Luận văn Nghiên cứu tính đa dạng của virus y trên khoai tây trồng tại Thái Nguyên

có mặt của 1 (PVYNW) đến 3 (PVYNTN) điểm tái tổ hợp giữa trình tự của PVYN và PVYO trong các biến thể PVY nổi lên gần đây. Nhƣ một sự thay thế cho phƣơng pháp huyết thanh, nhiều thí nghiếm sinh học phân tử đặc hiệu và nhạy cảm đƣợc phát triển dựa trên sự biến đổi trong trình tự PVYN, PVYO hay điểm tái tổ hợp ở bên trong genome nhằm phát hiện đặc hiệu các chủng và biến thể của PVY. Có thể kể đến các phƣơng pháp nhƣ: gel retardation (Rosner và Maslenin, 2001, 2003 [58] [59]; Matousek và cs, 2000 [47]); RT-PCR-RFLP (Glais và cs, 2002 [31]); single-restriction cleavage of PCR products (Rosner và Maslenin, 1999 [57] ); RT-PCR đơn thành phần (Nie và Singh, 2002 [50]; Boonham và cs, 2002 [20]); RT-PCR đa thành phần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 (Nie và Singh, 2002 [50]); AmpliDet RNA; competitive fluorescent RT-PCR (Walsh và cs, 2001 [71]) và PCR 3 mồi (Moravec và cs, 2003 [49]). Sử dụng vật liệu di truyền của virus để tạo cây khoai tây chuyển gen là một hƣớng đi mới, đã và đang nhận đƣợc những kết quả khá khả quan. Schubert và cs, 2004 đã tạo thành công khoai tây chuyển gen Nib kháng PVY. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu virus PVY ở Việt Nam Ở nƣớc ta, những nghiên cứu về bệnh virus nói chung và bệnh PVY nói riêng trên khoai tây còn rất ít. Việc nghiên cứu mới bắt đầu dừng lại ở phát hiện sự xuất hiện của bệnh, sự phân bố của bệnh trên các cánh đồng khoai tây, tỉ lệ nhiễm, thiệt hại và phản ứng của cây khi bị nhiễm virus. Cũng có những nghiên cứu xác định loại và chủng virus, nhƣng dựa trên các phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng, cây chỉ thị, huyết thanh, kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 1986) [6]. Với sự tiến bộ của công nghệ sinh học đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh Nguyễn Thị Kim Thanh và cs, 1994) [9], (Trần Thanh Thu và cs, 1988) [10], (Trƣơng Quang Vinh, 2007) [14]. Đến nay, vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu áp dụng kĩ thuật sinh học phân tử trong phân tích, đánh giá đặc điểm di truyền của PVY khoai tây đƣợc công bố (Phạm Thị Vân và cs, 2009) [13]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các mẫu lá khoai tây có triệu chứng bị nhiễm bệnh đƣợc thu từ một số vùng thuộc miền Bắc Việt Nam. Các mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng sau: Bảng 2.1. Danh sách các mẫu thu tại các điểm nghiên cứu STT Địa điểm thu thập mẫu Kí hiệu 1 Phú Bình – Thái Nguyên Phú Bình 2 Phổ Yên – Thái Nguyên Phổ Yên 3 Văn Lâm – Hƣng Yên Hƣng Yên 4 Việt Yên - Bắc Giang Bắc Giang 5 Thái Thụy - Thái Bình Thái Bình 2.2. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.2.1. Hoá chất - Bộ kit tách chiết RNA tổng số của hãng Invitrogen. - Bộ kit tổng hợp cDNA của hãng Fermentas. - Bộ hoá chất sử dụng cho kĩ thuật PCR. - Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của Bioneer. - Các hoá chất thông dụng phục vụ cho các kĩ thuật sinh học phân tử nhƣ agarose, cồn, X- gal, ampicilin… 2.2.2. Thiết bị Máy li tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và nhiều thiết bị khác. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.2.3. Địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm đƣợc tiến hành tại: + Phòng thí nghiệm Di truyền học, khoa Sinh-trƣờng Đại học Sƣ phạm; Phòng thí nghiệm thuộc khoa Sinh-trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên. + Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các thí nghiệm công bố trong luận văn đƣợc thể hiện qua sơ đồ sau: Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 2.3.1. Phƣơng pháp thống kê Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY đƣợc xác định theo phƣơng pháp thống kê. Trong mỗi khu vực nghiên cứu, lấy ngẫu nhiên 3 lô thí nghiệm. Mỗi lô có 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng bị bệnh trong Xác định tỉ lệ nhiễm, Thu thập mẫu bệnh Tách RNA tổng số Nhân gen CP Tách dòng gen Xác định và so sánh trình tự gen CP Khai thác trình tự trong NCBI Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng bị bệnh ở mỗi vùng sẽ đƣợc tính bằng trung bình của tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh trên 3 lô. 2.3.2. Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số Chúng tôi đã sử dụng bộ kit Trizol Reagents (Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số theo quy trình sau: - Cân 100mg lá khoai tây có triệu chứng nhiễm bệnh, nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải đƣợc nghiền triệt để và tránh enzyme RNase cắt RNA. - Chuyển ngay mẫu vào ống eppendorf 2ml. - Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15-300C) trong 5 phút. - Bổ sung 200µl Chloroform: Isoamyl (24:1). - Đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút. - Hút 500 dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf 1,5ml. - Bổ sung 500µl Isopropanol đã đƣợc làm lạnh đến 40C, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa. - Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, ly tâm 10000 vòng/phút trong 15 phút. - Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cồn 700 pha trong DEPC 0,01%. - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút. - Làm khô RNA bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút. - Pha loãng RNA trong 40µl H2O đã xử lí DEPC 0,01%. - Ủ ở nhiệt độ 550C trong 5 phút để RNA tan hết. Do RNA dễ bị RNase cắt nên tất cả các dụng cụ đều phải xử lí DEPC 1% và khử trùng trƣớc khi sử dụng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.3.3. Phƣơng pháp RT-PCR Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) là sự kết hợp của hai phản ứng: sao mã ngƣợc (reverse transcription) tạo cDNA và PCR để nhân một đoạn gen quan tâm từ cDNA. Kỹ thuật RT-PCR để nhân gen CP đƣợc tiến hành theo hai bƣớc sau: Bước 1: Tổng hợp cDNA - Bổ sung lần lƣợt các thành phần sau đây vào ống eppendorf 0,5ml đã đƣợc xử lí DEPC 1% hoặc Rnase: Thành phần Thể tích 250ng mồi ngẫu nhiên 2µl 10pg - 5µg RNA tổng số 2µl dNTPs 10mM 2µl - Bổ sung nƣớc DEPC 0,01% tới thể tích 13µl. - Ủ ở 650C trong 5 phút, sau đó đặt vào đá. - Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng: Buffer 5X 4µl DTT 0,1M 1µl Rnase OUT TM (40 đơn vị/µl) 1µl Cloned AMV RT (15 đơn vị/µl) 1µl - Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kì nhiệt nhƣ sau: Bƣớc Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 25 10 2 45 50 3 85 5 4 4 ∞ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Bước 2: Phản ứng PCR Sau khi tổng hợp cDNA, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen CP. Thành phần, chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.2 và bảng 2.3. Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion, khử trùng 12,5 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (10mM) 2 5 Mồi xuôi 1 6 Mồi ngƣợc 1 7 Taq polymerase (1U/1µl) 0,5 8 cDNA 3 Tổng 25 Bảng 2.3. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 30 3 Gắn mồi 52 50 giây 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarase 1%, rồi đƣợc làm sạch (thôi gel) theo bộ kit của Bioneer và gắn vào vector pBT, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. 2.3.4. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR - Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, có kích thƣớc khoảng 1200bp. - Bổ sung dung dịch QG theo tỉ lệ: Vmẫu:VQG= 1 : 3. - Ủ ở 500C trong 15 phút, 3 phút trộn nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn. - Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel Qiaquick spin column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột chảy qua cột. - Thêm 750µl dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. - Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại hết PE. - Hoà tan DNA trong 30-50µl H2O deion, khử trùng đã đƣợc làm ấm đến 50 0C để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. 2.3.5. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng Thành phần phản ứng gắn gen vào vector đƣợc thể hiện ở trong bảng 2.4. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng STT Thành phần Thể tích (µl) 1 DNA 13 2 Ligation buffer 10X 2 3 pBT 2 4 PEG 4000 2 5 T4 ligase 1 Tổng 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 2 giờ, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli. 2.3.6. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Bổ sung 20µl vector đã gắn gen vào ống dựng tế bào khả biến và trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc ủ 40C trong 30 phút, rồi ủ ở 420C chính xác 1 phút và sau đó ủ 40C trong đá 5 phút. Bổ sung 300µl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở 370C, lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 100mg/l ampicillin, X- gal 0,004‰, IPTG 100µM. Ủ đĩa ở 370C trong 16 giờ. 2.3.7. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Kết quả của quá trình biến nạp là tổ hợp của các khuẩn lạc xanh và trắng. Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony- PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen CP mong muốn. Thành phần của phản ứng colony-PCR tƣơng tự nhƣ trong phản ứng PCR chỉ khác cặp mồi sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc, nhiệt độ gắn mồi 540C. Điện di sản phẩm colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmid nhƣ mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmid. 2.3.8. Tách chiết plasmid Plasmid đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp TELT. Quy trình: - Lấy 2ml dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 10000 vòng/phút trong 7 phút, loại dịch. - Bổ sung 200µl TELT, 10µl lyzozim, khuấy tan để khuẩn tan hết. - Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, ủ ở 950C trong 3 phút, ủ 40C trong 5 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. - Hút dịch nổi sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 - Loại dịch nổi, rửa tủa 2 lần bằng cồn 700. - Làm khô plasmid bằng máy Speed Vac. - Hoà tan plasmid trong 40µl nƣớc cất khử ion, khử trùng. - Bổ sung 0,1µl Rnase, ủ ở 370C trong 2 giờ. - Tinh sạch plasmid để đọc trình tự. Quy trình tinh sạch plasmid: - Bổ sung PB theo tỉ lệ Vmẫu:VPB=1:5, mix nhẹ. - Cho hỗn hợp dung dịch vào cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. - Bổ sung 0,75ml dung dịch NW, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. - Loại dịch, ly tâm bổ sung 1 phút để loại sạch NW. Cho cột tinh sạch vào ống eppendorf 1,5ml. - Bổ sung 30µl H2O deion khử trùng, để ở nhiệt độ phòng 1-2 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. 2.3.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide Trình tự gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer theo bộ kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR đọc trình tự trên máy luân nhiệt GeneAmp® PCR System 9700 nhƣ sau: Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Dung dịch đệm (5X) 3 2 Mồi 1,275 3 DNA mẫu (~200ng) 7,725 4 BigDye 3 Tổng 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Bảng 2.6. Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kì 1 Biến tính 96 1 phút 1 2 Biến tính 96 10 giây 25 3 Gắn mồi 55 5 giây 4 Kéo dài chuỗi 60 4 phút 5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 30 phút Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng cách bổ sung 5µl EDTA 125mM, 60µl cồn 100% và ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Tiếp đó ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để tủa các đoạn DNA, sau đó loại bỏ cồn. Bổ sung 60µl cồn 70% và li tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Làm khô kết tủa DNA, bổ sung 10µl Hi-DiTM Formamide và biến tính ở 950C trong 5 phút. Các mẫu đƣợc tra vào các giếng của khay đựng mẫu, sau đó điện di trong ống mao quản với polymer PoP-4TM của hãng ABI, Mỹ. Kết quả đƣợc xử lí bằng phần mềm DNAstar. 