Luận văn Tạo virus cúm A tái tổ hợp mang gene NA của chủng H5N1 Việt Nam bằng kỹ thuật di truyền ngược

Tổng quan tài liệu Phaàn 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU Tổng quan tài liệu 2 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam 1. Tổng quan tài liệu 1.1 Tình hình dịch tễ virus cúm A Trong suốt thế kỷ XX, virus cúm A đã gây ra nhiều trận dịch với các mức độ thiệt hại khác nhau cho người và gia cầm, một vài trận trong số đó phát triển thành đại dịch. Đại dịch cúm xảy ra thường để lại hậu quả nặng nề, thậm chí làm xáo trộn xã hội. Các virus cúm gây ra đại dịch thường là chủng virus mới, xa lạ với hệ thống miễn dịch của người và gia cầm, mà các virus mới này chủ yếu là do sự tái sắp xếp (reassortment) các protein bề mặt HA, NA hoặc protein bên trong của các chủng virus giữa người và gia cầm sinh ra. Đại dịch “cúm thế kỷ” H1N1 năm 1918 ban đầu xuất hiện ở Tây Ban Nha (nên còn gọi là “cúm Tây Ban Nha” – Spanish flu) sau đó nhanh chóng lan rộng ra toàn thế giới làm thiệt mạng ước tính từ 50 đến 100 triệu người (riêng ở Hoa Kỳ là 675.000 người), là một ví dụ điển hình nhất về tính khốc liệt [41]. Sau đó, đại dịch “cúm Châu Á” (Asian flu) H2N2 năm 1957 và đại dịch “cúm HongKong” (HongKong flu) H3N2 năm 1968 làm thiệt mạng chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ là 70.000 và 34.000 người, đều là các chủng virus đã có sự tái sắp xếp hai kháng nguyên bề mặt HA và NA [32]. Năm 1983 trận dịch do chủng H5N2 gây ra ở bang Pennsylvania (Hoa Kỳ) làm thiệt mạng hơn 17 triệu gia cầm, phải mất hơn hai năm để khống chế dịch bằng việc tiêu hủy và cách ly mầm bệnh, làm thiệt hại hơn 300 triệu đôla cho ngành công nghiệp [13]. Năm 1997, lần đầu tiên virus H5N1 lây nhiễm sang cho người ở HongKong làm 6 người thiệt mạng trong số 18 người nhiễm bệnh. Hầu hết những người bị bệnh này trước đó một tuần đều có sự tiếp xúc với gia cầm sống bán ở chợ. Để ngăn cản quá trình lan rộng của dịch, các nhà chức trách đã cho tiêu hủy 1,4 triệu gia cầm chỉ trong vòng ba ngày [65]. Theo các số liệu nghiên cứu từ năm 1959 đến năm 2006 cho thấy, tần suất dịch cúm A xảy ra ngày càng thường xuyên hơn, từ 3,09 năm xuống còn 0,83 năm một trận [3]. Đặc biệt, cuối năm 2003 đến năm 2005 dịch cúm H5N1 HPAI xảy ra ở Châu Á (Asia) và nhanh chóng lan rộng cho hơn 60 quốc gia trên toàn thế giới bao gồm Đông Nam Á (South-East Asia), Trung Đông (Middle East), Châu Âu (Europe) và Châu Phi (Africa). Có ba nguyên nhân chính cho sự lan truyền nhanh Tổng quan tài liệu 3 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam chóng này: sự di trú của các loài vịt, ngỗng, thiên nga trong tự nhiên; sự giao thương buôn bán gia cầm hay các loài chim hoang dã giữa các quốc gia [33, 65]. Theo FAO, tổng thiệt hại về kinh tế chỉ riêng vùng Đông Nam Á trong đợt dịch này ước tính khoảng 10 tỉ đôla [19]. Hình 1.1. Sự lan truyền của chủng H5N1 ở các quốc gia Châu Á, Châu Âu và Châu Phi vào cuối năm 2005 [33]. Từ tháng 11/2003 đến tháng 5/2009, theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới đã có 261 trường hợp tử vong trong số 424 ca dương tính với chủng virus cúm A độc lực cao H5N1 của 15 quốc gia: Azerbaijan, Bangladesh, Cambodia, China, Djibouti, Egypt, Indonesia, Iraq, Laos, Myanmar, Nigeria, Pakistan, Thailand, Turkey, và Việt Nam. Tỉ lệ tử vong trung bình là 60%. Việt Nam là một trong những nước chịu thiệt hại nặng nề nhất trong đợt dịch này trong vùng Đông Nam Á. Kể từ cuối năm 2003 đến nay (trừ năm 2006), năm nào Việt Nam cũng có người tử vong vì cúm gia cầm H5N1 với 56 trường hợp trong số 111 ca dương tính. Ngay từ đầu năm 2004 đã có 58 trên tổng số 64 tỉnh Tổng quan tài liệu 4 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam thành bị dịch cúm tấn công và phải tiêu hủy hơn 44 triệu gia cầm các loại, tổng thiệt hại kinh tế ước tính hơn 200 triệu đôla [19]. Hình 1.2. Các quốc gia có người tử vong do virus H5N1 từ năm 2003 đến tháng 5/2009. Điều này cho thấy cúm gia cầm luôn là mối đe dọa thường trực không chỉ cho ngành công nghiệp gia cầm mà còn đối với sức khỏe cộng đồng. Mối quan ngại lớn nhất hiện nay là liệu virus H5N1 này có thể nhiễm từ người sang người không? Những nghiên cứu hiện tại cho thấy chưa có bằng chứng rõ rệt nào để khẳng định điều này và cũng còn nhiều câu hỏi chưa trả lời được về việc virus H5N1 lây nhiễm cho người. Tuy nhiên, virus cúm H5N1 vẫn tiếp tục tiến hóa và lưu hành giữa các loài gia cầm tại rất nhiều quốc gia trên thế giới, vì vậy nguy cơ về một đại dịch cúm H5N1 khác vẫn luôn là mối đe dọa tiềm ẩn. Tổng quan tài liệu 5 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Hình 1.3. Biểu đồ biểu diễn số ca tử vong do virus H5N1 theo từng năm tại Việt Nam. ( 1.2 Đại cương về virus cúm A 1.2.1 Phân loại và cách đọc tên Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bộ gene là RNA mạch đơn (-), và được chia thành 4 type chính: Virus cúm A, B, C và Thogovirus (đôi khi còn gọi là virus cúm D) dựa trên sự khác nhau của các kháng nguyên protein Nucleocapsid (NP) và Matrix (M) của chúng [34]. Trong đó, virus cúm A được phân chia thành các thứ type (subtype) dựa trên 2 kháng nguyên bề mặt glycoprotein của chúng là Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA), các thứ type này khác nhau khoảng từ 30% hay hơn trong trình tự axít amin [59]. Cho đến nay, có 16 kháng nguyên HA và 9 kháng nguyên NA đã được xác định. Sự kết hợp giữa các kháng nguyên HA và NA sẽ tạo ra các thứ type virus cúm A khác nhau [23]. Virus cúm A lây nhiễm cho gia cầm được chia thành hai nhóm gồm: nhóm virus cúm A độc lực cao (highly pathogenic avian Influenza – HPAI) với mức độ độc tính gây tử vong trên gia cầm gần như 100%, thường do các thứ type H5 và H7 gây ra, nhưng không phải tất cả các thứ type H5 và H7 đều độc, và nhóm virus cúm A độc lực thấp (low pathogenic avian Influenza – LPAI) với mức độ độc tính thấp hơn hoặc đôi khi không gây triệu chứng gì trên gia cầm [3]. Tổng quan tài liệu 6 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam — Hệ thống danh mục (nomenclature system) của virus cúm bao gồm: Type virus/ vật chủ/ vị trí địa lý phân lập/ số chủng phân lập/ năm phân lập (thứ type HA và thứ type NA). Sự mô tả kháng nguyên Hemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) được đặt trong dấu ngoặc ( ). Ví dụ A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1). Bằng cách này, nếu con người đóng vai trò vật chủ thì không ghi, như A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [74]. 