Luận văn Xây dựng phương pháp định lượng azithromycin trong huyết tương

Èn nh¹y c¶m víi thuèc nh­ nhiÔm khuÈn ®­êng h« hÊp d­íi (viªm phæi, viªm phÕ qu¶n, c¸c nhiÔm khuÈn da vµ m« mÒm, viªm tai gi÷a), ®­êng h« hÊp trªn (viªm xoang, viªm häng vµ viªm amidan), nhiÔm khuÈn ®­êng sinh dôc ch­a biÕn chøng do Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae kh«ng ®a kh¸ng. * LiÒu dïng vµ c¸ch dïng [4]. - Dïng 1 lÇn mçi ngµy, uèng tr­íc b÷a ¨n 1 giê hoÆc sau khi ¨n 2 giê. - Ng­êi lín: ngµy ®Çu uèng 1 liÒu 500mg vµ dïng tiÕp 4 ngµy n÷a víi liÒu ®¬n 250mg/ngµy. - TrÎ em: liÒu gîi ý cho trÎ uèng ngµy ®Çu lµ 10mg/kg thÓ träng, vµ 4 ngµy tiÕp theo lµ 5mg/kg thÓ träng mçi ngµy uèng mét lÇn. * D¹ng bµo chÕ [5]. - Viªn nang AZI dihydrat t­¬ng ®­¬ng AZI 250mg vµ 500mg. - Bét pha hçn dÞch uèng AZI dihydrat t­¬ng ®­¬ng 200mg AZI/ 5ml, lä bét ®«ng kh« pha tiªm 500mg. - Viªn nÐn vµ viªn nÐn bao phim t­¬ng ®­¬ng AZI 125mg, 250mg vµ 500mg; viªn nÐn ph©n t¸n t­¬ng ®­¬ng AZI 100mg. 1.2. Mét sè ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng AZI trong dÞch sinh häc. Theo tµi liÖu khoa häc cña n­íc ngoµi cã thÓ ®Þnh l­îng AZI trong dÞch sinh häc b»ng nh÷ng ph­¬ng ph¸p sau: *C¸c nghiªn cøu sö dông s¾c ký B¶ng 1.1. Mét sè nghiªn cøu ®Þnh l­îng AZI trong dÞch sinh häc b»ng HPLC T/ liÖu MÉu thö Cét s¾c ký §iÒu kiÖn s¾c ký [12] HT ng­êi Acquity UPLC TM BHE C18 ( 50 x 2,1 mm; 1,7mm Waters) - Dung m«i chiÕt: Diethyl ether - Pha ®éng: MeCN- NH4CH3COO 0,05M - ChuÈn néi: ROXI - Tèc ®é dßng: 0,35ml/phót - Detector: MS - §­êng chuÈn: 1-1000ng/ml - LOQ: 1ng/ml [18] HuyÕt thanh ng­êi Al2O3 - Pha ®éng: Na3PO4 0,02M : MeCN(1:3) pH=10. - Tèc ®é dßng: 1,5ml/phót - Detector: ®iÖn hãa. - §­êng chuÈn: 10ng/ml – 1000ng/ml [13] HT ng­êi Symmetry C18 (250 x 2,1mm; 3mm) - Pha ®éng: MeCN- NH4CH3COO 0,05M. - ChuÈn néi: CLA - Tèc ®é dßng: 0,5ml/phót - Detector : MS - §­êng chuÈn 2,5-2000ng/ml [10] HuyÕt thanh ng­êi Phenyl C18 (250 x 2,1mm; 5mm) - Dung m«i chiÕt: Hexan - Pha ®éng: MeOH- Na3PO40,05M (71:29); pH=5,9 - ChuÈn néi: CLA - Tèc ®é dßng: 2,5ml/phót - Detector huúnh quang. - ChÊt dÉn xuÊt huúnh quang: FMOC-Cl. - §­êng chuÈn: 1-500ng/ml [14] HuyÕt thanh ng­êi Chromegabond alkylphenyl 5mm -Pha ®éng: MeCN-MeOH-NH4COOCH3-NaHClO3 (53:10:22:23) - Detector: ®iÖn hãa. -LOQ: 90ng/ml [16] HT ng­êi Waters C8 (100 x 4,6mm ; 3,5 mm) - Dung m«i chiÕt: Tert-butyl metyl ether - Pha ®éng: MeCN- ®Öm phosphat (36,5:63,5) pH=7,40 - Tèc ®é dßng: 1,2ml/phót - Detector : ®iÖn hãa [17] HT ng­êi Spheri-5 cyano (100x4,6mm; 5mm) Norwark USA - Dung m«i chiÕt: Ethyl acetat-hexan(1:1) - Pha ®éng: MeCN-MeOH-§Öm phosphat 0,04M pH=6,9 (52:9:39) - Tèc ®é dßng: 1ml/phót - Detector: ®iÖn hãa. - §­êng chuÈn: 40-800ng/ml [15] HT ng­êi Zorbax SB CN (150x4,6mm; 5mm) - Dung m«i chiÕt: Tert-butyl methyl ether - Pha ®éng:Na2HPO450mM-NaH2PO450mM -MeCN-MeOH pH 6,5-7,5 - Tèc ®é dßng: 1ml/phót - Detector : ®iÖn hãa - §­êng chuÈn: 25-1000ng/ml *C¸c ph­¬ng ph¸p kh¸c - Ph­¬ng ph¸p Cùc phæ, mÉu thö lµ dÞch sinh häc [20]. - Ph­¬ng ph¸p vi sinh: Xö lý mÉu: pha lo·ng HT b»ng ethanol (1:1), ñ ë 4o C , ly t©m 12.000 vßng/phót trong 15 phót, lÊy dÞch næi ë trªn c« ë 55oC ®Õn thÓ tÝch ban ®Çu cña mÉu. §Þnh l­îng trong m«i tr­êng th¹ch víi chñng vi khuÈn chØ thÞ lµ Micrococcus luteus NCTC 8440, kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh tõ 0,005 ®Õn 1mg/L[11]. 