Luận văn Tuyển chọn, nuôi cấy chủng aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-Β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó

cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tƣơng ứng. Khi sử dụng CMC vào môi trƣờng nuôi cấy sẽ tác động mạnh đến sinh trƣởng và sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045. Chủng A. oryzae VTCC-F-045 nuôi trong môi 0 40 80 120 160 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 Thời gian (giờ) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 trƣờng MTK pH 6,5 ở 30C và bổ sung CMC ở các nồng độ khác nhau, lắc 200 vòng/phút sau 120 giờ. Kết quả cho thấy ở các nồng độ 0,7; 1,0 và 1,5% hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tăng cao hơn so với đối chứng (ở 0,5%), tăng cao nhất ở nồng độ 1,0% (tăng 32%) và hoạt tính enzyme đạt 11,27 U/ml. Các nồng độ CMC còn lại, hoạt tính enzyme giảm tuyến tính so với đối chứng, giảm mạnh nhất ở nồng độ 2,7% (giảm 57%) và đạt 3,66 U/ml (Hình 3.5 và Bảng 4.4). Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Cao Cƣờng và Nguyễn Đức Lƣợng (2003) khi sử dụng CMC, bột cellulose hay chitinaza vách tế bào nấm làm cơ chất cảm ứng, chúng đều có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp cellulase cao; trong đó cao nhất là CMC. Nhƣ vậy, với nồng độ 1% CMC enzyme đƣợc cảm ứng sinh ra đủ để thủy phân các cao phân tử trong môi trƣờng và cơ chất cho sự sinh trƣởng của tế bào. 3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon Chủng A. oryzae VTCC-F-045 nuôi trong môi trƣờng MTK pH 6,5 bổ sung 1% CMC ở 30C, cao nấm men đƣợc thay bằng các nguồn carbon khác và môi trƣờng có nguồn cao nấm men làm đối chứng, lắc 200 vòng/phút. Sau 0 40 80 120 160 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Nồng độ CMC (%) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 120 giờ nuôi cấy, khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng nghiên cứu trong môi trƣờng có nguồn carbon là lactose và glucose cao hơn đối chứng, hoạt tính đạt 11,81 U/ml và 2,61 U/ml. Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh ra trong môi trƣờng có lõi ngô, vỏ quýt giảm không đáng kể so với nguồn cao nấm men, hoạt tính đạt 2,29 U/ml (lõi ngô) và 1,93 U/ml (vỏ quýt) (Bảng 3.3 và Bảng 4.5). Nhƣ vậy, lactose là nguồn carbon tốt nhất cho chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase. Tuy nhiên, lõi ngô là nguyên liệu dễ kiếm, nên có thể sử dụng cho lên men lƣợng lớn sau này. Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nguồn carbon Hoạt tính U/ml % Bã mía 0,82 35 Cao nấm men 2,32 100 CMC 2,11 91 Glucose 2,61 112 Lactose 11,81 508 Lõi ngô 2,29 99 Sucrose 1,93 83 Trấu cám 1,09 47 Vỏ cà phê 1,62 70 Vỏ lạc 1,01 43 Vỏ quýt 2,10 90 Acharya và cs (2008) nhận thấy, chủng nấm A. niger sinh cellulase mạnh nhất trong môi trƣờng có nguồn carbon là mùn cƣa, hoạt tính đạt 0,18 U/ml. Ở chủng A. flavus NSPR 101 mùn cƣa cũng là nguồn carbon tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase (0,074 U/ml) (Ojumu et al., 2003). Trong khi đó 3 chủng Trichoderma longi, A. niger và Saccheromyces Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 cerevisae khi sử dụng nguồn carbon là vỏ quýt rất thích hợp cho quá trình sinh cellulase (Omojasola and Jilani, 2008). Hoàng Quốc Khánh và cs (2003) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase ở chủng A. niger NRRL-363 cho thấy môi trƣờng chứa nguồn carbon trấu xay và rỉ mật đƣờng rất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase. Ở các chủng xạ khuẩn phân lập từ vỏ cà phê, nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh tổng hợp cellulase là bột cellulose và CMC (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Chellapandi và cs (2008) khi nghiên cứu quá trình tổng hợp endoglucanase ở chủng Streptomyces sp BRC1 và BRC2 cho thấy nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endoglucanase lần lƣợt là glucose và cellobiose. Từ các số liệu thu đƣợc cũng nhƣ tham khảo các tài liệu trong nƣớc và trên thế giới, chúng tôi nhận thấy các chủng khác nhau sẽ thích hợp với nguồn carbon tối ƣu là khác nhau để sinh tổng hợp enzyme tốt nhất. 3.3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ carbon Sau khi xác định đƣợc nguồn carbon là lactose có khả năng cảm ứng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao nhất trong số các nguồn carbon đƣợc khảo sát, lactose đƣợc đƣa vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau từ 0,1% và 0,2-2,2% (cách nhau 0,2). Sau 120 giờ nuôi cấy, hoạt tính endo-β-1,4- glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 đạt cao nhất (15,47 U/ml) ở nồng độ 0,4% lactose, cao gấp 3,64 lần so với đối chứng ở 0,1%. Còn ở nồng độ 0,8% lactose, hoạt tính giảm mạnh nhất, giảm tới 51% so với đối chứng (Hình 3.6 và Bảng 4.6). Nhƣ vậy, với nồng độ 0,4 % lactose endo-β-1,4-glucanase đƣợc cảm ứng sinh tổng hợp cao nhất để phân hủy nguồn carbon dinh dƣỡng cho sự sinh trƣởng của tế bào. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 3.3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MTK bổ sung 1% CMC và 0,4% lactose ở 30C, lắc 200 vòng/phút sau 120 giờ, nguồn peptone đƣợc thay bằng các nguồn nitrogen khác. Kết quả cho thấy khả năng tổng hợp endo-β-1,4-glucanase trong môi trƣờng chứa bột đậu tƣơng tăng 89% so với peptone, còn nguồn nitrogen là NaNO3 và bột cá giảm khá nhiều so với peptone, giảm tới 50-59%. Ở nguồn nitrogen bột đậu tƣơng hoạt tính đạt 12,92 U/ml (Hình 3.7 và Bảng 4.7). Nhƣ vậy, bột đậu tƣơng đƣợc chọn làm nguồn nitrogen trong quá trình nuôi thu enzyme. Đây là nguồn nitrogen tốt và dễ kiếm nên thuận tiện cho việc lên men lƣợng lớn sau này. Những nghiên cứu ở chủng A. niger cho thấy, khi sử dụng nguồn nitrogen là peptone, ammonium sulfate, urea đều thích hợp cho quá trình sinh cellulase và ammonium sulfate làm tăng khả năng sinh cellulase cao nhất (Acharya et al., 2008). Trong khi đó, urea và bột đậu tƣơng lại là nguồn nitrogen thích hợp nhất cho quá trình sinh cellulase ở chủng A. niger (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Narasimha et al., 2006). Đối với các chủng xạ khuẩn đƣợc phân lập từ mẫu vỏ cà 0 100 200 300 400 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 Nồng độ lactose (%) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 phê, sinh tổng hợp mạnh nhất trong môi trƣờng có nguồn nitrogen là KNO3 (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005). Tăng Thị Chính và cs (1999) khi nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt nhận thấy nguồn nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơng) rất thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp cellulase. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen tốt nhất cho chủng Penicillium sp. DQT-HK1 sinh tổng hợp cellulase (Trịnh Đình Khá, 2006). Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 PT: pepton, NO3: NaNO3, NH4: (NH4)2SO4, BC: bột cá, BĐT: bột đậu tƣơng 3.3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ nitrogen Sau khi xác định đƣợc nguồn nitrogen là bột đậu tƣơng có khả năng cảm ứng sinh endo-β-1,4-glucanase cao nhất trong số các nguồn nitrogen đƣợc khảo sát, bột đậu tƣơng đƣợc đƣa vào môi trƣờng với các nồng độ khác nhau: 0,1; 0,5; 1; 1,5; 1,8 và 2%. Sau 120 giờ nuôi cấy, endo-β-1,4-glucanase đƣợc chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp cao nhất (16,39 U/ml) ở nồng độ bột đậu tƣơng 1% cao hơn so 38% so với đối chứng. Bột đậu tƣơng ở 0 50 100 150 200 PT NO3 Ure NH4 BC BĐT Nguồn nitrogen Ho ạt tí nh e nd o- β- 1, 4- gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 các nồng độ còn lại đều làm giảm sinh tổng hợp enzyme so với đối chứng, giảm mạnh nhất ở nồng độ 0,5% (giảm 58%) (Hình 3.8 và Bảng 4.8). Bột đậu tƣơng nồng độ 1% thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045. Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 3.3.7. Nhiệt độ nuôi cấy Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau 28, 30 và 37C trong môi trƣờng khoáng MTK có 0,4% lactose; 1% bột đậu tƣơng, lắc 200 vòng/phút, ở pH 6,5. Sau 120 giờ, nuôi cấy sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đạt cao nhất (14,23 U/ml) ở nhiệt độ 28C và giảm dần khi tăng nhiệt độ lên 30C và 37C. Giảm nhiều nhất ở nhiệt độ 37C, hoạt tính đạt 5,86 U/ml (Hình 3.9 và Bảng 4.9). 0 50 100 150 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Nồng độ bột đậu tương (%) H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh tổng hợp enzyme endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Những nghiên cứu ở chủng A. niger cho thấy, cellulase đƣợc tạo ra nhiều nhất ở 28C (Narasimha et al., 2006, Acharya et al., 2008) và 50C thích hợp cho chủng A. niger NRRL-363 sinh tổng hợp cellulase (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). Ba chủng Trichoderma longi, A. niger và Saccheromyces cerevisae có nhiệt độ tối ƣu là 45C (Omojasola and Jilani, 2008). Các chủng nấm sợi ƣa ấm sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở nhiệt độ 31-34C (Đặng Minh Hằng, 1999). Trong khi đó nhiệt độ tối ƣu cho chủng Penicilium sp. DQT-HK1 là 30C (Trịnh Đình Khá, 2006). Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 28C thích hợp để chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase. 3.3.8. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy Chủng A. oryzae VTCC-F-045 đƣợc nuôi cấy trong MTK có 0,4% lactose và 1% bột đậu tƣơng, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28C và ở các pH khác nhau. Sau 120 giờ nuôi cấy, khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase đạt cao nhất ở pH 5,5 (100%) là 35,7 U/ml. Ở dải pH 4,0-6,5, chủng A. oryzae 0 40 80 120 28 30 37 Nhiệt độ H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase tƣơng đối ổn định từ 34,12-31,48 U/ml đạt 86-88% so với pH tối ƣu 5,5. Ở pH 7,0 endo-β-1,4- glucanase đƣợc tổng hợp thấp nhất (10,37 U/ml) giảm 71 % so với ở pH 5,5 (Hình 3.10 và Bảng 4.10). Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng tới khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhƣ vậy, chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase mạnh trong điều kiện pH môi trƣờng ban đầu nghiêng về phía acid. Theo những nghiên cứu trƣớc đây, các chủng Aspergillus thích hợp trong khoảng pH 4,5-6,0 (Đặng Minh Hằng, 1999, Trịnh Đình Khá, 2006, Omojasola and Jilani, 2008). Trong khi, pH môi trƣờng 5,5 lại thích hợp cho chủng A. niger NRRL-363 sinh cellulase (Hoàng Quốc Khánh et al., 2003). 3.4. Tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase Để tinh sạch sơ bộ endo-β-1,4-glucanase, 40 ml dịch nổi sau khi nuôi cấy đƣợc tủa với ammonium sulfate ở nồng độ 65% và giữ ở 4C qua đêm. Tủa thu đƣợc hòa với 0,1 M đệm acetate pH 5,0 và thẩm tích loại muối. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase riêng của dịch tủa sau loại muối đạt 24,46 U/mg protein và độ sạch enzyme đạt 1,6 lần so với dịch thô ban đầu. 0 40 80 120 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 pH môi trường H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Dịch tủa sau khi loại muối cho qua cột sắc ký lọc gel Sephadex G-100 với thể tích 10 ml, tốc độ dòng chảy là 25 ml/h. Thu thể tích mỗi phân đoạn 2 ml (thu 20 phân đoạn). Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (Hình 3.11A) cho thấy, protein đƣợc phân tách thành 2 peak, trong đó peak ở phân đoạn 10 cao nhất. Hoạt tính riêng của peak 10 đạt 40,36 U/mg protein. Các phân đoạn có hoạt tính cao đƣợc điện di trên gel 12,5% polyacrylamide với chất chỉ thị phân tử. Điện di đồ hình 3.11B cho thấy, peak 10 xuất hiện một băng đậm, có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa. Chứng tỏ, enzyme thu đƣợc khá sạch với độ sạch 2,6 lần so với dịch enzyme thô ban đầu (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Tóm tắt quá trình tinh sạch endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 Bƣớc tinh sạch Protein tổng số (mg/ml) Hoạt tính enzyme Độ tinh sạch (Lần) Hiệu suất thu hồi (%) U/ml U/mg Dịch thô 0,213 3,31 15,54 1,0 100 Tủa (NH4)2SO4 0,074 1,81 24,46 1,6 55 Sephadex G-100 0,028 1,13 40,36 2,6 34 Hình 3.11. Sắc kí đồ trên cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE của chủng A. oryzae VTCC-F-045 (B) Giếng 1: dịch nổi; 2: dịch tủa; 3: phân đoạn 8; 4: phân đoạn 9; 5: phân đoạn 10; 6: marker A B 1 2 3 4 5 6 0 100 200 300 400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Các phân đoạn H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se (U /m g pr ot ei n) 0.0 0.1 0.2 0.3 H àm lư ợ ng p ro te in ( m g/ m l) U/mg mg/ml kDa 116 66 45 35 25 36 kDa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới. Hong và cs (2001) khi tinh sạch endo-β-1,4- glucanase tái tổ hợp (Eng1) ở nấm men sau hai bƣớc tinh sạch: tủa ammonium sulfate (60-100%) và đƣa qua cột DEAE-sephadex A-50 đã thu đƣợc Eng1 có độ sạch 1,73 lần so với dịch enzyme thô, khối lƣợng phân tử khoảng 37 kDa. Endo-β-1,4-glucanase (gồm Cel-1 và Cel-3) từ chủng A. oryzae có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 62 và 34 kDa (Fukuda et al., 2002); Kitamoto và cs (1996) đã tinh sạch endo-β-1,4-glucanase (gồm CelA và Cel B) từ chủng A. oryzae KBN616 sau khi qua cột DEAE (CelA) và SE-sephadex C50 có khối lƣợng lần lƣợt là 31 kDa và 53 kDa. Endo-β-1,4- glucanase (eng1) từ chủng Trametes hirsuta có khối lƣợng khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007). 3.5. Tính chất lý hóa của endo-β-1,4-glucanase 3.5.1. Nhiệt độ phản ứng tối ƣu Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ xúc tác thủy phân cơ chất của enzyme. Mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh sạch và cơ chất CMC đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-80°C, trong 5 phút. Hoạt tính tăng dần trong khoảng từ 19-100% ở dải nhiệt độ từ 30-55C và đạt tối đa 67,69 U/mg ở 55C. Khi nhiệt độ tiếp tục tăng thì hoạt tính enzyme giảm dần, chỉ đạt 63% ở 80C (Hình 3.12 và Bảng 4.12). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Theo những nghiên cứu trƣớc đây, endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. oryzae KBN616 là Cel A và Cel B có nhiệt độ tối ƣu lần lƣợt ở 55C và 45C (Kitamoto et al., 1996); trong khi endo-β-1,4-glucanase gồm Cel-1 và Cel-3 của A. oryzae là 50C và 60C (Fukuda et al., 2002); endo-β-1,4- glucanase (eng1) từ chủng A. niger IFO31125 hoạt động tốt nhất ở 70C (Hong et al., 2001); còn CMCase của chủng A. niger Z10 là 40C (Coral et al., 2002). 3.5.2. pH phản ứng tối ƣu pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tác của enzyme, vì nó ảnh hƣởng tới mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hƣởng tới độ bền protein enzyme. Để khảo sát pH tối ƣu của endo-β-1,4-glucanase, phản ứng giữa enzyme với cơ chất CMC (CMC đƣợc pha trong các đệm có pH khác nhau từ 3,5-7,5) ở 55C và sau 5 phút ủ. Hoạt tính đạt cực đại 95,88 U/mg ở pH 5,5 và tƣơng đối cao ở dải pH từ 5,5-6,5 (48,03-95,88 U/mg) (Hình 3.13 và Bảng 4.13). 0 40 80 120 20 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 Theo nghiên cứu trƣớc đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase của chủng Trametes hirsuta hoạt động mạnh nhất là 5,0; endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae KBN616 gồm CelA và CelB lần lƣợt là 5,0 và 4,0; CMCase của chủng A. niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH là 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002). 3.5.3. Độ bền nhiệt Dƣới tác động của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và bị ảnh hƣởng tới hoạt tính. Một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc và trung tâm hoạt động của enzyme bị đứt gãy bởi nhiệt độ. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào thời gian và nhiệt độ ủ enzyme. Dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau 30, 45, 50, 55 và 60C. Kết quả cho thấy, từ 0-4 giờ ở các nhiệt độ 30, 45, 55 và 60C hoạt tính vẫn đạt từ 47,61-68,81 U/mg. Đặc biệt ở 4 giờ đối với 30C và 55C hoạt tính đạt 65,74-68,81U/mg, tăng 21-27% 0 40 80 120 3 4 5 6 7 8 pH phản ứng H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 so với đối chứng. Từ 6-8 giờ ủ ở 45C và 30C hoạt tính enzyme vẫn duy trì đƣợc từ 68-85%. Ở nhiệt độ còn lại giảm khá mạnh, chỉ đạt 38% ở 50C (Hình 3.14 và Bảng 4.14). Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 bền ở dải nhiệt độ 30-45C. Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Kitamoto và cs (2006) khi nghiên trên chủng A. oryzae KBN616 cho rằng CelA bền ở nhiệt độ dƣới 55C sau 20 giờ ủ, nhiệt độ trên 60C CelA không có hoạt tính; trong khi đó CelB thì bền ở nhiệt độ dƣới 50C và mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 55C. Cũng ở chủng A. oryzae sau khi ủ enzyme (Cel-1 và Cel-3) ở dải nhiệt độ khác nhau (10-80C) trong 30 phút, Yamane và cs (2002) nhận thấy Cel-1 bền ở dải nhiệt độ dƣới 50C và Cel-3 bền ở dải nhiệt độ dƣới 60C. Ở chủng A. niger endo-β-1,4-glucanase sau khi ủ ở 80C hoạt tính còn lại 56% (Hong et al., 2001). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. terreus M11 vẫn còn duy trì đƣợc 60% hoạt tính sau khi ủ ở 70C trong 1 giờ (Gao et al., 2008). 0 50 100 150 0 2 4 6 8 10 Thời gian ủ (giờ) Ho ạt tí nh e nd o- β- 1, 4- glu ca na se tư ơn g đố i ( % ) 30 45 50 55 60 0 50 100 150 0 2 4 6 8 10 Thời gian ủ (giờ) Hoạt tính e ndo-β-1,4-g lucanase tư ơng đối (% ) 30 45 50 55 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 3.5.4. Độ bền pH pH ảnh hƣởng tới độ bền enzyme, nên việc lựa chọn pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Tùy loại protein enzyme mà có độ bền trong một môi trƣờng pH nhất định. Ở đây, độ bền của endo-β-1,4-glucanase đƣợc khảo sát trong các đệm khác nhau với dải pH 4,5-7,5. Kết quả cho thấy sau 1 giờ ủ, chỉ có ở pH 6,0 hoạt tính tƣơng đối của enzyme vẫn giữ đƣợc 88%, trong khi ở các pH còn lại giảm khá mạnh, giảm mạnh nhất ở pH 6,5 hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 60%. Ở các thời gian ủ 2, 4 và 6 giờ hoạt tính còn lại của enzyme ở các pH khảo sát giảm khá mạnh, giảm mạnh nhất ở pH 6,5 hoạt tính chỉ đạt 53% và giảm ít nhất ở pH 6,0 hoạt tính đạt 64%. Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase ở chủng A. oryzae VTCC-F-045 bền ở pH 6,0 sau 1 giờ ủ (Hình 3.15 và Bảng 4.15). Hình 3.15. Ảnh hƣởng của pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, endo-β-1,4-glucanase gồm CelA và CelB của chủng A. oryzae KBN616 bền ở dải pH từ 3,0-7,0 sau 20 giờ ủ ở 30C, tuy nhiên CelB không bền ở pH 3,0 và 7,0 giống CelA (Kitamoto et al., 0 40 80 120 0 2 4 6 8 Thời gian ủ (giờ) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tƣơn g đối (%) pH 4.5 pH 5.0 pH 5.5 pH 6,0 pH 7.5 40 80 120 0 2 4 6 8 Thời gian ủ (giờ) Ho ạt tín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tƣ ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 1996); Trong khi enzyme từ chủng A. niger bền ở dải pH từ 3,0-10,0 sau 1 giờ ủ (Hong et al., 2001). CMCase gồm C-I và C-II của chủng Cephalosporium sp RYM-202 bền ở dải pH rộng và hoạt tính vẫn còn duy trì trên 80% ở pH 11 sau 24 giờ ủ (Kang and Rhee, 1995). Endo-β-1,4-glucanase của chủng A. terreus M11 bền ở dải pH từ 2,0-5,0 (Gao et al., 2008). 3.5.5. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ Trong dung dịch enzyme, dung môi hữu cơ làm giảm hằng số điện môi và tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợc ủ cùng với các dung môi khác nhau ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, cả 5 dung môi khảo sát làm giảm hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase. Trong đó, n-butanol ảnh hƣởng mạnh nhất làm giảm hoạt tính tƣơng đối của enzyme chỉ còn 43%. Acetone và ethanol làm hoạt tính tƣơng đối của enzyme còn 56% và 76%. Isopropanol và methanol làm giảm hoạt tính ít hơn so với đối chứng (80-81%) (Hình 3.16 và Bảng 4.16). Nhƣ vậy, các dung môi hữu cơ khảo sát ít ảnh hƣởng tới hoạt tính của endo-β- 1,4-glucanase trừ n-butanol. Hình 3.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 0 40 80 120 ĐC MetOH EtOH IsOH Act n-BtOH Dung môi hữu cơ H oạ t t ín h en do -β -1 ,4 -g lu ca na se tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 3.5.6. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa Các chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS ảnh hƣởng tới hoạt tính enzyme. Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với các chất tẩy rửa có nồng độ khác nhau là 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 và 2,0% ở nhiệt độ phòng, sau 4 giờ ủ hoạt tính còn lại đƣợc xác định ở 55°C. Kết quả cho thấy, nồng độ các chất tẩy rửa càng cao thì hoạt tính của enzyme giảm càng mạnh. Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS ở 5 nồng độ đều làm giảm hoạt tính tƣơng đối của enzyme so với đối chứng. Hoạt tính tƣơng đối của enzyme khi ủ với Tween 20 ở nồng độ 0,4-0,8% vẫn còn duy trì đƣợc 63-77% so với đối chứng; trong khi ở nồng độ 1,2-2,0% làm hoạt tính enzyme giảm khá mạnh, hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 31% ở nồng độ 2,0%. Tween 80, Triton X-100 và SDS làm hoạt tính tƣơng đối của enzyme giảm mạnh. Đối với SDS hoạt tính enzyme bị ức chế rõ rệt. SDS ở nồng độ 0,4% hoạt tính chỉ đạt 15%, còn ở nồng độ 2,0% hoạt tính chỉ còn 4% so với đối chứng (Hình 3.17 và Bảng 4.17). Hình 3.17. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 0 25 50 75 100 T20 T80 TX-100 SDS Chất tẩy rửa Hoạt tính end o-β-1,4-gluca nase tương đ ối (%) 0.4% 0,8% 1.2% 1,6% 2.0% 0 25 50 75 100 T20 T80 TX-100 SDS Chất tẩy rửa Ho ạt tí nh e nd o- β- 1, 4- gl uc an as e tư ơn g đố i ( % ) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 3.5.7. Ảnh hƣởng của ion kim loại Để nghiên cứu ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính của endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với các ion kim loại ở các nồng độ khác nhau là 4; 8 và 12 mM ở nhiệt độ phòng. Sau 4 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định ở 55°C. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 4 mM các ion kim loại và EDTA ảnh hƣởng rất ít tới hoạt tính enzyme. Trong đó, ion K+ làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme so với đối chứng (tăng 3%). Các ion kim loại khác và EDTA làm hoạt tính enzyme giảm nhẹ. Trong đó, ion Ag + làm hoạt tính enzyme giảm hơn cả (giảm 16%). Ở nồng độ 8-12% hoạt tính enzyme vẫn đƣợc duy trì từ 70-99% khi ủ với các ion kim loại. Trừ Fe2+ và Zn 2+ làm giảm mạnh hoạt tính enzyme Zn2+ 57%, Fe2+ 58%) (Bảng 3.4 và Bảng 4.18). Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Ion kim loại (mM) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase sau 4 giờ ủ (%) 4 8 12 Ag + 84 99 73 Ca 2+ 90 81 73 Co 2+ 92 93 92 Cu 2+ 96 92 87 EDTA 96 89 71 Fe 2+ 87 64 58 K + 103 86 83 Mn 2+ 97 82 77 Ni 2+ 95 92 70 Zn 2+ 87 62 57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Gao và cs (2008) khi nghiên cứu endo-β-1,4-glucanase từ chủng A. terreus M11 cho thấy, hoạt tính endo-β-1,4-glucanase giảm mạnh khi ủ với các ion kim loại Hg2+, Cu2+; Pb2+ và EDTA ở nồng độ 2,0 mM. Hoạt tính chỉ đạt 77% đối với ion Hg2+ và 59% với ion Cu2+. Trong khi Sr2+, Zn2+ và Mn2+ lại làm tăng hoạt tính của enzyme. Chinedu và cs (2008) nghiên cứu trên chủng P. chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và Fe2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% và 162%). Trong khi Mn 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ và EDTA ức chế mạnh hoạt động của enzyme (đạt 20% với EDTA và 43% với Hg2+). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Chủng A. oryzae VTCC-F-045 có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase cao nhất trong số 35 chủng đã đƣợc tuyển chọn. Trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng này (đăng ký trong Genebank: GQ382276) tƣơng đồng 99,7% với chủng thuộc chi Aspergillus trong cây phân loại. 2. Điều kiện để chủng A. oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4- glucanase tối ƣu là: Thời gian 120 giờ; nhiệt độ 28°C; pH ban đầu 5,5; môi trƣờng khoáng MTK với 1% CMC; 0,4% lactose (nguồn carbon) và 1% bột đậu tƣơng (nguồn nitrogen) 3. Qua hai bƣớc tinh sạch bằng tủa ammonium sulfate 65% và cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, endo-β-1,4-glucanase tinh sạch đƣợc có độ sạch so với enzyme thô ban đầu là 2,6 lần và có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa. 4. Endo-β-1,4-glucanase hoạt động tốt nhất ở pH 5,5 và nhiệt độ 55°C, bền ở 30-45°C và có hoạt tính cao trong pH 6,0. Các dung môi hữu cơ ít ảnh tới endo-β-1,4-glucanase trừ n-butanol. Các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 và SDS), các ion kim loại và EDTA (nồng độ 4-12 mM hầu nhƣ đều làm giảm hoạt tính endo-β-1,4-glucanase. KIẾN NGHỊ 1. Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với nguồn dinh dƣỡng là bột đậu tƣơng, lõi ngô, CMC và thành phần khoáng. 2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endo-β-1,4-glucanase từ môi trƣờng nuôi cấy. 3. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc, nâng cao chất lƣợng của vật nuôi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 4. Nghiên cứu cấu trúc gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase, tạo endo-β- 1,4-glucanase tái tổ hợp nhằm cải thiện năng suất và có những tính năng phù hợp mong muốn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999) Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloza cao để nâng cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551. 2. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999) Nghiên cứu sản xuất cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797. 3. Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Khảo sát quá trình cảm ứng enzyme chitinaza và celluloza của Trichoderma harzianum ảnh hƣởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsic, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 321-324. 4. Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu quả sử dụng năng lƣợng và giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ chăn nuôi-Viện chăn nuôi quốc gia: 16. 5. Đặng Minh Hằng (1999) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339. 6. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003) Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, xenluloza hoặc dầu ô lƣu trong quá trình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 phân hủy chất thải hữu cơ, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291. 7. Nguyễn Lan Hƣơng, Lê Văn Nhƣơng, Hoàng Đình Hoà (1999) Phân lập và hoạt hóa vi sinh vật ƣa nhiệt độ có hoạt tính xenlulaza cao để bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 531-536. 8. Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase, Luận văn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 9. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL- 363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307. 10. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa học, hội nghị viện Công Nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội: 177-182. 11. Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Sản xuất cà phê theo phƣơng pháp enzyme, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 318-320. 12. Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999) Khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus, Báo khoa học, hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội: 804-809. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 13. Nguyễn Thị Thảo (2005) Tối ƣu các điều kiện nuôi cấy chủng Serratia sp. DT3 sinh tổng hợp protease ngoại bào và xác định tính chất lý hóa, Luận văn thạc sỹ sinh học. 14. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 15. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Bích, Hoàng Thị Hà Giang (2008) Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ Actinomyces để xử lý phế thải nông nghiệp, Hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học và Kỹ thuật: 901-903. 16. Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007) Tƣơng lai ứng dụng enzyme trong xử lý phế thải, Tạp chí khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 23: 75-85. 17. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Văn Thuật, Quyền Đình Thi (2008) Đánh giá một số tính chất hóa lý của xylanase từ chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1863, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(3): 721-728. 18. Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh, Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính (2005) Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp xenllulaza cao, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 872-875. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 TIẾNG ANH 1. Acharya PB, Acharya DK, Modi HA (2008) Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate, Afr J Biotechnol, 7: 4147-4152. 2. Bergquist P, Gibbs M, Morris D, Teo V, Saul D, Morgan H (1999) Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria, FEMS Microbiol Ecol 28: 99-110. 3. Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM (1990) Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic cello oligosaccharides, Biochem J, 266: 371-378. 4. Chellapandi P, Himanshu M, Jani (2008) Production of endoglucanase by the native strains of Steptomyces isolates in submerged fermentation, Brazil Microbiol, 39: 122-127. 5. Chinedu S, Nwinyi C, Okochi V (2008) Properties of endoglucanase of Penicillium chrysogemum PCL501, Austr Basic Appl Sci, 2(3): 738- 746. 6. Claeyssens M, Tilbeurgh HV, Tomme P, Wood TM, McRae SI (1989) Fungal cellulase systems. Comparison of the specificities of the cellobiohydrolases isolated from Penicillium pinophilum and Trichoderma reesei, Biochem J, 216: 819-900. 7. Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002) Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus nige1r Z10 wild-type strain, Turk J Biol, 26: 209-213. 8. Dahot M, Noomrio M (1996) Microbial production of cellulase by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source, J Islamic Acad Sci, 9: 119-124. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 9. de la Mata I, Estrada P, Macarron R, Dominguez JM, Castillon MP, Acebal C (1992) Chemical mechanism of beta glucosidase from Trichoderma reesei QM 9414 pH-defrendence of kinetic parameters, Biochem, 283: 679-682. 10. Fukuda H, Mikami S, Kizaki Y, Wakabayashi S (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci and Bioeng, 95(5): 479-484. 11. Galagan JE, Calvo SE, Cuomo C, Ma LJ, Wortman, JR, Batzoglou S, Lee SI, Basturkmen M (2005) Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with Aspergillus fumigatus and Aspergillus oryzae, Nature, 438: 1105-1115. 12. Gao JN, Weng HB, Xi Y, Zhu DH, Han SY (2008) Purification and characterization of a novel endo-β-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus, Biotechnol Lett, 30: 323-327. 13. Gielkens M, Dekkers E, Visser J, Graaff L (1990) Two cellobiohydrolase-encoding gene from Aspergillus niger require D- xylose and the xylanolytic transriptional activator XlnR for thier expression, Appl Envirion Microbiol, 65: 4340-4345. 14. Gilkes N, Henrissat B, Kilburn D, Miler R, Warren R (1991) Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence consveration, function, and enzyme families, Microbial Rev, 55: 303-315. 15. Hara Y, Hinoki Y, Shimoi H, Ito K (2003) Cloning and sequence analysis of endoglucanase genes from an industrial fungus Aspergillus kawachi, Biosci Biotechnol Biochem, 67: 2010-2013. 16. Henning J, Morkeberg A, Krogh K, Olsson L (2005) Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary elechtrophoresis, Enzyme Microb Tech, 36:42-48. 17. Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon J (1989) Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis, Gene, 81: 83-95. 18. Hong J, Tamoki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumajai H (2001) Cloning of a gene encoding a highly stable endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast, J Biosc and Bioengin, 92: 434-441. 19. Kang M, Rhee Y (1995) Caeboxymethyl cellulases active and stable at alkaline pH from alkalophilic cephalosporium sp. RYM-202, Biotechnol Lette, 17: 507-512. 20. Kawamori M, Takayama K, Takasawa S (1987) Production of cellulase by a thermophilic fungus, Thermoascus aurantiacus A-131, Agric Biol Chem, 51: 647-654. 21. Khan M, Ali S, Fakhrul-Razi A, Alam Z (2007) Use of fungi for the bioconversion of rice straw into cellulase enzyme, J Environ Sci Health, 42: 381-386. 22. Kitamoto K (2002) Molecular biology of te Koij molds, Adv in Appl Microbiol, 51: 129-153. 23. Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K, Tsukagoshi N (1996) Molecular cloning, purification and characterization of two endo-1,4-β-glucanases from Aspergillus oryzae KBN616, Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544. 24. Lee R, Weimer P, Vanzyl W, Pretorius I (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnolog, Microbiol Mol Biol Rev, 66: 506-577. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 25. Macarron R, Acebal C, Castillon M, Dominguez M, Kata I, Pettersson G, Tomme P, Claeyssenst M (1993) Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma reesei, Biochem J, 289: 867-873. 26. Machida M, Asai K, Sano M, Tanaka T, Kumagai T, Terai G, Kusumoto K, Terai G, Kusumoto K, Arima T (2005) Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae, Nature, 438: 1157- 1161. 27. Milala M, Shehu B, Zanna H, Omosioda V (2009) Degradation of Agaro-Waste by Cellulase from Aspergillus candidus, Asian Journal of Biotechnology, 1: 51-56. 28. Narasimha G, Sridevi A, Buddolla V, Subhosh CM, Rajsekhar RB (2006) Nutrient effect on production of cellulolytic enzyme by Aspergillus oryzae, Afr J Biotechnol, 5: 472-476. 29. Nelson N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi mehtod for the determination of glucose, J Biol Chem, 153: 375-380. 30. Nozaki K, Seki T, matsui K, Mizuno M, Kanda T, Amano Y (2007) Structure and characteristics of an endo-beta-1,4-glucanase, isolated from Trametes hirsuta, with high degradation to crystalline cellulose, Biosci Biotechnol Biochem, 71(10): 2375-2382. 