Luận văn Nghiên cứu đa dạng di truyền của quần thể nấm corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại trại thực nghiệm lai khê, viện nghiên cứu cao su Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD

ào tử nấm C. cassiicola tương đối lớn.  Với phương pháp phân lập như trên, sau khi phân lập các mẫu nấm cần phải được kiểm tra lại bằng cách quan sát hình thái sợi nấm và bào tử của nấm C. cassiicola dưới kính hiển vi.  Nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trường nhân tạo, để tạo được bào tử C. cassiicola trên môi trường nhân tạo có thể tiến hành theo phương pháp sau: Các mẫu nấm sau khi thuần được cấy vào đĩa etri có chứa 10 ml môi trường PSA. Nuôi cấy trong điều kiện tối liên tục 24/24h ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày. 32 Sau 5 ngày nuôi cấy sử dụng một tấm lame vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử (Chee, 1988). Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24h ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau thời gian trên tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm bằng cách soi bào tử dưới kính hiển vi (đặt bào tử trong giọt nước cất hoặc giọt dung dịch methylene blue). Hình dạng bào tử được so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971). Các nguồn nấm được xác định chính xác là nấm C. cassiicola sẽ được sử dụng vào những phân tích tiếp theo. 3.3.2.3. Phƣơng pháp tách dơn bào tử nấm C. cassiicola Đặt các lame sạch vào đĩa petri, hút 1 ml môi trường agar cho vào lame và trang thành một lớp mỏng. Hút 10 ml nước cất 2 lần vô trùng cho trực tiếp vào đĩa nấm, quan sát mật độ bào tử dưới kính hiển vi và pha loãng tới mật độ thích hợp thuận lợi cho quá trình tách đơn bào tử. Hút 0,1 ml dịch bào tử chuyển lên lame agar đã chuẩn bị, dùng que cấy tam giác trang đều cho đến khi bề mặt agar khô hoàn toàn. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ phòng qua đêm (khoảng 10 – 12 giờ) bào tử bắt đầu nảy mầm trên bề mặt môi trường. Đặt lame dưới kính hiển vi quan sát những bào tử nào mọc mầm riêng lẻ, sau đó đánh dấu vùng có đơn bào tử. Dùng dao cắt cẩn thận, vùng cắt càng nhỏ thì độ chính xác càng cao. Sau khi cắt xong đặt vào đĩa môi trường PGA chuẩn bị sẵn, đem ủ ở nhiệt độ phòng trong bóng tối vài ngày để cho đơn bào tử phát triển thành khuẩn lạc. Sử dụng khuẩn lạc này để nhân sinh khối sợi nấm (C. KuruvillaJacob và cộng sự, 2002). 3.3.3. Nhân sinh khối 3.3.3.1. Dụng cụ Máy lắc, bình tam giác, kim mũi mác, đèn cồn.v.v. 33 3.3.3.2. Phƣơng pháp  Các dòng nấm C. cassiicola sau khi đã phân lập thuần được chuyển sang môi trường lỏng, tiến hành nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút), điều kiện nhiệt độ 26 - 30 C.  Sau 4 ngày tiến hành thu sinh khối sợi nấm. Cần lưu ý là sợi nấm phải khô và nên giữ nguồn sợi nấm ở -70 C. 3.3.4. Tách chiết DNA 3.3.4.1. Hóa chất và dụng cụ ly trích  Becher, phễu lọc, giấy thấm, nitơ lỏng, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, lysis buffer, isopropanol, TE 1X, ethanol 100%, ethanol 70%.  Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette và các loại đầu típ, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex. 3.3.4.2. Phƣơng pháp ly trích Phương pháp ly trích DNA được thực hiện theo quy trình của Lee và Taylor có cải tiến (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005) như sau: 1) Nuôi trong môi trường lỏng. 2) Giữ sợi nấm ở - 70 C. 3) Lấy 1g sợi nấm khô kiệt vào cối và nghiền trong dung dịch nitơ lỏng. 4) Chuyển phần bột nấm vào ống eppendorf. Ở bước này, cố gắng giữ cho bột nấm được nghiền không tan. 5) Thêm 400 l lysis buffer (xem phụ lục 2), trộn đều hỗn hợp. 6) Ủ ở 65 C trong 1 giờ. 7) Di chuyển ống nghiệm ra khỏi dung dịch nước ấm (ra khỏi bồn ủ nhiệt). 8) Thêm vào 300 l phenol: chlorophorm và isoamyl alcohol. (25:24:1), lắc nhẹ (lúc này dung dịch có màu trắng đục). Ly tâm 14 000 vòng trong 1 phút ở 28 C. 34 9) Chuyển phần trên ống eppendorf sang một eppendorf khác với thể tích 300 l và kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ và cẩn thận. DNA sẽ kết tủa dạng sợi màu trắng đục. 10) Ly tâm 14000 vòng trong 1 phút ở 28 C. 11) Cẩn thận đổ bỏ phần dịch lỏng. Dùng ethanol 70 % rửa sạch nhiều lần DNA. 12) Làm khô DNA, hoà tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở 4 C hay – 20 C cho đến khi sử dụng. 3.3.4.3. Kiểm tra chất lƣợng DNA  Yêu cầu DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều).  Định tính DNA bằng phương pháp điện di. Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay không, có bẩn không,.v.v.).Tuy nhiên không cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác. Quá trình điện di kiểm tra chất lượng được thực hiện theo qui trình như sau (Nguyễn Thị Lang, 2002). Chuẩn bị gel agrose Chuẩn bị DNA cho loading: dùng parafilm để dặt DNA lên (khoảng 10- 15ul cho 1 mẫu)+4 l dung dịch nhuộm Đầu tiên đặt mẫu DNA chuẩn : mẫu DNA chuẩn dùng cho thí nghiệm là 0,5X (5 l),1X (10 l) và 2 (20 l). Các mẫu chuẩn này đạt bên cạnh các mẫu thí nghiệm để dễ dàng so sánh kết quả. Điện di và chụp ảnh. Dựa trên băng hình DNA đánh giá chất lượng Pha dung dịch DNA bằng TE.  Định lượng DNA bằng quang phổ kế 35 Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA có trong mẫu kết quả thu được. Hàm lượng DNA được tính theo công thức: DNA (ng/μl) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha loãng Gồm hai bước: Xây dựng đường chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 10 μl dung dịch DNA hòa tan với 990 μl TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD.  DNA sau khi tách chiết và kiểm tra định tính, định lượng sẽ được bảo quản ở 40C để dùng cho việc chạy RAPD –PCR. 3.3.5. Thực hiện phản ứng RAPD Kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước cơ bản: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR. Điện di trên gel agarose. Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram), các số liệu thu được cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. 3.3.5.1. Hóa chất và dụng cụ a> Các hóa chất cần thiết cho kỹ thuật RAPD. 1. Trisbase 1M. 2. KCl 1M. 3. Taq polymerase (Promega). 4. Dầu khoáng (Mineral oil). 