1.3. Nguyªn t¾c chung vÒ ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch b»ng HPLC [2]. S¾c ký láng lµ qu¸ tr×nh t¸ch x¶y ra trªn cét t¸ch víi pha tÜnh lµ chÊt r¾n vµ pha ®éng lµ chÊt láng (s¾c ký láng- r¾n). MÉu ph©n tÝch ®­îc chuyÓn lªn cét t¸ch d­íi d¹ng dung dÞch. Khi tiÕn hµnh ch¹y s¾c ký, c¸c chÊt ph©n tÝch ®­îc ph©n bè liªn tôc gi÷a pha ®éng vµ pha tÜnh. Trong hçn hîp c¸c chÊt ph©n tÝch, do cÊu tróc ph©n tö vµ tÝnh chÊt lý hãa cña c¸c chÊt kh¸c nhau nªn kh¶ n¨ng t­¬ng t¸c cña chóng víi pha ®éng vµ pha tÜnh kh¸c nhau. Do vËy, chóng di chuyÓn víi tèc ®é kh¸c nhau vµ t¸ch ra khái nhau. 1.3.1. Ph©n tÝch ®Þnh tÝnh. Mét trong c¸c ®¹i l­îng ®Æc tr­ng cho sù t¸ch s¾c ký cña c¸c chÊt trong mét hÖ pha ®· chän lµ thêi gian l­u cña c¸c chÊt. NghÜa lµ trong mét hÖ pha vµ trong c¸c ®iÒu kiÖn t¸ch HPLC ®· chän th× mçi chÊt ph©n tÝch sÏ cã thêi gian l­u kh¸c nhau vµ cè ®Þnh. ChÝnh ®¹i l­îng nµy lµ mét tÝnh chÊt hay th«ng sè ®Ó ®Þnh tÝnh c¸c chÊt trong mét hçn hîp mÉu. V× vËy, sau khi ®· chän ®­îc c¸c ®iÒu kiÖn tèi ­u cho qu¸ tr×nh s¾c ký, tiÕn hµnh ghi s¾c ®å cña mÉu ph©n tÝch, vµ x¸c ®Þnh thêi gian l­u cña tõng pic øng víi mçi chÊt trong s¾c ®å. Sau ®ã so s¸nh thêi gian l­u cña chÊt ph©n tÝch víi thêi gian l­u cña chÊt chuÈn, tõ ®ã sÏ x¸c ®Þnh ®­îc trong mÉu ph©n tÝch cã nh÷ng chÊt nµo. 1.3.2. Ph©n tÝch ®Þnh l­îng: §Ó cã thÓ ®Þnh l­îng ®­îc th× yªu cÇu gi÷a ®¸p øng ph©n tÝch (chiÒu cao, diÖn tÝch pic) ph¶i cã t­¬ng quan víi nång ®é chÊt thö. Hi = k1.Ci Si= k2.Ci Hi; Si lµ chiÒu cao pic vµ diÖn tÝch pic t­¬ng øng cña chÊt i Ci lµ nång ®é chÊt i k1; k2 lµ c¸c h»ng sè thùc nghiÖm. *Ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn: - Ph­¬ng ph¸p ngo¹i chuÈn: LËp ®­êng chuÈn víi chuÈn ®èi chiÕu ë ngoµi mÉu ph©n tÝch. - Ph­¬ng ph¸p thªm ®­êng chuÈn: LËp ®­êng chuÈn víi chuÈn ®èi chiÕu trªn nÒn mÉu ph©n tÝch. - Ph­¬ng ph¸p néi chuÈn: §Ó gi¶m sai sè vµ t¨ng ®é lÆp l¹i, ng­êi ta th­êng dïng mét chuÈn thø 2 thªm vµo mÉu ph©n tÝch vµ mÉu chuÈn ®èi chiÕu. ChÊt thªm vµo nµy gäi lµ néi chuÈn. Trong cïng ®iÒu kiÖn s¾c ký nã cã thêi gian l­u gÇn víi thêi gian l­u cña chÊt ph©n tÝch nh­ng ®­îc t¸ch hoµn toµn, cã tÝnh chÊt t­¬ng tù nh­ chÊt cÇn ph©n tÝch nh­ng kh«ng g©y ¶nh h­ëng lªn tÝn hiÖu cña chÊt cÇn ph©n tÝch. Tû sè diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic cña chÊt ph©n tÝch vµ chÊt chuÈn néi trong dung dich chuÈn ®èi chiÕu lµ th«ng sè ph©n tÝch ®­îc dïng ®Ó x©y dùng ®­êng chuÈn. *Ph­¬ng ph¸p chuÈn hãa diÖn tÝch: Hµm l­îng phÇn tr¨m cña mét thµnh phÇn trong mÉu ph©n tÝch ®­îc x¸c ®Þnh b»ng tû sè (tÝnh b»ng phÇn tr¨m) cña diÖn tÝch pic cña thµnh phÇn ®ã vµ tæng diÖn tÝch cña tÊt c¶ c¸c thµnh phÇn cã mÆt trong mÉu( trõ pic dung m«i, thuèc thö vµ pic c¸c chÊt cã hµm l­îng nhá h¬n giíi h¹n ph¸t hiÖn). Hai yªu cÇu cÇn ®¸p øng khi sö dông ph­¬ng ph¸p nµy: - TÊt c¶ c¸c thµnh phÇn trong mÉu ph©n tÝch cÇn ®­îc röa gi¶i, xuÊt hiÖn tr©n s¾c ký ®å. - Detector cña thiÕt bÞ cã ®¸p øng nh­ nhau ®èi víi tÊt c¶ c¸c thµnh phÇn cã mÆt trong mÉu. Do hai yªu cÇu trªn rÊt khã ®­îc ®¸p øng ®Çy ®ñ nªn kÕt qu¶ th­êng kh«ng tin cËy. §Ó t¨ng ®é tin cËy ng­êi ta dïng hÖ sè ®¸p øng cña detector ®èi víi tõng thµnh phÇn cña mÉu. 1.4. Vµi nÐt vÒ HPLC víi detector huúnh quang. Quang phæ huúnh quang ngoµi viÖc ¸p dông ®Ó ®Þnh tÝnh, ®Þnh l­îng c¸c chÊt trªn m¸y ®o quang phæ huúnh quang th× nã cßn ®­îc dïng ®Ó chÕ t¹o bé phËn ph¸t hiÖn cña m¸y HPLC. Detector huúnh quang ®ãng vai trß nh­ mét m¸y huúnh quang kÕt nèi víi s¾c ký láng ®Ó ph¸t hiÖn vÒ ph©n tÝch ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l­îng c¸c chÊt sau khi ra khái cét s¾c ký. Detector huúnh quang cã ®é chän läc vµ nh¹y h¬n (cã thÓ ®Õn 1000 lÇn) detector hÊp thô UV. HPLC-detector huúnh quang cã thÓ ph¸t hiÖn tíi 10-12g. Do cã ®é nh¹y cao nªn detector huúnh quang ®­îc sö dông trong ph©n tÝch vÕt trong kiÓm so¸t m«i tr­êng, gi¸m ®Þnh ph¸p y, ®Þnh l­îng ho¹t chÊt trong dÞch sinh häc... Tïy theo c¸c chÊt cÇn ®Þnh l­îng cã kh¶ n¨ng ph¸t quang hay kh«ng mµ tiÕn hµnh ®Þnh l­îng trùc tiÕp hay gi¸n tiÕp th«ng qua dÉn chÊt