1.2.2 Đặc điểm sinh thái virus cúm A Thời gian tồn tại trong môi trường nước của các chủng virus gia cầm khác nhau. Virus cúm A độc lực thấp (LPAI) trong phân các loài thủy cầm hay chim hoang dã có thể tồn tại ít nhất 30 ngày ở 40C và 7 ngày ở 200C trong môi trường nước mà vẫn còn khả năng lây nhiễm. Virus cúm A độc lực cao (HPAI) H5 và H7 có khả năng tồn tại trong môi trường nước rất lâu dài, ngay trong cùng thứ type thời gian tồn tại cũng khác nhau. Một số chủng virus cúm gia cầm hoang dại H7 vẫn còn khả năng lây nhiễm sau hơn 190 ngày tồn tại trong nước 170C (pH = 7,4) như A/Mallard/MN/182761/98 (H7N3) hay A/Laughing Gull/DE/AI00-2455 (H7N3) với nồng độ TCID50 virus ban đầu là 106. Cũng ở điều kiện tương tự, chủng A/Duckmeat/Anyang/01 (H5N1) tồn tại hơn 90 ngày, còn chủng A/Whooper Swan/Mongolia/244/05 (H5N1) tồn tại hơn 150 ngày [10]. 1.2.3 Hình thái - cấu trúc hạt virus cúm A Thành phần cấu trúc của virus cúm A gồm có: 1% RNA, 70% protein, 20% lipid, và 5 - 8% carbohydrate. Vỏ lipid của virus cúm được cấu trúc từ màng sinh chất (plasma membrane) của tế bào chủ (host cell). Các virion (hạt virus hoàn chỉnh, dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ) cúm A phát triển trong trứng gà và trong các mô tế bào nuôi cấy có hình dạng khá đều đặn khi chụp dưới kính hiển vi, với đường kính từ 80 - 120 nm. Phần lớn các chủng virus cúm A phân lập từ gia cầm có hình cầu, trong khi từ các loài khác thì hình dạng virus cũng rất khác nhau về đường kính, độ dài, và thậm chí có hình dáng rất lạ [74]. Điểm nổi bật nhất của virion cúm A là có khoảng 500 mấu gai (spikes) nhô ra Tổng quan tài liệu 7 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam xung quanh ngoài màng lipid, dài 10 - 14 nm, đường kính 4 - 6 nm. Các mấu gai này có 2 loại: mấu gai hình que (rod-shaped) của HA và mấu gai hình nấm (mushroom-shaped) của NA. Tỉ lệ giữa HA và NA trong 1 virion thường khoảng 4:1 đến 5:1. Bên dưới lớp màng đôi lipid là các protein nền M1 (matrix protein) và chúng liên kết với lõi ribonucleprotein của virion, M1 là một trong những protein phong phú nhất. Ngoài ra, virus cúm A còn mã hóa cho một protein xuyên màng M2, đóng vai trò như kênh ion kiểm soát các proton (ion H+), các bằng chứng sinh hóa cho thấy chỉ có một vài bản sao M2 trong virion [77]. Hình 1.4. Cấu trúc hạt virus cúm A. (A) Virus cúm A dưới kính hiển vi điện tử. (B) Sự phân bố các protein trong virus cúm A [74]. Bên trong virus là các phức hợp ribonucleoprotein (RNP) với nhiều kích thước khác nhau, phụ thuộc vào đoạn vRNA (viral RNA) liên kết, loại lớn dài từ 90 - 110 nm, loại trung bình từ 60 - 90 nm và loại nhỏ từ 30 - 50 nm. Virus cúm A có 8 đoạn RNA mã hóa cho các protein: PB2, PB1, PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M1 và M2, NS1 và NS2. Các sợi RNP thường có các vòng xoắn ở một đầu, điều này là do chúng tự gấp lại sau đó tiếp tục cuộn xoắn để hình thành sợi đôi xoắn. Mỗi RNP gồm có bốn protein NP, PB1, PB2, PA và một sợi RNA, trong đó protein NP có số lượng nhiều nhất và ba protein còn lại đóng vai trò là phức hợp RNA polymerase [35]. 1.2.4 Đặc điểm vật chất di truyền và chức năng Tổng quan tài liệu 8 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Bộ gene virus cúm A gồm 8 đoạn RNA mạch đơn, xoắn âm (single-stranded RNA (-)), mã hoá cho 11 protein của virus: - RNA1 mã hóa Polymerase B2 protein (PB2) - RNA2 mã hóa Polymerase B1 protein (PB1) và PB1-F2 - RNA3 mã hóa Polymerase A protein (PA) - RNA4 mã hóa Haemagglutinin (HA hay H) - RNA5 mã hóa Nucleocapsid protein (NP) - RNA6 mã hóa Neuraminidase (NA hay N) - RNA7 mã hóa Matrix protein (M): gồm M1 và M2 - RNA8 mã hóa Non-structural protein (NS): gồm NS1 và NS2 Mỗi đoạn RNA được bao xung quanh bởi protein NP (nucleoprotein) tạo thành cấu trúc RNP. RNP kết hợp với phức hợp gồm 3 loại polymerase protein là PB1, PB2, PA chịu trách nhiệm cho sự phiên mã và sao chép RNA của virus. Trình tự hai đầu 5’ và 3’ của mỗi đoạn RNA đều được bảo tồn ở mức độ cao. Polymerase B2 Protein (PB2) Polymerase PB2 được mã hoá bởi đoạn RNA 1, trọng lượng phân tử 85.700. Protein này là thành viên của phức hợp có hoạt tính RNA polymerase phụ thuộc RNA (RNA – dependent RNA polymerase). Protein PB2 nhận diện và liên kết cấu trúc mũ chụp (m7GpppXm) đầu 5’ của các mRNA của tế bào chủ và sử dụng chúng như các mồi cho quá trình phiên mã mRNA của virus [72]. Polymerase B1 Protein (PB1) Polymerase PB1 được mã hoá bởi đoạn RNA 2, trọng lượng phân tử 86.500. Nó thực hiện đồng thời nhiều chức năng, vừa có chức năng như một endonuclease vừa có chức năng như polymerase kéo dài trong quá trình tổng hợp mRNA virus cũng như trong tổng hợp các RNA khuôn (cRNA) và vRNA. Ngoài ra, trên khung đọc mở (Open Reading Frame) của PB1 còn mã hóa một protein nhỏ, ngắn gồm 87 axít amin là PB1-F2. Trong đa số trường hợp tế bào các loài bị nhiễm, PB1-F2 có mặt phần lớn trong ti thể (chiếm 50%), còn lại chúng có thể phân bố trong nhân hoặc trong bào tương. PB1-F2 