Luận văn So sánh tác dụng thủy phân đậu hũ bằng phức hệ enzyme của Bacillus subtilis sp. và Bacillus natto sp. để chế biến thức uống chức năng

2 ml dung dịch kali ferixianua, khuấy đều, đun trên nồi cách thủy sôi 15 phút. Sau đó để nguội, thêm vào ống nghiệm 4 ml dung dịch Fe2(SO4)3 khuấy đều và dẫn đến mức 20 ml. Đo cường độ màu ở bước sóng 710 nm. Tính kết quả Dựa vào mật độ quang (OD) đối chiếu với độ thị chuẩn, tính lượng đường. 2.2.7.7. Phương pháp xác định hàm lượng lipid thô [3] Nguyên tắc Nguyên liệu được làm khô, sau đó trích ly lipid ra khỏi nguyên liệu bằng ether dầu hỏa hoặc ether ethylic trên máy Soxhlet và xác định khối lượng chất béo. Dụng cụ và hóa chất - Máy Soxhlet. - Giấy lọc. - Ether dầu hỏa ether ethylic. Cách tiến hành - Giấy lọc được sấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi. - Nguyên liệu và sản phẩm được nghiền nhỏ, sấy ở 105oC đến trọng lượng không đổi. - Cân chính xác 2- 5 g nguyên liệu khô tuyệt đối cho vào giấy lọc và gói lại cho kín không để mẫu rơi ra ngoài. Để giấy lọc có chứa mẫu vào trụ chiết của máy Soxhlet. Chiết bằng ether dầu hỏa hoặc ether ethylic. Sau khi chiết hết lipid (khoảng 8 giờ), lấy túi mẫu ra, cho bay hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi. Tính kết quả Hàm lượng lipid thô được tính theo công thức X= c ba 100*)(  X : hàm lượng lipid %. a : trọng lượng giấy lọc và mẫu trước khi chiết (g). b : trọng lượng giấy lọc và mẫu sau khi chiết (g). c : trọng lượng mẫu lấy để phân tích lipid. 2.2.7.8. Phương pháp xác định peroxide [3] Nguyên lý Chỉ số peroxid là số g iot giải phóng ra bởi peroxid có trong 100 g mẫu. R1 - CH - CH - R2 + 2 KI + 2 CH3COOH O O R1 - CH2 – CH - R2 + 2 CH3COOK + H2O + I2 O I2 + 2 Na2S2O3  2 NaI + Na2S4O6. Nguyên liệu và hóa chất - Acid acetic. - Dung dịch KI bão hòa (pha dùng ngay), lắc kỹ đậy nút cẩn thận. - Dung dịch Na2S2O3 0,01N. - Dung dịch hòa tinh bột 1%. - Cloroform. Cách tiến hành Lấy 1 g mẫu khô tuyệt đối, ống đối chứng 1 ml nước cất. Mỗi bình cho 10 ml dung dịch hỗn hợp acid acetic : Cloroform (2:1), 1 ml dung dịch KI bão hòa (mới pha), cho erlen vào chỗ tối 10 phút. Cho thêm vào erlen 0,5 ml chỉ thị hồ tinh bột 1% chuẩn độ iod tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 (đến khi mất màu nâu). Tính kết quả Chỉ số peroxide P= C fba 100*01269.0**)(  a : số ml dung dịch Na2S2O3 dùng chuẩn mẫu thật. b : số ml dung dịch Na2S2O3dùng chuẩn mẫu thử không . c : trọng lượng mẫu.. f : hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O3 0,01N. 0,01269: số gam iod tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O3 0,01N. 100: hệ số quy chuẩn 100 g chất béo. 2.2.7.9. Định lượng bào tử Bacillus subtilis sp. trong sản phẩm bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [17] Nguyên tắc Cấy một thể tích xác định mẫu huyền phù vi sinh vật cấy lên môi trường thạch có thành phần cơ chất đặc trưng và thích hợp cho loài vi sinh vật cần định lượng phát triển. Sau một khoảng thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc. Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã cấy và hệ số pha loãng, ta có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1 ml mẫu khảo sát ban đầu. Cách tiến hành - Xác định bào tử có trong sản phẩm Nhuộm bào tử: bào tử của Bacillus subtilis sp. có màu hồng, thường nằm giữa tế bào có màu xanh. - Khử trùng mẫu theo kiểu Pasteur là biện pháp hấp nóng nguyên liệu một lần ở nhiệt độ thấp hơn 100oC. Nhiệt độ và thời gian khử trùng theo kiểu Pasteur tùy thuộc vào sức đề kháng của vật liệu đối với nhiệt độ. Đun nóng dịch tế bào thu được từ các thí nghiệm trên ở nhiệt độ 80oC trong 15 phút. - Pha loãng dịch huyền phù bào tử ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3… Tiến hành cấy 0,1 ml dịch mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa Petri môi trường NA đã được đổ sẵn. Đặt các đĩa thạch vừa cấy ở nhiệt độ phòng và ủ trong 24 giờ. - Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng bào tử trong 1 ml mẫu. Thí nghiệm lặp lại 2 lần. Tính kết quả Mật độ tế bào được tính theo công thức sau: C (CFU/ml) = N n1V1f1 + …+ niVifi Trong đó: C (CFU/ml): số tế bào vi khuẩn trong 1 ml mẫu. N (CFU): tổng số khuẩn lạc đếm trên các đĩa. ni: số đĩa cấy ở nồng độ pha loãng thứ i. Vi(ml): thể tích mẫu cấy trong mỗi đĩa. fi: độ pha loãng thứ i. 2.2.8. Phương pháp đánh giá cảm quan sản phẩm 2.2.8.1. Phương pháp mô tả mùi - vị [4] Mục đích Xác định nồng độ hương, lượng đường aspartam bổ sung vào thức uống chức năng đậu hũ nhằm cải thiện mùi vị của nguyên liệu ban đầu, tăng giá trị cảm quan. Cơ sở Phương pháp mô tả mùi - vị (flavor profile) có nguồn gốc từ nhóm tư vấn Arthur D. Little vào cuối những năm 1940. Vào thời điểm đó, nhóm này cung cấp một công cụ chung để đánh giá tính chất đặc trưng hương - vị của một thực phẩm và thay thế phương pháp sử dụng chuyên gia thử nếm bằng một hội đồng gồm các thành viên được huấn luyện. Không giống các phương pháp thực nghiệm hiện đại, phương pháp luận của flavor profile sử dụng một quá trình “đồng thuận”. Những đánh giá riêng biệt của nhóm bắt đầu bằng làm việc độc lập với nhau nhưng sau đó lại tập hợp lại trong một nhóm để kết thúc flavor profile. Cách tiến hành - Tổ chức 3 nhóm, mỗi nhóm 5 người. - Chuẩn bị sản phẩm + Đánh giá hương (hương phomai): chuẩn bị các mẫu thử với nồng độ hương khác nhau, được kí hiệu như bảng 2.2. Bảng 2.2. Kí hiệu mẫu thử hương Tỉ lệ hương 0/00 (v/w) 10/00 2 0/00 3 0/00 4 0/00 Kí kiệu mẫu A B C D + Đánh giá vị (đường aspartam): chuẩn bị các mẫu thử với nồng độ đường khác nhau, được kí hiệu như bảng 2.3. Bảng 2.3. Kí hiệu mẫu thử vị Tỉ lệ đường 0/00 (mg/g) 0.350/00 (1 gói) 0.70/00 (2 gói) 1.050/00 (3 gói) 1.400/00 (4 gói) Kí kiệu mẫu A B C D - Thử sản phẩm, mỗi thành viên làm việc độc lập, ghi lại cảm nhận của từng sản phẩm và chọn ra sản phẩm vừa miệng. 