cã kh¶ n¨ng ph¸t quang cña nã. Ng­êi ta cã thÓ cho chÊt cÇn ph©n tÝch ph¶n øng víi thuèc thö ®Ó t¹o dÉn chÊt ph¸t huúnh quang m¹nh tr­íc khi ®Õn detector huúnh quang. ViÖc t¹o dÉn xuÊt nµy cã thÓ tiÕn hµnh tr­íc hoÆc sau khi chÊt cÇn ph©n tÝch ®i qua cét s¾c ký. NÕu chÊt cÇn ph©n tÝch ®­îc ph¶n øng víi thuèc thö tr­íc khi qua cét th× kü thuËt nµy gäi lµ t¹o dÉn xuÊt tr­íc cét. NÕu chÊt cÇn ph©n tÝch ®­îc ph¶n øng víi thuèc thö sau khi ®· ®i ra khái cét, th× ®­îc gäi lµ t¹o dÉn xuÊt sau cét. 1.5. Vài nÐt vÒ LC-MS. LC-MS lµ kü thuËt ph©n tÝch dùa trªn sù kÕt hîp s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao vµ ph©n tÝch khèi phæ. Sù kÕt hîp nµy t¹o nªn mét hÖ thèng cã nh÷ng øng dông réng lín trong ph©n tÝch. - Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng khèi phæ cho phÐp ph©n tÝch hçn hîp c¸c chÊt khã bay h¬i nh­ c¸c thuèc b¶o vÖ thùc vËt, c¸c thuèc ch÷a bÖnh,... c¸c ®éc tè, c¸c ph©n tö protein cã ph©n tö l­îng lín tõ vµi ngµn ®Õn hµng tr¨m ngµn ®¬n vÞ dalton... [8]. - Ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng khèi phæ cã bé kÕt nèi phun ®iÖn ®­îc sö dông rÊt h÷u hiÖu ph©n tÝch d­îc phÈm c¶ ®Þnh tÝnh vµ ®Þnh l­îng, vÝ dô c¸c thuèc cã trong c¸c mÉu sinh häc phøc t¹p nh­ HT, huyÕt thanh, n­íc tiÓu... [8]. *Nguyªn t¾c ho¹t ®éng cña m¸y ph©n tÝch khèi phæ: §©y lµ kü thuËt ®o trùc tiÕp tû sè khèi l­îng vµ ®iÖn tÝch cña ion (m/z) ®­îc t¹o thµnh trong pha khÝ tõ ph©n tö hay nguyªn tö cña mÉu. C¸c ion ®­îc t¹o thµnh trong buång ion hãa, ®­îc gia tèc vµ t¸ch riªng nhê bé ph©n tÝch khèi tr­íc khi ®Õn detector. TÊt c¶ c¸c qu¸ tr×nh nµy diÔn ra trong thiÕt bÞ ¸p suÊt thÊp, ¸p suÊt trong hÖ dao ®éng tõ 10-3 ®Õn 10-6 Pa. NhiÖm vô cña detector khèi phæ: ChuyÓn c¸c ion ®· ®Õn detector thµnh tÝn hiÖu ®iÖn ®o b»ng hÖ ®iÖn tö cña m¸y khèi phæ. *C¸c bé phËn cña m¸y ph©n tÝch khèi phæ: - Bé n¹p mÉu: Cã ®­êng kÕt nèi víi ®Çu ra cña m¸y s¾c ký láng. - Bé nguån ion hãa: NhiÖm vô ion hãa c¸c ph©n tö, nguyªn tö cña mÉu. Cã rÊt nhiÒu kü thuËt ion hãa kh¸c nhau nh­ng hiÖn nay th­êng sö dông kü thuËt ion hãa b»ng phun ®iÖn tö (ESI) vµ ion hãa hãa häc ë ¸p suÊt th­êng (APCI) Trong ®Ò tµi nµy chóng t«i sö dông kü thuËt ESI. ESI cã vai trß chuyÓn ion tõ pha láng sang pha khÝ. Kü thuËt nµy ®­îc m« t¶ nh­ sau: C¸c ph©n tö dung m«i vµ hãa chÊt sau khi ra khái cét s¾c ký sÏ ®­îc ®­a vµo mét èng mao qu¶n cao thÕ 2 ®Õn 5 KV (®iÖn thÕ d­¬ng ë ®Çu kim t¹o ion d­¬ng, ®iÖn thÕ ©m ë ®Çu kim t¹o ion ©m vµ ®­îc quyÕt ®Þnh tïy chÊt kh¶o s¸t). D­íi t¸c ®éng cña ®iÖn thÕ cao cã sù t¹o thµnh nh÷ng h¹t nhá mang ®iÖn. Sau khi qua èng mao qu¶n d­íi t¸c ®éng cña luång khÝ nit¬ nãng c¸c ph©n tö dung m«i tõ tõ bay h¬i, c¸c h¹t mang ®iÖn tÝch nhá dÇn. Sau ®ã c¸c ion d­¬ng hay ©m t¹o thµnh ®­îc ®­a vµo bé phËn t¸ch ion qua mét cöa rÊt nhá, dung m«i vµ khÝ nit¬ bÞ b¬m hót ra ngoµi [21]. - Bé ph©n tÝch khèi: cã nhiÖm vô t¸ch c¸c ion cã trÞ sè m/z kh¸c nhau thµnh tõng phÇn riªng biÖt. - Bé phËn ph¸t hiÖn ion: Cã nhiÖm vô chuyÓn c¸c ion ®· ®Õn thµnh tÝn hiÖu ®iÖn ®o b»ng hÖ ®iÖn tö cña m¸y khèi phæ. -Bé xö lý d÷ liÖu: TÝn hiÖu ®iÖn ®­îc khuyÕch ®¹i tr­íc khi chuyÓn thµnh tÝn hiÖu phôc vô sö lý d÷ liÖu theo yªu cÇu kh¸c nhau: Ghi phæ, ®Þnh l­îng... * Mét sè kü thuËt LC-MS - Kü thuËt ph©n tÝch toµn thang (full scan) Lµ kü thuËt ph©n tÝch mµ phæ khèi sÏ ®­a ra toµn bé ion sinh ra tõ ion gèc, ta cã mét s¾c ®å toµn ion (Total Ion Chromatogram). Kü thuËt nµy cã ®é nhiÔu ®­êng nÒn rÊt lín nªn ®é nh¹y kÐm [9]. - Kü thuËt ph©n tÝch chän läc ion (SIM) §©y lµ kü thuËt ngay tõ ®Çu chØ cho phæ kÕ nhËn diÖn mét ion vµ ghi s¾c ®å theo thêi gian. Lóc nµy s¾c ®å chØ ghi tÊt c¶ c¸c mòi cã chøa ion ®ã. Kü thuËt nµy cã t¸c dông lµm gi¶m bít nhiÔu ®­êng nÒn vµ do ®ã lµm t¨ng ®é nh¹y (t¨ng tû lÖ tÝn hiÖu /nhiÔu ®­êng nÒn). Kü thuËt nµy thuËn lîi ®Ó ph©n tÝch d­ l­îng mét chÊt ®· biÕt trong mét mÉu phøc t¹p [9]. - Kü thuËt MS/MS Kü thuËt nµy chän mét ion ë chÕ ®é MS lÇn 1, ion ®ã sÏ ®­îc ph©n tÝch tiÕp b»ng c¸ch t¹o ra m¶nh ion nhá h¬n ®Æc tr­ng cho ion tr­íc ®ã, ®­îc ph©n tÝch MS lÇn 2. NÕu tiÕp tôc chän ion vµ bÎ g·y ion ta cã kü thuËt MSn (n lµ sè lÇn bÎ gÉy ion) [21] Ch­¬ng 2: §èi t­îng, néi dung vµ ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu. 2.1.