2.3.10. Phƣơng pháp xử lí trình tự gen thu đƣợc Hiện nay, có nhiều phần mềm chuyên dụng xử lí trình tự gen nhƣ PC GENE, Clustal, DNAstar, BioEdit, Chromas…. Trong các phần mềm kể trên, DNAstar là hệ thống phần mềm tiện dụng nhất, đƣợc tạo ra bởi một nhóm các nhà khoa học Mỹ. Phần mềm này bao gồm nhiều chƣơng trình với các chức năng khác nhau dùng để phân tích và xử lí số liệu trong sinh học phân tử. Việc so sánh và xử lí trình tự gen CP đƣợc tiến hành theo trình tự sau: - So sánh trình tự gen đƣợc đọc từ hai đầu xuôi và ngƣợc để xác định trình tự đầy đủ và đúng của gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 - So sánh trình tự đầy đủ của gen với các trình tự gen trong BLAST của NCBI để xác định gen đƣợc tách dòng là của PVY. - Giải mã trình tự nucleotide sang trình tự acid amine theo một trong các khung đọc mở, xác định vị trí mở đầu và kết thúc dịch mã. - Lập cây phân loại và bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tƣơng đồng di truyền của 3 trình tự nucleotide của 3 dòng gen CP thu đƣợc với nhau và với trình tự gen CP của các PVY từ nhiều khu vực khác nhau trên thế giới đã đƣợc công bố trong ngân hàng dữ liệu gen (Gen Bank). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT TỈ LỆ NHIỄM PVY Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG Chúng tôi đã tiến hành điều tra các vùng trồng khoai tây ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam và tiến hành khảo sát ở các địa điểm sau: + Cánh đồng khoai tây thuộc thôn Hành Lạc, thị trấn Nhƣ Quỳnh, huyện Văn Lâm, tỉnh Hƣng Yên. + Cánh đồng khoai tây thuộc làng Khả Lý Hạ, xã Quảng Minh, huyện Việt Yên, tỉnh Bắc Giang. + Cánh đồng khoai tây tại thôn Thùa Lâm, xã Tiên Phong, huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên. + Cánh đồng khoai tây thuộc huyện Phú Bình, tỉnh Thái Nguyên. + Cánh đồng khoai tây thuộc xã Thụy Ninh, huyện Thái Thụy, tỉnh Thái Bình. Trong đó, chỉ cánh đồng ở Phổ Yên-Thái Nguyên trồng khoai tây Hà Lan còn các cánh đồng khác trồng khoai tây Trung Quốc. Thời điểm khảo sát là khi khoai tây đã trồng đƣợc 1 tháng rƣỡi đến 2 tháng. Ở mỗi vùng, chúng tôi đã tiến hành phát hiện và xác định tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY. Việc chẩn đoán cây bị bệnh đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng. Trên từng cánh đồng, chúng tôi lấy 3 lô ngẫu nhiên, mỗi lô 100 khóm. Xác định số khóm có triệu chứng nhiễm PVY trên từng lô. Tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY trên mỗi cánh đồng đƣợc tính bằng giá trị trung bình tỉ lệ nhiễm ở 3 lô. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Bảng 3.1. Tỉ lệ có triệu chứng bị bệnh ở các cánh đồng khoai tây nghiên cứu Cánh đồng khoai tây Ký hiệu Triệu chứng nhiễm PVY (%) Phổ Yên-Thái Nguyên Phổ Yên 14,23 ± 2,56 Phú Bình-Thái Nguyên Phú Bình 28,07 ± 3,03 Thái Thụy-Thái Bình Thái Bình 20,03 ± 3,13 Văn Lâm-Hƣng Yên Hƣng Yên 22,56 ± 2,85 Việt Yên-Bắc Giang Bắc Giang 31,71 ± 2,15 Nhƣ vậy, tỷ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY dao động từ 14,23±2,56% đến 31,71±2,15%. Kết quả này phù hợp với kết quả điều tra của Trƣơng Văn Hộ và cs (1990) [4]. Trong đó, cánh đồng ở Bắc Giang có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY cao nhất (31,71±2,85%) và ở Phổ Yên-Thái Nguyên có tỷ lệ khoai tây mang triệu chứng nhiễm PVY thấp nhất (14,23±2,56%). Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Bắc Giang Mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh ở Bắc Giang Cánh đồng khoai tây khảo sát ở Hưng Yên Mẫu có triệu chứng bị bệnh ở Hưng Yên Hình 3.1. Một số hình ảnh về khoai tây ở các vùng nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Tuy vậy, phƣơng pháp chuẩn đoán bằng mắt thƣờng dễ có sự nhầm lẫn với các bệnh khác nhƣ bệnh do tuyến trùng, các bệnh sinh lí do dinh dƣỡng hay điều kiện khí hậu gây ra. Ngoài ra, dễ nhầm lẫn virus này với những virus khác do có sự xâm nhiễm hỗn hợp của các virus trên cùng một cây. Do đó, chuẩn đoán chính xác khoai tây nhiễm PVY cần kết hợp với các phƣơng pháp khác nhƣ sử dụng kính hiển vi điện tử, phƣơng pháp huyết thanh hay sinh học phân tử. Trong nghiên cứu này, để xác định các mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY thu đƣợc từ 5 cánh đồng khoai tây trên có chính xác là bị nhiễm PVY hay không, chúng tôi tiến hành phân lập và xác định trình tự gen CP của PVY. 3.2. KẾT QUẢ NHÂN GEN, TÁCH DÒNG cDNA 3.2.1. Kết quả nhân gen bằng kỹ thuật RT-PCR Chúng tôi đã thu thập một số mẫu lá khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY từ 5 cánh đồng khoai tây: Phổ Yên, Phú Bình, Thái Bình, Hƣng Yên, Bắc Giang. Sau đó, tiến hành phân lập gen CP của PVY từ các mẫu lá khoai tây này. Trƣớc tiên, chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá có triệu chứng nhiễm bệnh (theo quan sát bằng mắt thƣờng) và tổng hợp cDNA từ RNA tổng số này. Gen CP đƣợc nhân lên bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc cung cấp bởi Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Công nghệ Sinh học: Bảng 3.2. Trình tự mồi đặc hiệu nhân gen CP Mồi Trình tự PVYCPF1 5‟ GCYTTCACTGAAATGATGGT 3‟ PVYCPR1 5‟GTCTCCTGATTGAAGTTTACA3‟ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Để kết quả nhân gen đƣợc chính xác, chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm 3 lần và có đối chứng dƣơng (+), đối chứng âm (-) khi làm thí nghiệm. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.2. Có rất nhiều yếu tố có thể ảnh hƣởng tới chất lƣợng của phản ứng RT- PCR nhƣ: Lƣợng RNA quá ít hoặc quá nhiều, nồng độ mồi quá cao hoặc quá thấp, nhiệt độ gắn mồi chƣa phù hợp…Vì vậy trong quá trình tiến phản ứng cần điều chỉnh hàm lƣợng các thành phần phản ứng (lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg 2+…), nhiệt độ gắn mồi, thời gian đối với mỗi bƣớc của chu kì nhiệt…để phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Hình 3.2. Kết quả RT-PCR từ RNA của các mẫu lá khoai tây nghi nhiễm bệnh M: Marker DNA 1Kb 1: Hƣng Yên; 2: Bắc Giang; 3: Thái Bình1; 4: Thái Bình2; 5: Phổ Yên; 6: Phú Bình (+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-) : Đối chứng âm-thành phần PCR không có RNA Hình 3.2 cho thấy, chỉ mẫu lá khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên, Phú Bình-Thái Nguyên và plasmid mang gen PVY là có đoạn gen đƣợc nhân lên với kích thƣớc khoảng 1200bp. Kích thƣớc này phù hợp với tính toán khi thiết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 