2.2.8.2. Phương pháp phép thử cho điểm thị hiếu [22] Mục đích Tìm hiểu mức độ hài lòng, ưa thích của người sử dụng đối với sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic. Nguyên tắc Người thử được mời thử sản phẩm nhưng thay vào việc đánh giá cường độ của một tính chất cảm quan nào đó họ sẽ “đo” mức độ ưa thích, hài lòng của mình đối với sản phẩm bằng thang điểm 9 đã được định nghĩa trước thông qua các thuật ngữ mô tả cấp độ hài lòng, ưa thích: 1. Cực kỳ không thích 2. Rất không thích 3. Không thích 4. Tương đối không thích 5. Không thích cũng không ghét 6. Tương đối thích 7. Thích 8. Rất thích 9. Cực kỳ thích Cách tiến hành - Chuẩn bị mẫu thử. - Chọn đối tượng thử: 100 người ở khu phố 1 - P.Hiệp Bình Phước - Q. Thủ Đức - Tp.HCM với đầy đủ các lứa tuổi, giới tính và mức thu nhập. - Thử và cho điểm sản phẩm theo thang 9 diểm với mức đánh giá như trên. 2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu 2.2.9.1. Phương pháp xử lý số liệu quy hoạch thực nghiệm Mục đích - Xây dựng phương trình hồi quy. - Kiểm tra phương trình hồi quy có tương thích với thực nghiệm hay không. Cách tiến hành Phương trình hồi quy có dạng: Y = b0 + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 + b123X1X2X3. Để kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm, ta tìm phương sai tái hiện ở thí nghiệm tại tâm. - Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm tại tâm: y = yu 3 u= 1 3 - Phương sai tái hiện sth 2 =  3 u = 1 (yu - y ) 2 n0 - 1  sth - Phương sai các hệ số: sbj = sth N - Các hệ số trong phương trình hồi quy được xác định như sau: bj = 1 N  N i = 1 xịyi - Đánh giá mức ý nghĩa của các hệ số theo tiêu chuẩn Student. + Tra bảng tp(f) = t0.05(2) = 4.3 khi chọn p=0.05 + Tính các giá trị t theo công thức sau: tj = | |bj sbj So sánh các giá trị t với tp(f) để xác định phương trình hồi quy tương ứng. - Đánh giá mức độ tương thích của phương trình theo tiêu chuẩn Fisher. + Tính các giá trị của y theo phương trình hồi quy đã xác định ^ y s2tt =  i = n i = 1 (yi - ^ yi ) /n-l + Tính F F = s 2 tt s2th + Giá trị ở bảng của tiêu chuẩn Fisher với mức ý nghĩa p = 0.05, các bậc tự do f1 = 3; f2 = 2 là F1- p(f1, f2) = 19.2. Nếu Ftính < F1-p(f1, f2) thì phương trình hồi quy tương quan với thực nghiệm, còn ngược lại thì không. 2.2.9.2. Phương pháp xử lý số liệu đánh giá cảm quan bằng toán học thống kê Trong thí nghiệm đánh giá cảm quan, tiến hành trên mẫu gồm 100 người thử. Mục đích - Xác định mức đánh giá sản phẩm theo thang điểm được xây dựng. - Kiểm tra kết quả thu được có tin cậy không. Cách tiến hành - Lập bảng phân phối thí nghiệm Điểm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Số người - Tính các tham số + Trung bình cộng - X = 1 f  i = 9 i = 1 Xifi Với Xi : điểm số; fi là số người cho điểm Xi. + Sai số trung bình cộng m = S/ f Với S là mức độ phân tán quanh giá trị trung bình S = ± f 1  i = 9 i = 1 fi(Xi - - X) + Hệ số biến thiên Cv%: phản ánh mức độ biến thiên trong nhiều tập hợp có X khác nhau. Cv% = S - X *100% Cv% = 0%-10% : dao động nhỏ, đáng tin cậy. Cv% = 10%-30%: dao động trung bình, tin cậy. Cv% = 30%-100%: dao động lớn, ít tin cậy. - Vẽ đồ thị. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG TRONG ĐỀ TÀI 3.1.1. Bacillus subtilis sp. (BsTC) và Bacillus natto sp. (Bn) 3.1.1.1. Đặc điểm hình thái Hình 3.1. Khuẩn lạc của BsTC (trái) và Bn (phải) Hình 3.2. Tế bào và bào tử của BsTC (trái) và Bn (phải) Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái vi khuẩn BsTC và Bn Đặc điểm BsTC Bn Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc to; màu trắng đục, bám vào mặt thạch; bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn, nhớt. Khuẩn lạc to; trắng đục, bám vào mặt thạch; bề mặt có thể nhăn hoặc trơn. Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ hay kết chuỗi. Tế bào có mang bào tử hình trứng; bào tử nằm ở giữa tế bào sinh dưỡng. Hình que, đứng riêng rẽ hay kết chuỗi. Tế bào có mang bào tử hình trứng; bào tử nằm ở giữa tế bào sinh dưỡng. Kích thước tế bào 1 - 1,5 µm 1 - 1,5 µm Bào tử Nhuộm Gram Gram dương Gram dương Nhận xét Như vậy, về mặt hình thái thì Bacillus subtilis sp. không khác gì so với Bacillus natto sp., do đó nếu dựa vào tiêu chí này thì không phân biệt hai chủng vi khuẩn trên. 3.1.1.2. Đặc điểm sinh lý  Đường cong sinh trưởng của BsTC và Bn trên môi trường CP Bảng 3.2. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC (logCFU/ml) Bn (logCFU/ml) 0 3.64 2.85 4 4.71 3.42 8 5.98 5.16 12 7.46 6.23 16 8.15 6.77 20 8.27 7.19 24 8.33 7.78 28 8.39 7.96 32 8.28 8.19 36 7.92 8 40 7.47 6.92 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) lo g C F U /m l Đồ thị 3.1. Đường cong sinh trưởng của BsTC và Bn trên môi trường CP Nhận xét Từ đường cong sinh trưởng của vi khuẩn BsTC và Bn trên môi trường CP, chúng tôi nhận thấy: - Pha lag của cả hai đường cong đều kéo dài trong khoảng từ 0-2 giờ đầu, số lượng tế bào tăng lên không đáng kể. Độ dài pha lag tương đối ngắn, chứng tỏ các tế bào vi khuẩn còn trẻ, nhanh chóng thích nghi với môi trường CP. Sau đó, vi khuẩn bắt đầu sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa do vi khuẩn đã thích nghi với môi trường và trong môi trường giàu chất dinh dưỡng. Mật độ tế bào đạt cực đại ở 28 giờ ở BsTC khoảng 2,43.10 8 và 32 giờ ở Bn khoảng 1,56.108. - Pha ổn định kéo dài từ 20-32 giờ, trong giai đọan này sinh sản vẫn tiếp tục diễn ra ở một số tế bào trong môi trường nuôi cấy. - Sau 32 giờ, mật độ tế bào giảm dần do môi trường ngày càng cạn kiệt chất dinh dưỡng, đồng thời các sản phẩm trao đổi chất của chúng sinh ra cũng ức chế lại sự phát triển của vi khuẩn. Kết luận Mật độ tế bào đạt cực đại ở BsTC cao và sớm hơn Bn: 28 giờ ở BsTC khoảng 2,43.10 8 và 32 giờ ở Bn khoảng 1,56.108.  Đường cong sinh trưởng của BsTC và Bn trên môi trường sữa đậu nành Bảng 3.3. Kết quả mật độ tế bào theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC (logCFU/ml) Bn (logCFU/ml) 0 7.84 7.63 4 7.86 7.78 8 8.00 7.94 12 8.56 8.02 16 8.78 8.23 20 8.98 8.63 24 9.23 9.01 28 9.45 9.24 32 9.40 9.31 36 9.34 9.29 40 9.06 8.87 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) lo g C F U /m l Đồ thị 3.2. Đường cong sinh trưởng BsTC và Bn trên môi trường sữa đậu nành Nhận xét: - Pha lag của BsTC khoảng từ 0-8 giờ ngắn hơn của Bn khoảng từ 0-16 giờ. - Mật độ tế bào cực đại của BsTC ở 28 giờ, của Bn là 32 giờ. Kết luận: Chúng tôi kết thúc quá trình tăng sinh vi khuẩn trong môi trường sữa đậu nành sau 24 giờ nuôi cấy (đối với BsTC ) và 28 giờ (đối với Bn). 