§èi t­îng nghiªn cøu §Ó x©y dùng vµ thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch AZI trong HT ng­êi, chóng t«i tiÕn hµnh nghiªn cøu trªn c¸c ®èi t­îng sau: - MÉu tr¾ng: lµ HT ng­êi cña viÖn HuyÕt häc vµ truyÒn m¸u trung ­¬ng. - MÉu chuÈn: lµ mÉu tr¾ng ®­îc thªm AZI víi nång ®é x¸c ®Þnh. - MÉu thö: lµ HT ng­êi cã sö dông AZI. 2.2. Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ * Ho¸ chÊt : B¶ng 2.1: Danh môc hãa chÊt- thuèc thö- chÊt chuÈn Tªn chÊt Nguån gèc Tiªu chuÈn Hµml­îng Hãa chÊt thuèc thö Diethyl ether Merck - §øc P.A 99,5% Acetonitril Baker - Mü HPLC nhµ s¶n xuÊt 99,9% Methanol Baker - Mü HPLC nhµ s¶n xuÊt 99,8% Natri carbonat Vel - BØ P.A Acid boric Vel - BØ P.A Kali clorid Vel - BØ P.A Amoni acetat Vel - BØ P.A FMOC-Cl Aldrich-Mü P.A ChÊt chuÈn Azithromycin ViÖn kiÓm nghiÖm T¦ - VN 97,27% Roxithromycin ViÖn kiÓm nghiÖm T¦ - VN 97,73% Clarithromycin ViÖn kiÓm nghiÖm T¦ - VN 97,82% ChÕ phÈm HT ng­êi ViÖn huyÕt häc vµ truyÒn m¸u T¦ -VN Viªn nÐn Zithromax Pfizer-USA 250mg * ThiÕt bÞ - dông cô - HÖ thèng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao Shimadzu 10A-VP - Detector huúnh quang. - HÖ thèng s¾c ký láng khèi phæ Thermo-Finnigan LCQ Advantage Max. - Bé läc dung m«i (mµng läc 0,45μm), bé läc mÉu (mµng läc 0,2μm) - M¸y l¾c siªu ©m (Brasonic - Mü). - C©n ph©n tÝch (Sartorius - §øc) - M¸y ®o pH (Metrohm - Thôy SÜ). - M¸y ly t©m (Jouan - Ph¸p) - M¸y siªu li t©m (Sartorius - §øc) - Tñ l¹nh s©u (Frigo - §an M¹ch). - M¸y läc n­íc siªu s¹ch (Elga -Anh). - M¸y l¾c (Labinco - Hµ Lan). - Nåi c¸ch thñy. - èng nghiÖm lÊy m¸u chøa EDTA, - èng nghiÖm teflon dung tÝch 30ml. - B×nh ®Þnh møc chÝnh x¸c, pipet chÝnh x¸c vµ c¸c dông cô thñy tinh kh¸c. 2.3. Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu §Þnh l­îng AZI trong HT lµ qu¸ tr×nh ph©n tÝch phøc t¹p yªu cÇu ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch ph¶i cã tÝnh chän läc tèt, ®é nh¹y, ®é chÝnh x¸c cao. Sau khi t×m hiÓu s©u vÒ ®èi t­îng nghiªn cøu, môc tiªu cña ®Ò tµi vµ tham kh¶o tµi liÖu chóng t«i ®· lùa chän hai ph­¬ng ¸n ®Ó tiÕn hµnh kh¶o s¸t ®ã lµ: HPLC víi detector huúnh quang vµ LC-MS. 2.3.1. Kh¶o s¸t quy tr×nh ®Þnh l­îng AZI trong dung m«i b»ng HPLC detector huúnh quang. *ChuÈn bÞ dung dÞch: - Dung dÞch chuÈn AZI nång ®é lÇn l­ît lµ 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml trong methanol - Dung dÞch néi chuÈn CLA (IS) 50 mg/ml - Dung dÞch dÉn xuÊt huúnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml - Dung dÞch ®Öm Borat 0,1M pH 7,4 * Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký. Kh¶o s¸t vÒ cét, nhiÖt ®é cét, pha ®éng, tèc ®é dßng, detector huúnh quang (b­íc sãng kÝch thÝch, b­íc sãng ph¸t x¹) * Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn t¹o dÉn xuÊt huúnh quang. - Kh¶o s¸t nhiÖt ®é ph¶n øng t¹o dÉn xuÊt: Gi÷ nguyªn c¸c ®iÒu kiÖn ph¶n øng kh¸c, chØ thay ®æi nhiÖt ®é tõ 30 ®Õn 70oC, c¸ch 10oC - Kh¶o s¸t thêi gian ph¶n øng: Gi÷ nguyªn nhiÖt ®é ph¶n øng tèi ­u lµ 50oC, thay ®æi thêi gian ph¶n øng trong kho¶ng tõ 30 ®Õn 60 phót, c¸ch 10 phót. * §¸nh gi¸ mét sè th«ng sè kü thuËt cña ph­¬ng ph¸p. - TÝnh chän läc. - TÝnh phï hîp cña hÖ thèng s¾c ký. - Kho¶ng tuyÕn tÝnh. - Giíi h¹n ph¸t hiÖn (LOD) vµ giíi h¹n ®Þnh l­îng (LOQ). 