ thò CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 67 b: Doøng chaát loûng chaïm daûi chæ thò vaø laøm ñoåi maøu chæ thò c: Doøng chaát loûng chaïy heát kit Cuï theå ñoái vôùi caùc noàng ñoä phenol red khaùc nhau, maøu saéc cuûa chæ thò thay ñoåi nhö sau: 1 2 3 4 Hình 3.6: Kit thöû vôùi caùc noàng ñoä phenol red khaùc nhau sau khi nhuùng dung dòch urea 2% Noàng đoä PR: 1 – 0.05%, 2 – 0.1%, 3 – 0.2%, 4 – 0.5% Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò laø do NH3 ñöôïc sinh ra töø phaûn öùng thuûy phaân urea xuùc taùc bôûi enzyme urease coù treân kit. Doøng urea ñi leân gaëp enzyme urease tröôùc, bò thuûy phaân taïo ra NH3 laøm taêng pH cuûa dung dòch, sau ñoù di chuyeån leân tieáp gaëp chæ thò vaø laøm ñoåi maøu cuûa chæ thò. Vì dung dòch urea coù noàng ñoä khaù cao 2% neân phaûn öùng thuûy phaân xaûy ra maïnh vaø taïo ra nhieàu NH3, do ñoù dung dòch urea khoâng caàn chaïm daûi chæ thò ñaõ laøm ñoåi maøu chæ thò nhö hình treân. Sau khi doøng urea chaïy heát kit, NH3 ñöôïc sinh ra taäp trung ôû ñaàu kit vaø laøm cho maøu saéc cuûa chæ thò trôû neân đaäm daàn – maøu hoàng ñaäm nhö hình döôùi ñaây: Hình 3.7: Kit thöû sau khi dung dòch urea chaïy heát kit Taát caû maãu kit thöû ñeàu ñöôïc so saùnh vôùi maãu kit traéng (khoâng coù urease treân kit). Dung dòch urea khoâng bò thuûy phaân, khoâng taïo NH3 laøm taêng pH neân khoâng laøm ñoåi maøu cuûa chæ thò. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 68 Hình 3.8: Kit thöû traéng sau khi dung dòch urea chaïy heát kit Thôøi gian hieän maøu cuûa caû 4 maãu kit thöû treân ñeàu ngaén (khoaûng 5 – 7 phuùt). Trong 4 maãu khi dung dòch urea chöa chaïm daûi chæ thò thì maøu saéc cuûa phenol red noàng ñoä 0.5% deã quan saùt nhaát (maøu ñoû) neân chuùng toâi choïn noàng ñoä chaát chæ thò cho leân kit laø 0.5%. Löôïng dung dòch phenol red treân moät kit laø 10µl ñeå ñaûm baûo daûi chæ thò khoâng bò loang vaø taïo moät dieän tích maøu khoaûng 1.5cm × (0.5 – 0.7)cm ñuû ñeå quan saùt söï chuyeån maøu baèng maét thöôøng. 3.3. Khaûo saùt dung moâi pha urease 3.3.1. Khaûo saùt hoaït tính cuûa enzyme urease theo phöông phaùp Nessler  Xaây döïng đöôøng chuaån NH3: Baûng 3.2: Xaây döïng ñöôøng chuaån NH3 Löôïng NH3 (g) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 OD490nm 0 0.058 0.132 0.226 0.325 0.412 0.538 0.627 0.741 0.811 0.907 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 69 3 y = 0.0187x - 0.0226 R2 = 0.9978 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 O D 49 0n m Hình 3.9: Đoà thò NH3 chuaån duøng đeå xaùc đònh hoaït tính urease Söû duïng phöông phaùp Nessler đeå đo hoaït tính cuûa enzyme urease söû duïng, chuùng toâi thu đöôïc keát quaû nhö sau: Baûng 3.3: Keát quaû ño hoaït tính enzyme urease Laàn đo 1 2 3 OD 0.816 0.846 0.830 OD tb 0.831 ± 0.015* Hoaït tính (µmol NH3/phuùt.mg)** 4.026 (*) Ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. (**) Hoaït tính urease đöôïc tính theo coâng thöùc: F m 1 1017 1 1.0 1 5.0 5.1 a byA      ( Trong đoù: y – giaù trò OD đo đöôïc b = •0.0216, a = 0.0186 m – noàng đoä dung dòch urease đe F – ñoä pha loaõng Hàm lượng NH3 (µg)µmol NH3/phuùt.mg boät) m đo hoaït tính (mg/ml) CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 70 3.3.2. Khaûo saùt dung moâi duøng ñeå pha urease  Muïc ñích: tìm ra dung moâi thích hôïp hoøa tan urease đeå duy trì hoaït tính cuûa enzyme vaø traùnh caùc aûnh höôûng gaây öùc cheá töø moâi tröôøng. Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt caùc dung moâi sau:  Nöôùc caát  Nöôùc caát + EDTA 5mM  Nöôùc caát + Ni2+ 4mM  Nöôùc caát + EDTA 5mM + Ni2+ 4mM EDTA đöôïc boå sung coù taùc duïng keát hôïp ion kim loaïi taïp nhaèm laøm giaûm söï aûnh höôûng cuûa caùc ion naøy đeán hoaït tính cuûa urease vì coù theå chuùng seõ laø caùc chaát öùc cheá do coù cuøng hoùa trò vôùi cofactor laø Ni2+ cuûa urease. Ion Ni2+ coù maët trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa urease neân vieäc boå sung coù taùc duïng hoaït hoùa enzyme. Ño hoaït tính enzyme urease khi pha trong 4 loaïi dung moâi treân cho keát quaû nhö sau: Baûng 3.4: Hoaït tính cuûa urease trong caùc dung moâi khaùc nhau Dung moâi Nöôùc Nöôùc + EDTA 5mM Nöôùc + Ni2+ 4mM Nöôùc + EDTA 5mM + Ni2+ 4mM Laàn 1 0.816 0.685 0.177 0.118 Laàn 2 0.846 0.685 0.176 0.118OD Laàn 3 0.830 0.662 0.159 0.122 OD trung bình 0.831 ± 0.015* 0.677 ± 0.013 0.171 ± 0.010 0.119 ± 0.002 Hoaït tính (µmol NH3/phuùt.mg) 4.026 3.303 0.912 0.670 (*) Ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 71 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Nước Nước + EDTA 5mM Nước + Ni 4mM Nước + EDTA 5mM + Ni 4mM Dung môi Hình 3.10: Bieåu đoà so saùnh hoaït tính urease trong caùc loaïi dung moâi Döïa vaøo bieåu ñoà treân, chuùng toâi nhaän thaáy hoaït tính urease trong nöôùc caát laø cao nhaát (cao hôn dung moâi coù boå sung EDTA gaàn 1.2 laàn, dung moâi coù boå sung Ni2+ 4.4 laàn, dung moâi boå sung EDTA vaø Ni2+ 6 laàn). Vieäc boå sung EDTA ñeå keát hôïp vôùi ion kim loaïi taïp nhaèm traùnh aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme urease nhöng keát quaû thí nghieäm laïi cho keát quaû ngöôïc laïi. Ñieàu naøy coù theå laø do nguoàn nöôùc caát cuûa phoøng thí nghieäm chöùa raát ít kim loaïi taïp, do ñoù EDTA thay vì coù taùc duïng keát hôïp vôùi caùc ion kim loaïi naøy laïi keát hôïp vôùi ion Ni2+ naèm ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme urease daãn tôùi laøm giaûm hoaït tính cuûa enzyme naøy (nhö ñoà thò). Moät khaû naêng nöõa laø EDTA söû duïng chæ hoaït ñoäng toát trong moâi tröôøng kieàm neân vôùi pH nöôùc caát 6 – 6.5 thì EDTA laïi khoâng cho taùc duïng coù lôïi nhö muïc ñích ban ñaàu. Ion