Luận văn Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (cymbidium) bằng phương pháp PCR

nhƣ khoai tây, cà chua, cải thìa (Chinese cabbages) có thể bị ảnh hƣởng bởi bệnh này. Loài Erwinia carotovora là Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Erwinia carotovora. a. Vi khuẩn có dạng hình gậy. b. Lông roi bao quanh thân. a b 21 một đơn vị phân loại phức tạp mà những dòng này thì đa dạng ở những mức độ khác nhau (sinh lý, huyết thanh học, đặc tính di truyền và dãy kí chủ). Erwinia carotovora đƣợc chia thành 5 nhóm phụ (subspecies) gồm: E. c. atroseptica (Eca), E. c. carotovora (Ecc), E. c. betavasculorum (Ecb), E. c. wasabiae (Ecw), E. c. odorifera (Eco) (Seo và ctv, 2001). 2.3.3. Erwinia carotovora subsp. carotovora Phân bố địa lý: Erwinia carotovora subsp. carotovora là một loại vi khuẩn phân bố rộng khắp mà nó là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên các loại cây cảnh (ornamental) và cây nông nghiệp (horticultural) khác nhau. Erwinia carotovora subsp. carotovora phân bố rộng khắp cả vùng nhiệt đới và ôn đới, có phổ kí chủ rộng hơn những nhóm phụ khác (Fiori và Schiaffino, 2003). Đặc điểm: hình thái tế bào vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử: vi khuẩn có dạng hình gậy, đơn lẻ hoặc thành từng cặp, có khả năng di động do có lông roi bao quanh và có kích thƣớc trung bình từ 0,6 – 0,7 2 – 2,5 μm. Bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa đã xác định đƣợc Erwinia carotovora subsp. carotovora: vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi (facultative anaerobe), catalase (+), oxidase (-), Indole (-), hóa lỏng pectate (liquefied pectate) trên môi trƣờng CVP, khử nitrate thành nitrite, không phát sáng trên môi trƣờng KB, phân giải esculine và gelatine nhƣng không phân giải tinh bột, tạo acetoin và H2S nhƣng không tạo urease, tạo phản ứng quỳ sữa (acidized litmus milk), không có khả năng thủy giải arginine hoặc khử sucrose, kháng erythromycin, lên men glucose, chịu đựng đƣợc 5% NaCl và có thể phát triển đƣợc ở 370C, tạo acid từ arabinose, cellobiose, galactose, lactose, mannose, melibiose, ramnose, salicin, threalose, xylose, inositol, manitol và sorbitol. Đối với maltose, - methyl glucoside và adonitol vi khuẩn không tạo acid, có khả năng sử dụng asparagine, acetate, citrate, fumarate, lactate và malate. Đối với alanine, arginine, threonine, valine, glycolate, gluconate, levulinate, nicotinate, adipate, caprate, citraconate, formate, glutarate, malonate và tartrate thì không (Fiori và Schiaffino, 2003). Đƣờng lây nhiễm: Erwinia xâm nhập vào cây thông qua con đƣờng tự nhiên nhƣ khí khổng (stomata) và lỗ vỏ, thân, rễ (lenticles) hoặc thông qua vết thƣơng gây ra bởi côn trùng, động vật ăn cỏ (herbivorus), gió…(Marcos Montesano, 2002). 22 Khả năng gây bệnh: Erwinia carotovora subsp. carotovora là tác nhân gây bệnh cơ hội mà tính độc của nó phụ thuộc vào sự tƣơng tác giữa nó với ký chủ và môi trƣờng. Trong những điều kiện thuận lợi, tác nhân gây bệnh cây biểu hiện những nhân tố độc nhƣ các enzyme ngoại bào (extracellular enzymes). Sự sản xuất các enzyme phân hủy thành tế bào bao gồm: protease, pectinolytic enzymes là enzyme ngoại bào chính liên quan đến sự phát triển của bệnh. Pectinases bao gồm pectate lyase (Pel), pectin lyases (Pnl), polygalacturonases (Peh) và pectin methylesterases (Pme), phá vỡ và sử dụng pectins, gây hƣ hại tế bào và làm mô suy yếu. Theo Darrasse và ctv (1994), một vài pel gen mã hóa pectate lyase đã biết trình tự. Có 3 họ đã đƣợc xác định và giữa chúng có tính tƣơng đồng cao: họ BC (BC family) chứa gen pel chung cho cả Erwinia carotovora và Erwinia chrysanthemi, họ ADE (ADE family) bao gồm những gen chỉ hiện diện trong Erwinia chrysanthemi, nhóm thứ ba tƣơng ứng với gen đƣợc tìm thấy trên một vài dòng Erwinia carotovora và trên vi khuẩn Yersinia pseudotuberculosis (Y family). Cellulases hoạt động trên thành tế bào cây bằng sự thủy phân trong (endohydrolysis) của liên kết 1,4-β-D- glucosidic trong cellulose, lichenin, β-D-glucan trong ngũ cốc. pH tối ƣu gần bằng 7, cellulases phối hợp với các enzyme ngoại bào khác tấn công thành tế bào sơ cấp và thứ cấp của cây trồng. Tuy nhiên, ngoài các enzyme phân hủy thành tế bào, các nhân tố khác cũng ảnh hƣởng ở giai đoạn sớm, thành lập và xúc tiến sự lây nhiễm, đáp ứng tốt với cơ chế kháng của ký chủ. Các nhân tố này bao gồm tính di động (motility), LPS (lipopolysaccharides), kị sắt (siderophores), gen hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity), NLPs (Nep-1 like protein) (Nep: necrosis and ethylene inducing peptide) và những nhân tố chống lại sự phá hủy của oxy (oxygen damage) hoặc những peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides) (Heidi Hyytiainen, 2005). Triệu chứng: triệu chứng phổ biến rất đặc trƣng cho các loài vi khuẩn Erwinia carotovora là hiện tƣợng thối nhũn củ khoai tây, cà rốt, bắp cải, hành tây,…Hiện tƣợng thối hỏng là hậu quả của quá trình phá vỡ cấu trúc mô tế bào của cây do tác động chủ yếu của các enzyme phân giải của vi khuẩn. Toàn bộ thịt củ, quả bị thối biến thành một khối nhão, có mùi (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). 23 Mức độ gây hại của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora: bệnh thối mềm là một bệnh rất nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này có khả năng kí sinh, chọn lọc phạm vi kí chủ rất rộng bao gồm nhiều loại cây trong nhiều họ thực vật khác nhau. Hiện nay chƣa có cách phòng trị hiệu quả, thiệt hại do vi khuẩn này gây ra là rất lớn. Năm 1995, tại Argentina, trái và cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill. hybrid Tommy) từ các nhà kính thƣơng mại (commercial greenhouses) gần La Plata và gần Chacabuco xuất hiện những triệu chứng bệnh gây ra bởi Erwinia carotovora subsp. carotovora. Tỉ lệ bệnh 2% là phổ biến và gần 10% cây ở vùng ẩm ƣớt trong nhà kính thì bị nhiễm bệnh. Năm 1994, tại Thổ Nhĩ Kỳ, bệnh thối thân cây cà chua gây ra bởi Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi đƣợc phát hiện lần đầu tiên trong nhà kính ở vùng phía đông Địa Trung Hải (eastern Mediterrean region). Từ năm 1999, bệnh bùng phát nghiêm trọng trong nhiều nhà kính trồng cà chua ở vùng Địa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ. Năm 2003, phạm vi tác động của bệnh hơn 25% ở vùng Địa Trung Hải và Aegean của Thổ Nhĩ Kỳ (Aysan và ctv). Vụ đông và đông xuân năm 2002, xuất hiện bệnh trong một vài nhà kính thƣơng mại (several commercial plastic- covered greenhouses) ở Mersin và Antakya, vùng phía đông Địa Trung Hải của Thổ Nhĩ Kỳ. Phạm vi tác động của bệnh này khoảng 20 – 25% và 80 – 90% nhà kính ở Mersin và Antakya. Sau khi quan sát các triệu chứng, phân lập, mô tả về mặt hình thái học, sinh lý, sinh hóa, kiểm tra tính gây bệnh và phân tích FAME (fatty acid methyl ester) ngƣời ta đã xác định đƣợc nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn Pseudomonas viridiflava, Erwinia carotovora subsp. carotovora và Erwinia chrysanthemi (Aysan và ctv). Tại Canada, thiệt hại do vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây ra là 12% và 20% vào năm 1996 và 1997 tại các nhà kính trồng tiêu (Capsicum annuum) tại St. David ' s, Ontario. Bệnh cũng đƣợc quan sát trên cánh đồng trồng tiêu gần Harrow năm 1996 – 1997. Đây là báo cáo đầu tiên về vi khuẩn gây thối thân (bacterial stem canker) tại các nhà kính trồng tiêu ở Canada (Cerkauskas và Brown, 2001). 24 Ở New Zealand, một loại vi khuẩn đƣợc phân lập từ những củ cala (Zantedeschia spp. ) bị nhiễm bệnh đƣợc xác định là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Báo cáo này cho thấy Erwinia carotovora subsp. carotovora là nguyên nhân gây ra bệnh thối mềm trên cây hoa kiểng quan trọng ở New Zealand (Wright, 1998). Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora Trên thế giới: trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau.Với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử ra đời nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA),… đã tạo nên một sự chuyển biến mới trong công tác bảo vệ thực vật. Một nhóm các nhà nghiên cứu Thái Lan sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện và phân loại vi khuẩn gây bệnh thối mềm Erwinia trên thực vật ở Thái Lan. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 để khuếch đại đoạn 434 bp trong khung đọc mở (open reading frame) của pectate lyase (Pel) gen của Erwinia carotovora, cặp primer ADE1và ADE2 để khuếch đại đoạn 420 bp trong khung đọc mở của pectate lyase gen của Erwinia chrysanthemi. Kết quả chỉ có cặp primer Y1 và Y2 khuếch đại đƣợc đoạn gen mong muốn của tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc (Phokum và ctv). Darrasse và ctv, (1994) sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP trên gen pel (mã hóa pectate lyases) để xác định mối quan hệ giữa Erwinia carotovora với bệnh trên cây khoai tây. Bằng cách sử dụng cặp primer Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một đoạn 434 bp của những dòng Erwinia carotovora. Trong 89 dòng Erwinia carotovora đƣợc kiểm tra, chỉ những dòng Erwinia carotovora subsp. betavasculorum là không phát hiện thấy. RFLP đƣợc thực hiện trên đoạn đƣợc khuếch đại với 7 enzyme endonuclease: TaqI, HaeIII, HhaI, AluI, HaeII, Sau3AI, HpaII thì thấy có sự đa hình giữa các dòng. Seo và ctv, (2001) đã sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP nghiên cứu về kiểu hình và đa dạng di truyền trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora ssp. carotovora (Ecc) phân lập từ các cây kí chủ khác nhau ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Thái Lan. Thí nghiệm tiến 25 hành phân tích PCR – RFLP của gen 16S ribosomol DNA (rDNA) với cặp primer fD1 và rP2, 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs) với cặp primer R16 - 1, R23 – 2R, gen pel mã hóa pectate lyase với cặp primer Y1và Y2. Bằng phân tích RFLP trên sản phẩm khuếch đại với các enzyme cắt giới hạn HinfI, MboI, Sau3AI, kết quả cho thấy sự đa hình giữa các dòng nghiên cứu. Năm 2003, nhóm các nhà nghiên cứu này cũng đã sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP và RAPD để nghiên cứu về mặt kiểu hình và đặc tính di truyền của vi khuẩn Erwinia carotovora trên cây dâu tằm (mulberry) (Morus spp.). Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 9 dòng vi khuẩn đƣợc phân lập từ cây dâu tằm. Bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa, những dòng vi khuẩn này đƣợc chia thành 2 loại: type 1 và type 2. Hai dòng thuộc type 1 giống với Ecc trong khi 7 dòng thuộc type 2 thì khác biệt với Ecc. Bằng nghiên cứu qua nhiều giai đoạn bao gồm thử nghiệm huyết thanh học (serological assay), PCR chuyên biệt cho Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), PCR – RFLP với pectate lyase (Pel) gen và PCR – RAPD cho thấy những dòng vi khuẩn thuộc type 2 thuộc về những nhóm phụ Erwinia carotovora khác hơn là Ecc và Eca. Fiori và Schiaffino, (2003) cũng sử dụng phƣơng pháp PCR – RFLP để nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh thối mềm thân cây hồ tiêu (Capsicum annuum L.): Erwinia carotovora subsp. carotovora tại các nhà kính ở Sardinia, Italia. Phản ứng PCR với cặp mồi Y1 và Y2 cho phép khuếch đại một trình tự có kích thƣớc 434bp. Phân tích RFLP trên sản phẩm PCR đƣợc tiến hành với 4 enzyme endonuclase giới hạn AluI, HaeII, HpaII, Sau3AI thì thấy có sự đa hình giữa các dòng. Tại Việt Nam: hiện tại, theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây bệnh trên địa lan (Cymbidium). 