2.3.2. Kh¶o s¸t x©y dùng quy tr×nh ®Þnh l­îng AZI trong HT b»ng LC-MS. 2.3.2.1. ChuÈn bÞ dung dÞch chuÈn. §Ó gi¶m c¸c yÕu tè ¶nh h­ëng ®Õn kÕt qu¶ ph©n tÝch vµ t¨ng ®é chÝnh s¸c chóng t«i chän ph­¬ng ph¸p néi chuÈn. Sau khi t×m hiÓu, tham kh¶o mét sè tµi liÖu chóng t«i chän hai chÊt cã cïng cÊu tróc ph©n tö lµ CLA vµ ROXI ®Ó tiÕn hµnh kh¶o s¸t chän lµm chuÈn néi. - Pha dung dÞch chuÈn gèc AZI: c©n chÝnh x¸c chÊt chuÈn AZI, hßa tan trong methanol ®Ó ®­îc dung dÞch gèc. Tõ ®ã pha thµnh c¸c dung dÞch chuÈn thø cÊp cã nång ®é 0,2- 20mg/ml trong methanol. 2.3.2.2. Sö lý mÉu Tõ c¸c tÝnh chÊt lý hãa cña AZI vµ theo c¸c tµi liÖu ®· c«ng bè, chóng t«i chän x©y dùng quy tr×nh sö lý mÉu theo ph­¬ng ph¸p chiÕt láng - láng. 2.3.2.3. Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ®Ó ®Þnh l­îng AZI. TiÕn hµnh ch¹y thö trªn tõng mÉu AZI, chuÈn néi (IS) vµ hçn hîp AZI vµ IS trong dung m«i pha ®éng ®Ó: * Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn khèi phæ. - Kü thuËt MS mét lÇn: ph©n tÝch toµn thang ®Ó x¸c ®Þnh ion ph©n tö. - Kü thuËt SIM sö dông ion ph©n tö ®Ó ®Þnh l­îng. * Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn s¾c ký. - Cét s¾c ký: kh¶o s¸t kh¶ n¨ng t¸ch cña AZI vµ IS trªn c¸c cét: Thermo C18 (50 x 2,1mm; 5mm) vµ Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm). - Pha ®éng: dùa vµo c¸c tµi liÖu tham kh¶o, tiÕn hµnh kh¶o s¸t trªn hÖ pha ®éng acetonitril : amoni acetat 0,05M víi tû lÖ kh¸c nhau vµ ch¹y chÕ ®é ®¼ng dßng hay gradient. - Tèc ®é dßng: thay ®æi l­u l­îng pha ®éng tõ 0,2 – 0,6ml/phót ®Ó x¸c ®Þnh ®­îc tèc ®é phï hîp cho thêi gian l­u tèi ­u. - Tiªm mÉu tù ®éng 25ml 2.3.2.4 ThÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch * TÝnh chän läc ChuÈn bÞ mÉu: - HT tr¾ng. - HT cã AZI. - HT cã IS. - HT cã AZI vµ IS. Xö lý mÉu vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch * TÝnh phï hîp cña hÖ thèng s¾c ký ChuÈn bÞ mÉu chuÈn cã AZI vµ IS trong pha ®éng. TiÕn hµnh s¾c ký 6 lÇn liªn tiÕp, x¸c ®Þnh ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c th«ng sè: thêi gian l­u, tû sè diÖn tÝch pic. * Kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh, hµm ®¸p øng ChuÈn bÞ c¸c mÉu HT tr¾ng, thªm AZI vµ IS t¹o thµnh c¸c mÉu cã nång ®é AZI tõ 0,02 - 2 mg/ml, xö lý mÉu theo s¬ ®å h×nh 3.1 vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch. *LOD vµ LOQ LOD lµ nång ®é thÊp nhÊt cña chÊt ph©n tÝch cã thÓ x¸c ®Þnh ®­îc nh­ng kh«ng nhÊt thiÕt ph¶i ®Þnh l­îng ®­îc trong ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm cô thÓ. LOD ®­îc coi lµ nång ®é chÊt ph©n tÝch g©y nªn sù t¨ng tÝn hiÖu ®¸p øng 3 lÇn so víi ®¸p øng tÝn hiÖu cña mÉu tr¾ng (S/N=3). LOQ lµ nång ®é thÊp nhÊt cña chÊt cÇn ph©n tÝch cã thÓ ®Þnh l­îng ®­îc víi ®é ®óng vµ ®é chÝnh x¸c phï hîp. LOQ ®­îc chÊp nhËn nÕu ®¸p øng cña chÊt ph©n tÝch ph¶i Ýt nhÊt gÊp 10 lÇn ®¸p øng cña mÉu tr¾ng. Trong ph­¬ng ph¸p s¾c ký ®é nhiÔu cña ®­êng nÒn cã thÓ thay cho tÝn hiÖu cña mÉu tr¾ng. TiÕn hµnh xö lý c¸c mÉu HT tr¾ng vµ mÉu chuÈn cã nång ®é AZI thÊp dÇn vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch. * §é ®óng ChuÈn bÞ c¸c mÉu AZI trong HT tr¾ng ë 3 nång ®é kh¶o s¸t, mçi nång ®é lµm 5 mÉu, xö lý mÉu vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch, so s¸nh gi¸ trÞ trung b×nh gi÷a c¸c lÇn ®Þnh l­îng cña mçi nång ®é víi gi¸ trÞ thùc cã trong mÉu, tÝnh theo l­îng chuÈn ®· c©n vµ thÓ tÝch ®· pha. *§é chÝnh x¸c. ChuÈn bÞ c¸c mÉu AZI trong HT tr¾ng ë 3 nång ®é, mçi nång ®é lµm 5 mÉu vµ xö lý nh­ trong phÇn x¸c ®Þnh ®é ®óng, sau khi tiÕn hµnh s¸c ký, ®¸nh gi¸ ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c mÉu theo tõng nång ®é. 2.3.2.5. X¸c ®Þnh hiÖu suÊt chiÕt ChuÈn bÞ c¸c mÉu