kế mồi nhân gen. Vì vậy, chúng tôi kết luận đã nhân thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP của PVY trên khoai tây từ 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình. Từ kết quả RT-PCR chúng tôi kết luận: - Các mẫu lá đƣợc nghi có triệu chứng bị bệnh PVY thu thập từ Hƣng Yên, Bắc Giang, Thái Bình không chứa PVY. Điều này có thể do khi thu thập mẫu quan sát bằng mắt thƣờng nên nhầm lẫn với các bệnh hay loại virus khác. Nhƣ vậy, phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng để xác định bệnh do PVY gây ra ở khoai tây sẽ không chính xác. - Đã phân lập thành công đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với gen CP của PVY từ mẫu khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên. Để đƣa ra kết luận chính xác đoạn gen nhân đƣợc là gen CP từ PVY cần tiến hành tách dòng và đọc trình tự đoạn gen này. 3.2.2. Tinh sạch sản phẩm RT-PCR Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng. Tuy nhiên, sản phẩm PCR ngoài đoạn gen mong muốn ra còn rất nhiều sản phẩm phụ, các nucleotide dƣ thừa sau phản ứng, mồi, enzyme, đệm…Vì vậy để phản ứng ghép nối đạt đƣợc hiệu quả cao nhất cần thiết phải có quá trình tinh sạch sản phẩm PCR để loại bỏ các thành phần không mong muốn. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel) đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit QIAquick Gel Extraction. Khi nâng nhiệt độ 500C thì agarose tan chảy, DNA đƣợc hoà vào dung dịch QG. Sau khi cho dung dịch vào cột tinh sạch QIAquick spin, DNA đƣợc giữ lại bởi các phân tử có ái lực cao với DNA cố định trên màng lọc của cột tinh sạch, dịch đệm QG và agarose bị loại đi nhờ li tâm. Để loại bỏ hết agarose còn bám trên màng lọc, cần thiết phải bổ sung QG vào cột lần thứ 2. DNA đƣợc làm sạch bằng đệm rửa PE chứa 80% ethanol và đƣợc hoà tan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 trong dịch đệm EB hoặc nƣớc deion khử trùng. Bằng phƣơng pháp này đã giữ lại với hiệu suất 85% trở lên. Hình 3.3. Kết quả điện di DNA thu đƣợc từ kỹ thuật thôi gel trên agarose 1% (M: Marker DNA 1Kb; 1: Phổ Yên; 2: Phú Bình) Hình 3.3 cho thấy, sản phẩm thôi gel có hàm lƣợng cao, không bị đứt gẫy đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Chúng tôi sử dụng vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp để tiến hành phản ứng ghép nối và biến nạp. Sản phẩm RT-PCR sau khi tinh sạch đƣợc gắn vào vector pBT bởi enzyme T4 ligase. Phản ứng ghép nối dựa trên nguyên tắc bổ sung giữa hai đầu nucleotide A thò ra ở sản phẩm PCR với Taq polymerase và hai đầu nucleotide T trên vector tách dòng. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vector tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung ampicillin 100mg/l, X-gal 40mg/ml và IPTG 100M. Ủ đĩa petri ở 370C trong 16 giờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Thành công của thí nghiệm này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, nhƣng có 2 yếu tố quan trọng nhất: + Sản phẩm PCR phải đặc hiệu, chất lƣợng tốt. + Tế bào khả biến phải đƣợc chuẩn bị tốt mới đạt đƣợc hiệu suất biến nạp cao nhất. Chúng tôi đã thu đƣợc một lƣợng lớn khuẩn lạc gồm cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Các khuẩn lạc xanh có thể mọc lên từ tế bào nhận đƣợc plasmid tự đóng vòng trở lại nên gen lac-operon hoạt động tổng hợp enzyme β-galactosidase. Enzyme này sẽ chuyển hoá cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh dƣới sự cảm ứng của IPTG. Còn những khuẩn lạc trắng xuất hiện là do vi khuẩn nhận đƣợc plasmid mang lac-operon không hoạt động, enzyme β- galactosidase không đƣợc tạo nên không có quá trình chuyển hoá X-gal thành dạng màu xanh. Lac-operon bị bất hoạt có thể do đoạn gen ngoại lai xen vào giữa promotor của operon gen LacZ làm cho lac-promotor không thể điều khiển quá trình tổng hợp enzyme. Đoạn gen ngoại lai có thể là đoạn gen CP- PVY nguyên vẹn hoặc cũng có thể là những đoạn bị đứt gãy. Các khuẩn lạc trắng có thể là những khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid. Khuẩn lạc vệ tinh có kích thƣớc nhỏ, đƣợc mọc lên xung quanh các khuẩn lạc có plasmid chứa đoạn gen xen vào sau khi khuẩn lạc này đã phân huỷ đáng kể lƣợng kháng sinh trong môi trƣờng xung quanh. Để nhân đƣợc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen CP cần phải tiến hành chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng cách PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) để loại bỏ các trƣờng hợp không mong muốn. 3.2.4. Kết quả chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng colony-PCR Tiến hành PCR trực tiếp từ một số khuẩn lạc trắng với cặp mồi pUC18- F1/pUC18-R1 để xác định khuẩn lạc có thể mang gen CP. Chỉ sử dụng cặp mồi này chứ không sử dụng cặp mồi đặc hiệu nằm trong gen vì trong phản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 ứng gắn gen vào vector, một lƣợng lớn gen không đƣợc gắn vào vector vẫn tồn tại trong hỗn hợp phản ứng, do đó khi cấy trải lên đĩa thạch các gen này nằm rải rác trên đĩa thạch và có thể nằm ngay dƣới hoặc xung quanh các khuẩn lạc. Do đó, phản ứng colony-PCR sẽ bị gây nhiễm và kết quả không chính xác Hình 3.4. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phổ Yên M: Marker DNA 1Kb 1-7: Dòng khuẩn lạc số 1-7 (+) : Đối chứng dƣơng - plasmid pTZ57R/T/CP-PVY (-1) : Đối chứng âm – dòng khuẩn lạc xanh (-2) : Đối chứng âm – Thành phần PCR không có khuẩn lạc Bảng 3.3. Trình tự mồi để thực hiện colony-PCR Tên mồi Trình tự pUC18-F1 5 ‟ - GAGGGTTTTCCCAGTCACGA – 3‟ pUC18-R1 5 ‟ - GCGGATAACAATTTCACACA – 3‟ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Hình 3.5. Kết quả colony-PCR một số dòng khuẩn lạc với mẫu Phú Bình M: Marker DNA 1Kb 8-9: Dòng khuẩn lạc số 8-9 Từ kết quả điện di cho thấy, sản phẩm colony PCR từ 9 dòng khuẩn lạc trắng có 7 dòng cho kết quả dƣơng tính đó là các dòng 1, 2, 4, 5, 6, 8, 9. 