31. Ojumu TV, Solomon BO, Betiku EL, Stephen K, Amigun B (2003) Cellulase production by Aspergillus flavus Linn Isolate NSPR 101 fermented in sawdust, bagasse and corncob, Afr Biotechnol, 2: 150-152. 32. Omojasola P, Jilani O (2008) Cellulase production by Trichoderma longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste from orange, Pakistan Biol Sci, 11: 2382-2388. 33. Sandgren M, Guafetti, PJ, Paech, C, Paech S, Shaw A, Gross L, Saldajeno M, Berglund G, Jones T, Mitchinson C (2003) The Humicola Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability, Protein Sci, 12: 2782– 2793. 34. Sang J, Young J, Hyen S (1995) Characterization of a bifunctional cellulase and structural gene. The cel gene of Bacillus sp. D04 has exo- endoglucanase activity, J Biol chem, 270: 26012-26019 35. Tang X, He G, Chen Q, Zhang X, Ali M (2004) Medium optimization for the production of thermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology, Bioresour Technol, 93(2): 175-181. 36. Yamane Y, Furita J, Izuwa S, Fukuchi K, Shimizu R, Hiyoshi A (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash fermention, Biosci Bioeng, 95(5): 479-484. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 PHỤ LỤC Bảng 4.1. Đƣờng chuẩn glucose STT glucose (μl ) Đệm natri acetate pH 5,0 (l) Nồng độ (μg/ml) OD (660nm) 1 10 490 20 0,112 2 15 485 30 0,188 3 20 480 40 0,256 4 25 475 50 0,319 5 30 470 60 0,401 6 40 460 80 0,566 Bảng 4.2. Trình tự nucleotide của đoạn gene 28S rRNA từ chủng A. oryzae VTCC-F-045 Trình tự nucleotide Vị trí Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Bảng 4.3. Khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian Thời gian (giờ) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 24 0,42 0,54 0,47 1,96 ± 0,062 101 36 0,46 0,50 0,48 1,99 ± 0,022 103 48 0,45 0,52 0,48 2,00 ± 0,033 104 60 0,37 0,47 0,42 1,73 ± 0,053 90 72 0,39 0,54 0,47 1,93 ± 0,075 100 84 0,40 0,48 0,44 1,81 ± 0,038 94 96 0,26 0,27 0,26 1,09 ± 0,002 56 108 0,36 0,36 0,36 1,49 ± 0,003 77 120 0,66 0,48 0,57 2,35 ± 0,091 122 132 0,28 0,57 0,42 1,75 ± 0,145 90 144 0,33 0,67 0,50 2,08 ± 0,170 107 156 0,22 0,63 0,42 1,76 ± 0,207 91 Bảng 4.4. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nồng độ CMC (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 0,5 0,42 0,39 0,44 0,42 8,52 ± 0,014 100 0,7 0,49 0,48 0,48 0,48 9,86 ± 0,002 116 1,0 0,51 0,59 0,56 0,55 11,27 ± 0,025 132 1,5 0,43 0,41 0,43 0,42 8,58 ± 0,008 101 2,0 0,30 0,31 0,30 0,31 6,21 ± 0,012 73 2,5 0,21 0,22 0,24 0,22 4,53 ± 0,008 53 2,7 0,18 0,16 0,20 0,18 3,66 ± 0,012 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nguồn cacbon OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình Bã mía 0,33 0,38 0,35 0,82 ± 0,028 35 Cao nấm men 0,87 1,12 0,99 2,32 ± 0,124 100 CMC 0,27 0,26 0,26 2,11 ± 0,005 91 Glucose 0,57 0,41 0,49 2,61 ± 0,082 112 Lactose 0,40 0,35 0,38 11,81 ± 0,022 508 Lõi ngô 0,42 0,50 0,46 2,29 ± 0,040 99 Sacarose 0,61 0,61 0,61 1,93 ± 0,004 83 Vỏ cà phê 0,66 0,68 0,67 1,62 ± 0,009 70 Vỏ lạc 0,26 0,38 0,32 1,01 ± 0,060 43 Vỏ quýt 0,65 0,94 0,80 2,10 ± 0,0143 90 Trấu cám 0,51 0,62 0,57 1,09 ± 0,055 47 Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của nồng độ lactose tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nồng độ lactose (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 0,1 0,11 0,10 0,11 4,25 ± 0,002 100 0,2 0,20 0,11 0,15 6,24 ± 0,043 147 0,4 0,49 0,27 0,38 15,47 ± 0,111 364 0,6 0,22 0,16 0,19 7,57 ± 0,030 178 0,8 0,04 0,06 0,05 2,08 ± 0,010 49 1,0 0,09 0,18 0,14 5,52 ± 0,044 130 1,2 0,15 0,20 0,17 6,92 ± 0,026 163 1,4 0,19 0,26 0,23 9,13 ± 0,033 215 1,6 0,11 0,10 0,11 4,29 ± 0,005 101 1,8 0,11 0,09 0,10 4,13 ± 0,009 97 2,0 0,07 0,14 0,10 4,09 ± 0,034 96 2,2 0,12 0,14 0,13 5,13 ± 0,013 121 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 Bảng 4.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nguồn nitrogen OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 TB Bột cá 0,14 0,20 0,17 3,39 ± 0,033 50 Bột đậu tƣơng 0,63 0,63 0,63 12,92 ± 0,002 189 Pepton 0,32 0,36 0,34 6,83 ± 0,020 100 Urea 0,32 0,48 0,40 8,13 ± 0,083 119 (NH4)2SO4 0,31 0,38 0,34 7,01 ± 0,036 103 NaNO3 0,15 0,13 0,14 2,79 ± 0,012 41 Bảng 4.8. Ảnh hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nồng độ bột đậu tƣơng (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 TB 0,1 0,42 0,35 0,39 11,85 ± 0,034 100 0,5 0,11 0,22 0,16 4,99 ± 0,035 42 1,0 0,57 0,50 0,54 16,39 ± 0,02 138 1,5 0,21 0,24 0,22 6,83 ± 0,002 58 1,8 0,21 0,21 0,21 6,38 ± 0,001 54 2,0 0,20 0,17 0,19 5,67 ± 0,014 48 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) % Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 28 o C 0,39 0,34 0,32 0,35 14,23 ± 0,023 100 30 o C 0,28 0,28 0,26 0,27 11,03 ± 0,008 78 37 o C 0,17 0,14 0,12 0,15 5,86 ± 0,014 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 Bảng 4.10. Ảnh hƣởng của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 pH OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB 3,5 0,39 0,42 0,45 0,42 17,04 ± 0,015 54 4,0 0,75 0,84 0,92 0,83 34,12 ± 0,050 108 4,5 0,78 0,78 0,70 0,75 30,71 ± 0,026 98 5,0 0,70 0,67 0,67 0,68 27,66 ± 0,010 88 5,5 0,81 0,89 0,91 0,87 35,70 ± 0,030 113 6,0 0,77 0,83 0,82 0,81 32,97 ± 0,019 105 6,5 0,80 0,69 0,82 0,77 31,48 ± 0,039 100 7,0 0,19 0,29 0,29 0,26 10,36 ± 0,035 33 7,5 0,31 0,32 0,25 0,29 11,88 ± 0,022 38 8,0 0,42 0,42 0,47 0,44 17,84 ± 0,018 57 8,5 0,49 0,38 0,38 0,42 17,01 ± 0,036 54 Bảng 4.