Ni2+ ñöôïc cho vaøo dung moâi döôùi daïng muoái NiSO4 nhaèm muïc ñích hoaït hoùa khaû naêng xuùc taùc cuûa enzyme urease vì enzyme sau moät thôøi gian baûo quaûn löôïng Ni2+ ôû trung taâm hoaït ñoäng seõ daàn daàn bò giaûm ñi [6]. Vieäc boå sung theâm Ni2+ coøn coù taùc duïng buø tröø cho löôïng ion bò maát ñi naøy. Tuy nhieân, theo keát quaû ño hoaït tính enzyme vôùi söï coù maët cuûa ion Ni2+ laïi laøm giaûm hoaït tính cuûa enzyme so vôùi söï khoâng coù maët cuûa ion Ni2+. Nguyeân nhaân laø do Ni2+ cuõng laø moät ion kim loaïi naëng neân ôû noàng ñoä cao noù laïi öùc cheá enzyme [46]. H oạ t tí n h ( µ m o l N H 3/p hú t.m g) CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 72 Söï coù maët ñoàng thôøi EDTA vaø ion Ni2+ trong dung moâi pha urease vôùi muïc ñích ban ñaàu laø keát hôïp taùc duïng baét caùc ion kim loaïi taïp trong nöôùc cuûa EDTA vaø hoaït hoùa enzyme urease cuûa Ni2+ nhöng keát quaû ño hoaït tính ngöôïc laïi hoaøn toaøn. EDTA ñöôïc boå sung khoâng nhöõng keát hôïp vôùi caùc ion Ni2+ töï do maø coøn keát hôïp luoân vôùi ion Ni2+ naèm trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa urease do ñoù laøm giaûm maïnh hoaït tính cuûa enzyme naøy. Döïa vaøo keát quaû ño hoaït tính enzyme urease trong caùc 4 loaïi dung moâi treân, chuùng toâi choïn dung moâi ñeå pha urease laø nöôùc caát. 3.4. Khaûo saùt löôïng enzyme thích hôïp cho leân kit 3.4.1. Khaûo saùt theå tích chaám enzyme urease leân kit Chaám caùc theå tích dung dòch urease khaùc nhau leân giaáy kit kích thöôùc 1.5cm × 6cm (dieän tích kit laø 900mm2). Quan saùt, ño dieän tích veät loang vaø ño thôøi gian khoâ cuûa dung dòch cho ta keát quaû sau: Baûng 3.5: Khaûo saùt theå tích chaám enzyme urease leân kit Theå tích urease (µl) Hình daïng veät loang Dieän tích loang (mm2) Tyû leä so vôùi dieän tích kit Thôøi gian khoâ (phuùt) 10 Ñöôøng troøn d = 13mm 133 1/6.8 4 20 Hình chöõ nhaät 18×15mm 270 1/3.3 6 30 Hình chöõ nhaät 24×15mm 360 1/2.5 9 40 Hình chöõ nhaät 28×15mm 420 1/2.1 10 50 Hình chöõ nhaät 33×15mm 495 1/1.8 12 Döïa vaøo baûng treân, chuùng toâi choïn theå tích dung dòch urease cho leân 1 kit laø 30µl vì dieän tích loang khoâng lôùn vaø thôøi gian khoâ khoâng quaù daøi. 3.4.2. Khaûo saùt noàng ñoä dung dòch enzyme urease cho leân kit Trong thí nghieäm 3.4.1 chuùng toâi ñaõ choïn theå tích urease chaám leân 1 kit laø 30µl. Yeáu toá coøn laïi aûnh höôûng tôùi löôïng urease coù treân kit laø noàng ñoä dung dòch enzyme. Khaûo saùt caùc noàng ñoä khaùc nhau cuûa dung dòch enzyme chaám leân kit trong caùc noàng ñoä dung dòch urea khaùc CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 73 nhau cho chuùng toâi keát quaû veà khaû naêng phaùt hieän söï coù maët cuûa urea cuûa enzyme urease vôùi khoái löôïng khaùc nhau treân kit. Noàng ñoä enzyme khaûo saùt taêng daàn töø 0.5% ñeán 4%. Noàng ñoä enzyme khoâng neân quaù cao vì baûn chaát enzyme urease laø protein coù phaân töû löôïng lôùn (M = 480 000Da) neân seõ taïo ñoä nhôùt cao vaø ñoä tan thaáp ôû noàng ñoä cao. Noàng ñoä dung dòch urea khaûo saùt giaûm daàn töø 1000ppm ñeán 50ppm. Giôùi haïn khaûo saùt laø 50ppm vì ñaây laø noàng ñoä cao nhaát coù trong thöïc phaåm khoâng aûnh höôûng tôùi söùc khoûe con ngöôøi. Cô cheá tieáp xuùc cuûa enzyme urease vaø urea trong nghieân cöùu cuûa chuùng toâi laø cho doøng dung dòch urea chaïy töø töø leân kit ñaët ñöùng hoaëc nghieâng theo löïc huùt mao quaûn cuûa giaáy kit. Caùch tieáp xuùc naøy coù caùc öu ñieåm so vôùi cho enzyme hoøa tan vaøo dung dòch urea:  Taêng dieän tích beà maët tieáp xuùc giöõa enzyme urease vaø urea.  Deã quan saùt söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit.  Khoâng phuï thuoäc vaøo theå tích dung dòch urea, khoâng caàn theå tích maãu thöû lôùn, chæ caàn ñuû ñeå chaïy leân heát kit.  Quan saùt ñöôïc söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò ñoái vôùi caùc dung dòch coù maøu saãm hoaëc ñuïc nhö nöôùc maém hoaëc söõa.  Coù theå phaân tích maãu thöû raén nhöng phaûi coù dòch chaát loûng treân beà maët nhö thuûy saûn. Keát quaû khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit ñöôïc cho baûng sau: Baûng 3.6: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau Noàng ñoä urea (ppm) Noàng ñoä urease (%) 1000 800 600 400 200 100 50 4 + + + - - - - 2 - - - - - - - 1 - - - - - - - 0.5 - - - - - - - +: coù, –: khoâng CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 74 1 2 3 4 Hình 3.11: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit chaám 30µl urease 4% trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm Ñeå taêng giôùi haïn noàng ñoä urea phaùt hieän cuûa kit, chuùng toâi taêng soá laàn chaám urease leân kit qua ñoù taêng löôïng urease/kit: Baûng 3.7: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau khi taêng soá laàn chaám urease leân kit Noàng ñoä urea (ppm) Soá laàn chaám dd urease 4% (laàn) 1000 800 600 400 200 100 50 3 + + + + + + + 2 + + + + + + + 1 + + + + - - - +: coù, –: khoâng CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 75 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 3.12: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit chaám 60µl urease 4% trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 – 100ppm, 8 – 50ppm Khi taêng noàng ñoä dung dòch urease cuõng nhö taêng soá laàn chaám urease thì löôïng urease hay hoaït tính urease treân 1 kit taêng, khaû naêng phaùt hieän cuûa kit cuõng taêng. Keát quaû thí nghieäm theo löôïng urease/kit ñöôïc toùm taét trong baûng sau: Baûng 3.8: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit khi thay ñoåi löôïng urease/kit Noàng ñoä urea (ppm) Khoái löôïng urease/kit (mg) 1000 800 