2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra Hàng loạt các kỹ thuật truyền thống và hiện đại đƣợc sử dụng để phát hiện sự tồn tại của vi khuẩn gây bệnh trong hạt giống, tàn dƣ cây trồng, trong đất, nƣớc và các vector truyền khác. Phần lớn vi khuẩn gây bệnh cây trồng đƣợc truyền thông qua hạt giống hoặc các vật liệu nhân giống bị nhiễm bệnh. Do đó, phát hiện tác nhân gây ra bệnh trên cây 26 trồng có tầm quan trọng sống còn để đảm bảo một nền nông nghiệp an toàn và bền vững (Yeshitila và ctv, 2006). Chẩn đoán theo triệu chứng: một loài vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn hại cây có thể gây ra những loại triệu chứng bệnh đặc trƣng. Tuy nhiên, dựa vào triệu chứng bệnh chỉ có thể xác định chẩn đoán đúng trong rất ít trƣờng hợp.Trên một loài cây, nhiều loài vi khuẩn khác nhau và nhiều loại vi sinh vật khác nhau có thể tạo ra các triệu chứng bệnh tƣơng tự giống nhau rất khó phân biệt nhƣ các loại bệnh héo rũ, bệnh thối hỏng…(Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp vi sinh: để xác định bệnh do vi khuẩn gây ra, cần thiết phải khẳng định sự có mặt của vi khuẩn trong mô bệnh, phân lập từ mô bệnh để nuôi cấy vi khuẩn thuần khiết, sau đó lây bệnh nhân tạo để xác định tính gây bệnh của chúng trên cây kí chủ theo quy tắc Koch. Tiếp tục nghiên cứu xác định rõ đặc tính hình thái, sinh trƣởng (khuẩn lạc) và phản ứng sinh hóa để có cơ sở phân loại, giám định loại (giống) và loài vi khuẩn cần chẩn đoán (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh hóa: một số chỉ tiêu cần thiết để giám định loài vi khuẩn cần chẩn đoán phải đƣợc khảo sát nghiên cứu bằng phƣơng pháp thử các phản ứng sinh hóa riêng biệt. Các loại (giống) vi khuẩn khác nhau phân biệt về nhu cầu, khả năng sử dụng các chất dinh dƣỡng và về kiểu trao đổi chất (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp huyết thanh: là một phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bệnh vi khuẩn đƣợc ứng dụng trong bệnh cây nhất là trong việc kiểm tra, chọn lọc giống, vật liệu làm giống sạch bệnh và trong kiểm dịch thực vật. Phƣơng pháp huyết thanh chẩn đoán vi khuẩn dựa trên cơ sở phản ứng có tính đặc hiệu cao giữa kháng nguyên và kháng thể tƣơng ứng. Tế bào vi khuẩn là những kháng nguyên, là một khảm kháng nguyên trong đó kháng nguyên O (ở tế bào) và kháng nguyên H (lông roi) có ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng phƣơng pháp huyết thanh để chẩn đoán, xác định loài vi khuẩn gây bệnh một cách nhanh chóng và khá chính xác. Ngƣời ta đƣa kháng nguyên vi khuẩn vào trong cơ thể động vật rồi lấy kháng huyết thanh để thực hiện việc chẩn đoán. 27 Để tăng độ nhạy phản ứng của kháng huyết thanh nhất là trong trƣờng hợp số lƣợng tế bào vi khuẩn trong mô bệnh quá thấp, cần áp dụng các phƣơng pháp thử phản ứng theo phƣơng pháp miễn dịch khuếch tán trên gel hoặc phƣơng pháp miễn dịch liên kết men (ELISA) (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Chẩn đoán bằng phƣơng pháp sinh học phân tử: Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống là nuôi cấy trên một vài môi trƣờng chọn lọc. Phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian và không đủ nhạy (sensitive) (So Young Yoo và ctv, 2002). Do đó, yêu cầu có một kỹ thuật chẩn đoán, phát hiện bệnh một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả. Các phƣơng pháp sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn gây bệnh cây trồng nhƣ DNA probe, PCR, RFLP, RAPD,…Phƣơng pháp PCR là một trong những công cụ hữu hiệu trong việc xác định tác nhân gây bệnh cây trồng. Theo Kang và ctv ( 2003), kỹ thuật PCR cho phép phát hiện nhanh, nhạy, dễ dàng khi so sánh với lai probe (probe hybridization) và nó khuếch đại đặc hiệu một trình tự gen mục tiêu chỉ hiện diện trong genome của một loại vi khuẩn. Kỹ thuật PCR có thể đƣợc sử dụng để phát hiện tác nhân gây bệnh hiện diện với mật độ thấp trên mô cây bị nhiễm bệnh. Trên vi khuẩn ngƣời ta thƣờng nghiên cứu vùng 16S ribosomal DNA (rDNA), 16S – 23S rDNA intergenic spacer regions (ISRs). Theo Subandiyah và ctv (2000), 16S rDNA là một công cụ hữu dụng để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài và sự tiến hóa giữa vi khuẩn và các sinh vật prokaryote khác, trình tự 16S rRNA và vùng hoạt động (intergenic region) giữa 16S rRNA và 23S rRNA đƣợc xem nhƣ có thể biến đổi giữa các dòng trong một loài. Theo Christopher và David (1999), khi xem xét mối quan hệ thân cận trong loài, 23S rDNA thƣờng cho phép phân tích tốt hơn 16S rDNA bởi vì nó lớn hơn (khoảng 2,5 kb trong khi 16S rDNA khoảng 1,5 kb) và nó chứa trình tự biến đổi ở mức độ cao hơn. Ngoài ra, nhiều gen mục tiêu khác cũng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu xác định mối quan hệ phát sinh loài và phân loại tác nhân lây nhiễm nhƣ gen mã hóa protein heat- shock 65 (hsp65) trên loài Mycobacterial, trình tự 23S rDNA và gen mã hóa protein bề mặt A (ospA) và gen flagellin (fla) trên loài Borrelia. So Young Yoo và ctv, (2002) đã đề 28 xuất một hƣớng mới trong nghiên cứu xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA. Vùng ITS (Internal transcribed spacer) là một đoạn (stretch) DNA nằm giữa tiểu đơn vị ribosom nhỏ (16S) và tiểu đơn vị ribosom lớn (23S). Việc thiết kế probe dựa trên trình tự vùng ITS và 23S rDNA mà nó thích hợp với kỹ thuật microarray để chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra. Kết quả là đã tạo ra chip DNA chứa những probe đặc hiệu cho việc phát hiện nhiều loại vi khuẩn và nấm gây bệnh với tên thƣơng mại là Pathochip. 29 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm 3.1.1. Thời gian - địa điểm nghiên cứu Thời gian: đề tài đƣợc tiến hành từ 15/02/2006 đến 30/07/2006. Địa điểm nghiên cứu: - Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 3.1.2. Vật liệu Chủng vi sinh vật: các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora gây hại trên địa lan. Môi trƣờng Môi trƣờng PGA Môi trƣờng LB Khoai tây 200 g Bacto - tryptone 10 g Glucose 20 g Bacto – yeast extract 5 g Agar 20 g NaCl 10 g H2O 1.000 ml H2O 1.000 ml Môi trƣờng KB Môi trƣờng YDC Proteose peptone 20 g Yeast extract 10 g K2HPO4 1,5g Dextrose (Glucose) 20 g MgSO4.7H2O 1,5 g Calcium carbonate 20 g Glycerol 15 ml Agar 15 g Agar 15 g H2O 1.000 ml H2O 1.000ml 30 Các thiết bị, dụng cụ thƣờng sử dụng Các thiết bị Dụng cụ Máy Vortex Ống nghiệm Lò Viba Micropipette các loại Máy điện di (Bio-Rad) Đầu típ các loại Máy chụp gel (Gel Doc 2000) Eppendoft 0,2 ml, 1,5 ml Máy ly tâm (Sigma) Máy PCR (Thermus cycle) (Eppendoft) Các hóa chất sử dụng Hóa chất để ly trích DNA Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR TE 1X 10X buffer PCR (Bio-Rad) SDS 10% MgCl2 50 mM (Bio-Rad) NaCl dNTP's mix 25 mM (Bio-Rad) CTAB/NaCl Primer Xan1330, Xan322 và Erw1, Erw2 Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) Taq DNA polymerase Isopropanol Ethanol 70% Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết cây địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên địa lan tại một số hộ trồng địa lan trên địa bàn TP. Đà Lạt từ đó xác định đƣợc tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra. Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi, trò chuyện với từng hộ sản xuất. 3.2.2. Phân lập mẫu vi khuẩn Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vƣờn địa lan bị bệnh tại thành phố Đà Lạt. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trƣờng PGA. Cách phân lập mẫu: mẫu bệnh đƣợc phân lập từ vết bệnh điển hình. Cắt lấy mảnh nhỏ có kích thƣớc 3 – 5 mm 3 – 5 mm tại vị trí giữa mô bệnh và mô khỏe. Rửa mẫu bằng nƣớc cất 2 – 3 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó 31 rửa lại bằng nƣớc cất 2 – 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Chú ý không nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên môi trƣờng PGA, để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc cấy chuyền sang đĩa khác để tạo dòng thuần. Cách đặt tên mẫu: EC06 – 1 là mẫu vi khuẩn đƣợc phân lập từ các mẫu bệnh trên cây địa lan tại Đà Lạt năm 2006, mẫu 1. (E: Erwinia carotovora subsp. carotovora, C: Cymbidium). Sau đó, chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng các dòng vi khuẩn vừa phân lập đƣợc. Kiểm tra nhanh bằng cách sử dụng KOH 3%. Nhỏ một giọt KOH lên phiến kính, sau đó dùng tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy một ít vi khuẩn từ khuẩn lạc huyền phù trong giọt KOH đó khoảng 2 – 3 phút, nếu nhớt là gram âm ngƣợc lại là gram dƣơng. 3.2.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC Trên môi trƣờng KB: dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy chấm điểm lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ đem chiếu dƣới tia UV và quan sát sự phát sáng của vi khuẩn. Trên môi trƣờng YDC: tƣơng tự nhƣ cấy lên môi trƣờng KB. Sau 24 giờ quan sát sự tạo sắc tố và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. 3.2.4. Chủng vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan với 17 mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc: EC06-1, EC06-3, EC06-5, EC06-6, EC06-7, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06- 17, EC06-18, EC06-19. Mỗi mẫu phân lập là một công thức, mỗi công thức tiến hành trên một mẩu củ khoai tây và một lá địa lan, bố trí thí nghiệm 2 lần lặp lại. Các mẩu củ khoai tây và lá địa lan không để vi khuẩn vào dùng làm đối chứng. Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn trên củ khoai tây Vật liệu - Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC. - Củ khoai tây bi không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thƣớc 20 8 cm. - Giấy thấm đã sấy khử trùng, nƣớc cất, cồn 700. 32 Phƣơng pháp - Các hộp nhựa đƣợc khử trùng bằng cồn 700, dƣới đáy hộp có đặt một lớp giấy thấm. Sau đó nhỏ nƣớc cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm. - Củ khoai tây đƣợc rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Để khô tự nhiên sau đó dùng dao đã đƣợc khử trùng cắt thành từng miếng nhỏ và đặt vào hộp. Lấy một miếng thạch có chứa khuẩn lạc vi khuẩn và đặt vào chính giữa mẩu khoai tây. Sau đó, tất cả các hộp đƣợc để trong điều kiện nhiệt độ phòng. Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh vi khuẩn bao nhiêu ngày thì củ khoai tây bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh. Tiến hành chủng bệnh vi khuẩn lên lá địa lan Vật liệu - Vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng YDC. - Lá địa lan cùng tuổi (tuổi 2) không bị sâu bệnh. - Hộp nhựa có kích thƣớc 20 8 cm. - Giấy thấm đã sấy tiệt trùng, nƣớc cất, cồn 700. Phƣơng pháp - Các hộp nhựa đƣợc khử trùng bằng cồn 700, dƣới đáy hộp có đặt một lớp giấy thấm. Sau đó nhỏ nƣớc cất đã hấp tiệt trùng lên lớp giấy thấm để tạo độ ẩm. - Lấy lá địa lan không bị sâu bệnh rửa sạch và khử trùng bề mặt bằng cồn 700. Làm khô tự nhiên sau đó dùng dao lam sạch cắt một đoạn khoảng 20 cm và đặt vào hộp. - Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn chấm lên vết cắt. - Sau khi chủng xong các hộp mẫu đƣợc để ở trong phòng lạnh 250C. Đánh giá kết quả: theo dõi xem sau khi chủng bệnh bao nhiêu ngày thì lá địa lan bị bệnh và mô tả triệu chứng bệnh. Sau đó, lấy lá địa lan bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập mẫu: lấy lá địa lan bị bệnh cho vào cốc nƣớc sạch đã hấp tiệt trùng rửa sạch 2 – 3 lần, khử trùng mẫu bằng cồn 700 trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất 2 – 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Đặt mẫu lên môi trƣờng PGA và để ở nhiệt độ phòng. Khi vi khuẩn mọc lên thì quan sát và mô tả. 33 3.2.5. Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trƣờng LB lỏng Dùng que tăm đã sấy tiệt trùng chấm lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào ống nghiệm đựng 5 ml môi trƣờng LB đã hấp tiệt trùng và đậy lại bằng nút bông gòn. Các ống nghiệm này đƣợc gói lại thành bó và cho vào máy lắc . Sau 48 giờ tăng sinh dịch vi khuẩn thu đƣợc đem ly tâm để thu sinh khối sau đó tiến hành ly trích. 3.2.6. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn Phƣơng pháp ly trích DNA đƣợc thực hiện theo quy trình của Sambrook và ctv, 2001: Phƣơng pháp sử dụng CTAB/NaCl đã có cải tiến. Quy trình thực hiện nhƣ sau: - Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm dịch vi khuẩn 10.000 vòng/5 phút/4oC. Rửa sinh khối thu đƣợc với 1ml nƣớc cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (thƣờng 2- 3 lần). - Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 μl dung dịch TE và đánh tan bằng vortex, thêm 30 μl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 – 2 giờ. - Cho thêm vào 100 μl dung dịch NaCl , hòa tan thật kỹ bằng vortex. - Thêm vào 80 μl dung dịch CTAB/NaCl ( khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 650C/10 phút. - Thêm vào 780 μl dung dịch hỗn hợp Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng lắc tay, ly tâm 12.000 vòng/10 phút/4oC. - Thu hết dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào eppendorf mới. Nếu không thể phân biệt mặt phân cách chung giữa các dung dịch có thể ly tâm thêm lần nữa ở tốc độ lớn hơn. - Chiết xuất dung dịch DNA với Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1:v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14.000 vòng/10 phút/4oC. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào eppendorf mới (khoảng 500 μl). - Kết tủa DNA với dung dịch Isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích của dung dịch (khoảng 300 μl) và ủ ở tủ - 20oC/30 phút. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/10 phút/40C. Thu lấy kết tủa sau khi ly tâm. 34 - Rửa kết tủa bằng Ethanol 70% (khoảng 500 μl).Tốt hơn có thể dùng Ethanol 70% đƣợc làm lạnh – 200C, nghiêng nhẹ qua lại. Ly tâm 13.000 vòng/10 phút/4oC. Đổ cồn ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. - Hòa tan kết tủa trong 40 μl dung dịch TE, đem giữ trong tủ mát 40C trong suốt thời gian thử nghiệm. 3.2.7. Thực hiện phản ứng PCR Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 Sử dụng cặp primer có các thông số sau: nhiệt độ Tm: 60,7 0C và 53,60C, %GC: 61,9% và 47,6%, trình tự primer: Xan 1330 (5'- GTTCCCGGGCCTTGTACACAC - 3') và Xan 322 (5'-GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC - 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb (Khoodoo và ctv, 2004). Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTP ' s 10 mM 0.2 mM/mỗi loại Xan 1330 100 pmol/μl 10 pmol/μl Xan 322 100 pmol/μl 10 pmol/μl Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI DNA mẫu 10 – 100 ng H2O cất vừa đủ 25 μl Chu kỳ nhiệt Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động 940C 4 phút Chạy chu kỳ (30 chu kỳ) - Biến tính 940C 1 phút - Bắt cặp 560C 45 giây - Kéo dài 720C 1 phút 35 Giai đoạn kết thúc 720C 5 phút Giữ ở 40C Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 Sử dụng cặp primer có các thông số nhƣ sau: nhiệt độ Tm: 84,9 0C và 73,70C, %GC: 66% và 50%, trình tự primer: Erw1 (5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCG-- 3') và Erw2 (5'- CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAG-- 3'). Hai primer này đƣợc thiết kế trên vùng gen mã hóa pectate lyase của vi khuẩn Erwinia carotovora cho phép khuếch đại một đoạn DNA có kích thƣớc 434 bp (Darrasse và ctv, 1994). Thành phần phản ứng Thành phần Nồng độ cuối 10X buffer PCR 1X MgCl2 50 mM 1.5 mM dNTP ' s 10 mM 0.2 mM/mỗi loại Erw1 75 pmol/μl 10 pmol/μl Erw2 83 pmol/μl 10 pmol/μl Taq DNA polymerase 5 UI/μl 1UI H2O cất vừa đủ 25 μl Chu kỳ nhiệt: chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo quy trình của Seo và ctv, 2001. Các bƣớc của phản ứng Nhiệt độ Thời gian Giai đoạn khởi động 950C 5 phút Chạy chu kỳ (35 chu kỳ) - Biến tính 940C 30 giây - Bắt cặp 650C 30 giây - Kéo dài 720C 45 giây Giai đoạn kết thúc 720C 10 phút Giữ ở 40C Tùy theo sản phẩm PCR, các điều kiện của phản ứng PCR sẽ đƣợc điều chỉnh trong quá trình làm để thu đƣợc kết quả tốt nhất. 36 Điện di và đọc kết quả PCR Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, lấy eppendorf ra khỏi máy luân nhiệt. Sản phẩm PCR sẽ đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose. Chuẩn bị gel cho quá trình điện di: cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125g agarose, thêm 12,5 ml TAE 0.5X, đun trong lò viba ở mức sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) thì đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu. Tiến hành điện di: trộn dung dịch gồm 4 μl sản phẩm PCR và 2 μl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 40 – 50 phút với cƣờng độ dòng điện là 250 mA và hiệu điện thế 50V. Nhuộm mẫu: sau khi điện di, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung dịch EtBr trong khoảng 15 – 20 phút. Quan sát kết quả điện di: kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh Gel Doc, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad. 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh hại trên địa lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng Hoa lan cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, hƣơng vị, độ tƣơi bền dẫn đến làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng trong và ngoài nƣớc, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết cây địa lan đã gây thiệt hại rất lớn cho ngƣời nông dân trồng địa lan tại TP. Đà Lạt. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật. 4.1.1. Các triệu chứng bệnh trên địa lan: Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng xuất hiện trên địa lan với triệu chứng bệnh nhƣ sau: Trên chồi địa lan (a) (b) Hình 4.1.Các triệu chứng bệnh trên chồi địa lan. a. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Chồi địa lan với triệu chứng thối nâu đen. 38 Trên giả hành Trên phát hoa (a) (b) (c) (d) Hình 4.2. Các triệu chứng bệnh trên giả hành. a. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu vàng. b. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng thối nâu đen. c. Giả hành đƣợc cắt dọc với triệu chứng khô giả hành. d. Chậu địa lan với giả hành và chồi bệnh. (a) (b) Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh trên phát hoa. a. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu vàng. b. Phát hoa địa lan với triệu chứng thối nâu đen. 39 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 10 năm 2005) Vƣờn điều tra Tổng số chậu Số chậu bệnh do vi khuẩn Số chậu bệnh do virus Số chậu bệnh do nấm 1 200 60 100 0 2 15.000 3.000 750 3.000 3 1.000 500 100 0 4 7.000 2.800 210 0 5 2.000 1.400 400 800 6 150 0 15 8 7 150 60 15 15 8 20.000 0 0 600 9 300 0 0 0 10 2.500 0 1.750 1.000 11 1.000 800 0 200 12 400 160 80 120 13 400 80 40 100 14 450 45 405 135 15 2.000 0 1.200 200 16 3.500 2.450 350 350 17 500 150 50 50 18 1.000 100 0 100 Tổng cộng 57.550 11.605 5.465 6.678 Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỉ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra nhƣ sau: bệnh do vi khuẩn: 20,17%, bệnh do virus: 9,5%,bệnh do nấm: 11,6%. Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra. 40 Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng lan. Qua điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn so với tỉ lệ nhiễm bệnh do nấm và virus gây ra qua các vƣờn điều tra (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), có vƣờn không bị nhiễm bệnh hoặc chỉ bị nhiễm bệnh do hai tác nhân gây ra. Nhƣ thế, không thể kết luận đƣợc vƣờn đó là hoàn toàn sạch bệnh mà nó có thể bị bệnh tiềm ẩn, chƣa biểu hiện triệu chứng ra bên ngoài. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan và phát triển mạnh. Ngoài các yếu tố tự nhiên thì kỹ thuật trồng và chăm sóc của nông dân cũng ảnh hƣởng đến sự phát sinh, phát triển của bệnh. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý. 4.2. Phân lập mẫu vi khuẩn Theo Nguyễn Văn Minh (2005), qua điều tra và phỏng vấn ở những vƣờn địa lan có bệnh chết cây xuất hiện và vƣờn không có bệnh, cho thấy nhận thức của các chủ vƣờn về bệnh này còn kém. Phần lớn các chủ vƣờn đều nhận biết đƣợc triệu chứng bệnh và điều kiện giúp cho bệnh phát triển mạnh, nhƣng đa số các hộ trồng chƣa phân biệt đƣợc bệnh có bao nhiêu triệu chứng và nguyên nhân gây ra. Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra qua các vƣờn điều tra. 0 5 10 15 20 25 Tỉ lệ n hi ễm b ện h (% ) Vi khuẩn Virus Nấm Tác nhân gây bệnh 41 Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỉ lệ cao hơn cả. Trƣớc tình hình đó, chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu chồi địa lan có triệu chứng bệnh do vi khuẩn gây ra và tiến hành phân lập. Kết quả là phân lập đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (Hình 4.4): a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. Erwinia carotovora subsp. carotovora là vi khuẩn gram âm. Cho nên chúng tôi tiến hành kiểm tra gram âm, gram dƣơng để loại bỏ những dòng vi khuẩn gram dƣơng bằng cách sử dụng KOH 3%. Tuy nhiên, cách kiểm tra này cũng không cho kết quả thật chính xác. Có thể bị nhầm lẫn giữa gram âm và gram dƣơng đối với những vi khuẩn có thời gian nuôi lâu, nó cũng tạo nhớt khi huyền phù trong KOH. 4.3. Quan sát vi khuẩn trên môi trƣờng KB và môi trƣờng YDC 4.3.1. Trên môi trƣờng KB Môi trƣờng KB đƣợc dùng để xem sự phát sáng của vi khuẩn khi chiếu dƣới tia UV. Theo Fiori và Schiaffino (2003), vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora không phát sáng trên môi trƣờng KB. Do đó, chúng tôi đã chọn lọc đƣợc những dòng không phát sáng để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo (Hình 4.5.1). Hình 4.4. Vi khuẩn phân lập từ chồi địa lan bị bệnh trên môi trƣờng PGA. a. Khuẩn lạc màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. (a) (b) 42 4.3.2. Trên môi trƣờng YDC Theo Seo và ctv (2001), khi thử nghiệm sinh lý, sinh hóa trên 87 dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora thì thấy trong 22 dòng Thái Lan có 5 dòng sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC, 23 dòng Hàn Quốc và 24 dòng Nhật Bản đều không sản sinh sắc tố vàng trên môi trƣờng YDC. Nhƣ vậy, giữa các dòng vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora có sự đa dạng về đặc tính kiểu hình phenotyp, do chúng có phổ ký chủ và sự phân bố địa lý rộng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành cấy vi khuẩn lên môi trƣờng YDC để xem sự sản sinh sắc tố vàng và hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn. Sau 24 giờ quan sát thấy trên môi trƣờng YDC, khuẩn lạc vi khuẩn có màu rất đặc trƣng (Hình 4.5.2). - Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. a Hình 4.5.2. Hình thái của khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng YDC sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng). b a. Khuẩn lạc vi khuẩn màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. b. Khuẩn lạc vi khuẩn màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. a a b Hình 4.5.1. Khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng KB chiếu dƣới tia UV sau 24 giờ nuôi cấy (ở nhiệt độ phòng). a. Khuẩn lạc vi khuẩn phát sáng khi chiếu dƣới tia UV, tạo thành quầng sáng xung quanh. b. Khuẩn lạc vi khuẩn không phát sáng khi chiếu dƣới tia UV. b a 43 4.4. Chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây, lá địa lan Từ nguồn vi khuẩn cấy lên môi trƣờng YDC, chúng tôi tiến hành chủng lên củ khoai tây và lá địa lan. 4.4.1. Trên củ khoai tây: sau 48 giờ chủng bệnh, quan sát thấy triệu chứng bệnh biểu hiện nhƣ sau: Sau 48 giờ chủng vi khuẩn, quan sát thấy 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây hại mạnh: EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-14, EC06-15, EC06-16, EC06-17, EC06-18 và EC06-19 với các triệu chứng nhƣ hình 4.6.1. Ngoài ra, các dòng còn lại khả năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính của vi khuẩn bị giảm. (a) (b) (c) (d) Hình 4.6.1. Các triệu chứng bệnh trên củ khoai tây chủng vi khuẩn sau 48 giờ (ở nhiệt độ phòng). a. Vết bệnh lõm xuống, màu vàng kem, nhày. b. Vết bệnh lõm xuống, màu nâu đen, nhày. c. Vết bệnh có dịch nhày kèm theo bọt màu trắng. d. Vết bệnh hơi lõm xuống, nhày, xung quanh vết bệnh có đƣờng viền màu nâu nhạt. 44 4.4.2. Trên lá địa lan: Sau 10 ngày chủng bệnh, quan sát thấy hầu nhƣ các dòng vi khuẩn không gây bệnh trên lá địa lan. Chỉ duy nhất có dòng EC06-8 gây bệnh. Vết bệnh có màu vàng xanh, lan theo chiều rộng của phiến lá. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có viền màu nâu đen (Hình 4.6.2). Sau đó, chúng tôi đã tiến hành phân lập lại từ lá địa lan chủng bệnh vi khuẩn có biểu hiện bệnh. Kết quả thu nhận đƣợc vi khuẩn có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (Hình 4.6.3). 4.5. Ly trích DNA tổng số của vi khuẩn DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó, chúng ta phải ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,…Có nhiều phƣơng Hình 4.6.3. Vi khuẩn phân lập từ lá địa lan bị bệnh sau khi chủng vi khuẩn 10 ngày trên môi trƣờng PGA. Hình 4.6.2. Triệu chứng bệnh trên lá địa lan chủng vi khuẩn sau 10 ngày (ở 250C). a. Ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe có màu nâu đen. b. Vùng bị bệnh có màu vàng xanh. a b 45 pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Tuy giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng. Chúng tôi đã tiến hành ly trích một số dòng vi khuẩn. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến hành điện di kiểm tra DNA. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở hình 4.6. Qua hình trên cho thấy các mẫu ly trích có độ tinh sạch chƣa cao. Ngoài DNA tổng số còn có phần tạp (RNA và protein) ở phía dƣới. Có thể loại bỏ đƣợc phần tạp này bằng cách sử dụng enzyme RNAse. Có một số mẫu DNA bị đứt gãy tạo thành vệt sáng dài. Tuy nhiên, DNA thu đƣợc tƣơng đối sạch để thực hiện phản ứng PCR. Trƣớc khi tiến hành thực hiện phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành pha loãng DNA gốc trong nƣớc cất vô trùng hoặc TE 1X. Do lƣợng DNA mẫu dùng trong phản ứng PCR khoảng từ 10 – 100 ng. Nếu lƣợng DNA mẫu quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn. Sau khi pha loãng, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose để kiểm tra. Hình 4.7. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của vi khuẩn. 1. EC06-1, 2. EC06-3, 3. EC06-5, 4. EC06-6, 5. EC06-7, 6. EC06-8, 7. EC06-9, 8. EC06-10. Điện di trên gel agarose 0,8% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 3 μl mẫu/giếng. DNA tổng số Phần tạp nhiễm 1 2 3 4 5 6 7 8 46 4.6. Phản ứng PCR 4.6.1. Phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 Chúng tôi đã tiến hành chạy PCR trên các dòng vi khuẩn: EC06-1, EC06-5, EC06- 6, EC06-8, EC06-9, EC06-10, EC06-11, EC06-12, EC06-13, EC06-19 với cặp primer Xan 1330 và Xan 322. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose cho thấy chúng tôi đã thu đƣợc sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 1,5 kb. Tuy nhiên thấy xuất hiện 2 band điều đó chứng tỏ có sự tạp nhiễm. Lý do của sự tạp nhiễm này có thể đƣợc giải thích có thể tạp nhiễm trong khi ly trích hoặc tạp nhiễm khi nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Để khắc phục hiện tƣợng này, chúng tôi đã nâng nhiệt độ bắt cặp từ 560C lên 580C. Kết quả là thu đƣợc một band. 1 2 3 4 Hình 4.8. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 560C). 1. EC06-1, 2. EC06-8, 3. EC06-9, 4. EC06-19. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng. Sản phẩm PCR 1 2 3 4 Hình 4.9. Sản phẩm PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 (nhiệt độ bắt cặp 580C). 1. EC06-8. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4μl mẫu/giếng. Sản phẩm PCR 1 47 Trình tự 16S rDNA là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa , phân loại vi khuẩn và đã đƣợc xác định cho nhiều loài vi khuẩn. Trình tự 16S rDNA và vùng hoạt động giữa 16S – 23S rDNA chỉ ra sự biến đổi giữa các dòng trong cùng một loài. Dựa vào vùng này để phát hiện ra sự khác nhau giữa các loài vi khuẩn.Cặp primer chúng tôi sử dụng đƣợc thiết kế trên vùng 16S/23S rDNA, cho phép khuếch đại đoạn DNA có kích thƣớc 1,5 kb. Khi kiểm tra trên Genbank chúng tôi thấy cặp primer này có thể khuếch đại trên một số loài khác. Nhƣ thế, chúng tôi chƣa thể khẳng định đƣợc vi khuẩn chúng tôi đang nghiên cứu chính xác là Erwinia carotovora subsp. carotovora. Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2. 4.6.2. Phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 Primer Y1 (5 ' -TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3 ' ), Y2 (5 ' - CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT- 3 ') đƣợc sử dụng để khuếch đại đoạn DNA có kích thƣớc 434bp. Trình tự của mỗi mồi đã đƣợc kiểm tra trên Genbank và EBML (Darrasse và ctv, 1994). Trong thí nghiệm này, chúng tôi cũng sử dụng cặp primer có trình tự giống nhƣ mô tả của Darrasse và ctv (1994) nhƣng có tên khác là Erw1 và Erw2. Chúng tôi đã tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp primer Erw1 và Erw2 với chu kỳ nhiệt nhƣ đã nêu ở mục 3.2.7. Kết quả điện di trên gel agarose cho thấy không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra. Điều đó chứng tỏ phản ứng PCR không xảy ra (Hình 4.10). Hình 4.10. Sản phẩm PCR với cặp primer Erw1 và Erw2. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 50V/40 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4 μl/giếng. 48 Theo chúng tôi có nhiều nguyên nhân khiến cho phản ứng PCR không xảy ra: - Nhiệt độ nóng chảy (melting) của hai primer tƣơng đối cao (84,90C và 73,70C) do trong thành phần có nhiều GC (66% và 50%). Quy trình ban đầu chúng tôi thực hiện nhiệt độ giai đoạn bắt cặp là 650C nhƣ thế là tƣơng đối cao. Nhƣng kết quả vẫn không có sản phẩm khuếch đại. Do đó, chúng tôi tiến hành giảm xuống 620C, 600C, 580C nhƣng vẫn không có kết quả. - Nguyên nhân thứ hai có thể do nồng độ các chất tham gia phản ứng quá thấp nên không đủ cho phản ứng PCR xảy ra. Lƣợng Taq ban đầu chúng tôi sử dụng là 0,1μl/UI, có thể là thấp không đủ để xúc tác cho phản ứng xảy ra. Chúng tôi tiến hành tăng lƣợng Taq từ 0,1μl/UI lên 0,2μl/UI đồng thời tăng nồng độ primer từ 10 pmol lên 20 pmol. Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến quá trình PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng độ Mg2+ thấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngƣợc lại, nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Khoảng nồng độ cho phép của Mg2+ từ 1 – 5 mM (McPherson, M. J. và Møller, S. G. 2000). Từ đó, chúng tôi tiến hành tăng nồng Mg2+ từ 1,5 mM lên 2 mM, 2,5 mM, 3 mM nhƣng vẫn không cho bất kỳ kết quả nào. Nhƣ vậy, việc tăng nồng độ các hóa chất là không hiệu quả. - Nguyên nhân thứ ba có thể do số chu kỳ khuếch đại chúng tôi sử dụng ban đầu (35 chu kỳ) là tƣơng đối dài. Vì vậy, chúng tôi đã giảm từ 35 xuống 30 chu kỳ, 25 chu kỳ nhƣng vẫn không có sản phẩm khuếch đại nào đƣợc tạo ra cả. Qua các thí nghiệm thay đổi các điều kiện của phản ứng PCR, kết quả vẫn không có sản phẩm khuếch đại tạo ra.. Có nhiều lý do để giải thích cho vấn đề này. Thứ nhất, các mẫu địa lan khi bị thối có thể có nhiều loại vi sinh vật khác tấn công do đó có thể trong các mẫu vi khuẩn chúng tôi phân lập không có sự hiện diện của vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora. Thứ hai là có thể có sự tạp nhiễm khi phân lập và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Thứ ba là có thể các điều kiện của phản ứng chúng tôi thay đổi chƣa phù hợp. Do hạn chế về mặt thời gian nên chúng tôi vẫn chƣa tìm ra đƣợc một quy trình PCR thích hợp cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan. 49 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Bệnh thối làm chết cây địa lan đang ảnh hƣởng nghiêm trọng đến các vƣờn lan tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. Qua kết quả điều tra cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn gây ra cao hơn hẳn (20,17%) so với tỉ lệ nhiễm bệnh do virus (9,5%) và nấm (11,6%). 