3.1.1.3. Đặc điểm sinh hóa  Phản ứng nitratase dương tính (1): (-) H2O (2): (+) Pseudomonas aeruginosa (3): (+) BsTC (4): (+) Bn Hình 3.3. Thử nghiệm nitratase  Khả năng thủy phân casein Hình 3.4. Phản ứng thủy phân casein của BsTC (trái) và Bn (phải) 1 2 3 4  Khả năng thủy phân fibrin Hình 3.5. Phản ứng thủy phân fibrin của BsTC (trái) và Bn (phải)  Khả năng thủy phân tinh bột Hình 3.6. Phản ứng thủy phân tinh bột của BsTC (trái) và Bn (phải) Nhận xét Kết quả cho thấy cả BsTC và Bn đều có khả năng thủy phân protein, tinh bột. Đây là đặc điểm quan trọng để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, cụ thể là thủy phân đậu hũ làm thức uống chức năng. Thêm vào, chúng có khả năng thủy phân fibrin làm tăng thêm giá trị probiotic vì có tác dụng tốt trong các bệnh tim mạch. 3.1.2. Lactobacillus sp. 3.1.2.1. Đặc điểm hình thái Hình 3.7. Khuẩn lạc Lactobacillus sp. Hình 3.8. Tế bào Lactobacillus sp. Bảng 3.4. Đặc điểm hình thái Lactobacillus sp. Hình dạng khuẩn lạc Khuẩn lạc nhỏ tròn, màu trắng đục Hình dạng tế bào Hình que, đứng riêng rẽ Kích thước tế bào 0,5-1 µm Nhuộm Gram Gram dương 3.1.2.2. Đặc điểm sinh lý  Khả năng làm đông tụ sữa (+): đông tụ sữa sau cấy Lactobacillus sp. vào sữa đậu nành 24 giờ. (ĐC): sữa đậu nành đã được hấp tiệt trùng, không cấy giống vi khuẩn. Hình 3.9. Khả năng làm đông tụ sữa của Lactobacillus sp.  Kết quả định tính acid lactic Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 3 ml thuốc thử Ufermen. Ống 2: 3 ml dịch lên men, 3 ml thuốc thử Ufermen. Ống 3: 3 ml acid lactic 98 %, 3 ml thuốc thử Ufermen. Hình 3.10. Kết quả định tính acid lactic 3.1.2.3. Đặc điểm sinh hóa * Oxydase âm tính 1: Lactobacillus sp.(-) 2: (-) E.coli 3: (+) Pseudomonas 4: H2O Hình 3.11. Thử nghiệm oxydase * Catalase âm tính, không có hiện tượng sủi bọt Staphylococcus aureus dương tính Vi khuẩn lactic âm tính Hình 3.12. Thử nghiệm catalase * 1 2 3 1 2 3 4 + Thử nghiệm nitratase: Nitratase âm tính 1: (-) H2O 2: (+) Pseudomonas. 3: (-) Lactobacillus acidophilus 4: Lactobacillus sp. Hình 3.13. Thử nghiệm nitratase * Khả năng lên men glucose (1): ĐC (-): môi trường phenol red broth (2): ĐC (+): E.coli (3): Lactobacillus sp. Hình 3.14. Thử nghiệm khả năng lên men glucose 3.2. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG HỆ ENZYME CỦA BsTC và Bn 3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme amylase của BsTC và Bn 3.2.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo thời gian Bảng 3.5. Sự biến thiên hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 0 1.044 0.0126 1.05 0.0123 4 1.019 0.0139 1.012 0.0143 8 1.000 0.0149 0.911 0.0195 12 0.988 0.0155 0.902 0.02 16 0.848 0.0228 0.875 0.0214 20 0.771 0.0267 0.848 0.0228 24 0.623 0.0344 0.723 0.0292 28 0.495 0.041 0.761 0.0273 32 0.595 0.0357 0.605 0.0354 36 0.732 0.0288 0.677 0.0316 40 0.835 0.0235 0.932 0.0184 1 2 3 4 1 2 3 00.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo thời gian Nhận xét - Hoạt tính enzyme amylase của cả hai chủng tăng không đáng kể trong thời gian đầu, tăng rõ ở 16 - 32 giờ và đạt cực đại ở 28 giờ (BsTC ) và 32 giờ (Bn), sau đó giảm dần. - Nhìn chung, hoạt tính enzyme amylase của Bn thấp hơn, biến động hơn và thời gian đạt cực đại lâu hơn so với BsTC. 3.2.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo nhiệt độ Bảng 3.6. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo nhiệt độ 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 15 20 25 30 35 40 45 Nhiệt độ H oạ t t ín h (Đ V H T/ gM T) Nhiệt độ (0C) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 15 0.066 0.0194 0.109 0.0261 20 0.051 0.0301 0.105 0.0276 25 0.041 0.0373 0.086 0.0346 30 0.037 0.0401 0.074 0.0391 35 0.04 0.038 0.076 0.0384 40 0.043 0.0358 0.081 0.0365 45 0.053 0.0287 0.123 0.0209 Đồ thị 3.4. Sự biến thiên hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo nhiệt độ Nhận xét Nhìn vào đồ thị, ta thấy hoạt tính enzyme amylase của hai chủng giống theo nhiệt độ tương đương nhau, chúng có hoạt tính cao nhất vào khoảng 300C, tuy nhiên hoạt tính của Bn thấp hơn BsTC nhưng không đáng kể. 3.2.1.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo pH Bảng 3.7. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo pH pH BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 2 0.722 0.014 0.844 0.0051 3 0.722 0.014 0.69 0.0163 4 0.721 0.0141 0.622 0.0213 5 0.631 0.0206 0.576 0.0247 6 0.41 0.0346 0.54 0.0273 7 0.498 0.0303 0.553 0.0263 8 0.692 0.0162 0.594 0.0233 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 2 3 4 5 6 7 8 pH H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.5. Sự biến thiên hoạt tính enzyme amylase của BsTC và Bn theo pH Nhận xét Trong điều kiện pH = 2 (dịch vị dạ dày), cả hai chủng giống đều có khả năng phân giải tinh bột của đậu hũ nhưng không cao, chúng đạt cực đại khi pH = 6. 3.2.1.4. Tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme amylase của BsTC và Bn Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành làm quy hoạch thực nghiệm, chọn các yếu tố ảnh hưởng với các giới hạn và miền khảo sát như ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Điều kiện thí nghiệm được chọn Yếu tố Các mức Khoảng Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme amylase thu được sau đo OD595. Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng Y = f (X1, X2, X3) Thiết lập ma trận thí nghiệm và thu được kết quả như bảng 3.9. Bảng 3.9. Ma trận và kết quả quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme amylase của BsTC và Bn Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y BsTC Bn 1 + + + 0.0421 0.024 2 + + - 0.0392 0.02 3 + - + 0.0343 0.016 4 + - - 0.0352 0.018 5 - + + 0.0278 0.018 6 - + - 0.0322 0.015 7 - - + 0.029 0.013 8 - - - 0.0325 0.014 9 0 0 0 0.0427 0.027 10 0 0 0 0.0438 0.029 11 0 0 0 0.0431 0.03 Y = 0.034 + 0.0037 X1+ 0.0013X2 - 0.00074X3 + 0.0017X1X2 + 0.001238X1X3 (1) Y = 0.01725 + 0.00225X1 + 0.002X2 (2) Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. Sau khi giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0.05, số bậc tự do f = 3-1 = 2, chúng tôi thu được phương trình hồi quy (1) của chủng BsTC và phương trình hồi quy (2) của Bn.. Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher với Ftính = 6.0516 (BsTC) , Ftính = 5.128 (Bn); F0.95(5.2) = 19.296. Do Ftính của cả hai phương trình hồi quy về hoạt tính chung amylase ở BsTC và Bn đều bé hơn F0.95(5.2) nên cả hai phương trình hồi quy đó đều tương thích với thực nghiệm. Mức dưới (-) Tâm (0) Mức trên (+) biến thiên BsTC Bn BsTC Bn BsTC Bn X1 : thời gian 24 28 28 32 32 36 4 X2 : nhiệt độ 25 25 30 30 35 35 5 X3 : pH 5 5 6 6 7 7 1 3.2.2. Kết quả khảo sát hoạt tính chung enzyme protease của BsTC và Bn 3.2.1.1. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme protease của BsTC, Bn theo thời gian Bảng 3.10. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo thời gian Thời gian (giờ) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 0 0,081 2.236 0.079 2.116 4 0,092 2.957 0.093 3.028 8 0,11 4.35 0.099 3.467 12 0,135 6.724 0.122 5.426 16 0,148 8.159 0.133 6.515 20 0,168 10.638 0.139 7.151 24 0,183 14.502 0.14 7.259 28 0,203 15.761 0.149 8.276 32 0,176 11.86 0.176 11.721 36 0,132 8.99 0.159 9.482 40 0,109 4.963 0.143 7.591 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Thời gian (giờ) H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.6. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo thời gian Nhận xét Hoạt tính protease của cả hai chủng giống đều tăng dần trong khoảng từ 12-32 giờ, sau đó giảm dần. Với BsTC, hoạt tính protease đạt cực đại ở 28 giờ còn Bn thì ở 32 giờ. Nhìn chung, hoạt tính protease của BsTC cao hơn của Bn. 3.2.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme protease của BsTC, Bn theo nhiệt độ Bảng 3.11. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo nhiệt độ Nhiệt độ (0C) BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 15 0.548 25.036 0.556 27.229 20 0.580 34.122 0.629 49.654 25 0.685 69.805 0.636 52.033 30 0.733 89.114 0.655 58.691 35 0.731 88.272 0.634 51.349 40 0.675 66.018 0.619 46.324 45 0.647 55.852 0.525 19.022 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 15 20 25 30 35 40 45 Nhiệt độ H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.7. Sự biến thiên hoạt tính protease của BsTC và Bn theo nhiệt độ Nhận xét Cả hai chủng giống đều cho hoạt tính protease cao nhất ở 300C nhưng hoạt tính chung protease của BsTC cao hơn đáng kể so với Bn. 3.2.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme protease của BsTC và Bn theo pH Bảng 3.12. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của BsTC và Bn theo pH pH BsTC Bn OD ĐVHT/gMT OD ĐVHT/gMT 2 0.028 0.04 0.031 0.087 3 0.029 0.055 0.032 0.105 4 0.061 0.964 0.032 0.105 5 0.07 1.37 0.06 0.923 6 0.081 1.957 0.068 1.274 7 0.079 1.843 0.072 1.47 8 0.071 1.419 0.057 0.805 0 0.5 1 1.5 2 2.5 2 3 4 5 6 7 8 pH H o ạ t tí n h ( Đ V H T /g M T ) Đồ thị 3.8. Sự biến thiên hoạt tính enzyme protease của BsTC và Bn theo pH Nhận xét Trong điều kiện pH thay đổi thì hoạt tính protease cũng thay đổi theo, đạt giá trị cực đại ở pH = 6 đối với BsTC và ở pH = 7 đối với Bn. 3.2.1.4. Tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme protease của BsTC và Bn Từ kết quả khảo sát từng yếu tố, chúng tôi tiến hành làm quy hoạch thực nghiệm khảo sát hoạt tính protease chung các yếu tố. Các giới hạn và miền khảo sát của các yếu tố như ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Điều kiện thí nghiệm được chọn Hàm mục tiêu Y là hoạt tính enzyme protease thu được sau đo OD660. Phương trình biểu diễn mối quan hệ có dạng Y = f (X1, X2, X3) Thiết lập ma trận thí nghiệm và thu được kết quả như bảng 3.14. Bảng 3.14. Ma trận và kết quả quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính chung enzyme protease của BsTC và Bn Mẫu thí nghiệm X1 X2 X3 Y BsTC Bn 1 + + + 1.19 2.01 2 + + - 2.72 2.07 3 + - + 1.92 2.12 4 + - - 3.78 2.141 5 - + + 1.95 1.058 6 - + - 2.206 1.534 7 - - + 1.95 1.649 8 - - - 2.272 1.708 9 0 0 0 4.579 2.206 10 0 0 0 4.461 2.344 11 0 0 0 4.45 2.549 Y = 2.2485 + 0.154X1 - 0.232X2 - 0.496X3 - 0.2155X1X2 - 0.3515X1X3 (3) Yếu tố Các mức Khoảng biến thiên Mức dưới (-) Tâm (0) Mức trên (+) BsTC Bn BsTC Bn BsTC Bn X1 : thời gian 24 28 28 32 32 36 4 X2 : nhiệt độ 25 25 30 30 35 35 5 X3 : pH 5 6 6 7 7 8 1 Y = 1.78625 + 0.299X1 (4) Ghi chú: (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. Sau khi giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0.05, số bậc tự do f = 3-1 = 2, chúng tôi thu được phương trình hồi quy (3) của chủng BsTC , (4) của Bn.. Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher với Ftính = 2.768 (BsTC) , Ftính = 4.558 (Bn); F0.95(5.2) = 19.296. Do Ftính < F0.95(5.2) nên cả hai phương trình hồi quy đều tương thích với thực nghiệm. Kết luận chung Qua kết quả khảo sát hoạt tính hệ enzyme của hai chủng BsTC và Bn, chúng tôi nhận thấy gần như cả hai hoạt tính amylase và protease của BsTC có phần trội hơn so với Bn trong điều kiện xét riêng từng yếu tố cũng như khi thiết lập ma trận quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hệ enzyme của hai chủng vi khuẩn trên. Điều này được giải thích, có lẽ BsTC là chủng giống được phân lập từ chao Việt Nam nên có khả năng thích nghi với điều kiện môi trường thí nghiệm tại Việt Nam cao hơn so với chủng Bn được phân lập từ sản phẩm nattospes của Nhật Bản. Do vậy, chúng tôi chọn BsTC để thủy phân đậu hũ tạo sản phẩm thức uống chức năng. 3.3. KẾT QUẢ CHẾ BIẾN SẢN PHẨM 3.3.