5. dNTPs. 6. Agarose. 7. Ethidium bromide. 8. Methylene blue. 9. Thang chuẩn (DNA.ladder) 10. Bromphenol blue. 11. Xylenecyanode FF. 12. Glycerol. 13.Phản ứng RAPD –PCR được thực hiện với 3 primer sau: 36 Bảng 3.2 Các primer dùng cho phản ứng RAPD Tên primer Trình tự(5’-3’) TmoC OPL-08 AGCAGGTGGA 36 OPM-05 GGGAACGTGT 35 OPD-18 GAGAGCCAAC 32 b>Dụng cụ. 1. Pipet. 2. Máy PCR. 3. Máy ly tâm. 4. Máy điện di. 5. Máy chụp hình DNA Geldoc. 6. Lò vi sóng(Oven). 7. Tủ lạnh -20 0 C,- 400C. 3.3.5.2. 3.3.5.3. Khảo sát qui trình RAPD Mục đích tối ưu hóa qui trình RAPD. .Căn cứ trên một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng RAPD ở mục (2.10.2). Việc bố trí thí nghiệm để khảo sát tùy vào sản phẩm của phản ứng phân tích  đưa ra những thí nghiệm phù hợp nhằm đáp ứng mục đích chung của thí nghiệm. Quá trình khảo sát tín hành qua các thí nghiệm sau. A> Thí nghiệm 1. Mục đích thí nghiệm: khảo sát quy trình RAPD. Chỉ tiêu đánh giá: các băng DNA trên gel điện di. Phương pháp tiến hành: theo quy trình với thành phần hóa chất, chương trình nhiệt ghi trong bảng sau. a> Thành phần phản ứng cho thí nghiệm 1. 37 Bảng 3.3 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1(Silva và cộng sự, 2003) Hóa chất Dung dịch gốc Nồng độ cuối Thể tích sử dụng PCR buffer MgCl2 dNTP primer Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 10X 25 mM 10 mM 10 pmol/μl 5 U 10 ng/μl 1X 1,8 mM 0,2mM 0,5 mM 0,5 U 10 ng 1,μl 0,72 μl 0,2 μl 0,5 μl 0,1 μl 1 μl 5,58 μl b> Chương trình nhiệt cho thí nghiệm 1. Bảng 3.4 Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 (Silva và cộng sự, 2003) Số chu kỳ Bước Nhiệt độ(độ 0C) Thời gian 40 Bước1 94 1 phút Bước 2 36 1 phút Bước 3 72 1 phút Giữ 40C B> Thí nghiệm 2. Mục đích thí nghiệm : khảo sát ảnh hưởng của yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD. Chỉ tiêu đánh giá: các băng DNA trên gel điện di. Phương pháp tiến hành: theo quy trình với thành phần hóa chất và chương trình nhiệt ghi trong bảng sau : a> Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2: giống thí nghiệm 1 (Bảng 3.1). b> Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2: 38 Bảng 3.5 Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 Số lần lập lại Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 1 94 1 phút Lần,lượt tăng từ 40, 42, 45 2 94 45 giây. 3 35 1 phút 4 74 3 phút 1 5 72 10 phút 6 giữ 40C C> Thí nghiệm 3: Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố MgCl2, dNTPs và primer, Taq - polymerase, DNA lên phản ứng RAPD. Chỉ tiêu đánh giá: số lượng và chất lượng các băng DNA trên gel điện di. Phương pháp tiến hành: theo quy trình với thành phần hóa chất và chương trình nhiệt ghi trong bảng sau: a> Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của các nghiệm thức trong thí nghiệm 3. 39 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của các nghiệm thức - trong thí nghiệm 3 Nghiệm thức Hóa chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer Taq DNA polymerase DNA mẫu 10X 5 U 10 ng/μl 1 μl 0,1 μl 1 μl 1X 0,5U 10 ng 1 MgCl2 dNTP primer 10 mM 10 mM 10 pmol/μl 2,1 μl 0,2 μl 0,5 μl 2,1 mM 0,2 mM 0,5 mM 2 MgCl2 dNTP primer 10 mM 10 mM 10 pmol/μl 2,5 μl 0,2 μl 0,5 μl 2,5 mM 0,2 M 0,5 mM 3 MgCl2 dNTP primer 10 mM 10 mM 10 pmol/μl 2,5 μl 0,3 μl 0,5 μl 2,5 mM 0,3 mM 0,5 mM 4 MgCl2 dNTP primer 10mM 10mM 10 pmol/μl 2,5 μl 0,3 μl 0,6 μl 2,5 mM 0,3 mM 0,6 mM 5 MgCl2 dNTP primer 10 mM 10 mM 10 pmol/μl 2,5 μl 0,3 μl 0,4 μl 2,5mM 0,3mM 0,4mM 6 MgCl2 dNTP primer 10 mM 10 mM 10 pmol/μl 2,5 μl 0,35 ul 0,7 μl 2,5 uM 0,35 mM 0,7 mM H2O Thêm vào cho đủ 10 μl 40 Bảng 3.7. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD của các nghiệm thức 7 – 10 của thí nghiệm 3 Nghiệm thức Hóa chất Dung dịch gốc Thể tích sử dụng Nồng độ cuối MgCl2 dNTP primer 10 mM 10 mM 0.5 pmol/μl 2,5 μl 0,3 μl 0,5 μl 2,5 mM 0,3 mM 0,5 nM 7 DNA Taq 10ng 5U/1 ul 0,5 0,1 10 ng 0,5U 8 DNA Taq 10 ng 5U/ 1ul 1,5 0,1 15 0,5 9 DNA Taq 10 ng 5U/1 μl 1 μl 0,08 μl 10 ng 0,4 U 10 DNA Taq 10 ng 5U/1 μl 1 0,06 μl 10 ng 0,3U H2O Thêm vào cho đủ 10 μl b> Chương trình nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3. Chương trình nhiệt thu được ở thí nghiệm 2. Sau khi tìm được qui trình tối ưu cho phản ứng RAPD ta tiến hành thực hiện phản ứng RAPD với số lượng mẫu đã thu. Mẫu sau khi chạy PCR sẽ được bảo quản ở 40 C và tiến hành diện di. 3.3.5.4. Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose. a) Các hóa chất được sử dụng để điện di và đọc kết quả 1. Agarose. 2. TAE 0,5X. 3. Loading dye 6X. 4. Ethidium bromide. b) Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng để điện di và đọc kết quả 41 1. Cân kỹ thuật 4 số. 2. Lò viba. 3. Khay đổ gel. 4. Bồn và máy điện di (Bio-rad). 4. Giấy parafin. 5. Máy chụp hình gel (Biorad). 6. Ống đong. c) Quy trình thực hiện. 1. Cho 0,25 g agarose vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 2%). 2. Đun sôi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lò viba. 3. Để nguội ở nhiệt độ phòng còn khoảng 50oC. 4. Đổ gel vào khay (đặt lược tạo giếng trước khi đổ gel), chú ý tránh bọt khí khi đổ gel. 5. Để gel đông đặc lại ở nhiệt độ phòng, khoảng 30 phút, rút lược ra khỏi gel, cho gel vào bồn điện di sao cho gel ngập trong dung dịch TAE 0,5X khoảng 1 đến 1,5 cm. 6. Trộn 2,5 l sản phẩm PCR với 1,5 l loading dye 6X trên mặt giấy parafin. Cho hỗn hợp vào giếng của gel, bao gồm giếng thang chuẩn, giếng đối chứng và giếng chứa mẫu. 7. Vận hành máy điện di ở hiệu điện thế 50V, thời gian 70 phút. 8. Sau khi hoàn tất quá trình điện di, bảng gel được lấy ra khỏi bồn điện di và nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong khoảng 15 – 20 phút và chụp ảnh gel bằng máy chụp Geldoc. d) Đọc kết quả điện di. Sau khi điện di, gel được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide từ 5 - 15 phút. Vớt ra, rửa lại nhiều lần với nước và đọc kết quả dưới tia UV. DNA liên kết với ethidium bromide sẽ phát sáng dưới tia UV. Chụp ảnh kết quả điện di bằng máy Gel BioRad. 42 3.3.5.5. Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYSpc2.1 Các băng thu được từ kết quả điện di RAPD được mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1, băng nào có thì chuyển thành 1, băng không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa được lưu dưới dạng file excel (xls) và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 để xử lý. 43 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả lấy mẫu, phân lập và nhân sinh khối 4.1.1. Kết quả lấy mẫu, phân lập Mẫu bệnh rụng lá Corynespora với vết bệnh đặc trưng (mục 2.3.1.2) được thu thập từ nhiều dvt cao su khác nhau từ vườn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống – tại trại thực nghiệm cao su Lai Khê, VNCCSVN (Bình Dương). Trong quá trình lấy mẫu trên đồng ruộng chúng tôi nhận thấy ở Việt Nam chuyên canh cây cao su trên diện rộng, trải dài từ Bắc đến Nam trong vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều là điều kiện rất thuận lợi cho nấm C. cassiicola lây lan, phát triên. Hiện nay bệnh này chưa bùng phát mạnh nhờ hiệu quả của công tác quản lý dịch bệnh. Những dvt mẫn cảm với bệnh này đều bị loại bỏ và được khuyến cáo không trồng. Khi phát hiện vườn cây có bệnh, tiến hành cưa bỏ toàn bộ, đốt cháy để hạn chế sự phát tán mầm bệnh. Những khu vực phát hiện bệnh này là Miền Đông Nam Bộ (Bình Dương, Đồng Nai), miền Bắc (Hà Tây, Nghệ An). Những đợt điều tra bệnh lá trên cây cao su gần đây ở tỉnh Tây Ninh và khu vực Tây Nguyên chưa phát hiện thấy có bệnh này Xét về mức độ ảnh hưởng không giống với các nấm khác trên cây cao su thường chỉ gây bệnh tại một vị trí, hay một giai đoạn nhất định (bệnh Nấm Hồng, bệnh Phấn Trắng.v.v.). Nấm C. cassiicola gây bệnh tại nhiều vị trí trên cây cao su từ lá non, lá già, cuống lá, chồi. Bệnh gây hại quanh năm trong suốt các giai đoạn phát triển của cây cao su từ vườn ươm, vườn kiến thiết cơ bản đến vườn cây khai thác. Bệnh Corynespora có biểu hiện triệu chứng rất khác nhau, thay đổi tùy theo tính mẫn cảm của dvt đối với nấm bệnh. Ngoài triệu chứng điển hình trên lá già vết bệnh đặc trưng hình xương cá dọc theo gân, lá chuyển dần sang màu đỏ cam (Hình 4.1). Trên lá non còn có triệu chứng vết bệnh tròn, tâm đen có quầng màu vàng bao quanh.Tại trung tâm vết bệnh đôi khi hình thành lỗ thủng, lá quan biến dạng sau đó hình thành lỗ thủng. Triệu chứng đôi khi có thay đổi tùy mức độ mẫn cảm của dvt (Hình 4.2). Triệu chứng này có thể gây nhầm lẫn giữa bệnh rụng lá Corynespora với bệnh héo đen đầu lá do nấm 44 Colletotrichum gloeosporioides gây ra trên lá trưởng thành nhưng không u lồi mà trơn láng khi dùng tay vuốt nhẹ (Hình 4.3). Do cây cao su là cây cao to, tán lá lớn, rậm nên việc dùng biện pháp hóa học chỉ áp dụng cho vườn ươm, vườn nhân. Đối với cây cao su là một cây công nghiệp dài ngày, việc nhổ bỏ trồng lại sẽ gây thiệt hại rất lớn. (a) (b) (c) (d) Hình 4.1 Triệu chứng đặc trƣng của bệnh rụng lá Corynespora – vết bệnh hình xƣơng cá ở mặt trên của lá (a và b), ở mặt dƣới của lá(c), lá bình thƣờng (d) (Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN (a),(b). Chụp tại vườn tuyển non Lai Khê: (c),(d)) Hình 4.2 Triệu chứng không đặc trƣng của bệnh rụng lá Corynespora Dấu mũi tên chỉ vị trí vết bệnh. Vết bệnh phóng lớn (góc trái) 45 Hình 4.3 Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do Colletotrichum gloeosporioides gây ra trên cây cao su Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN) (a) (b) (c) Hình 4.4 Bào tử của nấm C. cassiicola trên môi trƣờng PDA (a), từ vết bệnh (b) và bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioides (c) dƣới kính hiển vi quang học. (Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN) Sau khi phân lập, các mẫu nấm được kiểm tra lại bằng cách làm tiêu bản và quan sát bào tử dưới kính hiển vi. Kết quả đã có 63 mẫu bệnh (Phụ lục 3) phân lập được nấm C. cassiicola, phần lớn các mẫu nấm là nấm Colletotrichum 46 gloeosporioides, phân biệt rất dễ dàng bằng bào tử (Hình 4.4). Các mẫu nấm sau khi phân lập được tiến hành tách đơn bào tử trên lame trang agar. Do nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trường nhân tạo. Nên chỉ tách đơn bào tử được 11 nguồn nấm C. cassiicola. Để dễ dàng trong việc phân tích, nguồn nấm được phân lập từ dvt cao su nào sẽ được gọi tên theo dvt cao su đó. Để dễ dàng cho việc chú thích chúng tôi kí hiệu tên 11 nguồn nấm theo số thứ tự từ 1- 11 (Bảng 4.1). Bảng 4.1 Danh sách các nguồn nấm C. cassiicola phân lập đƣợc. Số thứ tự Tên nguồn nấm Số thứ tự Tên nguồn nấm 1 LH99/0019 7 LH99/0679 2 LH99/0019 8 LH99/0053 3 LH99/0131 9 LH99/0216 4 LH99/0131 10 LH99/067 5 LH99/0431 11 RRIV4 6 LH99/0617 Các nguồn nấm có sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc. Tuy nhiên đặc điểm chung của các nguồn nấm phân lập từ các dvt cao su khác nhau là khuẩn lạc có màu xám, sợi nấm mọc thành những đường tròn đồng tâm. Khuẩn lạc mọc dầy và tụ lại. Khi quan sát bằng cách lật ngược đĩa petri có thể nhận thấy những đường tròn đồng tâm, nấm nuôi cấy lâu ngày sẽ tạo sắc tố màu đen. Ở điều kiện nuôi cấy bình thường, nấm C. cassiicola rất khó hình thành bào tử. Hình 4.5 Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng thạch đĩa PDA sau 4 ngày nuôi cấy 1 4 47 Các dòng nấm đã tách dơn bào tử được chuyển sang môi trường potato dextrose broth (môi trường PDA không có agar) lỏng để nhân sinh khối để tiếp tục nghiên cứu. 4.1.2. Kết quả nhân sinh khối Hình 4.6 Màu sắc sợi nấm trên môi trƣờng PDA lỏng. Bảng 4.2 Kết quả sau khi nhân sinh khối nấm C.cassiicola trong môi trƣờng lỏng. STT Nguồn nấm Khối lượng (g) Màu sắc môi trường (sau 4 ngày nuôi cấy) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 LH99/0019 LH99/0081 LH99/0098 LH99/0131 LH99/0431 LH99/0617 LH99/0679 LH99/0053 LH99/0216 LH99/0672 RRIV4 1,05 1,34 1,32 0,89 0,95 1,1 1,47 0,96 1,24 1,15 0,98 Đen Trắng Đen Đen Đen Đen Đen Đen Đen Đen Đen Bảng 4.2 cho thấy tất cả các nguồn nấm thí nghiệm đều có khả năng tạo sợi nấm trong môi trường lỏng PDA. Nguồn nấm 7: LH99/0679 cho khối lượng cao nhất với khối lượng là 1,47g. Nguồn nấm 4: LH99/0431 cho khối lượng thấp nhất với khối lượng là 0,89g. 48 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Qua quá trình nuôi cấy cho thấy các nguồn nấm có màu sắc đa dạng, thay đổi theo tuổi trên môi trường PDA lỏng. Darussamin A. và Pawirosoemardjo S., 1996, khi nuôi nấm trên môi trường môi trường PDA lỏng cũng đã thấy hiện tượng tương tự. Điều này cho thấy có thể ở các giai đoạn phát triển khác nhau tính trạng màu sắc của nguồn nấm được qui bởi các gen khác nhau. Cũng có thể trong quá trình phát triển các hoạt động trao đổi chất của các nguồn nấm này tạo ra các chất làm đổi màu sắc của các nguồn nấm trên. Tuy nhiên sau 4 ngày nuôi cây nguồn nấm 2: LH99/0081 có màu trắng còn các nguồn nấm còn lại có màu đen, các nguồn nấm đều cho thấy độ nhớt cao. Lưu ý nấm C. cassiicola rất dễ bị nhiễm trong quá trình nuôi cấy. Thường nấm C. cassiicola bị nhiễm sau 1 – 2 ngày nuôi cấy. Triệu chứng của các nguồn nấm bị nhiễm là môi trường nuôi cấy bị đục, tăng sinh khối chậm. Để xác định các nguồn nấm không bị nhiễm, trước khi thu sinh khối, dịch nuôi cấy của các nguồn nấm này đều đượclàm tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. 