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ (oC) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 30 0,12 0,16 0,14 12,67 ± 0,021 19 35 0,12 0,19 0,15 14,23 ± 0,033 21 40 0,52 0,40 0,46 42,53 ± 0,060 63 45 0,55 0,53 0,54 49,58 ± 0,007 73 50 0,58 0,56 0,57 52,19 ± 0,009 77 55 0,75 0,73 0,74 67,69 ± 0,009 100 60 0,73 0,71 0,72 66,25 ± 0,007 97 65 0,53 0,55 0,54 49,67 ± 0,011 73 70 0,45 0,46 0,46 41,98 ± 0,006 62 75 0,50 0,51 0,51 46,60 ± 0,005 69 80 0,49 0,44 0,47 42,99 ± 0,026 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Bảng 4.12. Ảnh hƣởng của pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 pH OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình 3,5 0,10 0,11 0,103 48,03± 0,003 50 4,0 0,10 0,10 0,104 48,49± 0,001 51 4,5 0,12 0,11 0,116 54,21± 0,002 57 5,0 0,12 0,13 0,126 58,79± 0,002 61 5,5 0,19 0,22 0,207 95,88± 0,013 100 6,0 0,13 0,14 0,135 62,91± 0,001 66 6,5 0,18 0,19 0,187 86,49± 0,003 90 7,0 0,14 0,14 0,136 63,14± 0,001 66 7,5 0,13 0,13 0,127 59,02± 0,001 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase Nhiệt độ ( o C) Thời gian ủ (giờ) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình ĐC 0 0,58 0,59 0,59 54,20 ± 0,002 100 30 1 0,52 0,51 0,51 53,56 ± 0,003 99 2 0,23 0,23 0,23 56,90 ± 0,001 105 4 0,21 0,21 0,21 65,74 ± 0,004 121 6 0,17 0,18 0,18 37,17 ± 0,001 69 8 0,14 0,15 0,14 36,90 ± 0,004 68 45 1 0,58 0,57 0,57 52,78 ± 0,005 97 2 0,55 0,56 0,56 51,04 ± 0,002 94 4 0,56 0,54 0,55 50,54 ± 0,006 93 6 0,54 0,55 0,54 49,99 ± 0,004 92 8 0,55 0,45 0,50 45,92 ± 0,005 85 50 1 0,41 0,45 0,43 59,60 ± 0,016 73 2 0,48 0,48 0,48 44,27 ± 0,003 82 4 0,39 0,38 0,38 35,20 ± 0,003 65 6 0,27 0,37 0,32 29,48 ± 0,046 54 8 0,23 0,22 0,22 20,78 ± 0,005 38 55 1 0,59 0,45 0,52 47,61 ± 0,067 88 2 0,57 0,63 0,60 55,26 ± 0,028 102 4 0,70 0,80 0,75 68,81 ± 0,049 127 6 0,63 0,58 0,60 55,30 ± 0,026 102 8 0,42 0,35 0,39 35,48 ± 0,034 65 60 1 0,58 0,58 0,58 53,24 ± 0,001 98 2 0,55 0,56 0,56 51,09± 0,005 94 4 0,54 0,52 0,53 48,80 ± 0,014 90 6 0,32 0,36 0,34 31,45 ± 0,021 58 8 0,32 0,30 0,31 28,56 ± 0,006 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 Bảng 4.14. Độ bền pH của endo-β-1,4-glucanase pH Thời gian ủ (giờ) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 Trung bình ĐC 0 0,58 0,59 0,59 112,3 ± 0,002 100 4,5 1 0,52 0,51 0,51 68,64 ± 0,003 61 2 0,23 0,23 0,23 67,03 ± 0,001 60 4 0,21 0,21 0,21 65,66 ± 0,004 58 6 0,17 0,18 0,18 59,96 ± 0,001 51 5,5 1 0,58 0,57 0,57 81,23 ± 0,005 72 2 0,55 0,56 0,56 80,31 ± 0,002 71 4 0,56 0,54 0,55 76,65 ± 0,006 68 6 0,54 0,55 0,54 57,42 ± 0,004 51 6,0 1 0,41 0,45 0,43 99,31 ± 0,016 88 2 0,48 0,48 0,48 75,50 ± 0,003 67 4 0,39 0,38 0,38 73,67 ± 0,003 66 6 0,27 0,37 0,32 72,07 ± 0,046 64 6,5 1 0,59 0,45 0,52 67,03 ± 0,067 60 2 0,57 0,63 0,60 64,06 ± 0,028 57 4 0,70 0,80 0,75 59,94 ± 0,049 53 6 0,63 0,58 0,60 59,25 ± 0,026 53 7,5 1 0,58 0,58 0,58 68,41 ± 0,001 61 2 0,55 0,56 0,56 67,95 ± 0,005 60 4 0,54 0,52 0,53 67,49 ± 0,014 60 6 0,32 0,36 0,34 63,14 ± 0,021 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Bảng 4.15. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 CTR Nồng độ (%) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 TB ĐC 0 0,22 0,21 0,22 99,54 ± 0,001 100 Tween 20 0,4 0,16 0,16 0,16 76,19 ± 0,000 77 0,8 0,14 0,13 0,13 62,68 ± 0,002 63 1,2 0,08 0,09 0,08 39,56 ± 0,002 40 1,6 0,07 0,07 0,07 32,23 ± 0,001 32 2,0 0,07 0,07 0,07 31,32 ± 0,001 31 Tween 80 0,4 0,09 0,08 0,09 40,02 ± 0,003 40 0,8 0,08 0,08 0,08 37,73 ± 0,000 38 1,2 0,07 0,07 0,07 32,92 ± 0,001 33 1,6 0,07 0,07 0,07 31,78 ± 0,002 32 2,0 0,06 0,06 0,06 26,97 ± 0,001 27 Trixton X100 0,4 0,10 0,09 0,10 44,60 ± 0,004 45 0,8 0,09 0,09 0,09 40,02 ± 0,000 40 1,2 0,08 0,09 0,08 39,79 ± 0,001 40 1,6 0,09 0,08 0,08 38,87 ± 0,003 39 2,0 0,08 0,07 0,07 34,29 ± 0,003 34 SDS 0,4 0,03 0,03 0,03 15,29 ± 0,001 15 0,8 0,02 0,02 0,02 11,63 ± 0,001 12 1,2 0,02 0,01 0,01 7,51 ± 0,001 8 1,6 0,01 0,01 0,01 6,59 ± 0,001 7 2,0 0,01 0,01 0,01 4,30 ± 0,001 4 Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ (oC) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % Lần 1 Lần 2 TB ĐC 0,16 0,17 0,17 76,65 ± 0,004 100 Metanol 0,13 0,14 0,13 62,00 ± 0,002 81 Ethanol 0,13 0,12 0,13 58,33 ± 0,002 76 Isopropanol 0,13 0,13 0,13 61,54 ± 0,000 80 Aceton 0,09 0,09 0,09 42,99 ± 0,002 56 n-Butanol 0,07 0,07 0,07 33,15 ± 0,001 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của chủng A. oryzae VTCC-F-045 Ion kim loại Nồng độ (mM) OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) Lần 1 Lần 2 TB ĐC 0 0,30 0,29 0,29 135,26 ± 0,003 Ag + 4 0,25 0,24 0,25 113,28 ± 0,001 8 0,29 0,29 0,29 131,42 ± 0,001 12 0,21 0,21 0,21 98,17 ± 0,002 Ca 2+ 4 0,28 0,25 0,26 121,52 ± 0,017 8 0,24 0,23 0,24 109,16 ± 0,002 12 0,21 0,22 0,21 99,08 ± 0,004 Co 2+ 4 0,27 0,27 0,27 124,50 ± 0,001 8 0,27 0,28 0,27 126,10 ± 0,003 12 0,27 0,27 0,27 124,73 ± 0,000 Cu 2+ 4 0,28 0,28 0,28 129,30 ± 0,000 8 0,27 0,27 0,27 124,27 ± 0,004 12 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,001 EDTA 4 0,25 0,31 0,28 129,30 ± 0,030 8 0,25 0,27 0,26 120,15 ± 0,010 12 0,20 0,21 0,21 95,42 ± 0,002 Fe 2+ 4 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,000 8 0,19 0,18 0,19 86,26 ± 0,002 12 0,16 0,17 0,17 78,02 ± 0,002 K + 4 0,30 0,30 0,30 138,69 ± 0,001 8 0,25 0,26 0,25 116,94 ± 0,002 12 0,24 0,24 0,24 111,90 ± 0,002 Mn 2+ 4 0,28 0,29 0,28 130,68 ± 0,003 8 0,24 0,24 0,24 111,45 ± 0,001 12 0,22 0,23 0,22 103,66 ± 0,004 Ni + 4 0,28 0,28 0,28 127,93 ± 0,001 8 0,27 0,27 0,27 124,45 ± 0,001 12 0,21 0,21 0,21 94,96 ± 0,000 Zn 2+ 4 0,25 0,26 0,26 118,32 ± 0,002 8 0,17 0,19 0,18 83,25 ± 0,010 12 0,17 0,17 0,17 77,11 ± 0,001 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79