2. Kết quả phân lập vi khuẩn thu đƣợc 2 dòng vi khuẩn có màu khuẩn lạc rất đặc trƣng: - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu vàng trứng, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. - Khuẩn lạc vi khuẩn có màu trắng đục, tròn, lồi, nhầy, bóng, mép khuẩn lạc tròn nhẵn. 3. Kết quả chủng bệnh vi khuẩn lên củ khoai tây và lá địa lan: - Trên củ khoai tây: 9 dòng vi khuẩn có khả năng gây bệnh mạnh, các dòng còn lại khả năng gây bệnh yếu hoặc không gây bệnh. - Trên lá địa lan : hầu nhƣ các dòng vi khuẩn không gây bệnh sau khi chủng bệnh 10 ngày, duy nhất chỉ có dòng EC06-8 gây bệnh. 4. Quy trình tách chiết DNA khá đơn giản, đảm bảo lƣợng DNA thu đƣợc có độ tinh sạch cao phục vụ tốt cho việc chạy PCR. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ ở mục 3.2.6. 5. Kết quả phản ứng PCR với cặp primer Xan 1330 và Xan 322 đã khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1,5 kb. 5.2. Đề nghị Từ những khó khăn, trở ngại gặp phải trong quá trình nghiên cứu nên chúng tôi có thể đƣa ra một số đề nghị sau: 1. Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trƣởng và phát triển, tiến hành thử các phản ứng sinh hóa. Bởi vì, nguồn mẫu ban đầu là rất quan trọng, phải khẳng định chắc chắn trƣớc khi tiến hành các thử nghiệm tiếp theo ở mức độ phân tử. 2. Cần có một mẫu đối chứng dƣơng là điều rất quan trọng và cần thiết. 3. Thiết lập lại quy trình PCR cho vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) và hoàn thiện quy trình. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Văn Bảo, 1999. Kỹ thuật nuôi trồng phong lan. Nhà xuất bản trẻ. 175 trang. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp - Ứng dụng). Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Nguyễn Văn Minh, 2005. Điều tra bệnh chết cây và kỹ thuật trồng địa lan (Cymbidium) tại TP. Đà Lạt – Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp Ngành Nông Học 2005. 4. Lê Hữu Quang, 2005. Nghiên cứu một số loại giá thể cho cây hoa địa lan (Cymbidium) trồng tại TP. Đà Lạt tỉnh Lâm Đồng. Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học 2005. 5. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. Trang 7 – 118. 6. Nguyễn Văn Tới, 2003. Một số vấn đề bảo vệ thực vật trong nuôi trồng hoa địa lan Cymbidium. 7. Trƣơng Trỗ, 1988. Đà Lạt Cymbidium. Sở khoa học, công nghệ và môi trƣờng Lâm Đồng. jpg&imgrefurl=... TIẾNG NƢỚC NGOÀI 8. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Mirik M. New symptoms of tomato soft rot diseases in Turkey. 51 9. Aysan Y., Saygili H., Sahin F. and Cetinkaya-Yildiz R. Present status of bacterial stem rot on tomato in Turkey. 10. Cerkaukas R. F. and Brown J. 2001. Bacterial stem and peduncle canker of greenhouse pepper. olume=23&articleFile=k01-019.pdf 11. Christopher P. K. and David H. P. 1999. Ribosomal DNA Sequencing as a tool for identification of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology, 2: 299 – 305. 12. Darrasse A., Priou S., Kotojansky A. and Bertheau Y. 1994. PCR and restriction fragment length polymorphism of a pel gen as a tool to identify Erwinia carotovora in relation to potato diseases. Applied and Environmental. Microbiology, May, p.1437 – 1443. 13. Fiori M. and Schiaffino A., 2003. Bacterial Stem Rot in Greenhouse Pepper (Capsicum annuum L. ): Occurrence of Erwinia carotovora sbsp. carotovora. J.Phytopathology. 152, 28 – 33. 14. Heidi Hyytiainen, 2005. Regulatory networks controlling virulence in the plant pathogen Erwinia carotovora ssp. carotovora. Department of Biological and Environmental Sciences. Faculty of Biosciences. University of Helsinki.57 pages. 15. Kang H. W., Kwon S. W. and Go S. J. 2003. PCR – based specific and sensitive detection of Pectobacterium ssp. carotovorum by primers generated from a URP – PCR fingerprinting – derived polymorphic band. Plant pathology. 52, 127 – 133. 52 16. Khoodoo M. H. R., Sahin F., Donmez M. F. and Jaufeerally Fakim Y. 2004. Molecular characterisation of Xanthomonas Strains isolated from aroids in Mauritius. Systematic and Applied Microbiology. 28, 366 – 380. 17. Marcos Montesano, 2002. Molecular characterization of plant defense respones to Erwinia carotovora. Division of Genetics, Department of Biosciences, Faculty of Science. University of Helsinki. 60 pages. 18. McPherson M. J. and Møller S. G., 2000. PCR. BIOS. 276 pages. 19. Phokum C., Jitareerat P., Photchanachai S. and Cheevadhanarak S. Detection and classification of soft rot Erwinia of vegetables in Thailand by DNA polymerase chain reaction. 20. Seo S. T., Furuya N., Lim C. K., Takanami Y. and Tsuchiya K. 2003. Phenotypic and genetic characterization of Erwinia carotovora from mulberry (Morus spp. ). Plant Pathology. p. 142. 21. Seo S. T., Furuya N., Lim C. K., Takanami Y. and Tsuchiya K. 2001. Phenotypic and Genetic Diversity of Erwinia carotovora ssp. carotovora Strains from Asia. J.Phytopathology.150: 120 – 127. 22. Subandiyah S., Iwanami T., Tsuyumu S. and Ieki H. 2000. Comparison of 16S rDNA and 16S/23S Intergenic Region Sequences Among Citrus Greening Organisms in Asia. Plant Dis. 84:15 – 18. 53 23. So Young Yoo, Sun Young Park, Won Min Yoo, Kyung Hee Chang, Nae Choon Yoo, June Myung Kim, Seung Min Yoo, Ki Chang Keum and Sang Yup Lee, 2002. Design of ITS and 23S rDNA – Targeted Probes and Its Usefulness for the Identification of Bacterial Pathogen. Genome Informatics. 13: 589 – 590. 24. Wright P. J. 1998. Plant disease record A soft rot of calla (Zantedeschia spp. ) caused by Erwinia carotovora subspecies carotovora. 25. Yeshitila Degefu, Sanna Jokela, Erkki-Joki Tkola and Elina Virtanen, 2006. DNA based detection of blackleg and soft rot disease causing Erwinia strains in seed potatoes. TRANG WEB