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống và thời gian thủy phân đậu hũ hợp lý Bảng 3.15. Kết quả khảo sát tỉ lệ giống BsTC và thời gian thủy phân đậu hũ Thời gian Đặc điểm Tỷ lệ giống 0.5% 1% 2% 15 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Chưa nhuyễn 7.826 Chưa nhuyễn 9.127 Hơi nhuyễn 9.428 18 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Chưa nhuyễn Nhiễm Nhuyễn, béo, thơm 9.505 Nhuyễn, béo, hơi đắng 9.790 21 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Nhuyễn Nhiễm Nhuyễn, hơi đắng, nồng 9.77 Nhão, chát, nồng 10.04 24 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Hơi nhão, đắng, nồng Hỏng Nhão, đắng, nồng 10.11 Rất nhão, rất đắng, nồng 27 giờ - Cơ chất - BsTC (logCFU/g) Hôi, tạo khí, màu đen Rất đắng, nồng Rất đắng, nồng Kết luận Theo kết quả ghi nhận được, chúng tôi thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các tỉ lệ BsTC theo thời gian thủy phân khác nhau, cụ thể: - Với tỉ lệ BsTC 0.5%: + Mật độ tế bào chưa cao. + Quá trình thủy phân lâu, đến 21 giờ cơ chất mới nhuyễn. + Dễ hư do tạp nhiễm. - Với tỉ lệ BsTC 1%: + Mật độ tế bào thay đổi tăng dần trong khoảng 18-24 giờ. + Quá trình thủy phân nhanh hơn, ít nhiễm. + Đến 21 giờ cơ chất bắt đầu bị đắng. Vậy, chúng ta nên ngừng thủy phân ở 18 giờ. - Với tỉ lệ BsTC 2%: + Số lượng tế bào cũng tăng đáng kể từ 15-21 giờ. + Quá trình thủy phân nhanh hơn so với tỉ lệ BsTC 1%, mùi đậu hũ thủy phân nhanh nồng hơn và vị đắng hơn. Như vậy, để đảm bảo giá trị cảm quan, đảm bảo sản phẩm thức uống chức năng không bị đắng do đậu hũ thủy phân quá mức, chúng tôi ngừng thủy phân đậu hũ ở 18 giờ với tỉ lệ giống BsTC 1%. 3.3.2. Kết quả khảo sát khả năng bảo quản của Lactobacillus sp. Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng vi khuẩn lactic để bảo quản sản phẩm, vừa đảm bảo sản phẩm không có chất bảo quản hóa học, vừa tăng yếu tố probiotic. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng bảo quản sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân với các tỉ lệ Lactibacillus sp. khác nhau cùng các tỉ lệ đường saccharose khác nhau và thu được kết quả như bảng 3.16. Bảng 3.16. Kết quả khảo sát khả năng bảo quản của Lactobacillus sp. đối với cơ chất đậu hũ thủy phân bởi BsTC Tỉ lệ saccharose (%) Đặc điểm Bảo quản ở nhiệt độ phòng Bảo quản trong tủ lạnh Tỉ lệ Lactobacillus sp. (%) 0% 1% 2% 0% 1% 2% 0% - Số ngày bảo quản - Tình trạng cơ chất 1 Lỏng, đắng, hôi. 7 Hơi chua, vị đắng. 10 Sệt, chua. 2 Lỏng, hơi đắng. 15 Hơi chua, chát. 30 Chua, nồng, bọt khí. 1% -Thời gian bảo quản - Tình trạng cơ chất 1 Lỏng, đắng, nồng. > 30 Sánh, chua nhẹ, chát. > 90 Sệt, chua nhẹ, thơm. 2 Lỏng, chát. > 60 Sánh, chua, hơi nồng. > 180 Sệt, chua nhẹ, thơm. 2% -Thời gian bảo quản - Tình trạng cơ chất 1 Lỏng, đắng, nồng. > 30 Sánh, chua nồng, đắng. > 90 Sệt, bọt khí, phân lớp. 2 Lỏng, đắng, hơi nồng. > 60 Sánh, chua nồng, chát. > 180 Sệt, chua, phân lớp Kết luận - Đậu hũ thủy phân bởi 1% BsTC có thể không bị tạp nhiễm trong vòng 24-30 giờ ở nhiệt độ phòng nhưng sau khoảng hơn 36 giờ thì dễ bị tạo khí, mùi hôi. - Thời gian bảo quản sản phẩm sẽ tăng lên nhiều nếu ta kết hợp bổ sung Lactobacillus sp. (để tạo acid lactic, làm môi trường acid hơn kìm hãm hoạt động của BsTC), đường saccharose (cơ chất cho Lactobacillus sp.) và bảo quản trong điều kiện lạnh (nhiệt độ tủ lạnh). - Như vậy, theo kết quả ở bảng 3.16 điều kiện nên chọn để vừa đảm bảo thời gian bảo quản lâu, vừa đảm bảo giá trị cảm quan của sản phẩm: + Tỉ lệ Lactobacillus sp. 2%. + Tỉ lệ đường saccharose 1%. + Bảo quản trong tủ lạnh. 3.3.3. Kết quả khảo sát nồng độ phụ gia 3.3.3.1. Hương phomai Bảng 3.17 . Kết quả khảo sát nồng độ hương phomai Tỉ lệ hương 0/00 (v/w) 10/00 (Mẫu A) 20/00 (Mẫu B) 30/00 (Mẫu C) 40/00 (Mẫu D) Đặc điểm được mô tả Không át được mùi đậu hũ lên men Mùi thơm nhẹ hương phomai, dễ chịu. Mùi phomai hơi gắt. Mùi nồng khó chịu. Số người chọn 0 14/15 1/15 0 Vậy, kết quả “đồng thuận” chung của 3 nhóm là chọn mẫu B, tương đương tỉ lệ hương phomai bổ sung vào sản phẩm là 20/00, sản phẩm sẽ có mùi thơm nhẹ của hương phomai, dễ chịu. 3.3.3.2. Đường aspartam Bảng 3.18. Kết quả khảo sát nồng độ đường aspartam Tỉ lệ đường aspartam 0/00 (mg/g) 0,350/00 (1 gói) (Mẫu A) 0,70/00 (2 gói) (Mẫu B) 1,050/00 (3 gói) (Mẫu C) 1,40/00 (4 gói) (Mẫu D) Đặc điểm được mô tả Ít ngọt Ngọt vừa Ngọt Quá ngọt Số người chọn 0 13/15 2/15 1/15 Kết quả “đồng thuận” chung của 3 nhóm chọn mẫu B, tương đương tỉ lệ đường aspartam bổ sung là 0,70/00 (2 gói) thì sản phẩm sẽ có vị ngọt vừa, dễ sử dụng. 3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG SẢN PHẨM Ký hiệu mẫu phân tích: M0: nguyên liệu M1: sau khi xử lý với B.subtilis 18 giờ M2: sản phẩm sau 3 ngày M3: sản phẩm sau 10 ngày M4: sản phẩm sau 20 ngày M5: sản phẩm sau 30 ngày 3.4.1. Độ ẩm (%) Bảng 3.19. Chỉ tiêu độ ẩm Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Độ ẩm 84 86.2 89 83.32 80.53 80 74 76 78 80 82 84 86 88 90 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ộ ẩ m ( % ) Đồ thị 3.9. Sự biến đổi độ ẩm theo thời gian Nhận xét Độ ẩm tăng cao hơn sau khi xử lý giống vì khi cấy giống vào ở dạng dung dịch (dung dịch BsTC và dung dịch lactic). Sau đó, hàm lượng ẩm giảm dần theo thời gian do hoạt động sống của vi sinh vật cần nước nên làm hao hụt nước trong sản phẩm, đồng thời một phần nước của sản phẩm bốc hơi theo thời gian. 3.4.2. Đạm tổng (%) Bảng 3.20. Chỉ tiêu đạm tổng Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đạm tổng (%) 6.47 5.64 5.17 4.72 3.07 2.43 0 1 2 3 4 5 6 7 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ạ m t ổ n g ( % ) Đồ thị 3.10. Sự biến đổi đạm tổng số của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đạm tổng số của các sản phẩm giảm dần theo thời gian do các vi sinh vật sử dụng đạm cho hoạt động sống của chúng. 3.4.3. Đạm formol (%) Bảng 3.21. Chỉ số đạm formol Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đạm formol (%) 0.21 0.28 0.43 0.64 0.85 0.96 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ạ m f o rm o l (% ) Đồ thị 3.11. Sự biến đổi đạm formol của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đạm formol trong mẫu tăng dần theo thời gian do các hoạt động thủy phân protein của BsTC. Ta thấy, hàm lượng protein thủy phân chưa cao (Nformol/NTS <0,5). 