600 400 200 100 50 3.6 + + + + + + + 2.4 + + + + + + + 1.2 + + + + - - - 0.6 - - - - - - - 0.3 - - - - - - - 0.15 - - - - - - - +: coù, –: khoâng CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 76 Döïa treân keát quaû thí nghieäm, chuùng toâi choïn theå tích urease cho leân 1 kit laø 60l noàng ñoä 4% (2 laàn chaám, moãi laàn chaám 30l) töông öùng vôùi 2.4mg urease/kit vì coù khaû naêng phaùt hieän söï coù maët urea ôû noàng ñoä raát thaáp (50ppm). Nhö vaäy, kit thöû urea giaáy coù caùc thoâng soá nhö sau: Baûng 3.9: Caùc thoâng soá cheá taïo cuûa kit Thoâng soá kit Giaù trò Chaát lieäu Giaáy loïc FNo3 Chaát chæ thò Phenol red Löôïng chaát chæ thò/kit 10l dung dòch phenol red 0.5% Löôïng urease/kit 60 × 4% = 2.4 (mg) Hoaït tính urease/kit 2.4 × 4.026 = 9.663 (µmol NH3/phuùt.kit) 3.5. Khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit, xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea vaø ñöôøng chuaånpH 3.5.1. Xaùc ñònh khaû naêng phaùt hieän cuûa kit Kit thöû ñöôïc cheá taïo nhö treân coù khaû naêng phaùt hieän tôùi noàng ñoä urea laø 50ppm. Ñeå khaûo saùt xem kit coøn coù theå phaùt hieän urea ôû noàng ñoä thaáp hôn khoâng, chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm vôùi caùc dung dòch urea coù noàng đoä thaáp hôn 50ppm. 1 2 3 4 5 6 7 Hình 3.13: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 77 Baûng 3.10: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong caùc dung dòch urea coù noàng ñoä thaáp Noàng ñoä urea (ppm) 50 40 30 20 10 5 Khaû naêng phaùt hieän cuûa kit + - - - - - +: coù, –: khoâng Nhö vaäy kit thöû khoâng coù khaû naêng phaùt hieän ôû noàng đoä thaáp hôn 50ppm, giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit noàng ñoä urea 0.005% (50ppm). 3.5.2. Xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea Toång hôïp maøu saéc nhaän bieát cuûa chæ thò đoái vôùi caùc noàng đoä urea khaùc nhau, chuùng toâi xaây döïng moät thang maøu theo chieàu taêng daàn cuûa noàng đoä nhö sau: 1 2 3 4 5 6 7 8 Hình 3.14: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 – 1000ppm Neáu thí nghieäm ñoái vôùi dung dòch urea noàng ñoä cao hôn (≥ 5000ppm), doøng urea chöa chaïm daûi chæ thò ñaõ laøm ñoåi maøu cuûa chæ thò do hôi NH3 ñöôïc taïo ra töø phaûn öùng thuûy phaân urea bay leân nhö hình döôùi ñaây. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 78 a b Hình 3.15: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea 0.5% vaø 1% a – Tröôùc khi chaïm daûi chæ thò b – Sau khi qua daûi chæ thò vaø chaïy heát kit Trong tröôøng hôïp khoâng quan saùt roõ söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò sau khi nhuùng hoaëc tröôøng hôïp noàng ñoä urea thaáp hôn 50ppm, ñeå ñònh tính söï coù maët cuûa urea ta coù theå laéc sao cho kit thöû ngaäp trong dung dòch maãu thöû vaø quan saùt xem dung dòch coù chuyeån sang maøu hoàng hay khoâng, neáu coù chöùng toû trong dung dòch coù urea. Tuy nhieân, neáu thí nghieäm ñoái vôùi caùc maãu thöû chöùa urea coù maøu saãm, ñuïc (nhö nöôùc maém, söõa…) thì maøu saéc cuûa chæ thò trong dung dòch maãu thöû seõ khoù quan saùt. Hình 3.16: Caùc böôùc ñònh tính söï coù maët urea trong maãu thöû 3.5.3. Xaây döïng ñöôøng chuaånpH ñeå ñònh löôïng urea Ñeå ñònh löôïng urea coù trong maãu thöû, chuùng toâi söû duïng ñöôøng chuaån bieåu thò söï thay ñoåi pH cuûa dung dòch maãu thöû tröôùc vaø sau khi cho urease theo noàng ñoä urea ñaõ bieát coù trong maãu. Ñoái vôùi 1 maãu thöû baát kyø, sau khi ñònh tính söï coù maët cuûa urea baèng kit thöû vaø baùn ñònh CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 79 löôïng döïa treân maøu saéc cuûa chæ thò treân kit, ta coù theå ñònh löôïng chính xaùc haøm löôïng urea coù trong maãu thöû ñoù baèng ñöôøng chuaånpH. Trong tröôøng hôïp maãu thöû ban ñaàu coù pH cao hôn ñieåm chuyeån maøu cuûa phenol red (pH > 8.4) nghóa laø laøm cho maøu saéc cuûa chæ thò treân kit traéng hoùa hoàng thì ta khoâng theå ñònh tính vaø baùn ñònh löôïng söï coù maët cuûa urea baèng maøu saéc chæ thò. Khi ñoù, ta seõ ño söï thay ñoåi pH tröôùc vaø sau khi cho kit thöû (nhö nguoàn enzyme urease) ñeå ñònh tính vaø ñònh löôïng urea coù trong maãu. Vì vaäy, ta coù theå söû duïng kit keát hôïp vôùi pH keá caàm tay ñeå ñònh tính vaø ñònh löôïng urea. Tieán haønh ño pH cuûa dung dòch urea, nöôùc maém chöùa urea, söõa chöùa urea ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau, theå tích 3ml tröôùc vaø sau khi cho kit thöû chöùa urease (coù theå caét boû phaàn chæ thò) cho ta keát quaû sau: 3.5.3.1. Ñöôøng chuaånpH ñeå ñònh löôïng urea trong nöôùc: Baûng 3.11: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa dung dòch urea tröôùc vaø sau khi cho urease Sau khi cho ureasepH Noàng ñoä urea Tröôùc khi cho urease 1 2 3 TB pH 1000 6.83 8.95 8.97 9.37 9.097 2.267 800 6.86 8.91 8.93 9.30 9.047 2.187 600 7.00 8.88 8.90 9.33 9.037 2.037 400 7.19 8.85 8.87 9.36 9.027 1.837 200 7.25 8.73 8.75 9.48 8.987 1.737 100 6.74 8.65 8.61 8.93 8.730 1.990 50 6.60 8.60 8.55 8.79 8.647 2.047 0 6.49 6.80 6.78 6.85 6.810 0.320 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 80 y = 0.0007x + 1.5897 R2 = 0.9817 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Nồng độ urea (ppm) Hình 3.17: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong nöôùc Ñoái vôùi dung dòch urea, ñoà thò pH coù daïng ñöôøng thaúng (R2=0.9817) trong khoaûng noàng ñoä dung dòch urea 200ppm – 1000ppm. Do ñoù khi pH > 1.7, ta coù theå döïa vaøo ñöôøng chuaån naøy ñeå xaùc ñònh haøm löôïng urea coù trong maãu thöïc phaåm. Khi giaù trò pH naèm ngoaøi ñöôøng chuaån ta chæ coù theå ñònh tính söï coù maët cuûa urea trong maãu coøn haøm löôïng thì chöa theå