4.2. Kết quả ly trích Chúng tôi tiến hành ly trích DNA của 11 nguồn nấm theo quy trình ly trích của Lee và Taylor (1990) có cải tiến (mục3.3.4.2). Sau khi điện di, kết quả thu được thể thể hiện trong hình 4.7: Hình 4.4 Kết quả li trích DNA tổng số theo qui trình của Lee và Taylor (1990) có cải tiến Hình 4.7 cho thấy DNA tổng số ly trích theo quy trình ở mục 3.3.4.2 không sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng số còn có các đoạn DNA bị gãy do quá trình 49 nghiền chưa tốt hoặc thao tác chưa tốt, các đoạn DNA bị gãy thể hiện thành các vệt mờ chạy dọc theo giếng, xuất hiện cả bên trên và bên dưới băng DNA tổng số. Các vệt sáng ở cuối giếng là phần tạp nhiễm do quá trình tinh sạch DNA li trích chưa tốt. Hơn nữa lượng DNA tổng số ly trích được không nhiều (30 ng). Với mục tiêu cố gắng tối ưu hóa từng giai đoạn để đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra tốt. Nhận thấy sản phẩm ly trích còn nhiều tạp nhiễm, lượng DNA tổng số ly trích được không nhiều. Trên cơ sở tham khảo, phân tích và thử nghiệm các qui trình li trích của: Lee và Taylor, 1990; David và cộng sự 1980; Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005. Chúng tôi có một số thay đổi, cải tiến qui trình li trích như sau. Nghiền 0,1 – 0,3 g sợi nấm đã được làm khô kiệt trong nitơ lỏng. Thêm 400 µl lysis buffer (phụ lục 2) và vortex cho tới khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer (cho tới 700 µl). Ủ 1h ở 65oC. Thêm một thể tích tương ứng (400 µl) hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1), và lắc nhẹ. 1. Ly tâm 1 phút với tốc độ 14000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. 2. Chuyển dịch nổi (khoảng 300 µl) vào một ống eppendorf mới. 3. Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 1/2 thể tích isopropanol. Trộn nhẹ nhàng. 4. Ly tâm 1 phút (10000 vòng/phút ở 4oC). 5. Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70%. 6. Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với một thể tích TE 1X hoặc nước (khoảng200 µl). 7. Thêm vào 2 l RNase vào hỗn hợp trên, trộn đều. 8. Ủ ở 370C khoảng 1 giờ. 9. Thêm vào 2 l Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ trong 2 phút. 10. Ly tâm 1 phút với tốc độ 14000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. 11. Chuyển phần trên sang một ống eppendorf mới. 50 12. Kết tủa DNA bằng cách thêm 0,03 thể tích natri acetate 3M (6 µl) và 0,5 thể tích isopropanol(100 µl). Trộn nhẹ nhàng. 13. Ly tâm 1 phút (10000 vòng/phút ở 4oC). 14. Loại bỏ dịch nổi, rửa phần kết tủa 3 lần với ethanol 70% 15. Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với một thể tích TE 1X hoặc nước (khoảng50 µl). 16. Kiểm tra sự có mặt và độ tinh sạch của DNA bằng cách điện di trên gel agarose và đo OD. Kết quả li trích thể hiện qua Hình 4.8 Hình 4.8. DNA tổng số của 11 nguồn nấm C. cassiicola (Bảng 4.1), li trích theo qui trình mới cải tiến Hình 4.8 cho thấy các mẫu DNA li trích đã sạch hơn so với kết quả ở Hình 4.4. Các phần tạp bị loại bỏ. Qui trình ly trích sử dụng RNase giúp loại bỏ RNA. Natri acetate kết hợp với isopropanol kết tủa và rửa sạch DNA, bảo vệ DNA, thao tác cũng đã tốt hơn, nhờ đó các mẫu DNA gãy đã ít hơn. Các mẫu DNA đều có nồng độ cao (100 ng) và đồng đều cần pha loãng (10 lần) trước khi tiến hành phản ứng PCR. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 51 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Hình 4.9 Các mẫu DNA của 11 nguồn nấm (Bảng 4.1), sau khi tiến hành pha loãng Một số lưu ý trong quá trình li trích : Quá trình li trích DNA phụ thuộc rất nhiều vào thao tác và kinh nghiệm của người li trích. Trong quá trình li trích thao tác nhẹ nhàng tránh làm đứt gãy DNA, cần chú ý một số vấn đề sau: Lysis buffer bảo quản ở 4oC khi đem ra sử dụng có hiện tượng kết tủa ảnh hưởng đến hiệu quả li trích DNA do đó cần mang ủ ở 37 C trước khi sử dụng Quá trình nghiền nấm trong Nitơ lỏng cần thao tác đều tay, không quá mạnh gây ảnh hưởng đến sự đứt gãy DNA. Ở lần ly tâm thứ nhất sau khi ly tâm nếu phần dịch nổi phía trên chưa trong thì có thể ly tâm lại. Khi chuyển dịch trong sang eppendorf mới (sau khi ly tâm lần thứ nhất) cần cẩn thận tránh lấy phải phần tạp phía dưới. Thường bước này chỉnh pipet ở 400ul hút khoảng 300 μl là vừa. Tóm lại qui trình li trích DNA trên ổn định và hiệu quả, phù hợp để li trích DNA nấm C. cassiicola. 4.3. Thiết lập qui trình RAPD và đánh giá độ đa dạng di truyền của các chủng nấm C. cassiicola phân lập đƣợc từ vƣờn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống –trại thực ngiệm Lai Khê– VNCCSVN (Bình Dƣơng). 4.3.1. Thí nghiệm 1: khảo sát qui trình RAPD của Silva và cộng sự, 2003. Thực hiện theo qui trình này sản phẩm PCR không có băng sau khi điện di trên gel dù Silva và ctc, 2003 đã thu dược kết quả tốt khi phân tích đa dạng di 52 4 5 6 truyền của 42 chủng nấm C. cassiicola với các primer OPL-08, OPM-O5, OPD - 18, các băng DNA được tạo ra có kích từ 300bp đến 2600bp. Điều này có thể do hóa chất có nguồn gốc khác nhau hoặc thiết bị PCR khác nhau (máy thermo cycler khác nhau). Chúng tôi cũng đã thử nghiệm một vài qui trình khác tuy nhiên kết quả cũng không tốt lên. Trên cớ sở lý thuyết (mục 2.6.2), tham khảo một số qui trình nhiệt của các tác giả khác (P. romruensukharom và cộng sự, 2005; Silva và cộng sự, 1998, 2002, 2003) và trải qua quá trình phân tích, thử nghiệm, cuối cùng chúng tôi đề ra được qui trình nhiệt như sau. Bảng 4.3 Chƣơng trình nhiệt đƣợc xây dựng ở thí nghiệm 1 Số lần lập lại Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 1 94 1 phút 39 2 94 45 giây. 3 35 1 phút 4 74 3 phút 1 5 72 10 phút 6 giữ 40C Với qui trình nhiệt ở Bảng 4.3 sản phẩm PCR đã xuất hiện băng điện di trên gel. Tuy nhiên các băng còn mờ. Do đó chúng tôi nghĩ có thể do số chu kỳ ít hoặc thành phần hóa chất chưa tối ưu. Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR ở thí nghiệm 1, primer OPM-O5, nguồn nấm 4, 5, 6, (Bảng 4.1) 4 5 6 53 4.3.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố chu kỳ đến phản ứng RAPD. Hình 4.10 cho thấy phẩm PCR có xuất hiện băng trên gel điện di nhưng kết quả các băng còn mờ. Mặt khác kỹ thuật RAPD thường tiến hành với 45 chu kỳ, ở 45 chu kỳ sẽ cho số lượng sản phẩm nhiều hơn so với 40 chu kỳ (Kurt Weising, Hide Nybom, Kirten Wolff, Wieland Meyer, 1995). Do đó chúng tôi lần lượt tăng số chu kỳ lên 42 và 45 chu kỳ. Kết quả thể hiện qua hình 4.11. Chúng tôi cũng đã tiến hành thí nghiệm ở cả 3 máy PCR: Master gradient PCR, Bio rad, PTC100 Thermal cycler. Do các loại máy PCR khác nhau có thời gian chuyển giữa các bước 2, 3, 4 (Bảng 4.3) trong một chu kì nhiệt là khác nhau. Nên cùng một chương trình nhiệt nhưng chỉ có hai loại máy PCR có xuất hiện băng diện di trên gel: Master gradient PCR và Bio rad là sản phẩm PCR có băng điện di trên gel. Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR của thí 2 nghiệm khi thực hiện với primer OPM - O5, nguồn nấm 4 (Bảng 4.1), trên máy PCR Master gradient PCR (M), Bio rad (B. Qua Hình 4.11 cho thấy ở 45 chu kỳ các băng DNA rõ hơn, sản phẩm PCR nhiều hơn. Cả hai máy PCR Master gradient PCR và Bio rad đều cho sản phẩm PCR có băng khi điện di, tuy nhiên máy PCR Master gradient PCR với chất lượng băng tốt hơn. Do đó để đảm bảo tính chính xác cho nghiên cứu chúng tôi quyết định chọn máy PCR: Master gradient PCR để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. B M B M B M 40 chu kỳ 42 chu kỳ 45 chu kỳ 54 4.3.3. Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hƣởng của các yếu tố MgCl2, dNTP, primer, DNA, Taq - polymerase (Promega) lên phản ứng RAPD. Phản ứng PCR là một hệ tương thích các thành phần hóa chất được xác định cụ thể trong thực nghiệm. Với mục tiêu tối ưu hóa cho phản ứng RAPD chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3: lần lượt thay đổi các thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD. Kết quả thể hiện trong Hình 4.12. (a) (b) (c) (d) Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm RAPD các nghiêm thức từ 1 – 6 với primer OPL-08 (Hình 4.12.a), primer OPM-O5 (Hình 4.12.b), primer OPD - 18 (Hình 4.12.c), nghiệm thức 7-10 ở nguồn nấm 4 (Bảng 4.1) với primer OPM-O5 (Hình 4.12.d), nguồn nấm 4 (Bảng 4.1), NT:(nghiệm thức) Qua Hình 4.12. cho thấy ở cả 3 primer nghiệm thức 3 là tối ưu nhất. Do dó chúng tôi chọn nghiệm thức này để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.  Sau hai lần lập lại các thí nghiệm 1, 2, 3 chúng tôi đã chọn qui trình RAPD cho kết tốt nhất. Quy trình này được thể hiện qua Bảng 4.4 và Bảng 4.5. NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 55 Bảng 4.4 Thành phần hóa chất phản ứng RAPD thu đƣợc sau thí nghiệm 1, 2, 3 Hóa chất Dung dịch gốc Nồng độ cuối Thể tích sử dụng PCR buffer MgCl2 dNTP primer Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 10X 25 mM 10 mM 10 pmol/μl 5 U 10 ng/μl 1X 2,5 mM 0,3 mM 0,5 mM 0,5 U 10 ng 1. μl 1 μl 0,3 μl 1 μl 0,1 μl 1 μl 5,6 μl Bảng 4.5 Chƣơng trình nhiệt đƣợc xây dựng sau thí nghiệm 1, 2, 3 Số lần lập lại Các bước Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 1 94 1 phút 45 2 94 45 giây. 3 35 1 phút 4 74 3 phút 1 5 72 10 phút 6 giữ 40C 4.3.4. Đánh giá độ đa dạng di truyền của các chủng nấm C. cassiicola phân lập đƣợc từ vƣờn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống tại trại thực nghiệm Lai Khê – VNCCSVN (Bình Dƣơng). Để phát hiện sự đa hình của các nguồn nấm trên, 3 primer (OPL-08, OPM- O5, OPD - 18) được sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA thu được từ các chủng Corynespora cassiicola (Burt &Curt) Wei, theo qui trình đã tối ưu sau các nghiệm thức trên. Sản phẩm RAPD của những primer này được quan sát theo kết quả điện di trên gel (Hình 4.13). Mỗi giếng đại diện cho một dòng, mỗi băng hiện diện với một kích thước phân tử xác định bởi vì nó là kết quả của sự tăng bội của một sợi đơn DNA gốc. Các đoạn DNA có cùng trọng lượng phân tử sẽ di chuyển với cùng khoảng cách trên gel. Sự đa dạng di truyền phân tử được chỉ ra bởi sự khác biệt của các băng DNA hình thành. 56 Quan sát Hình 4.13 cho thấy cả ba primer được sử dụng đều cho sản phẩm khuếch đại tốt, các băng rõ, các băng đa hình nhiều. Tổng cộng có 35 băng, kích thước từ 100 bp – 2600 bp. Trong đó có 34 băng đa hình (băng đa hình có ở mẫu này nhưng không có ở mẫu kia. băng đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu). chiếm tỉ lệ 97,1%, 1 băng đồng hình duy nhất (với primer OPM-O5, kích thước 400kb) chiếm tỉ lệ 2,9%. Qua Hình 4.13 còn cho thấy ngoài những băng rõ (Hình 4.13.a là các băng 350bp, 450bp; Hình 4.13.a là các băng 400bp, 800bp .v.v.; Hình 4.13.a là các băng 650bp, 800bp.v.v.). Còn có những băng mờ hoặc khó nhận diện. Điều này có thể do đặc điểm di truyền làm hạn chế khả năng bắt cặp của primer, làm giảm số lượng sản phẩm PCR. Nguyên nhân khác có thể do thao tác PCR chưa tốt, điều kiện PCR chưa thật phù hợp. Trong trường hợp này để các băng rõ hơn có thể phải thay đổi nhiều yếu tố trong phản ứng PCR và có thể kết quả cũng sẽ mất đi một vài băng đã có. Trong điều kiện khóa luận chúng tôi chưa khảo sát sâu vấn đề này nên kết quả thu được còn vài băng chưa rõ nếu nhìn bằng mắt. Tuy nhiên nếu sử dụng chức năng detected band trong máy Geldoc thì các băng này vẫn được nhận diện rõ ràng (Hình 4.14). Một nguyên nhân khác nữa có thể do thời gian nhuộm ethium bromide ít, chất lượng ethiumbromide kém (lâu ngày không thay mới). Ngoài ra còn có một số băng tách không rõ có thể do quá trình điện di các băng có kích thước gần bằng nhau nên các băng tách không rõ, bên cạnh đó còn có hiện tượng các băng di chuyển không đều, có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hưởng đến sự di chuyển của các DNA. Những trường hợp này nên thực hiện lại phản ứng PCR hay chạy điện di lại, cho lượng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. 