AZI trong HT tr¾ng ë 3 nång ®é kh¶o s¸t, mçi nång ®é lµm 3 mÉu, song song tiÕn hµnh s¾c ký c¸c mÉu chuÈn pha trong pha ®éng ë 3 nång ®é t­¬ng øng. §¸nh gi¸ hiÖu suÊt chiÕt th«ng qua so s¸nh chØ sè diÖn tÝch pic trung b×nh trong HT so víi trong pha ®éng ë tõng nång ®é t­¬ng øng. 2.3.3. §Þnh l­îng th¨m dß AZI trong HT ng­êi uèng AZI TiÕn hµnh lÊy m¸u ®Þnh l­îng AZI trong HT 2 ng­êi t×nh nguyÖn sö dông chÕ phÈm cã chøa AZI ( uèng 2 viªn nÐn Athromax hµm l­îng 250 mg). Mçi ng­êi ®­îc lÊy m¸u ë 2 thêi ®iÓm, sau uèng thuèc 1 giê vµ 1,75 giê. LÊy m¸u tÜnh m¹ch c¸nh tay vµo èng nghiÖm cã chøa EDTA, ly t©m lÊy HT thªm chuÈn néi, xö lý mÉu vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch. 2.3.4. Ph©n tÝch sè liÖu thùc nghiÖm TÝnh to¸n c¸c sè liÖu: gi¸ trÞ trung b×nh, ®é lÖch chuÈn, ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi, ph­¬ng tr×nh håi quy vµ hÖ sè t­¬ng quan håi quy b»ng ch­¬ng tr×nh phÇn mÒm Microsoft Excel. Ch­¬ng 3: KÕt qu¶ 3.1. X©y dùng quy tr×nh xö lý mÉu Tõ c¸c tÝnh chÊt lý hãa cña AZI vµ theo c¸c tµi liÖu ®· c«ng bè, trªn c¬ së ®iÒu kiÖn hiÖn cã chóng t«i x©y dùng quy tr×nh chiÕt AZI tõ HT theo ph­¬ng ph¸p chiÕt láng-láng. - KiÒm hãa b»ng Na2CO3 0.05M - Dung m«i chiÕt: Diethyl ether - ThÓ tÝch dung m«i:10ml - Thêi gian l¾c xo¸y: 3 phót - NhiÖt ®é c« bay h¬i dung m«i: 45oC Quy tr×nh xö lý mÉu ®­îc tr×nh bµy cô thÓ t¹i h×nh 3.1  0,5ml HT+ 0,1ml IS Hçn hîp chiÕt L¾c xo¸y 30 gi©y HT ®· kiÒm hãa + KiÒm hãa b»ng 0,4ml ®Öm Carbonat 0,05M + L¾c xo¸y 30 gi©y DÞch chiÕt + Dung m«i chiÕt (10ml) + L¾c xo¸y 5 phót + Siªu ly t©m 10phót (12.500 vßng/phót) + Hót 7 ml dung m«i C¾n kh« Bèc h¬i c¸ch thñy 45oC Dung dÞch trong DÞch läc + 0,7 ml pha ®éng + L¾c xo¸y 60 gi©y Läc qua mµng läc cã ®­êng kÝnh lç läc 0,2mm Ch¹y s¾c ký H×nh 3.1. S¬ ®å quy tr×nh chiÕt AZI trong HT 3.2. Kh¶o s¸t quy tr×nh ®Þnh l­îng AZI trong dung m«i b»ng HPLC detector huúnh quang. §Þnh l­îng AZI trong nÒn mÉu HT b»ng ph­¬ng ph¸p HPLC víi detector huúnh quang ®ßi hái tr¶i qua qu¸ tr×nh xö lý mÉu phøc t¹p vµ qu¸ tr×nh dÉn xuÊt hãa ®Ó t¹o chÊt ph¸t huúnh quang. Tr­íc hÕt, tiÕn hµnh kh¶o s¸t trªn mÉu AZI chuÈn pha trong acetonitril. §Ó h¹n chÕ c¸c sai sè cã thÓ gÆp ph¶i chóng t«i lùa chän sö dông chÊt néi chuÈn. Qua qu¸ tr×nh kh¶o s¸t chóng t«i chän CLA lµ mét chÊt cã nhiÒu tÝnh chÊt t­¬ng ®ång víi AZI lµm chÊt néi chuÈn. *ChuÈn bÞ dung dÞch chuÈn: - Dung dÞch chuÈn gèc AZI: C©n chÝnh x¸c mét l­îng chÊt chuÈn AZI pha trong acetonitril sao cho thu ®­îc dung dÞch chuÈn gèc cã nång ®é 1000 mg/ml. Tõ dung dÞch chuÈn gèc AZI pha lo·ng b»ng acetonitril ®Ó thu ®­îc c¸c dung dÞch chuÈn lµm viÖc cã nång ®é lÇn l­ît lµ 5, 10, 25, 50, 100 mg/ml - Dung dÞch néi chuÈn CLA 50 mg/ml trong acetonitril *Dung dÞch dÉn xuÊt huúnh quang FMOC-Cl: 0,5mg/ml pha trong acetonitril *Dung dÞch ®Öm Borat 0,1M pH 7,4 (0,625g acid boric vµ 0,750 KCl pha trong 100ml n­íc, chØnh pH tíi 7,4). 3.2.1.§iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký ®Ó ®Þnh l­îng AZI Qua kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn ph©n tÝch, chóng t«i ®· chän lùa ®iÒu kiÖn ph©n tÝch nh­ sau: Cét: C18 (150 mm x 4,6 mm x 5 m) cña Symmestry Waters NhiÖt ®é cét: 400C Pha ®éng: Acetonitril: §Öm phosphat 0,1M pH 7,7 (76:24) Tèc ®é dßng: 1,5ml/phót Tiªm mÉu: 50ml Detector huúnh quang: B­íc sãng kÝch thÝch: 270 nm B­íc sãng ph¸t x¹: 317 nm 3.2.2. Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn t¹o dÉn xuÊt huúnh quang DÉn xuÊt hãa víi FMOC-Cl ®Ó t¹o dÉn xuÊt ph¸t huúnh quang Theo c¸c nghiªn cøu tr­íc ®©y, nhiÒu t¸c gi¶ ®· sö dông FMOC-Cl ®Ó t¹o dÉn xuÊt huúnh quang cho ®Þnh l­îng nhiÒu chÊt thuéc nhãm Macrolid, trong ®ã cã AZI. Chóng t«i triÓn khai nghiªn cøu c¸c ®iÒu kiÖn ph¶n øng cho tèi ­u víi ®iÒu kiÖn ë phßng thÝ nghiÖm. Dung dÞch dÉn xuÊt hãa FMOC-Cl ®­îc pha trong acetonitril víi nång ®é gi÷ cè ®Þnh 0,5mg/ml vµ ph¶n øng ®­îc thùc hiÖn ë pH 7,4 [10]. Hai th«ng sè chóng t«i kh¶o s¸t thªm lµ nhiÖt ®é tiÕn hµnh ph¶n øng vµ thêi gian ph¶n øng. *ChuÈn bÞ dung dÞch chuÈn tiÕn hµnh dÉn xuÊt hãa ChuÈn bÞ 5 èng nghiÖm thñy tinh cã n¾p kÝn vµ tiÕn hµnh theo b¶ng sau: B¶ng 3.1: Quy tr×nh t¹o d·y mÉu chuÈn vµ dÉn xuÊt hãa èng ChuÈn 1 2 3 4 5 AZI 5mg/ml 0,1ml AZI 10mg/ml 0,1ml AZI 25mg/ml 0,1ml AZI 50mg/ml 0,1ml AZI 100mg/ml 0,1ml CLA 50mg/ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml Thæi kh« b»ng khÝ Nit¬ ë nhiÖt ®é < 500C Dung dÞch FMOC-Cl 0,5mg/ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml 0,8ml Dung dÞch ®Öm Borat pH 7,4 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml L¾c xo¸y 30s Ph¶n øng ë 500C trong 40 phót Lµm l¹nh, läc qua mµng läc 0,45mm vµ b¬m vµo HPLC Nång ®é chuÈn AZI/dung dÞch (mg/ml) 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 * Kh¶o s¸t nhiÖt ®é ph¶n øng: Gi÷ nguyªn c¸c ®iÒu kiÖn ph¶n øng kh¸c, chØ thay ®æi nhiÖt ®é tõ 30, 40, 50, 60, 70o C. KÕt qu¶ ®­îc thÓ hiÖn theo biÓu ®å sau: H×nh 3.2. KÕt qu¶ kh¶o s¸t nhiÖt ®é ph¶n øng t¹o dÉn xuÊt huúnh quang KÕt qu¶ cho thÊy ë nhiÖt ®é 500C lµ nhiÖt ®é mµ ph¶n øng ®¹t ®­îc hiÖu suÊt tèt nhÊt * Kh¶o s¸t thêi gian ph¶n øng Gi÷ nguyªn nhiÖt ®é ph¶n øng tèi ­u lµ 50oC, thay ®æi thêi gian ph¶n øng trong kho¶ng tõ 30 ®Õn 60 phót. KÕt qu¶ thu ®­îc theo biÓu ®å sau: H×nh 3.3. KÕt qu¶ kh¶o s¸t thêi gian ph¶n øng t¹o dÉn xuÊt huúnh quang KÕt qu¶ cho thÊy ph¶n øng x¶y ra tèt nhÊt trong vßng kho¶ng 40 phót, do ®ã chóng t«i quyÕt ®Þnh chän thêi gian ph¶n øng lµ 40 phót vµ ph¶n øng ë 50 0C. Tæng kÕt c¸c ®iÒu kiÖn dÉn xuÊt hãa: + Nång ®é thuèc thö FMOC-Cl: 0,5mg/ml, pH 7,4. + NhiÖt ®é 500C + Thêi gian 40 phót 3.2.3. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ mét sè chØ tiªu thÈm ®Þnh. *TÝnh chän läc: ChuÈn bÞ: MÉu tr¾ng MÉu cã AZI MÉu cã CLA MÉu cã AZI vµ CLA TiÕn hµnh dÉn xuÊt hãa vµ ch¹y s¾c ký. H×nh 3.4: S¾c ký ®å mÉu tr¾ng H×nh 3.5: S¾c ký ®å mÉu cã AZI H×nh 3.6: S¾c ký ®å mÉu cã CLA H×nh 3.7: S¾c ký ®å mÉu cã AZI vµ CLA NhËn xÐt: trªn s¾c ký ®å mÉu tr¾ng t¹i c¸c vÞ trÝ t­¬ng øng víi thêi gian l­u cña c¸c pic AZI vµ CLA ®· dÉn xuÊt hãa kh«ng xuÊt hiÖn pic l¹, c¸c pic AZI vµ CLA c©n ®èi, s¾c nÐt, t¸ch riªng biÖt. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn cho thÊy ph­¬ng ph¸p cã tÝnh chän läc tèt. *TÝnh phï hîp cña hÖ thèng HPLC: ChuÈn bÞ mÉu chuÈn cã Azi nång ®é 10mg/ml vµ CLA nång ®é 5mg/ml vµ tiÕn hµnh ph¶n øng dÉn xuÊt hãa vµ ph©n tÝch theo ®iÒu kiÖn s¾c ký ®· x¸c ®Þnh. TiÕn hµnh s¾c ký 6 lÇn liªn tiÕp, x¸c ®Þnh ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c th«ng sè: thêi gian l­u, tû sè diÖn tÝch pic. B¶ng 3.2.: KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh phï hîp cña hÖ thèng HPLC LÇn tiªm Thêi gian l­u AZI(phót) DiÖn tÝch pic AZI(Volts*s) Thêi gian l­u CLA(phót) DiÖn tÝch pic CLA (Volts*s ) Tû sè dt AZI/CLA 1 12,94 1709837 10,61 244582 6,99 2 13,21 1774072 10,87 236838 7,49 3 13,24 1787837 10,75 256497 6,97 4 13,13 1770982 10,70 243870 7,26 5 12,87 1761861 10,54 244921 7,19 6 13,01 1771063 10,72 243981 7,26 TB 13,07 1766,11 7,19 SD 0,15 4299,78 0,19 RSD (%) 1,15 1,06 2,70 NhËn xÐt: ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c th«ng sè ph©n tÝch ®Òu nhá h¬n 3%, ®iÒu nµy chøng tá hÖ thèng s¾c ký cã tÝnh thÝch hîp chÊp nhËn ®­îc. *Kho¶ng tuyÕn tÝnh: ChuÈn bÞ c¸c mÉu cã nång ®é AZI tõ 0,5 – 10,0 mg/ml vµ CLA cã nång ®é cè ®Þnh 5,0mg/ml, tiÕn hµnh dÉn xuÊt huúnh quang, ph©n tÝch theo quy tr×nh ®· x¸c ®Þnh. B¶ng 3.3: Sù phô thuéc gi÷a tû sè diÖn tÝch pic vµ nång ®é AZI