xaùc ñònh chính xaùc. 3.5.3.2. Ñöôøng chuaånpH ñeå ñònh löôïng urea trong nöôùc maém: Baûng 3.12: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa nöôùc maém chöùa urea tröôùc vaø sau khi cho urease Sau khi cho ureasepH Noàng ñoä urea Tröôùc khi cho urease 1 2 3 TB pH 1000 6.62 6.73 6.75 6.76 6.747 0.127 800 6.63 6.72 6.73 6.75 6.733 0.103 600 6.61 6.70 6.70 6.74 6.713 0.103 400 6.61 6.73 6.73 6.73 6.730 0.120 200 6.60 6.70 6.71 6.72 6.710 0.110 100 6.60 6.67 6.69 6.70 6.687 0.087  pH CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 81 50 6.59 6.67 6.68 6.70 6.683 0.093 0 6.58 6.71 6.70 6.73 6.713 0.133 y = 1E-05x + 0.1057 R2 = 0.0505 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Nồng độ urea (ppm) Hình 3.18: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong nöôùc maém Nhìn treân ñoà thò ta thaáy khi noàng ñoä urea trong nöôùc maém taêng thì pH sau khi cho urease coù taêng nhöng khoâng khaùc nhau ôû caùc noàng ñoä (ñoà thò ñöôøng thaúng gaàn nhö naèm ngang). pH > 0 laø do enzyme urease cho vaøo laøm thay ñoåi pH cuûa moâi tröôøng nöôùc maém. pH ≈ const chöùng toû khoâng coù söï thuûy phaân urea trong nöôùc maém. Nguyeân nhaân coù theå do trong nöôùc maém chöùa nhöõng thaønh phaàn gaây öùc cheá hoaït tính cuûa enzyme urease. Vì vaäy, trong thí nghieäm naøy chuùng toâi chöa xaây döïng ñöôïc ñöôøng chuaån pH theo noàng ñoä urea cho moâi tröôøng nöôùc maém. Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa nöôùc maém goàm coù:  Nöôùc (57 – 68%)  NaCl (22 – 30% )  Ñaïm toång (7 – 21%): acid amine, acid nucleic, peptides, ammonia…  Hôïp chaát voâ cô (ngoaøi NaCl): P, Ca, Mg, S, I, Br…  Vitamin: B1, B2, B12, PP…  pH CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 82  Hôïp chaát bay hôi: acid, alcohol, aldehyde, ketones, lactone, furan, hydrocarbon, ester…  Phuï gia thöïc phaåm: 950 (Acesulfame potassium – chaát taïo ngoït), 627 (Disodium guanylate – chaát taêng cöôøng höông), 631 (Disodium inosinate – chaát taêng cöôøng höông). Muoái aên khoâng phaûi laø thaønh phaàn gaây öùc cheá urease vì ñaõ coù nghieân cöùu phaân tích urea trong nöôùc bieån [19]. Vì vaäy, yeáu toá gaây öùc cheá hoaït tính urease trong nöôùc maém coù theå laø trong soá caùc thaønh phaàn coøn laïi. 3.5.3.3. Ñöôøng chuaånpH ñeå ñònh löôïng urea trong söõa: Baûng 3.13: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa söõa chöùa urea tröôùc vaø sau khi cho urease Sau khi cho ureasepH Noàng ñoä urea Tröôùc khi cho urease 1 2 3 TB pH 1000 6.74 8.33 8.30 8.35 8.327 1.587 800 6.75 8.18 8.15 8.20 8.177 1.427 600 6.74 7.92 7.88 7.95 7.917 1.177 400 6.72 7.71 7.69 7.73 7.710 0.990 200 6.75 7.38 7.38 7.39 7.383 0.633 100 6.74 7.15 7.14 7.17 7.153 0.413 50 6.75 7.15 7.13 7.15 7.143 0.393 0 6.75 7.07 7.00 7.07 7.047 0.297 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 83 y = 0.0013x + 0.3404 R2 = 0.9833 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Nồng độ urea (ppm) Hình 3.19: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong söõa Ñöôøng chuaån pH theo noàng ñoä urea coù trong söõa coù daïng ñöôøng thaúng (R2=0.9833). Döïa vaøo ñöôøng chuaån naøy, ta coù theå xaùc ñònh haøm löôïng urea coù trong maãu söõa thoâng qua vieäc ño söï thay ñoåi pH. 3.6. Khaûo saùt thôøi gian hieän maøu cuûa kit Kit thöû coù kích thöôùc 1.5cm × 6cm, khoâng quaù daøi đeå ruùt ngaén thôøi gian hieän maøu, cuõng khoâng quaù ngaén đeå doøng urea chaïy töø döôùi leân đeàu tröôùc khi gaëp urease taïo ra đuû löôïng NH3 laøm đoåi maøu chæ thò phía treân. Beà roäng daûi chæ thò töø 5 – 7 mm đeå deã quan saùt söï thay đoåi maøu saéc. Tieán haønh đo thôøi gian di chuyeån cuûa doøng urea treân kit, chuùng toâi thu đöôïc caùc giaù trò sau:  pH CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 84 Baûng 3.14: Khaûo saùt thôøi gian hieän maøu cuûa kit STT Teân maãu Noàng ñoä urea (ppm) Baét ñaàu Keát thuùc Thôøi gian hieän maøu (phuùt) 1 Dung dòch urea 5000 16h15 16h21 6 2 Dung dòch urea 5000 16h15 16h21 6 3 Dung dòch urea 5000 16h15 16h22 7 4 Dung dòch urea 2000 16h15 16h23 8 5 Dung dòch urea 2000 16h15 16h23 8 6 Dung dòch urea 2000 16h15 16h24 9 7 Dung dòch urea 1000 16h30 16h40 10 8 Dung dòch urea 1000 16h30 16h39 9 9 Dung dòch urea 1000 16h30 16h39 9 10 Dung dòch urea 800 16h30 16h40 10 11 Dung dòch urea 800 16h30 16h40 10 12 Dung dòch urea 800 16h30 16h41 11 13 Dung dòch urea 600 16h45 16h57 12 14 Dung dòch urea 600 16h45 16h57 12 15 Dung dòch urea 600 16h45 16h56 11 16 Dung dòch urea 400 16h45 16h57 12 17 Dung dòch urea 400 16h45 16h58 13 18 Dung dòch urea 400 16h45 16h57 12 19 Dung dòch urea 200 17h00 17h10 10 20 Dung dòch urea 200 17h00 17h09 9 21 Dung dòch urea 200 17h00 17h12 12 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 85 22 Dung dòch urea 100 17h00 17h11 11 23 Dung dòch urea 100 17h00 17h11 11 24 Dung dòch urea 100 17h00 17h13 13 25 Dung dòch urea 50 17h15 17h27 12 26 Dung dòch urea 50 17h15 17h27 12 27 Dung dòch urea 50 17h15 17h30 15 28 Söõa 400 17h35 18h33 58 29 Söõa 400 17h35 18h31 56 30 Söõa 400 17h35 18h34 59 Nhìn chung, ñoái vôùi dung dòch urea:  Thôøi gian doøng urea di chuyeån töø chaân kit tôùi khi đuïng chaát chæ thò: 6 – 8 phuùt  Thôøi gian doøng urea di chuyeån qua daûi chæ thò: 4 – 6 phuùt  Thôøi gian doøng urea đi heát kit: 12 – 15 phuùt  Thôøi gian hieän maøu: 6 – 15 phuùt Đoái vôùi dung dòch urea noàng đoä cao, doøng urea chöa caàn đi heát kit đaõ laøm đoåi maøu chæ thò neân thôøi gian hieän maøu khoâng quaù 15 phuùt (noàng ñoä urea 5000ppm). Caùc dung dòch urea coøn laïi coù noàng ñoä trong giôùi haïn phaùt hieän thì thôøi gian hieän maøu trong khoaûng 8 – 15 phuùt. Thôøi gian hieän maøu cuûa kit