57 Hình 4.13.a (a) (.b) (c) Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của 11 nguồn nấm C. cassiicola (Bảng 4.1) với primer OPL-08 (Hình 4.13.a), primer OPM-O5 (Hình 4.13.b), primer OPD - 18 (Hình 4.13.c). Nồng độ gel 2%, hiệu điện thế 40V, thời gian 70 phút, M: DNA ladder (1.5 Kb). 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 Băng 400 bp Băng mờ 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 Băng 800bp Băng 1450 bp Băng 650 bp 58 Hình 4.14 Phát hiện băng bằng chức năng detected band Ngoài ra còn có một số băng tách không rõ có thể do quá trình điện di các băng có kích thước gần bằng nhau nên các băng tách không rõ, bên cạnh đó còn có hiện tượng các băng di chuyển không đều, có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hưởng đến sự di chuyển của các DNA. Những trường hợp này nên thực hiện lại phản ứng PCR hay chạy điện di lại, cho lượng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. Những nguyên nhân trên khiến cho việc thu thập dữ liệu để phân nhóm cần tiến hành cẩn thận. Ở cả 3 primer thì nguồn nấm số 7 cho số lượng băng rất ít. Điều này có thể do đặc điểm di truyền của các dòng nấm này đã làm giảm vị trí bắt cặp của các primer này, do đó làm giảm số lượng băng. Ba nguồn nấm 8, 9, 10 cho kiểu băng rất khác biệt, nên có thể phân biệt các nguồn nấm 7, 8, 9, 10 với nguồn nấm khác (trong phạm vi nghiên cứu này). Qua Hình 4.13.a cho thấy với primer OPL-08 sản phẩm tạo ra có 14 băng, kích thước từ 300 bp – 2 kp, cả 14 băng đều đa hình. Trung bình có 5.5 băng/nguồn nấm. Nguồn nấm số 7 có chỉ có 2 băng (khoảng 380 bp và 450 bp) do dó có thể phân biệt nguồn nấm này với các nguồn nấm còn lại (trong phạm vi nghiên cứu này). 59 Qua Hình 4.13.b cho thấy với primer OPM-O5 sản phẩm tạo ra có 15 băng, kích thước từ 200 bp – 2600 bp. Trung bình có 5.2 băng/nguồn nấm. Có một băng đồng hình duy nhất 400 bp, 14 băng còn lại đều đa hình. Băng 400 bp xuất hiện ổn định, có thể tiếp tục nghiên cứu để tìm mối quan hệ với tính trạng có liên quan. Qua Hình 4.13.c cho thấy với primer OPD - 18 sản phẩm khuếch đại tạo ra có 7 băng, kích thước từ 450 bp – 1850 bp. Cả 7 băng đều đa hình, đây là primer cho số lượng băng đa hình thấp nhất. Trung bình có 3 băng/nguồn nấm. Với Primer OPD - 18 sản phẩm khuếch đại tạo ra ở nguồn nấm số 7 cho một băng duy nhất (800 bp), nguồn nấm số 1 cho 2 băng (800 bp, 650 bp). Nguồn nấm số 8 cho 3 băng, trong đó có băng 1450 bp chỉ có ở nguồn nấm này. Do đó có thể tiếp tục nghiên cứu để dụng primer này như là chỉ thị (marker) phân tử cho các nguồn nấm số 1, 7, 8. Từ kết quả trên cũng dẫn đến một số nhân xét sau: Phản ứng RAPD rất nhạy cảm với các thành phần hóa chất, chỉ cần thay đổi 1 yếu tố thì sản phẩm thu được sẽ khác nhau. Do đó cần kiểm tra lại toàn bộ quy trình khi có sự thay đổi về một yếu tố nào đó. Chỉ sử dụng cùng một loại dụng cụ và thiết bị khi thực hiện kỹ thuật RAPD. Đặc biệt nên sử dụng cùng một loại eppendorf thành mỏng sẽ giúp trao đổi nhiệt tốt hơn, không dán nhãn vào thành eppendorf khi chạy PCR. Kỹ thuật đổ gel: agarose chưa tan đều hoặc do agarose quá nguội khi đổ. Điện trường của máy điện di: do điện thế không ổn định hoặc điện cực bị cong.v.v. Dung dịch điện di: cần thay dung dịch điện di khác. 4.3.5. Phân tích kết quả phản ứng RAPD bằng phần mềm NTSYS Kết quả phát hiện băng được mã hoá dạng nhị phân, theo nguyên tắc có băng thì ghi 1 và không có băng thì ghi 0 (Phụ lục 2). Số liệu thu được đem xử lý 60 bằng phần mềm NTSYSpc 2.1. Kết quả được hiển thị theo dạng số liệu và dạng cây di truyền. Hình 4.15 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với các nguồn nấm C. cassiicola Qua Hình 4.15 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền của 11 nguồn nấm biến thiên từ 0,3142 – 0,9428. Như vậy các mẫu phân tích có quan hệ di truyền khá xa nhau. Tuy nhiên kết luận này còn phụ thuộc vào tỷ lệ mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp. Nếu các mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp chiếm một tỷ lệ lớn thì các mẫu phân tích có quan hệ di truyền xa nhau. Ngược lại nếu chỉ một vài mẫu có hệ số đồng dạng di truyền thấp thì không kết luận được. Tuy nhiên kết quả này rất khó dùng đánh giá đa dạng di truyền. Trên cơ sở bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây phả hệ (dendrogram) . 61 N.1 N.1.2 N.2 N.1.1 H ì n h 4 . 1 6 C â Hình 4.16 Cây phả hệ (dendrogram) của 11 nguồn nấm C. cassiicola Qua Hình 4.16 cho thấy hệ số đồng đạng di truyền của các nguồn nấm được sử dụng trong nghiên cứu này biến thiên từ 0,43 – 0,94. Cây phả hệ (dendrogram) có nhiều nhánh. Điều này cho thấy có sự đa dạng di truyền giữa các nguồn nấm được nghiên cứu. Kết quả này cũng phù hợp với đánh giá: hiện nay nấm hình thành nhiều nòi sinh lí mới, tăng nguy cơ gây hại cho các dvt cao su của Phan Thành Dũng, 2006. Cây phả hệ (dendrogram) chia thành 2 nhóm chính như sau: Nhóm 1 (N1) gồm có 8 nguồn nấm :1, 2, 4, 5, 6, 3, 11. Có hệ số đồng dạng di truyền nằm trong khảng 0,74 – 0,94. Nhóm này lại được chia thành hai nhóm phụ với hệ số di truyền gần hơn như sau: Nhóm N1.1gồm hai nguồn nấm: 1 và 11 có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,79 chứng tỏ hai nguồn nấm này có quan hệ di truyền khá gần nhau. Nhóm N1.2 gồm năm nguồn nấm: 2, 4, 5, 6, 3, 7. Nhóm này có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,79 – 0,94 cây phả hệ (dendrogram) có nhiều nhánh. Điều này 62 cho thấy có thể các nguồn nấm này có cùng nguồn gốc nhưng nấm hình thành nòi mới thích nghi với tính kháng của kí chủ. Mặt khác các nguồn nấm trong nhóm N1.2 có hệ số đồng dạng di truyền cao nên tính kháng và tính mẫn cảm với thuốc bảo vệ thực vật của các nguồn nấm này có thể tương đương nhau. Từ đó ta có thể đề ra