thúc đẩy quá trình chết của tế bào nhiễm (apoptosis) bằng cách tiêu diệt các đại thực bào phổi, đồng thời hỗ trợ cho các vi khuẩn gây Tổng quan tài liệu 9 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam bệnh khác xâm nhiễm, từ đó góp phần vào độc tính của virus cúm A [14, 24]. Polymerase A Protein (PA) Polymerase PA được mã hoá bởi đoạn RNA 3, trọng lượng phân tử 84.200. Protein này là thành viên của phức hợp RNA polymerase phụ thuộc RNA. Tuy nhiên, chức năng của protein PA vẫn chưa được biết rõ, nhưng cũng đã có những bằng chứng cho thấy PA có hoạt tính như protein kinase hay protein tháo xoắn [72]. PB1 và PB2 được tìm thấy trong quá trình tổng hợp mRNA và PA được tìm thấy trong quá trình tổng hợp RNA của virus. Ba protein này tạo thành một phức hợp enzyme chịu trách nhiệm phiên mã, sao chép, có hoạt tính endonuclease. Sau khi được tổng hợp trong tế bào chất, chúng được vận chuyển vào nhân. Hemagglutinin (HA) HA được mã hóa bởi đoạn RNA 4, là protein xuyên màng và là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm. Protein HA giúp virus gắn vào các thụ thể (receptor) chứa axít sialic của tế bào chủ và giúp sự dung hợp giữa vỏ hạt virus và màng tế bào chủ. HA được tổng hợp trên màng liên kết ribosome, sau đó được chuyển tới khoang lưới nội chất (ER - endoplasmic reticulum) ở dạng sợi polypeptide đơn HA0 (trọng lượng phân tử khoảng 76.000). Tùy thuộc vào chủng virus, tế bào chủ, và điều kiện sinh trưởng, HA có thể tồn tại ở dạng tiền thân HA0 hoặc dạng phân cắt gồm hai chuỗi HA1 và HA2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. Sự phân cắt HA0 này là điều kiện tiên quyết cho quá trình xâm nhiễm của virus cúm A, vì vậy đây là một tiêu chuẩn cho sự xác định độc tính của virus trong các trận dịch [62]. Nucleocapsid Protein (NP) Phân đoạn RNA 5 mã hóa cho protein NP. NP là protein cấu trúc chính, tương tác với các đoạn RNA để hình thành RNP (ribonucleoprotein). NP cũng là một trong những kháng nguyên chính để phân biệt các type A, B, C. Sau khi được tổng hợp trong tế bào chất, NP được chuyển vào nhân. Neuraminidase (NA) Neuraminidase (NA) là glycoprotein bề mặt của virus cúm có hình nấm, là một trong những kháng nguyên quan trọng của virus cúm [58], do đoạn RNA 6 mã hóa. NA có chức năng chủ yếu là thúc đẩy sự giải phóng virus ra khỏi tế bào, bằng cách Tổng quan tài liệu 10 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam loại bỏ axít sialic trên protein HA và NA mới được tổng hợp. Nếu không có NA, các hạt virus không giải phóng được và kết lại thành khối trên bề mặt tế bào chủ [4]. Bảng 1.1. Các đoạn RNA virus cúm A và chức năng mã hóa [34] *Các số liệu này có tính tương đối; **Số lượng phân tử trong một virion. Matrix protein (M) Đoạn RNA số 7 mã hóa cho hai protein M1 và M2. M1 là protein nền, nằm sát dưới lớp vỏ lipid của virus, giúp cho hạt virus cứng chắc. Ở giai đoạn cuối của quá trình xâm nhiễm, protein M1 tương tác với các RNP mới được lắp ráp bên trong nhân, giúp cho các RNP bền vững. M2 là protein xuyên màng, hoạt động như một kênh ion kiểm soát các ion H+, hỗ trợ cho sự cởi vỏ của virus trong các endosome của tế bào bị nhiễm [72]. Non-structural protein (NS) Đoạn RNA số 8 mã hóa cho hai protein NS1 và NS2. NS1 có nhiều trong các tế bào bị nhiễm, nhưng lại không có trong các hạt virion. NS1 là protein đa chức năng, STT Dài (Nu)* Protein Dài (aa)* Số lượng** Chức năng 1 2341 PB2 759 30-60 Thành phần của phức hệ enzyme phiên mã, có vai trò nhận diện mũ chụp m7GpppXmNm của RNA tế bào chủ. 2341 PB1 757 30-60 Thành phần của phức hệ enzyme phiên mã, có vai trò xúc tác bổ sung nucleotide. 2 303 PB1-F2 101 - Protein tiền apoptotic, tương tác với bộ máy đáp ứng miễn dịch của vật chủ, số lượng thay đổi. 3 2233 PA 716 30-60 Thành phần của phức hệ enzyme sao chép và phiên mã, chức năng chưa được biết. 4 1778 HA 566 500 Glycoprotein bề mặt, có vai trò gắn kết thụ thể, dung hợp protein và là yếu tố chính quyết định kháng nguyên. 5 1565 NP 498 1000 Kết hợp với các sợi RNA virus hình thành cuộn ribonucleoprotein; khởi động quá trình tổng hợp RNA virus. 6 1413 NA 454 100 Glycoprotein bề mặt; phân tách liên kết HA-axít sialic và phóng thích virus; quyết định kháng nguyên. 1027 M1 252 3000 Protein cấu trúc chính của virus; tương tác với các RNP virus và thúc đẩy quá trình lắp ráp của virion. 7 M2 97 20-60 Protein màng; hoạt động như kênh ion cần thiết cho sự cởi vỏ của virus; bị ức chế bởi amantadine. 890 NS1 230 - Protein không cấu trúc trong tế bào chất và nhân, số lượng phong phú; ức chế sự phân tách và bổ sung đầu 3’ của tiền mRNA tế bào. 8 NS2 121 130-200 Protein không cấu trúc, có trong nhân và tế bào chất; có vai trò vận chuyển các RNP virus ra khỏi nhân. Tổng quan tài liệu 11 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam chúng ngăn chặn quá trình tự ghép nối các tiền mRNA (pre-mRNA) mới tổng hợp [22], giúp virus kháng Interferon, vận chuyển protein từ nhân ra tế bào chất [37]. Protein NS2 giúp vận chuyển các RNP ra khỏi nhân [49]. 