trong maãu söõa coù urea daøi hôn raát nhieàu so vôùi dung dòch urea (gaàn 1 giôø). Nguyeân nhaân laø do söõa laø moät dung dòch keo chöùa nhieàu thaønh phaàn chaát tan beân trong neân löïc huùt mao quaûn cuûa maïng cellulose caáu taïo neân giaáy kit khoâng ñuû lôùn ñeå keùo doøng chaát loûng leân nhanh nhö ñoái vôùi dung dòch urea. 3.7. Khaûo saùt thôøi gian söû duïng cuûa kit Ño hoaït tính cuûa urease coøn laïi treân kit theo thôøi gian, chuùng toâi thu ñöôïc caùc keát quaû sau: CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 86 Baûng 3.15: Khaûo saùt hoaït tính cuûa urease treân kit theo thôøi gian OD Hoaït tính/kit (µmol NH3/phuùt.kit)Thôøi gian 1 2 3 1 2 3 TB Ngaøy 1 0.112 0.112 0.115 5.081 5.081 5.194 5.119 ± 0.065* Ngaøy 2 0.119 0.123 0.124 5.345 5.496 5.534 5.458 ± 0.100 Ngaøy 3 0.113 0.112 0.113 5.119 5.081 5.119 5.106 ±0.022 Ngaøy 4 0.101 0.088 0.106 4.666 4.175 4.854 4.565 ± 0.351 Ngaøy 5 0.112 0.108 0.110 5.081 4.930 5.005 5.005 ± 0.075 Ngaøy 6 0.110 0.112 0.114 5.005 5.081 5.156 5.081 ± 0.075 Ngaøy 7 0.115 0.114 0.114 5.194 5.156 5.156 5.169 ± 0.022 Ngaøy 8 0.116 0.115 0.115 5.232 5.194 5.194 5.207 ± 0.022 Ngaøy 9 0.108 0.108 0.109 4.930 4.930 4.968 4.942 ± 0.022 Ngaøy 10 0.112 0.108 0.110 5.081 4.930 5.005 5.005 ± 0.075 (*) Ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. y = -0.0136x + 5.1404 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ngaøy Hình 3.20: Ñoà thò bieãu dieãn hoaït tính urease treân kit theo thôøi gian H oạ t tí n h k it ( µ m o l N H 3/p hú t.k it) CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 87 Löôïng hoaït tính enzyme urease cho leân kit laø 9.663 (µmol NH3/phuùt.kit) nhöng sau khi chaám leân kit vaø ño laïi hoaït tính thì giaù trò hoaït tính giaûm ñi gaàn ½. Nguyeân nhaân coù theå laø do:  Enzyme urease bò thaát thoaùt trong quaù trình bay hôi nöôùc ñeå laøm khoâ kit.  Enzyme urease treân kit chöa hoøa tan heát vaøo trong nöôùc, coøn moät soá phaân töû urease bò maéc keït trong maïng cellulose cuûa giaáy kit.  Söï oxy hoùa töï nhieân nhoùm –SH bôûi oxy khoâng khí nhöng quaù trình naøy chæ ñaùng keå khi coù maët ion kim loaïi xuùc taùc ñaëc bieät laø saét vaø ñoàng. Nhìn treân ñoà thò, ta thaáy ñöôøng thaúng bieåu dieãn hoaït tính cuûa enzyme urease theo thôøi gian gaàn nhö naèm ngang. Ñieàu naøy cho thaáy trong thôøi gian 10 ngaøy, hoaït tính cuûa enzyme urease gaàn nhö khoâng thay ñoåi nghóa laø kit coù theå baûo quaûn hôn 10 ngaøy cho ñeán khi söû duïng vôùi ñieàu kieän ôû nhieät ñoä thaáp (nhieät ñoä tuû laïnh) ñeå traùnh söï maát hoaït tính cuûa enzyme. Tuy nhieân, theo thôøi gian, urease treân giaáy kit seõ giaûm daàn hoaït tính vì:  Caùc phaân töû enzyme vaãn duy trì söï töông taùc vôùi nhau neân caáu truùc seõ thay ñoåi ít nhieàu.  Söï khoâng oån ñònh cuûa caùc yeáu toá moâi tröôøng nhö nhieät ñoä, ñoä aåm…cuõng taùc ñoäng ñeán caáu truùc cuûa enzyme. 3.8. Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong maãu thöïc 3.8.1. Söõa Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt söï coù maët cuûa urea trong 8 maãu söõa ñöôïc laáy taïi trung taâm thu mua söõa cuûa Vinamilk taïi phöôøng 12 quaän Goø Vaáp. Caùc böôùc ñònh tính urea trong maãu söõa nhö sau: CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 88 1 2 3 4 Hình 3.21: Söû duïng kit ñeå phaùt hieän urea trong söõa 1 – Ñaët kit vaøo trong söõa 2 – Sau khi söõa chaïy heát kit traéng (khoâng coù urease) 3 – Sau khi söõa chaïy heát kit thöû 4 – Söõa sau khi nhuùng ngaäp kit Baûng 3.16: Khaûo saùt söï coù maët cuûa urea trong söõa pH sau khi cho ureaseTeân maãu Maøu saéc chæ thò kit traéng Maøu saéc chæ thò kit thöû pH ban ñaàu 1 2 3 TB pH Haøm löôïng urea (ppm) 105 Vaøng Vaøng 6.80 7.01 6.94 6.93 6.960 0.160 -138.769 109 Vaøng Vaøng 6.78 7.02 6.95 6.98 6.983 0.203 -105.436 205 Vaøng Vaøng 6.76 7.11 7.11 7.21 7.143 0.383 33.026 208 Vaøng Vaøng 6.76 7.06 7.01 7.03 7.033 0.273 -51.590 211 Vaøng Vaøng 6.81 7.15 7.12 7.16 7.143 0.333 -5.436 212 Vaøng Vaøng 6.77 7.08 7.05 7.06 7.063 0.293 -36.205 213 Vaøng Vaøng 6.79 7.06 7.02 7.07 7.050 0.260 -61.846 214 Vaøng Vaøng 6.85 7.04 7.03 7.04 7.030 0.180 -123.385 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 89 Trong 8 maãu söõa khaûo saùt chæ coù 1 maãu coù chöùa urea nhöng haøm löôïng khaù thaáp (33ppm). Nguyeân nhaân coù theå do boø aên thöùc aên coù troän 1 ít urea. Haøm löôïng naøy chöa gaây nhöõng taùc haïi ñeán söùc khoûe cuûa con ngöôøi. 3.8.2. Nöôùc maém Chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt thöû urea trong caùc maãu nöôùc maém laáy töø Trung taâm Y teá Döï phoøng. Caùc böôùc ñònh tính urea trong maãu nöôùc maém nhö sau: 1 2 3 4 Hình 3.22: Söû duïng kit ñeå phaùt hieän urea trong nöôùc maém 1 – Ñaët kit vaøo trong nöôùc maém 2 – Sau khi nöôùc maém chaïy heát kit traéng (khoâng coù urease) 3 – Sau khi nöôùc maém chaïy heát kit thöû 4 – Nöôùc maém sau khi nhuùng ngaäp kit CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 90 Baûng 3.17: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa caùc maãu nöôùc maém pH sau khi cho urease STT Maøu saéc chæ thò kit traéng Maøu saéc chæ thò kit thöû pH ban ñaàu 1 2 3 TB pH Haøm löôïng urea (ppm) NM1 Vaøng Vaøng 5.58 5.61 5.59 5.58 5.593 0.013 0 NM2 Vaøng Vaøng 6.58 6.6 6.59 6.59 6.593 0.013 0 NM3 Vaøng Vaøng 5.53 5.53 5.53 5.52 5.527 -0.003 0 NM4 Vaøng Vaøng 5.78 5.80 5.80 5.78 5.793 0.013 0 NM5 Vaøng Vaøng 5.93 5.97 5.94 5.93 5.947 0.017 0 NM6 Vaøng Vaøng 6.11 6.11 6.12 6.10 6.110 0.000 0 NM7 Vaøng Vaøng 5.66 5.67 5.66 5.67 5.667 0.007 0 NM8 Vaøng Vaøng 5.54 5.57 5.55 5.54 5.553 0.013 0 NM9 Vaøng Vaøng 6.24 6.24 6.24 6.25 6.237 -0.003 0 NM10 Vaøng Vaøng 5.71 5.71 5.71 5.70 5.707 -0.003 0 NM11 Vaøng Vaøng 5.73 5.78 5.74 5.75 5.757 0.027 0 NM12 Vaøng Vaøng 5.69 5.70 5.68 5.68 5.687 -0.003 0 NM13 Vaøng Vaøng 5.84 5.85 5.84 5.84 5.843 0.003 0 NM14 Vaøng Vaøng 5.74 5.79 5.76 5.78 5.777 0.037 0 Keát quaû khaûo saùt cuõng cho thaáy ñoái vôùi nöôùc maém, söï thay ñoåi pH sau khi cho kit chöùa urease laø khoâng ñaùng keå. Ñieàu naøy khoâng coù nghóa laø trong caùc maãu nöôùc maém naøy khoâng coù urea maø trong nöôùc maém chöùa nhöõng thaønh phaàn gaây öùc cheá hoaït tính cuûa enzyme urease. 