3.2.5. Kết quả tách plasmid từ các khuẩn lạc của 2 mẫu nghiên cứu A B Hình 3.6. Kết quả điện di tách plasmid mang gen CP (A: Mẫu Phổ Yên; B: Mẫu Phú Bình) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Chúng tôi chọn khuẩn lạc trắng của dòng 1 và dòng 2 với mẫu Phổ Yên; dòng 8 của mẫu Phú Bình để tách plasmid theo bộ kit của hãng Bioneer. Sản phẩm DNA plasmid đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.6. Kết quả điện di trên hình 3.6 cho thấy, sản phẩm tách plasmid sạch, đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng để tiến hành đọc trình tự nucleotide của gen CP. 3.3. KẾT QUẢ SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA PVY TỪ HAI MẪU NGHIÊN CỨU Trình tự nucleotide của gen CP đƣợc xác định trên máy đọc tự động ABI PRISM ® 3100 Avant Genetic Analyzer theo hai chiều xuôi và ngƣợc. Khi so sánh 2 trình tự này trong BLAST của NCBI, kết quả cho biết đây là các trình tự gen mã hoá CP của PVY ở khoai tây. Chiều dài gen CP ở 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình đều có kích thƣớc 1201 nucleotide, đoạn mã hóa dài 801 nucleotide, protein dài 267 acid amine. Chúng tôi kết luận đã nhân, tách dòng và đọc trình tự thành công đoạn gen mã hoá CP của PVY trên khoai tây. 3.3.1. So sánh trình tự nuclotide và acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 Pho Yen GGAAATGACA CAATCGATGC AGGAGGAAGC ACTAAGAAGG ATGCAAAACA Phu Binh GCAAATGACA CAATTGATGC AGGAGAAAGC AACAAGAAAG ATGCAAAACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 Pho Yen AGAGCAAGGT AGCATTCAAC CAAATCTCAA CAAGGAAAAG GAAAAGGACG Phu Binh AGAGCAAGGC AGCATCCAGT CAAACCTGAA CAAAGGAAAA GATAAGGATG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 Pho Yen TGAATGTTGG AACATCTGGA ACTCATACTG TGCCACGAAT TAAAGCTATC Phu Binh TGAATGCTGG TACATCTGGG ACACATACTG TGCCGAGAAT CAAGGCTATC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 Pho Yen ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAGAGTAAA GGTGCAACTG TACTAAATTT Phu Binh ACGTCCAAAA TGAGAATGCC CAAAAGCAAG GGAGCAACCG TGCTAAATTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 Pho Yen GGAACACTTA CTCGAGTATG CTCCACAGCA AATTGACATC TCAAATACTC Phu Binh AGAACACTTG CTTGAGTACG CTCCACAACA AATTGATATT TCAAATACTC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 260 270 280 290 300 Pho Yen GAGCAACTCA ATCACAGTTT GATACGTGGT ATGAAGCGGT ACAACCTGCA Phu Binh GGGCAACTCA ATCACAGTTT GATGCGTGGT ATGAGGCAGT GCGGATGGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 310 320 330 340 350 Pho Yen TACGACATAG GAGAAACTGA AATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT Phu Binh TACGACATAG GAGAAACTGA GATGCCAACT GTGATGAATG GGCTTATGGT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 360 370 380 390 400 Pho Yen TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA CATCAACGGA GTTTGGGTTA Phu Binh TTGGTGCATT GAAAATGGAA CCTCGCCAAA TGTCAACGGA GTTTGGGTTA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 410 420 430 440 450 Pho Yen TGATGGATGG AGATGAACAA GTCGAATACC CACTGAAACC AATCGTTGAG Phu Binh TGATGGATGA GAATGAACAA GTTGAGTACC CGTTGAAACC AATCGTTGAG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 460 470 480 490 500 Pho Yen AATGCAAAAC CAACACTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC Phu Binh AATGCAAAAC CAACCCTTAG GCAAATCATG GCACATTTCT CAGATGTTGC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 510 520 530 540 550 Pho Yen AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT Phu Binh AGAAGCGTAT ATAGAAATGC GCAACAAAAA GGAACCATAT ATGCCACGAT Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 560 570 580 590 600 Pho Yen ATGGTTTAGT TCGTAATCTG CGCGATGGAA GTTTGGCTCG CTATGCTTTT Phu Binh ATGGTTTAAT TCGAAATCTG CGGGATGTGG GTTTAGCGCG TTATGCCTTT ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 610 620 630 640 650 Pho Yen GACTTTTATG AGGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA Phu Binh GACTTTTATG AAGTCACATC ACGAACACCA GTGAGGGCTA GGGAAGCGCA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 660 670 680 690 700 Pho Yen CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG Phu Binh CATTCAAATG AAGGCCGCAG CATTGAAATC AGCCCAACCT CGACTTTTCG ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 710 720 730 740 750 Pho Yen GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC Phu Binh GGTTGGACGG TGGCATCAGT ACACAAGAGG AGAACACAGA GAGGCACACC ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 760 770 780 790 800 Pho Yen ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT Phu Binh ACCGAGGATG TCTCTCCAAG TATGCATACT CTACTTGGAG TCAAGAACAT . Pho Yen G Phu Binh G Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 10 20 30 40 50 Pho Yen GNDTIDAGGS TKKDAKQEQG SIQPNLNKEK EKDVNVGTSG THTVPRIKAI Phu Binh ANDTIDAGES NKKDAKPEQG SIQSNLNKGK DKDVNAGTSG THTVPRIKAI ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 60 70 80 90 100 Pho Yen TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DTWYEAVQPA Phu Binh TSKMRMPKSK GATVLNLEHL LEYAPQQIDI SNTRATQSQF DAWYEAVRMA ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 110 120 130 140 150 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Pho Yen YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNING VWVMMDGDEQ VEYPLKPIVE Phu Binh YDIGETEMPT VMNGLMVWCI ENGTSPNVNG VWVMMDENEQ VEYPLKPIVE ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 160 170 180 190 200 Pho Yen NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLVRNL RDGSLARYAF Phu Binh NAKPTLRQIM AHFSDVAEAY IEMRNKKEPY MPRYGLIRNL RDVGLARYAF ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| 210 220 230 240 250 Pho Yen DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT Phu Binh DFYEVTSRTP VRAREAHIQM KAAALKSAQP RLFGLDGGIS TQEENTERHT ....|....| ....|.. 260 Pho Yen TEDVSPSMHT LLGVKNM Phu Binh TEDVSPSMHT LLGVKNM Hình 3.8. So sánh trình tự acid amine của gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu Trình tự gen CP-PVY từ 2 mẫu nghiên cứu có sự sai khác ở 71 vị trí nuleotide. Do đó có thể thấy, mức độ tƣơng đồng giữa 2 trình tự này tƣơng đối thấp (91,1%). So sánh protein suy diễn từ 2 trình tự gen này cho thấy mức độ sai khác là 6,4%. Sự biến động về trình tự nucleotide giữa 2 gen không đồng đều, trong khi có những vùng biến động lớn (nhƣ vùng 2 đến 144) thì có những vùng không biến động một nuleotide nào (nhƣ vùng từ 613 đến 801). Sự sai khác về nucleotide dẫn đến sự sai khác về acid amin, tuy vậy có những vùng có sự sai khác về nuleotide không dẫn tới sự sai khác vế acid amin (nhƣ vùng nucleotide từ 108 đến 273). 