1.2.5 Kháng nguyên Neuraminidase (NA) 1.2.5.1 Đặc điểm cấu trúc và chức năng Đoạn RNA số 6 có 1413 nucleotide, mã hóa chuỗi polypeptide NA dài khoảng 453 axít amin [34]. Mỗi homotetramer NA (hiểu ngắn gọn là gene NA) được chia thành bốn vùng chính [26]: - Vùng đuôi thuộc tế bào chất (cytoplasmic tail) của virus, gần đầu Nitơ gồm 6 axít amin N-Met-Asn-Pro-Asn-Gly-Lys (MNPNQK) được bảo tồn giữa các thứ type của virus cúm A [34], có vai trò trong sự hợp nhất của NA trong quá trình lắp ráp tạo thành hạt virion. Gốc Proline (Pro) giúp duy trì hình dáng thích hợp của cytoplasmic tail dọc theo màng tế bào (vật chủ) để tương tác với các thành phần bên trong hạt virion đang nẩy chồi [9]. Vùng đuôi này không hoàn toàn đòi hỏi trong quá trình sao chép của virus, nhưng nếu không có nó và vùng đuôi của HA, sẽ ảnh hưởng đến hình dạng hạt virus, tạo ra những hạt virus có các sợi nhỏ kỳ lạ (bizarre filamentous) [6], làm cho hạt virus nhỏ lại khoảng 10 lần [30, 47], và sự hợp nhất của các NA trong hạt virion giảm 86% [40]. - Vùng trans-membrane (TM - Vùng xuyên màng) gồm 29 axít amin bảo tồn cao trong type cúm A, với chủng A/WSN/33 (H1N1) trình tự 29 axít amin này là IITIGSICMVVGIISLILQIGNIISIWIS, đóng vai trò “tín hiệu chuyển vị” (translocation signal) và như một “mỏ neo” liên kết với màng (anchor domain) [6, 15], vùng này của các thứ type của virus cúm A và B có tính chất chung là kị nước chứ không tương đồng trong trình tự. Trong vùng cystoplasmic tail và transmembrane các axít amin 5-13 (QKIITIGSI) không cần thiết cho chức năng NA. Do khi thay thế 2 axít amin ở vị trí 5,6 (QK) bằng Alanine (A) (NA2A5), tương tự cho các vị trí 7,8,9 (NA3A7), 10,11,12,13 (NA4A10), thì virus vẫn phát triển bình thường gần như type hoang dại (Hình 1.5). Nhưng nếu thay 5 Alanine cho vị trí 27,28,29,30,31 hay 5 Alanine cho vị trí 31,32,33,34,35 sẽ ảnh hưởng Tổng quan tài liệu 12 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam mạnh đến sự sinh sản virus, làm giảm 50 lần (nếu có trypsin) và 250 lần (nếu không có trypsin) khả năng sinh sản của virus [6]. Hình 1.5. Thí nghiệm thay các axít amin trên vùng TM của gene N1 bằng Alanine [6]. - Vùng stalk (cuống thân) có chiều dài thay đổi trong các type virus cúm cũng như trong các thứ type, vùng này có thể dài từ 0 tới 52 axít amin bắt đầu từ khoảng axít amin ở vị trí 40 phía đầu Nitơ (N) [11, 58], chẳng hạn chủng A/WSN/33 có 24 axít amin, còn chủng A/Brevig Mission/1/18 (H1N1) có vùng thân đầy đủ chứa 1 gốc Cys và 4 vị trí Glycosyl [58]. Mặc dù chiều dài vùng stalk thay đổi nhiều, nhưng giữa các thứ type, chúng vẫn có một số tính chất chung như chứa ít nhất 1 gốc Cys và 1 điểm Glycosyl. Trong trứng gà vùng này thực sự cần thiết trong việc sao chép của virus, vùng stalk càng dài quá trình sao chép của virus càng mạnh, còn trong nuôi cấy tế bào (MDBK) có hay không có vùng stalk cũng không ảnh hưởng nhiều cho việc sao chép [11]. Chiều dài của vùng stalk ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, càng dài hoạt tính enzyme càng mạnh. Khi mất vùng này hoạt tính enzyme giảm 6 lần so với NA có vùng stalk nguyên vẹn [67], thậm chí mất khả năng giải phóng virus [11]. Hình 1.6. Trình tự axít amin gene N1 của chủng WSN trong thí nghiệm gây đột biến vùng stalk. Vùng stalk được in nghiêng, vùng trasmembrane là CHỮ ĐẬM IN HOA. Phần axít amin thêm vào của chủng A/Tokyo/67 (H2N2) được gạch chân và của chủng A/Tern/Australia/G70C/75 (H11N9) được gạch chân bằng gạch đôi [11]. Tổng quan tài liệu 13 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Năm 1993, Castrucci và Kawaoka đã thí nghiệm trên chủng A/WSN/33 (HlNl) với gene N1 bị mất một phần hay toàn bộ vùng thân và khi thêm một vài axít amin vào vùng stalk hoàn chỉnh. Cụ thể là trong thí nghiệm cắt bỏ vùng stalk gồm có cắt bỏ 9 axít amin không phải là các axít amin bảo tồn (Cys và vị trí Glycosyl) (gọi là chủng SD9) và cắt bỏ toàn bộ vùng stalk (gọi là SD0). Còn trong thí nghiệm chèn thêm axít amin vào vùng stalk gồm thêm 14 axít amin của thứ type N2 [A/Tokyo/67 (H2N2)] (SA14), thêm 28 axít amin gồm 14 axít amin của N2 [A/Tokyo/67 (H2N2)] và 14 axít amin của N9 [A/Tern/Australia/G70C/75 (H11N9)] (SA28) như trong hình 1.6. Kết quả là khi tiêm vào chuột chủng virus bị mất toàn bộ vùng stalk (SD0) thấy không có con chuột nào chết ngay cả khi tiêm với nồng độ 106 PFU (liều lượng cần thiết của chủng gốc H1N1 để giết 50% chuột là 102,5 PFU), hoặc khi tiêm chủng virus SD28 (thêm 28 axít amin trong vùng stalk) cũng không thấy có ảnh hưởng nào đáng kể về độc tính của virus đối với chuột. Còn khi kiểm tra khả năng giải phóng virion ra khỏi liên kết virion - hồng cầu (hemagglutination) nhờ hoạt tính enzyme của NA của các chủng đột biến thì thấy các chủng SA28 và SA14 hoàn toàn được phóng thích ra khỏi hồng cầu chỉ sau 1,5 giờ, trong khi các chủng SD9 và chủng gốc WSN được phóng thích lâu hơn, đặc biệt chủng SD0 chỉ được phóng thích chút ít ngay cả khi ủ đến 18 giờ. Điều này cho thấy chiều dài vùng stalk ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của NA, càng dài hoạt tính enzyme càng mạnh [11]. - Vùng head overall (hay globular head, head region), có vị trí hoạt động (active site) đóng vai trò xúc tác. Theo Colman, khi nghiên cứu cấu trúc không gian ba chiều gene N2 của chủng A/Tokyo/3/67 (H2N2) tương tác với axít sialic, thì vị trí hoạt động và vùng xung quanh gồm 15 axít amin là: Arg118 (R), Glu119 (E), Asp151 (D), Arg152 (R), Asp198 (D), Arg224 (R), Glu227 (E), Asp243 (D), His274 (H), Glu276 (E), Glu277 (E), Arg292 (R), Asp330 (D), Lys350 (K), và Glu425 (E) được bảo tồn trong toàn bộ các thứ type của virus cúm A [16, 58]. Năm 2007, Wang và cộng sự nghiên cứu cấu trúc theo mô hình 3D gene N1 của 109 chủng H5N1 tương tác trực tiếp với DANA (2,3-didehydro-2-deoxy-N- acetylneuraminic acid) - chất có tác dụng ức chế hoạt động protein NA tương tự Tổng quan tài liệu 14 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam như Oseltamivir, thì thấy vùng hoạt động của gene N1 bao gồm 11 axít amin chức năng (functional residues): Arg118 (R), Glu119 (E), Asp151 (D), Arg152 (R), Trp178 (W), Ile222 (I), Glu227(E), Glu276 (E), Arg292 (R), Arg371 (R), Tyr406 (Y) và 5 axít amin lân cận (framework residues): Arg156 (R),Asp198 (D), Arg224 (R), Asn294 (N), Glu425 (E) được bảo tồn trong toàn bộ 109 chủng H5N1 [70]. Hình 1.7. Các axít amin bảo tồn tại vị trí hoạt động trên NA. (A) Các a xít amin bảo tồn theo Colman [16]. (B) Các axít amin bảo