3.8.3. Thuûy saûn Tieán haønh khaûo saùt thöïc teá tình hình söû duïng urea ôû chôï Bình Ñieàn, moät moâ hình chôï ñaàu moái ñaàu tieân veà thuûy haûi saûn naèm ôû quaän 7. Baét ñaàu hoaït ñoäng töø thaùng 3/2006 ñeán nay, chôï CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 91 Bình Ñieàn laø nôi thu gom nguoàn thuûy haûi saûn cuûa 4 -5 chôï tröôùc ñaây. Toång khoái löôïng thuûy saûn vaän chuyeån tôùi moãi ngaøy: 400 – 500 taán, trong ñoù caù bieån chieám 150 – 200, caù nuoâi chieám 150 taán, ngheâu soø oác heán chieám 300 – 350 taán. Nguoàn thuûy haûi saûn chuû yeáu ñöôïc vaän chuyeån töø Nha Trang, tieáp theo laø caùc tænh Nam Boä nhö Tieàn Giang…, Thaønh Phoá Hoà Chí Minh (5.7%) Thuûy haûi saûn vaän chuyeån tôùi chôï töø 20h, ñöôïc phaân loaïi vaø baùn cho ngöôøi mua ñeå phaân phoái tôùi caùc chôï nhoû trong thaønh phoá ñeán 2 – 3h thì ngöøng. Thôøi gian hoaït ñoäng ngaén vaø thieáu caùc vaên baûn phaùp quy cuûa nhaø nöôùc ñaõ gaây khoù khaên cho coâng taùc kieåm tra chaát löôïng an toaøn veä sinh thöïc phaåm cuûa chôï. Hieän nay coù 3 phöông thöùc kieåm tra chaát löôïng thuûy haûi saûn (khaùc vôùi caùc tieâu chuaån qui ñònh cho xuaát khaåu)  Ngoaïi quan caûm quan: ñöôïc tieán haønh haèng ñeâm goàm  Ñaùnh giaù ñoä töôi, maøu saéc, muøi vò, traïng thaùi beân ngoaøi. Neáu ñaït vaãn caáp giaáy tieâu thuï cho loâ thöïc phaåm naøy.  Kieåm tra soá löôïng, chuûng loaïi, nguoàn goác, phöông phaùp baûo quaûn, bao goùi, nhaõn haøng hoùa…  Thao taùc veä sinh caùc duïng cuï chöùa.  Kieåm tra nhanh ñoái vôùi caùc tröôøng hôïp:  Phaùt hieän thöïc phaåm khoâng ñaûm baûo chaát löôïng.  Coù thoâng tin söû duïng hoùa chaát caám. Hieän nay treân thò tröôøng coù baùn caùc test kieåm tra cuûa nöôùc ngoaøi nhöng khoâng thaät söï hieäu quaû vaø keát quaû kieåm tra khoâng coù tính chaát phaùp lyù. Keát quaû kieåm tra chæ ñöôïc coâng nhaän töø phoøng thí nghieäm nhöng vieäc kieåm tra chæ ñöôïc tieán haønh khi saûn phaåm coù nguy cô bị giaûm chaát löôïng hoaëc nhieãm caùc hoùa chaát caám.  Laáy maãu ñònh kyø (theo thaùng hoaëc quí) do cô quan nhaø nöôùc thöïc hieän: Neáu keát quaû kieåm tra cho thaáy chaát löôïng nguoàn thuûy haûi saûn khoâng toát thì cô quan chöùc naêng vaø baø con seõ tieán haønh ñieàu tra xem nguyeân nhaân xuaát phaùt töø chôï hay töø caùc tænh, do ngöôøi nuoâi, ngöôøi thu mua hay ngöôøi vaän chuyeån, beân caïnh ñoù giaûm thôøi gian giöõa 2 laàn kieåm tra. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 92 Ñoái vôùi maãu loûng, ta neân cho maãu vaøo loï ñöïng coù naép, ñaët kit vaøo vaø chôø doøng chaát loûng chaïy leân daûi chæ thò ñeå quan saùt söï ñoåi maøu (neáu coù). Ñoái vôùi maãu raén nhö caù, toâm, möïc…coøn öôùt, ta coù theå ñaët kit leân thaân cuûa chuùng ñeå chaát loûng chaïy leân. Hình 3.23: Caùch söû duïng kit thöû ñeå phaùt hieän urea trong maãu nöôùc ñaù öôùp thuûy saûn vaø maãu caù Keát quaû khaûo saùt söï coù maët cuûa urea trong caùc maãu thuûy saûn laáy ôû chôï Bình Ñieàn ñöôïc cho trong baûng 3.18. Toång keát keát quaû:  Toång soá maãu: 30  Soá maãu khoâng ñaït: 21, haøm löôïng thaáp (< 200ppm) CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 93 Baûng 3.18: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän urea cuûa kit trong thuûy saûn STT Teân maãu Maøu saéc chæ thò kit traéng Maøu saéc chæ thò kit thöû pH ban ñaàu pH sau khi coù urease pH Khaû naêng phaùt hieän urea 1 Nöôùc ñaù öôùp toâm loät Vaøng Vaøng 6.82 7.30 0.48 + 2 Nöôùc ñaù öôùp möïc Vaøng Cam 6.95 7.53 0.58 + 3 Nöôùc ñaù öôùp möïc Vaøng Ñoû 6.80 7.80 1.00 + 4 Nöôùc ræ caù baïc maù Cam Ñoû 7.41 7.85 0.44 + 5 Nöôùc ræ caù thu Vaøng Vaøng 6.62 6.96 0.34 + 6 Ñaù öôùp Vaøng Vaøng 6.58 6.74 0.16 - 7 Nöôùc ñaù öôùp toâm Cam Ñoû 7.36 7.82 0.46 + 8 Nöôùc ñaù öôùp möïc Vaøng Vaøng 6.47 7.05 0.58 + 9 Nöôùc ñaù öôùp caù thaùc laùc Vaøng Vaøng 6.79 7.20 0.41 + 10 Nöôùc ñaù öôùp caù moùm Vaøng Vaøng 7.31 7.44 0.13 - 11 Nöôùc öôùp teùp Cam Cam 7.56 7.62 0.06 - 12 Nöôùc ñaù öôùp caù song Vaøng Vaøng 6.78 7.00 0.22 - 13 Ñaù öôùp caù tra Vaøng Vaøng 6.96 7.19 0.23 - 14 Ñaù öôùp caù baïc maù Vaøng Vaøng 7.13 7.28 0.15 - 15 Nöôùc ñaù öôùp toâm Cam Cam 7.40 7.60 0.20 - CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 94 16 Nöôùc ñaù öôùp toâm loät Vaøng Vaøng 7.21 7.38 0.17 - 17 Nöôùc ñaù öôùp baïch tuoäc Vaøng Vaøng 6.60 6.92 0.32 - 18 Nöôùc ñaù öôùp toâm Vaøng Vaøng 6.91 7.34 0.43 + 19 Ñaù töø xe Vaøng Vaøng 6.78 7.18 0.40 + 20 Nöôùc ñaù öôùp eách Vaøng Vaøng 6.73 7.09 0.36 + 21 Ñaù töø xe Vaøng Vaøng 6.85 7.41 0.56 + 22 Nöôùc ñaù öôùp toâm Vaøng Ñoû 7.20 7.84 0.64 + 23 Nöôùc ñaù öôùp möïc Vaøng Vaøng 6.80 7.28 0.48 + 24 Nöôùc ñaù öôùp möïc Vaøng Cam 6.83 7.66 0.83 + 25 Nöôùc ñaù öôùp möïc Vaøng Vaøng 6.74 7.38 0.64 + 26 Muoái öôùp Hoàng Hoàng 8.80 8.25 0.55 + 27 Muoái öôùp Hoàng Hoàng 8.10 8.78 0.68 + 28 Muoái öôùp Hoàng Hoàng 8.22 8.85 0.63 + 29 Muoái öôùp Hoàng Hoàng 8.14 8.68 0.54 + 30 Muoái öôùp Hoàng Hoàng 8.78 9.10 0.32 + +: coù, –: khoâng CHÖÔNG 4: KEÁT LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 95 CHÖÔNG 4 KEÁT LUAÄN CHÖÔNG 4: KEÁT LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 96 4.1. Keát luaän Töø caùc keát quaû nghieân cöùu, chuùng toâi ñaõ taïo ra kit thöû nhanh urea trong thöïc phaåm vôùi caùc ñaëc ñieåm sau:  Chaát lieäu: loaïi giaáy loïc FNo3  Chaát chæ thò: Phenol red  Löôïng chaát chæ thò/kit: 10l dung dòch phenol red 0.5%  Hoaït tính urease/kit: 9.663 UI (µmol NH3/phuùt.mg)  Nguyeân taéc phaùt hieän urea: döïa vaøo söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit töø vaøng sang ñoû hoaëc hoàng giuùp coâng taùc saøng loïc nhanh thöïc phaåm coù urea ôû giôùi haïn phaùt hieän 50ppm.  