3.3.2. So sánh trình tự nuclotide gen CP-PVY trên 2 mẫu nghiên cứu với các trình tự gen CP-PVY trên khoai tây đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen Để thấy đƣợc sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của PVY, chúng tôi tiến hành so sánh 2 trình tự gen PVY phân lập từ Phú Bình và Phổ Yên với một số trình tự gen PVY khác trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Bảng 3.4. 19 trình tự trong ngân hàng gen đƣợc đƣa ra so sánh Sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để so sánh các trình tự gen, lập bảng hệ số tƣơng đồng và biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với 19 trình tự trên. Mã số Chủng (biến thể) Nƣớc Mã số Chủng (biến thể) Nƣớc DQ925437 PVY NTN Hà Nội-Việt Nam U91747 PVY N USA M95491 PVY NTN Hungary X97895 PVY N Switzerland X79305 PVY NTN Austria Z70237 PVY N Polan X92078 PVY NTN Lebanon AF118153 PVY O India AJ890345 PVY NTN Germany AY792597 PVY O China EF016294 PVY NTN UK D12539 PVY O Japan AB205416 PVY N Japan U09509 PVY O Canada AF255660 PVY N Brazil X14136 PVY O Argentina AM268435 PVY N New Zealand X68222 PVY O USA Z70239 PVY O Poland Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Hình 3.9. Biểu đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của CP-PVY phân lập đƣợc từ Phổ Yên và Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen Kết quả phân tích cho thấy, trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên, Phú Bình có độ tƣơng đồng khá cao (từ 89,3% đến 99,6%) so với các trình tự CP-PVY của các chủng PVY đã công bố. Nhƣ vậy, có thể đƣa ra kết luận: đã phân lập đƣợc thành công gen CP của PVY chứ không phải của một loại virus nào khác. Trình tự CP-PVY của mẫu ở Phổ Yên có độ tƣơng đồng từ 89,9% đến 91,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; từ 96,4% đến 97,4% so với các trình tự thuộc chủng PVYN; từ 98,6% đến 99,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY phân lập từ Phổ Yên có độ tƣơng đồng với các trình tự CP của các chủng PVYNTN cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tƣơng đồng cao nhất (99,6%) với trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 tự có mã số EF016294. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phổ Yên-Thái Nguyên thuộc chủng PVYNTN. Trình tự CP-PVY phân lập từ Phú Bình có độ tƣơng đồng từ 94,6% đến 98,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYO; 90,8% đến 91,5% so với các trình tự thuộc chủng PVYNTN; 89,3% đến 89,6% so với các trình tự thuộc chủng PVYN. Nhƣ vậy, trình tự CP-PVY của mẫu ở Phú Bình có độ tƣơng đồng với các trình tự thuộc chủng PVYO cao hơn so với các trình tự thuộc chủng khác. Trong đó, nó có độ tƣơng đồng cao nhất (98/5%) với trình tự có mã số Z70239. Điều này chứng tỏ PVY phân lập tại Phú Bình-Thái Nguyên thuộc chủng PVYO. Kết quả này cũng phù hợp với phân tích biểu đồ hình cây biểu diễn quan hệ di truyền của gen CP-PVY phân lập từ Phổ Yên, Phú Bình với 19 trình tự trong ngân hàng gen. Biểu đồ này cho thấy 21 trình tự đƣợc chia thành 2 nhóm lớn. Nhóm I lại đƣợc chia thành 2 nhóm phụ. Nhóm phụ I1 gồm các trình tự thuộc chủng PVYNTN và Phổ Yên. Nhóm phụ I2 gồm các trình tự của chủng PVYO và Phú Bình. Theo nghiên cứu của Mohamad Chikh Ali và cs , vị trí acid amine thứ 29 của gen CP-PVY là Gly29 bảo thủ cho các chủng PVY O , PVY C , PVY N W. Trong khi Gln17 và Glu31 lại bảo thủ trong gen CP của PVY N /PVY NTN (Chikh Ali và cs, 2007) [24]. Trình tự acid amine của CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên và Phú Bình hoàn toàn phù hợp với nhận định của Chikh Ali. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Bảng 3.5. Hệ số giống và khác nhau về trình tự nucleotide vùng mã hoá của gen CP ở mẫu nghiên cứu so với các mẫu trên ngân hàng NCBI H ệ số k h ác n h au ( % ) Hệ số giống nhau (%) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1.1. Đã tiến hành khảo sát, thống kê tỉ lệ khoai tây có triệu chứng nhiễm PVY theo phƣơng pháp quan sát bằng mắt thƣờng. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy phƣơng pháp này có độ tin cậy thấp vì dễ nhầm lẫn với các bệnh khác hay những phản ứng của cây trƣớc điều kiện sinh thái khác nhau. 1.2. Đã nhân đƣợc gen CP bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu từ mẫu lá khoai tây ở Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên. Sản phẩm PCR đƣợc dòng hoá nhờ vector pBT. Đoạn mã hóa dài 801 nucleotide và protein gồm 267 acid amine. 1.3. Trình tự gen CP-PVY của 2 mẫu Phổ Yên-Thái Nguyên và Phú Bình-Thái Nguyên có sự sai khác là 8,9%. 1.4. So sánh trình tự đoạn mã hoá của gen CP-PVY ở 2 mẫu nghiên cứu với các mẫu đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế NCBI cho thấy hệ số sai khác dao động từ 0,04% đến 10,7%. 1.5. Đã xác định đƣợc PVY phân lập từ Phổ Yên thuộc chủng PVYNTN, còn PVY phân lập từ Phú Bình thuộc chủng PVYO. 2. ĐỀ NGHỊ Tiếp tục đánh giá sự đa dạng cấu trúc gen CP của PVY phân lập từ các khu vực khác để tạo nguồn nguyên liệu phục vụ cho thiết kế vector chuyển gen kháng PVY ở khoai tây. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Vũ Thị Bƣởi (2009), “Xác định trình tự gen mã hoá protein vỏ của virus Y trên khoai tây và đánh giá sự đa dạng di truyền của virus này”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 56(8), Nxb Đại học Thái Nguyên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ và kĩ thuật thâm canh, NXB Lao động Xã hội, tr 12- 13. [2] Nguyễn Mạnh Chinh (2005), Khoai tây (Solanum tuberosum), [3] Đƣờng Hồng Dật (2005), Cây khoai tây và kĩ thuật thâm canh tăng năng suất, NXB Lao động Xã hội. [4] Trƣơng Văn Hộ, Trịnh Quốc Mỵ, Nguyễn Văn Đĩnh, P. Vander Zaag (1990), “Điều tra về bảo quản khoai tây giống ở đồng bằng Bắc Bộ”, Một số kết quả nghiên cứu khoai tây (1986- 1990), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 77- 82. [5] [7] Vũ Triệu Mân (1986), Bệnh virus khoai tây, Nxb Khoa học và Kĩ thuật. [8] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, NXB Nông nghiệp I, Hà Nội. [9] Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương, NXB Nông nghiệp I, Hà Nội. [10] Nguyễn Thị Kim Thanh, Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch (1994), “Một số kết quả về việc tạo củ giống khoai tây trong ống nghiệm in vitro”, Kết quả nghiên cứu khoa học trồng trọt 1992- 1993, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. [11] Trần Thanh Thu, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1988), “Tạo củ bi khoai tây sạch virus bằng kĩ thuật nuôi cấy mô in vitro” , Tạp chí Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp. [12] Hƣơng Tú ( 2008), Vị thuốc từ củ khoai tây, http:// www.ykhoanet.com. [13] Vũ Hƣớng Văn (2007), Khoai tây đâu chỉ là thực phẩm, http:// www.suckhoe360.com. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 [14] Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009), “Phân lập và so sánh trình tự gen mã hoá cho protein vở (CP) của PVY ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông hồng, Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 1(31), tr 85-91. [14] Trƣơng Quang Vinh (2007), Phân tích đa hình ADN và ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật vào việc nhân giống khoai tây củ bi sạch bệnh, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm-Đại học Thái Nguyên. Tài liệu nƣớc ngoài [15] Abdelmaksoud H.M., Gamal Eldin A.S. (2002), The complete nucleotide sequence of the Potato virus Y strain N-Egypt, unpublished (GenBank Accession number: AF522296). [16] Berckx R. (1967), “Methodische untersuchungen uber den serologischen nachweis pflanzenpathogener viren mit dem bentonitflockungstest, den latex- text und dem bariumsulfat test”, Phytopathologische Zeitschrift, 58, 1–17. [17] Bhat A.I., Varma A., Pappu H.R., Rajamannar M., Jain R.K., Praveen S. (2004), Accession AF118153, Potato virus Y polyprotein gene, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [18] Bill B., Dean (1992), “Managing the potato production system”, Food product press, An impuin of Haworth pess, New York, London, Nozwood (Australia), pp. 31-32. [19] Boonham N., Barker I. (1998), “Strain-specific recombinant antibodies to potato virus Y potyvirus”, J. Virol. Methods, 74 (2), 193–199. [20] Boonham N., Walsh K., Preston S., North J., Smith P., Barker I. (2002), “The detection of tuber necrotic isolates of Potato virus Y, and the accurate discrimination of PVY(O) PVY N and PVY C strains using RT-PCR”, J. Virol. Methods, 102 (1–2), 103–112. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 [21] Bravo-Almonacid F., Mentaberry,A.N. (2006), Accession X14136, Potato virus Y (PVY) mRNA for viral coat protein. ncbi.nlm.nih.gov. [22] Chachulska A.M., Chrzanowska M., Robaglia C., Zagorski W. (1996), Accession Z70237, Potato virus Y mRNA for coat protein. ncbi.nlm.nih.gov. [23] Chachulska,A.M., Chrzanowska,M., Robaglia,C., Zagorski,W. (1996), Accession Z70239, Potato virus Y mRNA for coat protein. ncbi.nlm.nih.gov. [24] Chikh Ali M. et al., (2001), Virus gense, 35 : 359-367. [25] Chrzanowska M. (1991), “New isolates of the necrotic strain of potato virus Y (PVY N ) found recently in Poland”, Potato Res, 34, 179–182. [26] Clark M.F., Adams A.N. (1977), “Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunoassay for the detection of plant viruses”, J. Gen. Virol, 34, 475–783. [27] Dhar A.K., Singh R.P., Boucher A. (2002), Accession U91747, Potato virus Y polyprotein gene, partial cds, coat protein region. ncbi.nlm.nih.gov. [28] Dimitre S. Mollov, Christian A. Thill* (2004), “Evidence of Potato Virus Y Asymptomatic Clones in Diploid and Tetraploid Potato-breeding Populations”, Potato Res (2004), 81:317-326 317. [29] Ellis P., Stace-Smith R., Bowler G., Mackenzie D.J. (1996), “Production of monoclonal antibodies for detection and identification of strains of potato virus Y”, Plant Pathol, 18, 64–70. [30] FAO (2005), FAO statistic database. [31] Glais L., Kerlan C., Robaglia C. (2001), “Variability and evolution of potato virus Y, the type species of the Potyvirus genus”, Plant Viruses as Molecular Pathogens, Food Products Press, The Haworth Press Inc., New York. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 [32] Gow L.J., Boonham N., Barker I., Foster G.D. (2006), Accession EF016294, Potato virus Y strain NTN isolate v942490, complete genome. ncbi.nlm.nih.gov. [33] Gugerli P., Fries P. (1983), “Characterization of monoclonal antibodies to potato virus Y and their use for virus detection”, J. Gen. Virol, 64, 2471–2477. [34] Ha C., Revill P., Harding R.M., Vu M., Dale J.L. (2008), Accession DQ925437, Potato virus Y isolate PVY-VN/P2 polyprotein gene, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [35] Health R., Sward R.J., Moran J.R., Mason A.J., Hallam N.D. (1987), “Biological characterization of six Australian isolates of potato virus Y and their serological detection by ELISA”, Aust. J. Agric. Res, 38, 395–402. [36] Hidaka M., Yoshida Y., Masaki H., Namba S., Yamashita S., Tsuchizaki T., Uozumi T. (2008), Accession D12539, Potato virus Y gene for polyprotein, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [37] Inoue-Nagata A.K., Fonseca M.E.N., Lobo T.O.T.A., de Avila A.C., Monte D.C. (2001), Accession AF255660, Potato virus Y isolate PVY-NBR polyprotein gene, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov. [38] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P. (1997), “Infectious in vivo and in vitro transcripts from a full-length cDNA clone of PVY-N605: a Swiss necrotic isolate of potato virus Y”, J. Gen. Virol, 78 (12), 31. [39] Jakab G., Droz E., Brigneti G., Baulcombe D., Malnoe P. (2005), Accession X97895, Potato virus Y genes encoding viral polyprotein. ncbi.nlm.nih.gov. [40] Kerlan C (2008), Potato Viruses, @ 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved. [41] Kerlan C, Moury B (2008), Potato virus Y, @ 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 [42] Kerlan C., Tribodet