tồn theo Wang. Trong đó, màu xanh là các axít amin chức năng, màu đỏ là các axít amin lân cận [70]. Vùng stalk và globular head gộp lại gọi là ectodomain [15]. Trong gene NA, phần head region là quan trọng nhất, vì có chứa vị trí hoạt động (active site), đóng vai trò quyết định trong hoạt tính enzyme của NA. Người ta đã làm thí nghiệm gây đột biến mất đoạn delNA-31 trên chủng A/Charlottesville/31/95 (H1N1) tạo ra gene NA “khuyết” (defective NA) mã hóa chuỗi peptid 95 axit amin gồm các vùng cytoplasmic tail, trans-membrane, vùng stalk và không có vùng head region mang active site. Tương tự, người ta cũng tạo đột biến delNA-28 trên chủng A/Charlottesville/28/95 (H1N1) tạo ra gene NA “khuyết” mã hóa chuỗi peptid 74 axít amin. Còn các gene khác (7 gene còn lại) dường như không thay đổi so với chủng hoang dại, trừ 2 thay đổi nhỏ trên gene PA là Ser-409 →Asn và Leu-531→Ile. Người ta thấy rằng, nồng độ các chủng virus đột biến này tạo ra sau khi chuyển nhiễm 60h và 72h thấp hơn 100 so với chủng hoang Tổng quan tài liệu 15 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam dại. Điều này chứng tỏ, không có active site, thì khả năng thúc đẩy sự giải phóng virus ra khỏi tế bào chủ (ở đây là tế bào Madin–Darby canine kidney (MDCK)) bị hạn chế rõ rệt [26]. 1.2.5.2 Các đột biến quan trọng trên NA Một trong những điểm đột biến quan trọng trên N1 là His274 (Histidine ở vị trí 274). Khi nghiên cứu đột biến ở vị trí này trên chủng A/WS/33 (H1N1), người ta thấy rằng: nếu thay thế His274 bằng các axít amin lớn hơn (lager side chain residuces) như Tyr hay Phe, thì khả năng kháng Oseltamivir (Tamiflu) tăng 300 lần so với type hoang dại, còn đối với Zanamivir (Relenza) thì chỉ tăng tính kháng chút ít. Còn thay thế His274 bằng các axít amin nhỏ hơn như Gly, Asn, Ser và Gln thì không thay đổi, thậm chí tăng tính nhạy cảm đối với Oseltamivir, nhưng giảm tính nhạy cảm đối với Zanamivir. Năm 2007, Hui-Ling Yen và cộng sự nghiên cứu trên gen N1 của chủng A/Vietnam/1203/04 (H5N1) cho thấy, khi gây đột biến His274Tyr, thì tính kháng Oseltamivir của chủng A/Vietnam/1203/04 (H5N1) tăng hơn 250 lần, còn đột biến Asn294Ser thì tính kháng Oseltamivir tăng hơn 20 lần so với bình thường trong điều kiện in vitro. Điều đáng ngạc nhiên hơn cả là độc tính trên chuột (in vivo) của các chủng chứa gen N1 đột biến này hoàn toàn giống với chủng H5N1 hoang dại lưu hành trong các động vật có vú [75]. Đột biến His274Tyr khiến N1 kháng thuốc, còn N2 không có tính chất này. Đi kèm với His274 là Glu276, đây cũng là vị trí đóng vai trò quan trọng trong tính kháng thuốc của N1, sự thay đổi cấu tạo của Glu276 khi liên kết với Oseltamivir liên quan đến độ lớn nhỏ của các axít amin ở His274, mà điều này lại quyết định tính kháng thuốc của N1 [69]. Một loại đột biến khác cũng ảnh hưởng đến chức năng xúc tác của NA là đột biến cysteine thành glycine. Trên chủng A/WSN/33 (H1N1), có 19 gốc Cysteine như trong hình 1.8. Trong đó, các cặp Cysteine được nối với nhau như C76-C402, C303-C320,… là những cặp Cysteine có liên kết disulfide ở giữa. Khi gây đột biến cysteine thành glycine ở C49, thì không làm thay đổi chức năng NA trong quá trình Tổng quan tài liệu 16 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam lây nhiễm của virus, còn đột biến ở C146 thì hoạt tính enzyme NA bằng khoảng 1/3 và 1/5 chủng hoang dại ở nhiệt độ 330C và 39,50C. Tuy nhiên, nếu gây đột biến như trên với cặp C303-C320, sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức năng và cấu trúc của NA, do liên kết disulfide giữa nó bị bẻ gãy, dẫn đến sự hình thành protein NA nhạy cảm với nhiệt độ (temperature sensitive - ts). Cụ thể ở 330C thì hoạt tính NA của chủng đột biến giảm 50 lần so với type hoang dại, còn ở 39,50C thì hầu như bị bất hoạt [7]. Hình 1.8. Sơ đồ các gốc Cysteine trên gene NA của chủng WSN [7]. 1.2.6 Chu trình sinh sản của virus cúm trong tế bào chủ Quá trình phiên mã, sao chép của virus cúm đặc biệt khác với các RNA virus khác ở điểm chỉ xảy ra trong nhân tế bào bị xâm nhiễm. 1.2.6.1 Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ của virus ở tế bào chủ Hạt virus cúm gắn vào tế bào nhờ liên kết giữa phân tử HA và các gốc axít sialic có trên các glycoprotein bề mặt tế bào nhiễm. Mặc dù, sự tương tác giữa HA với axít sialic có ái lực khá thấp nhưng nó vẫn đảm bảo sự gắn kết chặt chẽ giữa tế bào chủ và virus thông qua nhiều liên kết này. Sau khi gắn kết, virus cúm xâm nhập vào tế bào bằng con đường thực bào (endocytosis) qua trung gian thụ thể, và hạt virus được bao bởi thể nhân (endosome). Việc tháo vỏ của hạt virus phụ thuộc pH axít của thể nhân. Nhờ độ pH axít, các ion H+ bên trong thể nhân đi vào hạt virus thông qua kênh ion M2 để phá vỡ tương tác protein-protein, nhờ đó cắt đứt liên kết giữa các RNP và M1. Sau đó, các RNP chứa vRNA này được phóng thích vào tế bào chất nhờ sự dung hợp giữa màng virus và màng thể nhân qua trung gian HA. Trên cả bốn loại protein cấu trúc của RNP là NP, PB1, PB2 và PA đều chứa các Tổng quan tài liệu 17 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam trình tự đóng vai trò là tín hiệu hướng nhân (Nuclear Localization Signal – NLS), nên các RNP virus đã giải phóng vào nguyên sinh chất sẽ di chuyển tích cực vào nhân nhờ các tín hiệu hướng nhân này [34]. 