ÔÛ caùc maãu maøu saéc cuûa chæ thò khoâng thay ñoåi thì ta coù theå keát hôïp vôùi pH keá caàm tay ñeå kieåm tra söï thay ñoåi pH. Döïa vaøo ñöôøng chuaån, töø ñoä taêng pH suy ra haøm löôïng urea coù trong maãu thöïc phaåm.  Thôøi gian söû duïng kit: > 10 ngaøy Chuùng toâi ñaõ söû duïng kit thöû nhanh töï taïo naøy ñeå khaûo saùt söï coù maët urea trong moät soá loaïi thöïc phaåm:  Söõa: o Toång soá maãu: 8 maãu o Keát quaû: 1 maãu coù haøm löôïng urea 33ppm  Nöôùc maém: khoâng phaân tích ñöôïc urea baèng kit.  Thuûy saûn: a. Toång soá maãu: 30 maãu b. Keát quaû: 21 maãu coù chöùa urea, haøm löôïng thaáp (< 200ppm) CHÖÔNG 4: KEÁT LUAÄN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 97 4.2. Kieán nghò: Do nhöõng haïn cheá veà maët thôøi gian neân trong phaàn nghieân cöùu cuûa chuùng toâi chöa khaûo saùt ñöôïc moät soá vaán ñeà lieân quan tôùi hieäu quaû hoaït ñoäng cuûa kit cuõng nhö thöû nghieäm khaû naêng phaùt hieän cuûa kit treân nhöõng loaïi thöïc phaåm coù khaû naêng nhieãm urea. Töø ñoù chuùng toâi ñöa ra moät soá kieán nghò sau: 1. Nghieân cöùu coá ñònh enzyme urease leân caùc loaïi chaát mang khaùc (thay vì giaáy)…vaø ñaëc bieät laø coù khaû naêng taùi söû duïng vì ñaây cuõng laø moät loaïi enzyme coù giaù thaønh cao. 2. Nghieân cöùu söû duïng caùc loaïi chaát hieän maøu khaùc vôùi ammonia coù khaû naêng phaùt hieän söï coù maët cuûa ammonia ôû noàng ñoä thaáp. 3. Tieáp tuïc nghieân cöùu phaùt hieän nhanh urea trong nöôùc maém. 4. Trieån khai thöû nghieäm vieäc söû duïng kit treân nhieàu loaïi thöïc phaåm coù khaû naêng nhieãm urea, soá löôïng maãu lôùn vaø thoáng keâ keát quaû ñeå chöùng minh hieäu quaû söû duïng cuûa kit cuõng nhö tình hình nhieãm urea treân caùc loaïi thöïc phaåm. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 98 TAØØI LIEÄÄU THAM KHAÛÛO [1] Leâ Ngoïc Tuù, Hoùa Sinh Coâng Nghieäp, NXB Khoa hoïc vaø Kyõ thuaät Haø Noäi, 2002, 443 trang. [2] Nguyeãn Đöùc Löôïng, Coâng ngheä enzyme, NXB Đaïi hoïc Quoác Gia Tp.HCM, 2004, 534 trang. [3] Traàn Bích Lam, Toân Nöõ Minh Nguyeät, Đinh Traàn Nhaät Thu, Thí nghieäm hoùa sinh thöïc phaåm, NXB Đaïi hoïc Quoác Gia Tp. Hoà Chí Minh, 2004, 83 trang. [4] Adam Juszkiewicz, Anna Zaborska, Anna _aptas´, Zofia Olech, Adam Juszkiewicz, Anna. A study of the inhibition of jack bean urease by garlic extract, Food Chemistry 85 (2004), pp. 553–558. [5] Ankri, S., & Mirelman, D. (1999). Review: Antimicrobial properties of allicin from garlic. Microbes and Infection, 2, pp. 125–129. [6] Burt Zerner. Recent advances in the chemistry of an Old Enzyme Urease (1991). Bioorganic chemistry, 19, 116-131. [7] Block, E. (1992). The organosulfur chemistry of the genus Allium—implications for the organic chemistry of sulfur. Angewandte Chemie. International Edition in English, 31, pp. 1135–1178. [8] Blakeley, R. L., & Zerner, B. (1984). Jack bean urease: the first nickel enzyme. Journal of Molecular Catalysis, 23, pp. 263–292. [9] B. Manunza, S. Deiana, M. Pintore, V. Solinas and C. Gessa. A molecular modeling study of the urease active site. Journal of Molecular Structure: THEOCHEM, Volume 419, Issues 1-3, 8 December 1997, pp. 33-36. [10] Ciurli, S., Benini, S., Rypniewski, W. R., Wilson, K. S., Miletti, S., & Mangani, S. (1999). Structural properties of the nickel ions in urease: novel insight into the catalytic and inhibition mechanisms. Coordination Chemistry Reviews, 190–192, pp. 331–335. [11] Dixon NE, Gazzola C, Asher CJ, Lee DS, Blakeley RL, Zerner B. (1980). Jack been urease (EC 3.5.1.5). II. The relationship between nickel, enzymatic activity, and the TAØI LIEÄU THAM KHAÛO GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 99 "abnormal" ultraviolet spectrum. The nickel content of jack beans. Canad J. Biochem, 58 (6), 474-80. [12] E. Jabri, M.B. Carr, R.P. Hausinger and P.A. Karplus (1995). The crystal structure of urease from Klebsiella aerogenes. Science 26, 998. [13] Fishbein W., Nagarajan K. and Scurzi W., Urease Catalysis and Structure. The Journal of Biological Chemistry, Vol. 248, No.22, USA, 1978, pp. 7870– 877. [14] Ferary, S., & Auger, J. (1996). What is the true odour of cut Allium? Complementarity of various hyphenated methods: gas chromatography–mass spectrometry with particle beam and atmospheric pressure ionization interfaces in sulphenic acids rearrangement components discrimination. Journal of Chromatography A, 750, pp. 63–74. [15] Gupta, N., & Porter, T. D. (2001). Garlic and garlic-derivated compounds inhibit human squalene monooxygenase. Journal of Nutrition, 131, pp. 1662–1667. [16] Howell F. and Sumner J.B., The Specific effects of buffers upon urease activity, Cornell University Medical College, Ithaca, 1934, pp. 619 – 626. [17] Joseph C. and Evelyn A., Comparions of Soybean Urease Isolated from Seed and Tissue. The Journal of Biological Chemistry, Vol. 254, No. 5, U.S.A, 1979, pp. 1707–1715. [18] J.G. Mateer, E.K. Marshall (1916). The urease content of certain beans, with special reference to the jack bean. Journal of Biological Chemistry, 25(2), 297. [19] James J. McCarthy. A Urease Method for Urea in Seawater. Limnology and Oceanography, Vol. 15, No. 2 (Mar., 1970), pp. 309-313. [20] Khalid Mohammed Kan, Sajid Iqbal, Muhammad Arif Lodhi, Ghulam Murtaza Maharvi, Zia-Ullah, Muhammad Iqbal Choudhary, Atta-ur-Rahmana and Shahnaz Perveenb (2004). Biscoumarin: new class of urease inhibitors; economicalsynthesis andactivity. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 12, 1963–1968. [21] Kot, M., Krajewska, B., Leszko, M., Olech, Z., & Zaborska, W. (1998). Enthalpimetric and colorimetric determinations of the inhibition constant for the inhibition of urease by boric acid. J. Thermal Analysis, 53, pp. 757–768. [22] Kot, M., Zaborska, W., & Juszkiewicz, A. (2000). Inhibition of jack bean urease by thiols. Calorimetric studies. Thermochimica Acta, 354, pp. 63–69. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 100 [23] Kunio TAKISHIMA, Tatsuko SUGA, Gunji MAMIYA (1988). The structure of jack bean urease. The complete amino acid sequence, limited proteolysis and reactive cysteine residues. European Journal of Biochemistry 175 (1), 151–157. [24] Lawson, L. D., Wood, S. G., & Hughes, B. G. (1991). HPLC analysis of allicin and other thiosulfinates in garlic clove homogenates. Planta Medica, 57, 263–270. [25] Marshall E.K. On soybean urease: The effect of dilution, acids, alkalies and ethyl alcohol. The Laboratory of Physiological Chemistry, Johns Hopkins University, 1974, pp. 351 – 361. [26] Mobley, H. L. T., Island, M. D., & Hausinger, R. P. (1995). Molecular biology of microbial ureases. Microbiological Reviews, 59, pp. 451–480. [27] Manish M. Paradkar, Rekha S. Singhal And Pushpa R. Kulkarni. An approach to the detection of synthetic milk in dairy milk: 1. Detection of urea, International Journal of Dairy Technology, Vol. 53, No 3, August 2000. [28] Paul S. Francis, Simon W. Lewis, Kieran F. Lim. Analytical methodology for the determination of urea: current practice and future trends. Trends in analytical chemistry, vol. 21, no. 5, 2002, pp. 389 – 400. [29] Prakash, O., & Bhushan, G. (1998). A study of inhibition of urease from seeds of the water melon (Citrullus vulgaris). Journal of Enzyme Inhibition, 13, pp. 69–77. [30] Prakash, O., & Vishwakarma, D. K. (2001). Inhibition of urease from seeds of the water melon (Citrullus vulgaris) by heavy metal ions. Journal of Plant Biochemistry & Biotechnology, 10, pp. 147–149. [31] Remaut H., Safarov N., Structural Basis for Ni2+ Transport and Assembly of the Urease Active Site by the Methallochaperone UreE from Bacillus pasteurii. The Department of Agro_Enviromental Science and Technology, University of Bologna, Italy, 2001, pp. 49365 – 49370. [32] Reginald M., Slyke D., Manometric, Titrimetric and Colorimetric Methods for Measurement of Urease Activity, The Hospital of Rockefeller Institute of Medical Research, New York, 1944, pp. 623 – 642. [33] Reuter, H. D. (1995). Allium sativum and Allium ursinum: Part 2. Pharmacology and medical application, Phytomedicine, 2, 73–91. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 101 [34] Rabinkov, A., Miron, T., Konstantinovski, L., Wilchek, M., Mirelman, D., & Weiner, L. (1998). The mode of action of allicin: trapping of radical and interaction with thiol containing proteins. Biochimica et Biophysica Acta, 1379, 233–244. [35] Ramakrishnaiah and Bhat G S (1986), Significance urea level in heat stability of cow and buffalo, India Journal of Dairy Science, 39, 60-64. [36] Song H.K., Scott B. and Robert H., Crystal Structure of Klebsiella aerogenes, UreE, a Nickel-binding Metallochaperone for Urease Activation. Michigan State University, East Michgan, 2001, pp. 49359 – 49364. [37] Sumner J.B., The isolation and crystallization of the enzyme urease. Corell University Medical College, Ithaca, 1932, pp. 316 – 325. [38] Schmidt E.G., The inactivation of urease, The Department of Biological Chemistry of the University of Maryland School of Medicine, Baltimore, 1968, pp. 53 – 61. [39] S. Ciurli. Electronic structure of nickel ions in the active site of urease. Institute of Agricultural Chemistry, University of Bologna. [40] Small, L. D., Bailey, J. H., & Cavallito, C. J. (1947). Alkyl thiosulfinates. Journal of the American Chemical Society, 69, 1710–1713. [41] Srivastava, P. K., & Kayastha, A. M. (2000). Significance of sulfhydryl groups in the activity of urease from pigeonpea (Cajanus cajan L.) seeds. Plant Science, 159, 149–158. [42] Srivastava, P. K., Kayastha, A. M., & Jagannadham, M. V. (2002). Kinetics of inhibition and molecular asymmetry in pigeonpea (Cajanus cajan) urease. Journal of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, 6(1), 1–6. [43] Toru Tanaka, Masami Kawase, Satoru Tani, α-Hydroxyketones as inhibitors of urease. Bioorganic & Medicinal Chemistry 12 (2004), pp. 501–505. [44] T. Tanaka, M. Kawase, S. Tani (2003). Urease inhibitory activity of simple α, β- unsaturated ketones. Life Sciences, Volume 73, Number 23, 2985-2990. [45] Yuh-Ling Lin; Chien-Tsu Chen, Su-Cheng Lin, Cheng Lee, Hsien-Shou Kuo, Chun-Mean Shih, Yuan-Hsun Hsu, Yi-Ping Chin & Err-Cheng Chan. A simple method to determine urea concentration using intact Helicobacter pylori and BromoCresol Purple as a pH indicator. Biotechnology Letters 22: 1077–1079, 2000. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 102 [46] Zaborska, W., Krajewska, B., Leszko, M., & Olech, Z. (2001). Inhibition of urease by Ni2+ ions. Analysis of reaction progress curves. Journal of Molecular Catalysis. B: Enzymatic, 13, 103–108. [47] ml [48] [49] [50] [51] [52] [53] regensburg.de/Fakultaeten/nat_Fak_IV/Organische_Chemie/Didaktik/Keusch/chembox_ urease-e.htm [54]