hướng diệt nấm giống nhau Trong nhóm này có hai nguồn nấm: 2 và 4 có hệ số đồng dạng di truyền cao: 0,94 nhưng lại cho màu sắc khác nhau trên môi trường PDA sau 4 ngày nuôi cấy. Nguồn nấm số 4 cho màu đen còn nguồn nấm số 2 cho màu trắng (Hình 4.6). Điều này nói lên rằng có thể tính trạng màu sắc được qui định bởi một gen hay một số ít các gen, mà những gen này không hiện diện trong các băng tạo ra khi kỹ thuật RAPD được tiến hành với 3 primer (OPL-08, OPM-O5, OPD - 18) trong nghiên cứu này. Nhóm 2 gồm ba nguồn nấm, có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,69 – 0,85. Trong đó nguồn nấm số 8 có hệ số đồng dạng di truyền thấp nhất: 0,69 nghĩa là có sự khác biệt di truyền so với hai nguồn nấm còn lại trong nhóm. Tóm lại, phân tích RAPD giúp xác định được sự tương quan di truyền giữa các nguồn nấm, từ đó góp phần làm cơ sở sẽ sở cho các chiến lược phòng trừ bệnh và các nghiên cứu tiếp theo đạt hiệu quả hơn. 63 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đã phân lập được 11 nguồn nấm C. cassiicola từ các mẫu bệnh rụng lá Corynespora được thu thập từ vườn tuyển non Lai Khê thuộc Bộ Môn Giống tại trại thực nghiệm Lai Khê– VNCCSVN (Bình Dương) (Bảng 4.2). Xây dựng qui trình ly trích DNA ổn định và hiệu quả, phù hợp để li trích DNA nấm C. cassiicola (Hình 4.8). Quy trình RAPD tốt nhất là quy trình ở Bảng 4.4 và 4.5. Qui trình RAPD này có thể áp dụng để phân tích đa đạng di truyền của quần thể nấm C. cassiicola. Cả 3 primer dùng trong kỹ thuật RAPD ở nghiên cứu này đều cho kết quả khuếch đại tốt. Đã có 35 băng được tạo ra trong đó có 34 băng đa hình và một băng đồng hình. Băng 400bp là băng đặc trưng khi thực hiện kỹ thuật RAPD sử dụng primer OPM-O5 trên 11 nguồn nấm được sử dụng trong nghiên cứu này. Sự khác biệt về hình thái thì dường như không liên quan đến các nhóm RAPD trong nghiên cứu này Việc phân tích RAPD sử dụng 3 primer (OPL-08, OPM-O5, OPD - 18) trên 11 nguồn nấm sử dụng trong nghiên cứu này đã lập được cây phả hệ (dendrogram) có hệ số đồng dạng di truyền dao động trong khoảng 0,43 – 0,94 (Hình 4.15). Cây phả hệ (dendrogram) có nhiều nhánh cho thấy sự da dạng của 11 nguồn nấm sử dụng trong nghiên cứu này. Primer OPD – 18 có thể nhận biết được các nguồn nấm số 1, 2 và 7 trong các nguồn nấm sử dụng trong phạm vi nghiên cứu này. 5.2. Đề nghị Tăng số lượng mẫu và phạm vi lấy mẫu để kết quả nghiên cứu khái quát hơn. 64 Nên tiến hành lấy mẫu trên các kí chủ khác ngoài cây cao su để có thể xác định nguồn gốc nấm C. cassiicola trên cây cao su và phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật. Băng 400bp là băng đặc trưng khi thực hiện với primer OPM-O5 có thể tiếp tục nghiên cứu để tìm mối quan hệ với tính trạng có liên quan. Có thể áp dụng các kỹ thuật có độ tin cậy cao hơn để nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola như: SSR, AFLP. Nghiên cứu các nhân tố ảnh hưởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh như: điều kiện khí hậu, môi trường, tính độc của nguồn bệnh, tính nhạy cảm của kí chủ, quần thể nguồn bệnh, tìm mối quan hệ với các nhóm RAPD. Từ đó phục vụ cho các chiến lược quản lý và phòng trừ bệnh, các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu đặc tính sinh học, đa dạng di truyền và gen kháng của cây cao su. Những nghiên cứu này cần có chiến lược và sự hợp tác chặt chẽ giữa các tổ chức, viện, cơ quan.v.v. 5.3. Hạn chế của đề tài Phạm vi lấy mẫu hẹp, số lượng mẫu tách dơn bào tử được ít. Chưa có thông tin về tính độc của nguồn nấm được phân lập, tính mẫn cảm của các dvt đã lấy mẫu bệnh. Do đó chưa tìm mối quan hệ giữa các nhóm RAPD với tính độc của các nguồn nấm, tính mẫn cảm của các dvt cao su. 65 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT. 1. Nguyễn Quỳnh Anh, 2005. Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP.Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp. HCM 2. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp. HCM 3. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Quyển II, Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông nghiệp. 45-60. 4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. NXB Nông Nghiệp TP Hồ Chí Minh. 5. Trần Văn Cảnh, 2006. Công tác bảo vệ ngành cao su việt nam 6. Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005. Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phương pháp RFLP – PCR.. Khóa Luận tốt nghiệp kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm Tp. HCM. 7. Phan Thành Dũng, 2004. Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.124 trang. 8. Phan Thành Dũng, 2006. Công tác bảo vệ ngành cao su việt nam. Hiên trang và thác thức mới(.VNCCSVN) 9. Diễn đàn khuyến nông và công nghệ.Chuyên đề nâng cao năng lực cao su tiểu điền 2006(nhiều tác giả).Trang 1 – 21. 10. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 2000. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia 11. Nguyễn Hữu Hỗ, 2005. Chuyên đề chuyển gen.Tài liệu giảng dạy Đại Học Nông Lâm. 12. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp Tp. HCM. 220 trang. 13. Nguyễn Thái Thủy, 2003. PCR và Real - time PCR. Công ty Bio – Rad. 101 trang. 14. Nguyễn Hữu Trí, 2004.Công nghệ cao su thiên nhiên. trang17 – 20 66 15. Bùi Trang Việt, 2001. Sinh học Phân tử. Khoa sinh học, ĐH Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh., trường ĐH Khoa học tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh. . TIẾNG ANH 16. Dũng, P.T., 1995. Studies on C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei on rubber. Masters’ thesis. University Pertanian Malaysia. 17. Dũng, P.T and Hoan, N.T., 2000. Current status of Corynespora leaf fall in Vietnam. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 18. Ellis, M.B and Holiday, 1971.Corynespora cassiicola. C.M.I Description of Pathogenic Fungi and Bacteria. No. 303. 1-2. 19. Kuruvilla Jacob C. và cộng sự, 2002. A laboratory Manual for International Training on strategies for management of Corynespora Leaf Fall Disease of Heveabrasiliensis. 20. Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten Wolff, Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press. 322p. 21. Jayashinge, C.K. and W.P.K, Silva.1996. Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996. 22. Ismail, H., N.Z. Radzia and K. Silvadadyan, 1996. Management stragies of Corynespora leaf fall with fungicides and cultural practices. Presented at workshop onCorynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996. 23. Liyanage, A.de., Jayasighe, C. cassiicola k. and liyanage, N.I.S. (1988).Biology, epidemiology and pathogenicity of Corynespora cassiicola leaf fall disease workshop held at Bogor Research Instute, Indonesia, 12 th to 13 th february, 1988 24. Sabu, P.I., 2000. Current status of Corynespora leaf fall in India. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 25. Safiah A. and Noor H.H., 2003. Differentiating races of C. cassiicola using RAPD and ITS chỉ thị (marker)s. Journal of Rubber Research. 6(1). 59 – 64. 67 26. Shukhor S.K. and Hidir S.M., 1996. Current status of Corynespora leaf fall disease in Malaysia. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 27. Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1995. RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of nguồn nấm of the leaf spot fungus C. cassiicola. Aust. J. Bot., 43, 609 – 618. 28. Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1998. Molecular, physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka. Plant pathology, 47 (3), 267-277 29. Silva, W.P.K, Eric H. Karunanayake, Ravi L.C. Wijesundera andUhanowita M.S. Priyanka., 2003. Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence. Mycol Res. 2003 May;107 (Pt 5):567-71. 30. Sinulinga W., Suwanto and Soepena H., 1996. Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 31. Sujanto and Irwan Suhendry., 2000.Corynespora leaf fall disease on Hevea rubber in Indonesia.Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 32. The International Natural Rubber Organization, 1999. Improvement of management strategy in combating Corynespora leaf fall disease (CLFD) in Hevea brasiliensis. TÀI LIỆU TỪ INTERNET. 33. Database: Corynespora cassiicola. 34. =12884953&dopt=Abstract Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence 35. 68 Annual report 36. anion/rapd.html. Các từ khóa: rapd+picture+define 37. NUWS20050722.084916/public/04Chapter3.pdf Các từ khóa: rapd+apply+fungus 38. http:www3.sympatico.ca/roland.pelletier. 69 PHỤ LỤC. Phụ lục I Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR TAE buffer 50X: + Tris-HCl 242 g/l. + Glacial acetic acid 57,1 ml/l. + EDTA 0,5M, pH 8 100 ml/l. TE + Tris HCl 10 mM, pH 8,3. + EDTA 1mM. Loading buffer + 100 % glycerol 5 ml. + TE 5X buffer 2,5 ml. + Bromphenol Blue 0,015 ml. Ethidium bromide +15 l Ethidiumbromide. +300 ml TAE 0,5 X. Ladder +65 % TAE 0,5X. +25 % loading dye 6X. +15 % ladder. 70 Phụ lục II Bảng mã hóa số liệu NTSYS kết quả RAPD 1 36 11 3 Số thứ tự 1:L H99/ 0019 2:LH9 9/0081 3:L H99/ 0098 4:LH9 9/013 1 5:LH9 9/0431 6:LH 99/06 17 7:LH 99/06 79 8:LH9 9/005 3 9:LH 99/02 16 10:L H99/ 067 11:L HH Kích Thước bp OP L- 08 Tổng số 60 băng. Số lượng băng trung bình: 5,5 băng/nguồn nấm. 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2200 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1850 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1750 4 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1500 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1400 6 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1300 7 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1200 8 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 900 9 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 800 10 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 600 11 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 500 12 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 450 13 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 350 14 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 300 0p m0 5-4 Tổng số 59 băng. Số lượng băng trung bình: 5,2 băng/nguồn nấm. 15 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 2600 16 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2300 17 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1600 18 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1400 19 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1300 20 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1200 21 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 950 22 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 800 23 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 650 24 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 550 25 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 480 26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 400 27 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 250 28 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 200 0pd 19- h8 Tổng số 33 băng Số lượng băng trung bình: 3 băng/nguồn nấm. 29 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1850 30 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1450 31 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1300 32 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1100 33 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 800 34 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 650 35 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 450 71 Phụ lục III :Danh sách các dvt cao su phân lập đƣợc mẫu. Số thứ tự Dvt cao su phân lập được mẫu bệnh Số thứ tự Dvt cao su phân lập được mẫu bệnh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 LH99/0019 LH99/0081 LH99/0098 LH99/0131 LH99/0431 LH99/0617 LH99/0679 LH99/0053 LH99/0216 LH99/0672 RRIV4 LH99/0028 LH99/0090 LH99/0083 LH99/0093 LH99/0098 LH99/0023 LH99/0622 LH99/0627 LH99/0638 LH99/0648 LH99/0670 LH99/0696 LH99/0698 LH99/0699 LH99/0775 LH99/0291 LH99/0347 LH99/0675 LH99/0679 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 RRIV 2 MT/C/5 MT/C/4 AC/B/18 AC/B/17 LH 97/164 LH 96/347 RRIC 121 MTIT 14 MTIT 16 RO/CM/10 FX 2840 AC 88 PB 255 PB 260 MTI2 ROT5 LH 97/167 LH 82/008 LH 83/152 VM 515 VE2 LH 82/104 LH 82/183 RRIC 100 RRIC 102 GU 969 IAN 6323 LH 82/156 LH 83/161 LH99/0778