1.2.6.2 Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA của virus Các enzyme của virus không có khả năng khởi đầu sinh tổng hợp mRNA in vitro nếu không được cung cấp các mồi (primer). Các bản sao RNA được tạo ra do RNA polymerase II của tế bào chủ sẽ được phân cắt thành các đoạn RNA (dài 10 – 13 nucleotide) có chứa mũ chụp (m7GpppXm). Các đoạn RNA có mũ chụp này sẽ đóng vai trò như là các mồi cho quá trình khởi đầu sinh tổng hợp mRNA virus. Sinh tổng hợp mRNA virus Hình 1.9. Quá trình tổng hợp mRNA từ vRNA của Influenza virus [34]. R3 và R5 là vị trí gắn đầu 3’ và 5’ của sợi vRNA, C là vị trí gắn mồi m7GpppXm. Phức hợp RNA polymerase gồm có 3 loại protein P, không có hoạt tính cho đến khi chúng liên kết với trình tự ở đầu 5’ của vRNA (-). Sự gắn kết đầu 5’ của trình tự Tổng quan tài liệu 18 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam vRNA đến PB1 giúp cho protein PB2 liên kết với trình tự chứa mồi m7GpppXm của RNA tế bào chủ [64]. Khi trình tự ở đầu 3’ của vRNA (-) liên kết với trình tự axít amin thứ hai trên protein PB1, thì polymerase có hoạt tính để phân cắt tại nucleotides từ 10 đến 13 của RNA tế bào chủ tạo ra mồi m7GpppXm. Sau đó, RNA polymerase có thể thực hiện việc khởi đầu (initiation) và kéo dài (elongation) tổng hợp các mRNAs. Trong suốt quá trình tổng hợp, polymerase vẫn liên kết với đầu 5’ của vRNA, và đầu 3’ của vRNA được “xâu” xuyên qua (hay dọc theo bề mặt) của polymerase, protein PB1 xúc tác sự bổ sung của mỗi nucleotide đến chuỗi mRNA đang tổng hợp [35]. Quá trình xâu này tiếp diễn cho đến khi chuỗi mRNA chạm một vị trí trên vRNA gần với vị trí liên kết của polymerase. Tại vị trí này, tự bản thân polymerase sẽ khóa chức năng tổng hợp mRNA, và lặp lại quá trình sao chép từ 5 đến 7 gốc U. Sau khi có khoảng 15 đến 22 gốc A gắn vào đầu 3’ của chuỗi mRNA mới tổng hợp, quá trình tổng hợp mRNA kết thúc [34]. Sao chép RNA virus (vRNA) Việc chuyển từ tổng hợp mRNA virus thành sao chép vRNA được điều hòa bởi một số các phân tử protein NP, và các RNA polymerase của virus có khả năng xúc tác sự khởi đầu tổng hợp vRNA mà không cần mồi. Quá trình này gồm hai bước: đầu tiên tổng hợp các sợi RNA(+) khuôn (template RNA) trung gian từ vRNA(-), sau đó từ sợi RNA(+) khuôn này tổng hợp trở lại các sợi vRNA(-) của virus [61]. 1.2.6.3 Quá trình đóng gói và nẩy chồi Các protein bề mặt virus NA, HA và M2 sau khi được tổng hợp trên màng liên kết ribosome trong tế bào chất sẽ được chuyển xuyên qua lưới nội chất và hệ thống Golgi ra đến màng sinh chất của tế bào chủ [43]. Ngược lại, các protein PA, PB1, PB2 và NP sau khi được tổng hợp trong tế bào chất sẽ đi vào nhân và kết hợp với các vRNA tạo nên cấu trúc ribonucleoprotein (RNP). Sau đó, các RNP này kết hợp với protein NS2 và M1 tạo thành phức hợp RNP-M1-NS2, tín hiệu xuất nhân (Nuclear Export Signal – NES) trên NS2 tương tác với các protein tế bào, giúp chuyển phức hợp RNP-M1-NS2 này ra khỏi nhân đến bề mặt của tế bào chủ [49]. Tại đây, các protein và RNP sẽ được gói lại nhờ màng của tế bào chủ, hình thành Tổng quan tài liệu 19 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam Hình 1.10. Chu trình sinh sản của virus cúm [34]. (1-3) Virus gắn các phân tử HA vào axít sialic là thụ thể của tế bào chủ, xâm nhập theo cách thực ẩm bào (endocytose), giải phóng các RNP trong tế bào chất, toàn bộ vRNA cùng phức hợp RNA polymerase di chuyển vào nhân tế bào. (4-6) Phiên mã tạo ra các mRNA, sau đó mRNA được chuyển ra lại tế bào chất. (7) Các protein màng (HA, NA, M2) dịch mã trên màng liên kết ribosome, sau đó được chuyển xuyên qua ER và hệ thống Golgi đến màng tế bào. (8-10) Sao chép – kết hợp với sự dịch mã các protein virus trên các ribosome tự do và chuyển protein vào lại nhân. (11-13) Sao chép vRNA trong nhân. (14) Protein M1 và NS2 gắn vào các vRNP mới sinh tạo phức hợp RNP-M1-NS2 và chuyển ra bề mặt tế bào. (15-18) Các protein cấu trúc và RNP của virus lắp ráp ở màng sinh chất. (19) Lắp ráp các hạt virion hoàn chỉnh và nẩy chồi thoát ra khỏi tế bào chủ. Tổng quan tài liệu 20 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam các hạt virus nhô ra ngoài. Cuối giai đoạn này, nhờ hoạt tính enzyme của NA giúp các hạt virus mới tạo thành thoát khỏi bề mặt tế bào bị xâm nhiễm và tiếp tục xâm nhiễm vào tế bào mới [43]. Các hạt virus mới tạo thành không làm tan tế bào bị xâm nhiễm, nhưng những tế bào này dường như không còn khả năng sống sót do rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử sinh học. Một chu trình sao chép virus cúm hoàn chỉnh kéo dài khoảng 10h [14]. 1.2.7 Đặc điểm di truyền của virus cúm A Trong các virus hô hấp, chỉ có virus cúm hay có những thay đổi đáng kể về kháng nguyên. Cả hai kháng nguyên bề mặt quan trọng là NA và HA đều có thể trải qua hai dạng đột biến: đột biến nhỏ (antigenic drift) hay còn gọi là đột biến thường xuyên và đột biến lớn (antigenic shift) hay còn gọi là sự tái sắp xếp vật liệu di truyền. 1.2.7.1 Đột biến thường xuyên (Đột biến nhỏ – Antigenic Drift) Hình 1.11. Đột biến nhỏ thường xuyên xảy ra ở virus cúm [Roche]. Đột biến thường xuyên là kết quả của quá trình tích lũy những thay đổi về axít amin trên các kháng nguyên NA và HA. Quá trình này đều xảy ra đối với các virus cúm A, B, C. Tuy nhiên, virus cúm A có tỷ lệ đột biến cao nhất, trong khi virus cúm C được phân lập trong các thập kỷ qua cho thấy tỷ lệ thay đổi kháng nguyên rất ít. Tỷ lệ đột biến của virus cúm A khoảng 1,5 x 10-5 trên mỗi nucleotide trong một chu Tổng quan tài liệu 21 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam trình xâm nhiễm [51]. Trên chuỗi HA có 5 vùng kháng nguyên là A, B, C, D, và E. Do sự tích lũy một loạt các đột biến dẫn đến sự thay thế hay mất đi các axít amin trong các vùng kháng nguyên từ A đến E ở ngoài màng của HA. Chính những thay thế này ngăn chặn sự gắn kết của kháng thể sinh ra trong đợt nhiễm trùng trước, do đó virus có thể nhiễm tới vật chủ [74]. 