3.4.4. Đạm amoniac (%) Bảng 3.22. Chỉ số đạm amoniac Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đạm amoniac 0.077 0.081 0.132 0.256 0.418 0.425 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ạ m a m o n ia c ( % ) Đồ thị 3.12. Sự biến đổi đạm amoniac của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đạm amoniac tăng dần do các vi sinh vật chuyển hóa protein thành các acid amin và giải phóng một phần NH3. Tuy nhiên, tỉ lệ Namoniac/Nformol rất thấp (<0,5), vẫn còn trong mức cho phép, không ảnh hưởng chất lượng sản phẩm. 3.4.5. Đường tổng (%) Bảng 3.23. Chỉ số đường tổng 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ư ờ n g t ổ n g ( % ) Đồ thị 3.13. Sự biến đổi đường tổng của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đường tổng giảm hơn ½ sau 30 ngày và giảm dần theo thời gian do các vi sinh vật sử dụng lượng đường này cho các hoạt động sống của chúng. Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đường tổng 1.368 0.982 0.796 0.678 0.521 0.493 3.4.6. Đường khử (%) Bảng 3.24. Chỉ tiêu đường khử Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Đường khử (%) 0.214 0.225 0.250 0.276 0.349 0.367 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu Đ ư ờ n g k h ử ( % ) Đồ thị 3.14. Sự biến đổi đường khử của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng đường khử đều tăng theo thời gian do hoạt động của hệ enzyme amylase của BsTC phân giải tinh bột trong đậu hũ tạo đường glucose cho hoạt động sống của chúng. 3.4.7. Hàm lượng lipid Bảng 3.25. Chỉ số hàm lượng lipid Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Lipid 26.91 25.43 23.59 22.17 21.65 20.08 0 5 10 15 20 25 30 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu L ip id Đồ thị 3.15. Sự biến đổi hàm lượng lipid của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Hàm lượng chất béo của các sản phẩm đều ở mức khá cao, giảm dần do các vi sinh vật sử dụng để lấy năng lượng cho hoạt động sống của chúng và phân giải lipid thành các acid béo, tạo mùi đậu hũ đặc trưng. 3.4.8. Chỉ số peroxyde Bảng 3.26. Chỉ số peroxide Mẫu M0 M1 M2 M3 M4 M5 Chỉ số peroxyde 0.324 0.320 0.309 0.280 0.247 0.201 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Mẫu C h ỉ s ố p e ro x y d e Đồ thị 3.16. Sự biến đổi chỉ số peroxide của sản phẩm theo thời gian Nhận xét Lượng chất béo bị oxy hóa rất thấp, hoàn toàn nằm trong mức cho phép (< 5,0 đơn vị). Như vậy, khả năng chống oxy hóa của sản phẩm được đảm bảo bởi các chủng vi sinh vật đã được sử dụng. 3.4.9. Kết quả định lượng bào tử BsTC trong sản phẩm Theo kết quả thực nghiệm và tính toán, chúng tôi định lượng trong 1g sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ có khoảng 6,2.108 lượng bào tử của BsTC. 3.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN SẢN PHẨM 3.5.1. Đặc điểm cảm quan sản phẩm - Màu sắc: trắng như đậu hũ non. - Mùi: có mùi thơm của hương phomai. - Vị: ngọt vừa của đường aspartam bổ sung vào, béo của đậu hũ lên men. - Hình thái: mịn, đồng nhất, sệt, không bọt khí, cơ chất không rạn nứt. Hình 3.15. Sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ lên men 3.5.2. Kết quả đánh giá sản phẩm Bảng 3.27. Phân phối thí nghiệm Điểm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Số người 0 0 5 9 17 34 18 15 2 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 3 4 5 6 7 8 9 Xi fi /1 0 0 Đồ thị 3.17. Kết quả phân phối tần suất Bảng 3.28. Bảng các tham số đặc trưng Các tham số n - X ± m Cv% Giá trị 100 6.04 ± 0.03464 0.06% Kết luận Qua thực nghiệm đánh giá cảm quan, ta thấy mức độ ưa thích cũng như sự hài lòng của người thử đối với sản phẩm nằm trong khoảng 6.04 ± 0.03464, tương đương điểm 6 trong bảng điểm là tương đối thích. Điều này cũng dễ hiểu vì đây là sản phẩm mới, còn lạ với người tiêu dùng, cũng có thể do nhiều vấn đề khác như: thói quen tiêu dùng, sở thích, lứa tuổi, … nên mức độ ưa thích chưa cao. Tuy nhiên, cũng không đến mức độ không thích vì đây là sản phẩm có nguồn nguyên liệu là đậu hũ, là nguyên liệu quen thuộc của người Việt Nam nên nó dễ được chấp nhận. Kết quả thực nghiệm rất đáng tin cậy vì có hệ số biến thiên Cv% bé. CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN  Khảo sát hệ enzyme của hai chủng vi khuẩn BsTC và Bn trong điều kiện riêng biệt (thời gian, nhiệt độ, pH). Sau đó, khảo sát trong điều kiện tối ưu của cả 3 yếu tố theo quy hoạch thực nghiệm. Kết quả, chọn BsTC để làm sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic.  Xây dựng được quy trình chế biến thức uống chức năng từ đậu hũ nhờ Bacillus subtilis sp. thủy phân và lên men bởi Lactobacillus sp..  Khảo sát và xác định được một số thông số cần thiết cho quá trình chế biến sản phẩm: + Sử dụng 1% giống Bacillus subtilis sp. + Thời gian thủy phân cơ chất đậu hũ trong 18 giờ. + Bảo quản với 2% giống Lactobacillus sp. có bổ sung 1% đường saccharose và bảo quản trong tủ lạnh. + Bổ sung 20/00(v/w) hương phomai, 0,7 0/00(mg/g) đường aspartam để tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm.  Xác định được lượng bào tử BsTC có trong 1 gam sản phẩm là 6,2.10 8.  Sơ bộ đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp cho điểm thị hiếu trên mẫu 100 người, cho kết quả điểm trung bình 6.04 - tương đối thích.  Xác định được các chỉ tiêu dinh dưỡng quan trọng của sản phẩm. 4.2. ĐỀ NGHỊ Do thời gian và điều kiện có hạn nên chúng tôi vẫn chưa khảo sát trọn vẹn và đầy đủ hơn các thông số liên quan đến quá trình chế biến sản phẩm. Vì vậy, chúng tôi có một số kiến nghị sau:  Khảo sát thêm hoạt tính protease trong việc thủy phân fibrin để khẳng định thêm giá trị probiotic của sản phẩm.  Khảo sát thêm một số hương liệu khác như hương táo, hương dâu, hương sầu riêng, … để chọn hương có giá trị cảm quan cao nhất.  Đánh giá cảm quan sản phẩm chi tiết hơn ở các đặc điểm: màu, mùi, vị, ngoại hình, …  Nghiên cứu lâm sàng để chứng tỏ những lợi ích cho sức khỏe khi sử dụng thức uống chức năng đậu hũ, và khẳng định sản phẩm này được xếp vào là thực phẩm chức năng.  