M., Glais L., Guillet M. (1999), “Variability of potato virus Y in potato crops in France”, J. Phytopathol, 147, 643– 651. [43] Le Romancer M., Kerlan C., Nedellec M. (1994), “Biological characterization of various geographical isolates of potato virus Y inducing superficial necrosis on potato tubers”, Plant Pathol, 43, 138–144. [44] Maat D.Z., Huttinga H. (1987), “Serology”, Viruses of Potatoes and Seed-Potato Production, Pudoc, Wageningen, NL. [45] Macdec P. (1963), “Tuber forming substances in the potato”, The Growth of the potato, pp. 121- 130. [46] Marie-Jeanne Tordo V., Chachulska A.M., Fakhfakh H., Le Romancer M., Robaglia C., Astier-Manifacier S. (1995), “Sequence polymorphism in the 5 NTR and in the P1 coding region of potato virus Y genomic RNA”, J. Gen. Virol, 76, 939–949. [47] Matousek J., Ptacek J., Dedic P., Schubert J. (2000), “Analysis of variability of P1 gene region of N strain of potato virus Y using temperaturegradient gel electrophoresis and DNA heteroduplex analysis”, Acta Virol, 44 (1), 41–46. [48] Mc Donald J.G., Singh R.P. (1996), “Host range, symptomatology, and serology of isolates of Potato virus Y (PVY) that share properties with both the PVY N and PVY O strain groups”, Am. Potato J, 73, 309–315. [49] Moravec T., Cerovska N., Boonham N. (2003), “The detection of recombinant, tuber necrosing isolates of Potato virus Y (PVY NTN ) using a three-primer PCR-based in the coat protein gene”, J. Virol. Methods, 109 (1), 63–68. [50] Nie X., Singh R.P. (2002), “A new approach for the simultaneous differentiation of biological and geographical strains of Potato virus Y by uniplex and multiplex RT-PCR”, J. Virol. Methods, 104 (1), 41–54. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 [51] Nie X., Singh R.P. (2003), “Specific differentiation of recombinant PVY (N:O) and PVY (NTN) isolates by multiplex RT-PCR”, J. Virol. Methods, 113 (2),69–77. [52] Ohshima K., Sako K., Hiraishi C., Nakagawa A., Matsuo K., Ogawa T., Shikata E., Sako N. (2008), Accession AB025416, Potato virus Y gene for coat protein, partial cds, isolte: TND6. ncbi.nlm.nih.gov. [53] Oshima K., Inoue A.K., Ishikawa Y., Shikata E., Takashi H. (1990), “Production and application of monoclonal antibodies specific to ordinary strain and necrotic strain of potato virus Y”, Ann. Phytopathol. Soc. Jpn, 56, 508–514. [54] Ounouna H., Kerlan C., Lafaye P., Loukili M.J., ElGaaied A. (2002), “Production of monoclonal antibodies against synthetic peptides of the N- terminal region of Potato virus Y coat protein and their use in PVY strain differentiation”, Plant Pathol, 51, 487–494. [55] Revers F., Le Gall O., Candresse T., Le Romancer M., Dunez J. (1995), Accession X92078, Potato virus Y mRNA for coat protein. ncbi.nlm.nih.gov [56] Robaglia C., Durand-Tardif M., Tronchet M., Boudazin G., AstierManifacier S., Casse-Delbart F. (1989), “Nucleotide sequence of potato virus Y (N strain) genomic RNA”, J. Gen. Virol, 70, 935–947. [57] Rosner A., Maslenin L. (1999), “Differentiating PVYNTN by unique single-restriction cleavage of PCR products”, Potato Res, 42, 215–221. [58] Rosner A., Maslenin L. (2001), “Differentiating PVY(NTN) from PVY(N) by annealing to reference RNA transcripts”, J. Virol. Methods, 97 (1–2), 125–131. [59] Rosner A., Maslenin L. (2003), “Tagging of viral RNA transcripts with strain-specific oligonucleotides: characterization and application”, J. Virol. Methods, 110 (1), 105–109. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 [60] Sanz A., Cambra M., Perez de San Roman C., Miguet J.G., Cort´es E., Gorris M.T., Vela C. (1990), “Preparation of additional monoclonal antibodies for detection and discrimination of potato virus Y isolates infecting potato”, Potato Res, 33, 365–375. [61] Schubert J., Fomitcheva V., Sztangret-Wisniewska J. (2007), Accession AJ890345, Potato virus Y strain NTN gene for polyprotein, genomic RNA, isolate Linda. ncbi.nlm.nih.gov. [62] Singh R.P., Boucher A., Somerville T.H., Dhar A.K. (1993), “Selection of monoclonal antibody to detect PVY N and its use in ELISA and DIBA assays”, Can. J. Plant Pathol, 15, 293-300. [63] Singh M., Singh R.P. (1997), Accession U09509, Potato virus Y common strain, complete genome. ncbi.nlm.nih.gov. [64] Sudarsono, Woloshuk S.L., Xiong Z., Hellmann G.M., Wernsman E.A., Weissinger A.K., Lommel S.A. (1993), Accession X68222, Potato Virus Y (Potato US) genomic RNA of Capsid protein cistron. ncbi.nlm.nih.gov. [65] Talley J., Warren F.H.J.B., Torrance L., Jones R.A.C. (1980), “A simple kit for detection of plant viruses by the latex serological test”, Plant Pathol., 29, 77–79. [66] Tetsuji Ogawa a , Yasuhiro Tomitaka b , Akio Nakagawa a,1 , Kazusato Ohshima b,∗ (2008), “Genetic structure of a population of Potato virus Y inducing potato tuber necrotic ringspot disease in Japan; comparison with North American and European populations”, Virus Research, 131 (2008) 199–212. [67] Thole V., Dalmay T., Burgyan J., Balazs E. (1993), Accession M95491, Potato virus Y polyprotein gene, complete cds. ncbi.nlm.nih.gov. [68] Van den Heuvel J.F.J.M., van der Vlugt R.A.A., Verbeek M., De Haan P.T., Huttinga H. (1995), Accession X79305, Potato Virus Y genomic sequence for coat protein. ncbi.nlm.nih.gov. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 [69] Vetten H.J., Ehlers U., Paul H.L. (1983), “Detection of potato viruses Y and A in tubers by enzyme-linked immunosorbent assay after artificial break of dormancy”, Phytopathologische Zeitschrift, 108, 41–53. [70] Walkey D.G.A., Webb M.J.W. (1984), “The use of a simple electron microscope serology procedure to observe relationships of seven potyviruses”, Phytopathologische Zeitschrift, 110, 319–327. [71] Walsh K., North J., Barker I., Boonham N. (2001), “Detection of different strains of Potato virus Y and their mixed infections using competitive fluorescent RT-PCR”, J. Virol. Methods, 91 (2), 167–173. [72] Wang X., Zhu C., Wen F. (2004), Accession AY792597, Potato virus Y coat protein gene, partial cds. ncbi.nlm.nih.gov.