1.2.7.2 Tái sắp xếp vật liệu di truyền (Đột biến lớn – Antigenic Shift) Hình 1.12. Đột biến lớn có thể tạo nên các dòng virus gây ra đại dịch cúm [Belshe, 2005]. Đột biến lớn hay còn gọi là quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền liên quan đến những thay đổi kháng nguyên do sự thay thế các đoạn gene. Đột biến lớn thường xảy ra đột ngột và tạo ra chủng virus với các kháng nguyên HA hay NA hoàn toàn mới, có thể dẫn đến việc thay đổi ký chủ và gây ra đại dịch. Đột biến lớn ở virus cúm A tuy xảy ra không thường xuyên bằng đột biến nhỏ nhưng mức độ tác động của chúng lại lớn hơn nhiều. Ví dụ, từ những nghiên cứu về di truyền và hóa sinh các nhà khoa học kết luận: các chủng virus xuất hiện trong trận dịch năm 1957, 1968 và 1977 là kết quả của quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền (reassortment). Chủng virus H2N2 gây Tổng quan tài liệu 22 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam dịch “cúm Châu Á” năm 1957 gây thiệt mạng chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ là 70.000 người, chủng này sở hữu ba gene HA, NA và PB1 từ virus gia cầm (avian virus) và năm gene còn lại từ virus cúm người H1N1 trước đó. Còn chủng virus H3N2 gây dịch “cúm HongKong” năm 1968 gây thiệt mạng chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ là 34.000 người, chủng này sở hữu gene H3 và PB1 từ virus gia cầm và sáu gene còn lại từ virus cúm người đang lưu hành lúc đó [32]. Chủng virus H1N1 gây dịch “cúm Nga” năm 1977 chứa bốn gene HA, NA, M, NS của chủng H1N1 trước đó và bốn gene PB1, PB2, PA và NS của chủng virus cúm người H3N2. Đây là những minh chứng rõ ràng nhất về sự tái tổ hợp vật liệu di truyền giữa virus cúm A của người và động vật trong cơ thể (in vivo) [72] và giữa các chủng virus cúm A của người trong tự nhiên [76]. 1.3 Kỹ thuật di truyền ngược cho virus cúm A 1.3.1 Khái niệm về kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics) Kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetics system hay reverse genetics method) là thuật ngữ chỉ cho quá trình tái tạo ra hạt virus hoàn chỉnh từ bộ gene cDNA của virus đó đã dòng hóa vào plasmid chuyên dụng [47]. Hạt virus mới này hoàn toàn có khả năng xâm nhiễm và có các đặc tính sinh học giống như virus cùng loại trong tự nhiên. Bởi vì các thao tác di truyền đối với RNA virus – bộ gene này được RT- PCR thành cDNA, và các cDNA này được dòng hóa (clone) như DNA vào plasmid chuyên dụng và sau đó chúng sẽ được biểu hiện như RNA. Các bước chuyển từ RNA thành DNA, rồi từ DNA lại chuyển về RNA được diễn tả bằng thuật ngữ “di truyền ngược” (reverse genetics). 1.3.2 Sử dụng kỹ thuật di truyền ngược để tạo virus cúm A Virus cúm A (Influenza A virus) là virus RNA mạch đơn (-), chúng nhân đôi và sao chép bộ gene trong nhân của tế bào bị nhiễm. Trái với các virus RNA sợi đơn (+), bộ gene RNA của virus RNA sợi đơn (-) không lây nhiễm. Chỉ khi các vRNA được gói trong phức hệ protein polymerase PB1, PB2, PA và NP hình thành cấu trúc gọi là RNP thì mới có khả năng khởi động chu trình sao chép vRNA và phiên mã ra mRNA. Sau khi các RNP xâm nhập vào nhân tế bào, các protein trong phức Tổng quan tài liệu 23 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam hệ polymerase này bắt đầu phiên mã vRNA sợi (-) thành mRNA và cRNA sợi (+). Các cRNA sợi (+) này đóng vai trò là khuôn mẫu để tổng hợp trở lại các vRNA sợi (-), còn mRNA được hệ thống ribosome của tế bào dịch mã tạo ra các protein virus [34]. Từ đó sinh ra các hạt virus hoàn chỉnh và các hạt virus này hoàn toàn có khả năng xâm nhiễm vào các tế bào mới để tiếp tục sinh sản [28]. Dựa vào nguyên tắc này, các nhà khoa học đã thiết kế nhiều hệ thống di truyền ngược cho virus cúm A. Hình 1.13. Hệ thống chuyển nhiễm RNP và Polymerase I - phụ thuộc virus hỗ trợ [38]. Năm 1989, hệ thống reverse genetics đầu tiên được thiết kế cho virus Influenza. Trong hệ thống này các polymerase (PB1, PB2, PA) và nucleoprotein (NP) tinh sạch được trộn với các RNA virus (vRNA) tổng hợp trong điều kiện in vitro để lắp ráp thành những phức hợp RNP có chức năng. Sau đó phức hợp RNP có hoạt tính sinh học được chuyển nhiễm vào các tế bào bị xâm nhiễm bởi virus Influenza [38]. Với sự hỗ trợ của hệ thống di truyền ngược này, chúng ta có thể tạo ra các virus RNA sợi đơn (-) chứa vRNA có nguồn gốc từ các cDNA đã dòng hóa. Điều đó có nghĩa là các virus này có thể mang các thay đổi về di truyền [45]. Những virus Influenza gây đột biến điểm đặc hiệu được Enami và cộng sự tạo ra lần đầu tiên [18]. Trong hệ thống này, virus hỗ trợ (helper virus) đã cung cấp những protein virus cần thiết cho quá trình khuếch đại phức hợp RNP. Có nhiều cách để chọn lọc một virus tái tổ hợp chứa một gene tổng hợp từ các virus hỗ trợ, chẳng hạn như Tổng quan tài liệu 24 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam dùng kháng thể [5, 17], nhiệt độ [36], sự giới hạn về vật chủ [63], hay sự kháng thuốc [12]. Cho đến nay, các hệ thống chọn lọc đã được thiết kế cho sáu trong số tám đoạn gene của virus Influenza A, gồm các gene PB2 [63], HA [17], NP [36], NA [18], M [12] và NS [17], và cho HA, NA của virus Influenza B [5, 60]. Nhưng ứng dụng của kỹ thuật này vẫn còn hạn chế vì tính phức tạp của nó, bởi vì cần phải có một hệ thống chọn lọc mạnh và trình độ chuyên môn về kỹ thuật. Hệ thống reverse genetics thứ hai cho virus Influenza được thiết lập dựa trên hệ thống RNA polymerase I cho sự tổng hợp bên trong tế bào của RNA virus Influenza [44]. RNA polymerase I là một enzyme trong nhân của tế bào, chúng phiên mã RNA ribosome nhưng thiếu đầu 5’ (5’ cap) và đuôi poly(A) ở đầu 3’ (3’ poly(A) tail). Đầu tiên chuyển nhiễm vào tế bào một plasmid chứa cDNA đã dòng hóa từ gene của virus Influenza, có gắn trình tự khởi đầu (promoter) và kết thúc (terminator) của RNA polymerase I, sau đó cho virus Influenza xâm nhiễm vào tế bào, kết quả là sản sinh ra các virus hoang dại lẫn virus tái tổ hợp mang một gene mong muốn (Hình 1.13). Năm 1996, Pleschka và cộng sự đã cải thiện