Ứng dụng vào sản xuất quy mô lớn hơn (quy mô pilot và sản xuất thử). Với các kiến nghị trên, chúng tôi hy vọng phương pháp chế biến thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic ngày càng hoàn thiện hơn. Đồng thời tạo thêm sản phẩm có nhiều chức năng dinh dưỡng, có lợi cho sức khỏe người sử dụng. Và góp phần nâng cao giá trị kinh tế của đậu nành. TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu tiếng Việt: [1] Nguyễn Cảnh (1994), Quy hoạch thực nghiệm, Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. [2] Phạm Thị Trân Châu, Thực hành sinh hóa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. [3] Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hường, Phùng Gia Tường (1997), Thực tập lớn hóa sinh, Nhà xuất bản giáo dục, Hà Nội. [4] Nguyễn Hoàng Dũng (2005), Giáo trình thực hành đánh giá cảm quan, Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội. [6] Lê Hoàng Độ (1997), Cây đậu nành, NXB Khoa học kỹ thuật. [7] Vũ Văn Độ, Lê Chiến Phương, Lê Duy Thắng (2004), Nghiên cứu tận dụng bã đậu nành bằng phương pháp lên men xốp bởi nấm sợi Linh Chi (Ganoderma lucidum) và Bào Ngư (Pleurotuy florida) dùng trong chế biến thực phẩm, Viện Sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh. [8]. Giáo sư NX.Êgôrôp hiệu đính, người dịch PGS Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học, NXB Mir Maxcơva, NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. [9] Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS_Excel, NXB Giáo dục.. [10] Lê Độ Hoàng, Đặng Trần Phú, Nguyễn Uyển Tâm, Nguyễn Xuân Hiển (1997), Tư liệu về cây đậu tượng, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. [11] Phạm Thị Ánh Hồng , Kỹ thuật sinh hóa, NXB Kỹ thuật, Hà nội. [12] Nguyễn Đình Huyên và cộng sự, Giáo trình thực tập lớn sinh hóa, trường Đại học Tổng hợp, TPHCM. [13] Nguyễn Đức Lượng chủ biên (2004), Công nghệ enzyme, Đại học Quốc gia TP.HCM, trường ĐH Bách Khoa, NXB Đại học Quốc gia, TPHCM. [14] Nguyễn Đức Lượng chủ biên (2003), Thực tập Công nghệ sinh học, tập 2 – Thí nghiệm vi sinh vật học, Trường Đại học Quốc gia TPHCM, trường ĐH Bách Khoa, NXB Đại học Quốc gia, TPHCM. [15] Nguyễn Đức Lượng (2006), Công nghệ vi sinh - Tập 3: Thực phẩm lên men truyền thống, NXB ĐHQG, TP HCM. [16] Lê Văn Việt Mẫn (2004), Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống - Tập 1: Công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa, NXB ĐHQG, TP HCM. [17] Lê Văn Việt Mẫn (chủ biên), Lại Mai Hương (2006), Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, NXB ĐHQG, TP HCM. [18] Nguyễn Văn mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Kỹ thuật, Hà Nội. [19] Đồng Thị Thanh Thu (2000), Sinh hóa ứng dụng, NXB ĐHQG, TP HCM. [20] Lê Chiến Phương, Võ Thanh Trang (2007), Nghiên cứu chế biến phomai đậu nành, tóm tắt kỷ yếu hội nghị khoa học và công nghệ, Viện sinh học Nhiệt đới, TPHCM. [21]Trần Linh Thước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục, TPHCM. [22] Hà Duyên Tư, Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm, , NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội. II. Tài liệu tiếng Anh [23] Elina Tuomola, Ross Grittenden, Martin Playne, Erika Isolauri, and Seppo Salmine, Quality assurance criteria for probiotic bacteria, The American Journal of Clinial Nutrition, 2001. [24] E.M.EL-Safey, U.M.Abdul-Raouf (2004), “Production, purification and charaterization ofprotease enzyme from B .subtilis”, International conferences for development and the enviroment in the Arab world, Assiut University, 14. [25] KeShun Liu (2004), Soybean as Functional Foods and Ingredients, AOCS Press. [26] KeShun Liu (1999), Soybean: Chemistry, Technology & Utilization, An Aspen Publication. [27] Peter Golbitz and Joe Jordan (2006), Soy Application in Food, Chapter 1 - Soyfoods: Market and Products, Published by CRC Press Taylor & Francis Group. [28] John G.Holt, Noel R.Knieg, Peter H.A.Sneath, James T. Staley, Stanky T.Williams, Bergey’s Manual of Determinative bacteriology, Ninth edition. [29] Soomro, AH, T.Masud, Kiran Anwaar (2002) “Role of Lactic acid bacteria (LAB) in food preservation and human health-A review”, Pakistan Journal of Nutrition (1), 20-24. [30] S. Parvez, K.A.Mlik, S.AH, Kang & H.Y.Kim (2006), Probiotics and their fermented food products are beneficial for health, Journal of Applied Microbiology. [31] Stephen A.Norrell, Karen E.Mesley (1997), Microbiology Laboratory Manual, principles and applications, Prentice Hall Inc., New Jersey. [32] Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO) (1999), Technology of production edible flours and protein from soybeans - Chater 1: The soybean. III. Tài liệu internet [33] [34] [35] [36] [37] PHỤ LỤC 1. Một số thành phần môi trường dùng trong thực nghiệm * Môi trường CP (Cá peptone) Nước mắn 300N 20 ml Peptone 10 g Agar 20 g Nước cất 1000 ml * Môi trường sữa đậu nành Sữa đậu nành tỷ trọng 1.01 Đường saccharose 3 % * Môi trường Czapek-Dox NaNO3 3.5g K2HPO4 1.5g MgSO4 0.5g KCl 0.5g FeSO4 0.1g Đường kính 30g Agar 20g Nước 1000ml pH 6.5 - Xác định vòng phân giải amylase Môi trường Czapek-Dox bổ sung 1% dung dịch tinh bột 1%. - Xác định vòng phân giải protease Môi trường Czapek-Dox bổ sung 1% dung dịch casein 1%. - Xác định vòng phân giải fibrin Môi trường Czapek-Dox bổ sung 1% dung dịch fibrin 1%. 2. Một số phương trình đường chuẩn dùng trong đề tài * Phương trình đường chuẩn tyrosine: Đường chuẩn tyrosine y = 0.0049x - 0.0046 R 2 = 0.9994 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Nồng độ tyrosine (MicroG/ml) O D * Phương trình đường chuẩn của đường tổng: Đồ thị chuẩn dùng để định lượng đường tổng số y = 0.0089x + 0.0123 R 2 = 0.9927 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nồng độ đường (MicroG/ml) O D * Phương trình đường chuẩn của đường khử: Đồ thị chuẩn dùng để định lượng đường khử y = 0.0283x + 0.0135 R 2 = 0.9987 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Nồng độ đường (MicroG/ml) O D 2. Một số hình ảnh nuôi cấy BsTC Sau 24 gi, BsTC to màng sinh khi nhn trên b mt sa BsTC sinh bào t màu đen trên màng sinh khi. Sau 3 ngày, lp màng sinh khi tan 4. Phụ lục kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính hệ enzyme của BsTC và Bn Bảng 1. Kết quả đo OD xác định hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo thời gian với độ pha loãng 100 lần và thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thời gian (giờ) Bacillus subtilis sp. Bacillus natto sp. 1 2 3 1 2 3 0 1.019 1.068 1.045 1.061 1.078 1.011 4 1.102 1.009 0.945 0.914 1.096 1.025 8 1.008 1.058 0.934 0.815 0.974 0.945 12 0.944 1.043 0.976 0.841 0.898 0.967 16 0.819 0.901 0.825 0.916 0.883 0.827 20 0.77 0.747 0.797 0.878 0.857 0.809 24 0.607 0.638 0.625 0.697 0.723 0.75 28 0.487 0.509 0.49 0.798 0.683 0.801 32 0.589 0.602 0.605 0.502 0.615 0.697 36 0.774 0.709 0.712 0.701 0.698 0.633 40 0.814 0.845 0.845 0.934 0.937 0.926 ĐC 1.377 1.209 1.278 1.377 1.209 1.278 Bảng 2. Kết quả đo OD xác định hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo nhiệt độ với độ pha loãng 100 lần và thí nghiệm lặp lại 3 lần. Nhiệt độ (0C) Bacillus subtilis sp. Bacillus natto sp. 1 2 3 1 2 3 15 0.073 0.064 0.061 0.103 0.097 0.126 20 0.05 0.058 0.044 0.035 0.159 0.122 25 0.044 0.047 0.032 0.082 0.092 0.085 30 0.041 0.033 0.038 0.079 0.073 0.069 35 0.043 0.047 0.03 0.08 0.071 0.076 40 0.042 0.038 0.049 0.097 0.093 0.053 45 0.044 0.04 0.074 0.263 0.073 0.032 ĐC 0.098 0.087 0.094 0.177 0.178 0.182 Bảng 3. Kết quả đo OD xác định hoạt tính amylase của BsTC và Bn theo pH với độ pha loãng 100 lần và thí nghiệm lặp lại 3 lần. pH Bacillus subtilis sp. Bacillus natto sp. 1 2 3 1 2 3 2 0.778 0.64 0.748 0.914 0.891 0.727 3 0.769 0.716 0.68 0.664 0.663 0.743 4 0.744 0.706 0.713 0.63 0.627 0.609 5 0.689 0.644 0.559 0.664 0.67 0.394 6 0.433 0.431 0.456 0.433 0.631 0.556 7 0.516 0.4 0.578 0.545 0.547 0.567 8 0.693 0.664 0.72 0.597 0.496 0.69 ĐC 0.883 0.828 1.032 0.883 0.828 1.032 Bảng 4. Kết quả đo OD xác định hoạt tính protease của BsTC và Bn theo thời gian, với độ pha loãng 100 lần và thí nghiệm lặp lại 3 lần. Thời gian (giờ) Bacillus subtilis sp. Bacillus natto sp. 1 2 3 1 2 3 0 0.074 0.09 0.079 0.08 0.077 0.079 4 0.088 0.096 0.092 0.089 0.096 0.094 8 0.092 0.122 0.117 0.097 0.101 0.098 12 0.121 0.159 0.124 0.097 0.119 0.149 16 0.14 0.138 0.167 0.141 0.128 0.129 20 0.172 0.171 0.162 0.127 0.147 0.143 24 0.187 0.182 0.215 0.138 0.145 0.136 28 0.207 0.193 0.209 0.14 0.148 0.159 32 0.178 0.175 0.179 0.175 0.166 0.186 36 0.16 0.153 0.152 0.157 0.162 0.159 40 0.121 0.119 0.11 0.143 0.148 0.137 ĐC 0.011 0.017 0.024 0.011 0.017 0.024 Bảng 5. Kết quả đo OD xác định hoạt tính protease của BsTC và Bn theo nhiệt độ, với độ pha loãng 100 lần và thí nghiệm lặp lại 3 lần. Nhiệt độ (0C) Bacillus subtilis sp. Bacillus natto sp. 1 2 3 1 2 3 15 0.423 0.677 0.544 0.586 0.559 0.522 20 0.522 0.675 0.542 0.591 0.7 0.595 25 0.579 0.802 0.673 0.701 0.567 0.641 30 0.735 0.731 0.732 0.681 0.619 0.664 35 0.732 0.733 0.728 0.645 0.702 0.554 40 0.68 0.671 0.675 0.683 0.651 0.524 45 0.648 0.654 0.639 0.531 0.501 0.544 ĐC 0.451 0.425 0.436 0.451 0.425 0.436 Bảng 6. Kết quả đo OD xác định hoạt tính protease của BsTC và Bn theo pH, với độ pha loãng 100 lần và thí nghiệm lặp lại 3 lần. pH Bacillus subtilis sp. Bacillus natto sp. 1 2 3 1 2 3 2 0.026 0.029 0.03 0.034 0.033 0.027 3 0.03 0.029 0.028 0.03 0.033 0.032 4 0.065 0.059 0.058 0.031 0.03 0.034 5 0.067 0.07 0.072 0.058 0.052 0.058 6 0.08 0.081 0.082 0.063 0.068 0.074 7 0.078 0.081 0.079 0.078 0.069 0.068 8 0.072 0.071 0.07 0.06 0.058 0.052 ĐC 0.025 0.02 0.031 0.025 0.02 0.031 5. Phụ lục kết quả xử lý số liệu quy hoạc thực nghiệm Bảng 7. Kết quả các tham số Các tham số PTHQ (1) PTHQ (2) PTHQ (3) PTHQ (4) y 0.0432 0.02866667 4.496667 2.366333 Phương sai tái hiện sth 2 0.00000021 0.00000156 0.00341 0.019858 Phương sai các hệ số sbj 0.00016 0.00044159 0.020644 0.049822 b0 0.0340375 0.01725 2.2485 1.78625 b1 0.0036625 0.00225 0.154 0.299 b2 0.0012875 0.002 -0.232 -0.11825 b3 -0.0007375 0.0005 -0.496 -0.077 b12 0.0016625 0.0005 -0.2155 0.073 b13 0.0012375 0 -0.3515 0.05675 b123 0.0003625 0.00125 0.0495 -0.057 t0 210.084 39.06356 108.9153 35.8529 t1 22.60544 5.095247 7.459617 6.001409 t2 7.946623 4.529108 11.23786 2.373467 t3 4.551949 1.132277 24.02578 1.545513 t12 10.26117 1.132277 10.43862 1.465227 t13 7.638016 0 17.02633 1.139063 t123 2.237399 2.830693 2.397734 1.144081 s2tt 1.27083E-06 8E-06 0.009438 0.090515 F 6.051587302 5.128205128 2.768099 4.558222 6. Các mẫu phiếu đánh giá cảm quan Phiếu 1 . Phiếu trả lời của phép thử mô tả mùi PHIẾU TRẢ LỜI PHÉP THỬ MÔ TẢ MÙI Họ và tên: Nhóm: Ngày thử: Bạn nhận được 4 mẫu thử thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic, được kí hiệu A, B, C, D. Bạn hãy ngửi, mô tả, chọn ra sản phẩm có mùi mà bạn thích. Từ đó đưa ra kết quả đồng thuận cả nhóm. Trả lời: ................................................................................................................. Phiếu 2 . Phiếu trả lời của phép thử mô tả vị PHIẾU TRẢ LỜI PHÉP THỬ MÔ TẢ VỊ Họ và tên: Nhóm: Ngày thử: Bạn nhận được 4 mẫu thử thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic, được kí hiệu A, B, C, D. Bạn hãy nếm, mô tả, chọn ra sản phẩm có vị mà bạn thích. Từ đó đưa ra kết quả đồng thuận cả nhóm. Trả lời: ................................................................................................................. Lưu ý: dùng nước và bánh mỳ thanh vị sau mỗi lần thử. Phiếu 3. Phiếu trả lời của phép thử cho điểm thị hiếu PHIẾU TRẢ LỜI PHÉP THỬ CHO ĐIỂM THỊ HIẾU Họ và tên: Giới tính: Tuổi: Ngày thử: Bạn nhận được 1 mẫu sản phẩm thức uống chức năng từ đậu hũ thủy phân lên men lactic. Bạn vui lòng nếm và cho biết cảm nhận của mình về sản phẩm theo các mức độ của thang điểm sau: 1. Cực kỳ không thích 6. Tương đối thích 2. Rất không thích 7. Thích 3. Không thích 8. Rất thích 4. Tương đối không thích 9. Cực kỳ thích 5. Không thích cũng không ghét Khoanh tròn câu trả lời vào thang điểm trên. Cảm ơn bạn đã hợp tác. 7. Quy trình công nghệ sản xuất đậu hũ [10] Đậu nành (Vo, loại bỏ rác, sạn) Na2CO3 Ngâm và nước Đãi vỏ Nước Xay ướt Chất phá Dịch sữa đậu thô bọt và Na2CO3 H2O Lọc thô bã 1 rửa bã lọc bã 2 Lọc tinh dịch sữa Sữa đậu Làm thức ăn gia súc Đun sôi bã 3 Nước chua Kết tủa Chắt Nước Hoa đậu ép bánh đậu phụ (Cho gia súc)