thành công hệ thống này để tạo ra các virus Influenza tái tổ hợp với các gene HA và NA mong muốn [50]. Hệ thống này cũng được sử dụng để thiết kế hệ thống reverse genetics cho virus Thogoto (6 mảnh RNA, còn gọi là cúm D) sao chép trong nhân tế bào [66], và những virus khác như Uuk uniemi (3 mảnh RNA, Bunyaviridae) sao chép trong tế bào chất [20]. Với cả hai hệ thống chuyển nhiễm bằng RNP và hệ thống RNA polymerase I, sản phẩm sau khi chuyển nhiễm phải được chọn lọc từ một hỗn hợp chứa rất nhiều virus hỗ trợ, điều này đòi hỏi một hệ thống chọn lọc mạnh và do đó có thể tạo ra các virus khiếm khuyết (defective virus). Một trở ngại nữa là hiệu quả tạo virus thấp. Năm 1999, dựa trên hệ thống của Pleschka và cộng sự, Neumann và Fodor đã phát triển một hệ thống hoàn toàn dựa trên plasmid (plasmid-based system) [21, 48]. Hệ thống này có thể tạo ra virus cúm A hoàn toàn từ các cDNA đã dòng hóa và có thể được sử dụng để đưa những đột biến vào bất kỳ mảnh gene nào. Trong phương pháp này, tám cDNA được đưa vào giữa một promoter RNA polymerase I của người và terminator RNA polymerase I của chuột hay một ribozyme của virus Tổng quan tài liệu 25 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam delta hepatitis tương ứng. Fodor và cộng sự đã sử dụng ribozyme của virus delta hepatitis thay cho terminator RNA polymerase I để tạo ra các vRNA có trình tự ở đầu 3’ chính xác. Sự biểu hiện của bốn protein phức hợp RNP được điều khiển bởi promoter của human cytomegalovirus hay promoter HMG (mouse hydroxymethylglutary-coenzyme A reductase promoter) tương ứng. Sự chuyển nhiễm của 12 plasmid (gồm 4 plasmid biểu hiện các protein PA, PB1, PB2, NP và 8 plasmid biểu hiện 8 mảnh vRNA) vào 106 tế bào 293T dẫn đến virus phục hồi hơn 1 x 103 PFU (plaque forming unit) trên 1 ml dịch nổi sau chuyển nhiễm. Hiệu quả có thể tăng đến 107,7 PFU sau khi chuyển nhiễm với 17 plasmid, tức là 12 plasmid phía trên cộng thêm 5 plasmid biểu hiện các protein NA, HA, M1, M2, NS2 (Hình 1.14). Hệ thống có hiệu quả cao này được cho là do hiệu quả chuyển nhiễm cao của tế bào 293T, hình thành nên một bể các tế bào chứa đầy đủ các thành phần cần thiết cho sự khởi đầu sao chép của virus. Hình 1.14. Hệ thống di truyền ngược tạo virus cúm A từ 12 hay 17 plasmid [21, 48]. Năm 2000, một hệ thống 8 plasmid thiết kế dựa trên phức hợp RNA polymerase I/II hai chiều (bidirectional) (gọi tắt là hệ thống Pol I/II) được Hoffmann phát triển [28]. Mỗi cDNA mã hóa một mảnh vRNA được dòng hóa vào giữa trình tự promoter RNA polymerase I và terminator I, phức hợp này lần lượt được dòng hóa vào nằm giữa trình tự promoter RNA polymerase II (human cytomegalovirus - CMV) và đuôi polyadenylation. Sự phiên mã nhờ RNA Tổng quan tài liệu 26 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam polymerase I sản sinh ra vRNA sợi (-), trong khi đó sự phiên mã nhờ RNA polymerase II sẽ tạo ra mRNA sợi (+). Các vRNA và mRNA này được tạo ra từ các mẫu giống nhau, phá vỡ sự cần thiết cho việc xây dựng các protein biểu hiện (PB1, PB2, PA, NP) (Hình 1.15). Chúng cũng được dùng để thiết kế một hệ thống phiên mã một chiều (unidirectional) RNA polymerase I – polymerase II cho việc tạo ra virus cúm A từ 8 plasmid [27]. Trong phương pháp này, sự đồng chuyển nhiễm của 8 plasmid có promoter theo thứ tự RNA pol I - pol II chứa cDNA của chủng A/WSN/33 (H1N1) kết quả tạo ra virus cúm A có khả năng lây nhiễm, dù với hiệu quả thấp hơn so với hệ thống hai chiều (bidirectional system). Hai hệ thống reverse genetics này làm giảm số lượng plasmid cần thiết cho sự phục hồi virus cúm A và cho phép tạo ra những virus thay đổi về mặt di truyền (reassortant viruses). Bởi vì sự biểu hiện protein và tổng hợp vRNA được tiến hành từ khuôn mẫu giống nhau, nên hệ thống này không tạo ra các hạt virus khiếm khuyết hay chứa những đột biến độc trong một hay nhiều mảnh gene của virus. Hình 1.15. Hệ thống di truyền ngược Pol I/II tạo virus cúm A từ 8 plasmid [28]. Năm 2005, Neumann đã cải thiện hệ thống di truyền ngược dựa trên Polymerase I/II cho virus cúm A bằng cách giảm số lượng plasmid chuyển nhiễm xuống ít hơn 8 plasmid [46]. Trong phương pháp này, Neumann xây dựng nhiều plasmid khác nhau. Hệ thống plasmid polymerase I (PolI) gồm: plasmid pTM- Tổng quan tài liệu 27 Luận văn thạc sĩ – Mai Văn Nam WSN-PolI-All (Hình 1.16A) chứa toàn bộ 8 cDNA mã hóa 8 vRNA của chủng A/WSN/33 (H1N1) được chèn xen kẽ nhau giữa một promoter RNA polymerase I của người (human RNA polymerase I promoter) và một RNA polymerase I terminator của chuột; plasmid chứa 6 cDNA pTM-WSN-PolI-PB2-PB1-PA-NP-M- NS và plasmid chứa 2 cDNA pTM-WSN-PolI-HA-NA với cách xây dựng tương tự như trên (Hình 1.16B). Hệ thống plasmid polymerase II (PolII) gồm (Hình 1.16C): plasmid pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA chứa các cDNA nằm xen kẽ giữa RNA polymerase II promoter của gà (chicken ß-actin promoter) và trình tự polyadenyl (PolyA) biểu hiện đồng thời phức hệ protein PB2, PB1, PA; các plasmid pCAWS- PB2, pCAWS-PB1, pCAWS-PA, pCAWS-NP biểu hiện các protein PB2, PB1, PA và NP độc lập. Sau đó, kết hợp các phức hệ plasmid này theo nhiều kiểu khác nhau rồi chuyển nhiễm vào tế bào 293T hoặc Vero đều thu được chủng virus cúm A (H1N1). Ví dụ, đồng chuyển nhiễm 3 plasmid pTM-WSN-PolI-All, pC-PolII-WSN- PB2-PB1-PA và pCAWS-NP vào tế bào 293T sẽ cho hiệu quả chuyển nhiễm là 3,2 x 107 PFU. Tương tự, đồng chuyển nhiễm 4 plasmid pTM-WSN-PolI-PB2-PB1- PA-NP-M-NS, pTM-WSN-PolI-HA-NA, pC-PolII-WSN-PB2-PB1-PA và pCAWS- NP cho kết quả 6,3 x 107 PFU [46]. Hệ thống di truyền ngược này cho hiệu quả cao trong thời gian ngắn và giảm thiểu số lượng plasmid sử dụng. Hình 1.16. Các plasmid trong hệ thống di truyền ngược do Neumann cải tiến [46].