Nång ®é AZI (mg/ml) DiÖn tÝch pic AZI(Volts*s) DiÖn tÝch pic CLA(Volts*s) Tû sè diÖn tÝch pÝc 0,5 68486 255288 0,26827 1,0 143670 254804 0,563845 2,5 412723 244074 1,690975 5,0 849246 230574 3,683182 10,0 1796312 250506 7,170734 Ph­¬ng tr×nh håi qui: Y=0,7315X – 0,0982 HÖ sè t­¬ng quan : R2= 0,9993 Trong ®ã : Y lµ tû sè diÖn tÝch pic (AZI/CLA) X lµ nång ®é AZI H×nh 3.8: §å thÞ biÓu diÔn sù phô thuéc gi÷a tû sè diÖn tÝch pic vµ nång ®é AZI NhËn xÐt: Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn cho thÊy cã sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a tû sè diÖn tÝch pic (AZI/CLA) vµ nång ®é AZI. §­êng chuÈn håi quy cã d¹ng th¼ng vµ hÖ sè t­¬ng quan lín h¬n 0,999 chøng tá cã sù t­¬ng quan tuyÕn tÝnh chÆt gi÷a tû sè diÖn tÝch pic (AZI/CLA) vµ nång ®é AZI ë trong kho¶ng nång ®é kh¶o s¸t. *LOD và LOQ: T¹i nång ®é 0,5mg/ml dùa vµo s¾c ký ®å vµ theo kÕt qu¶ tÝnh to¸n ta thÊy tû lÖ S/N 10. VËy ta cã: LOQ = 0,5 mg/ml LOD = 0,5/3,3 = 0,15 mg/ml H×nh 3.9: S¾c ký ®å AZI 0,5mg/ml vµ CLA 5,0mg/ml NhËn xÐt: Víi LOQ lµ 0,5 mg/ml, rÊt khã cã thÓ ¸p dông ph­¬ng ph¸p HPLC víi detector huúnh quang ®· kh¶o s¸t trªn ®Ó ph©n tÝch AZI trong HT v× theo mét sè nghiªn cøu th× AZI cã Cmax = 0,33238±0,09012mg/ml trong HT[16], Cmax= 0,3942±0,1339mg/ml trong huyÕt thanh[10], khi uèng 2 viªn Zithromax(Pfizer,USA) 250mg. V× vËy chóng t«i chuyÓn sang kh¶o s¸t x©y dùng quy tr×nh ®Þnh l­îng AZI trong HT b»ng LC-MS ®Ó ®¹t ®­îc ®é nh¹y phï hîp. 3.3. Kh¶o s¸t x©y dùng ch­¬ng tr×nh LC-MS ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong HT 3.3.1.Kh¶o s¸t lùa chän chÊt chuÈn néi B¬m trùc tiÕp lÇn l­ît dung dÞch AZI, CLA vµ ROXI cã nång ®é 500ng/ml trong acetonitril : amoni acetat 0,05M (1:1) vµo hÖ thèng khèi phæ víi tèc ®é 5μl/phót, víi chÕ ®é phun ®iÖn tö ion d­¬ng ( +ESI). Phæ khèi cña AZI, CLA vµ ROXI ®­îc ghi ë h×nh 3.10, 3.11 vµ 3.12. H×nh3.10.Phæ khèi AZI H×nh3.11.Phæ khèi CLA H×nh3.12.Phæ khèi ROXI Sau khi kh¶o s¸t chóng t«i chän ROXI lµm chÊt chuÈn néi v× cã m¶nh khèi mÑ m/z= 837,7 kh¸c nhiÒu so víi m¶nh mÑ cña AZI, trong khi ®ã CLA cã m¶nh khèi qu¸ gÇn AZI (chØ kh¸c nhau 1 ®¬n vÞ) 3.3.2. X¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn khèi phæ *Tèi ­u hãa ®iÒu kiÖn b¾t ion ph©n tÝch ( ion mÑ m/z) §Ó x¸c ®Þnh ®iÒu kiÖn khèi phæ, tr­íc tiªn chóng t«i pha tõng chÊt trong pha ®éng, sau ®ã b¬m trùc tiÕp b»ng syringe vµ ch¹y ch­¬ng tr×nh Tune ®Ó ®iÒu chØnh c¸c th«ng sè khèi phæ. Qu¸ tr×nh tiÕn hµnh nh­ sau: - Pha dung dÞch chuÈn AZI vµ ROXI riªng rÏ trong acetonitril : amoni acetat 0,05M (1:1) cã nång ®é 500ng/ml. - BËt m¸y khèi phæ, khëi ®éng phÇn mÒm ®iÒu khiÓn trªn mµn h×nh windows (Instrument Setup) vµo Tune Plus, xuÊt hiÖn cöa sæ Tune Plus, chän chÕ ®é +ESI. - B¬m dung dÞch AZI 500ng/ml vµo hÖ thèng khèi phæ víi tèc ®é 5μl/phót, sau mét thêi gian sÏ xuÊt hiÖn m¶nh ion mÑ cã m/z= 749,3. NhÊn vµo biÓu t­îng Tune trªn mµn h×nh sÏ xuÊt hiÖn cöa sæ ch¹y chÕ ®é Automatic Tune, trong « Mass (m/z) ®¸nh sè 749 ®Ó Tune cho m¶nh mÑ, m¸y sÏ tù ®éng ®iÒu chØnh vµ tèi ­u hãa c¸c th«ng sè sao cho b¾t ion m/z= 749 tèt vµ nh¹y nhÊt. Qu¸ tr×nh nµy diÔn ra trong kho¶ng 5 phót. Sau khi m¸y ®· tù ®éng ®iÒu chØnh sÏ cho tÝn hiÖu cña ion m/z lín h¬n ban ®Çu. L­u file Tune nµy víi tªn AZI.LCQ Tune. - TiÕn hµnh nh­ trªn víi dung dÞch ROXI, m¶nh ion mÑ cã m/z= 837 l­u l¹i file Tune víi tªn ROXI.LCQ Tune * Tèi ­u hãa ®iÒu kiÖn b¾t ion ph©n tÝch d­íi ®iÒu kiÖn tèc ®é dßng cña s¾c ký láng. - Gäi ch­¬ng tr×nh Tune Plus vµ ph­¬ng ph¸p Tune nh­ ®· nªu, gäi file AZI.LCQ Tune. - TiÕp tôc ®iÒu chØnh tèi ­u hãa ®iÒu kiÖn khèi phæ ë ®iÒu kiÖn thùc tÕ cña s¾c ký láng (tèc ®é dßng 0,5ml/ phót). TiÕn hµnh b¬m AZI nång ®é 500ng/ml vµo hÖ thèng khèi phæ víi tèc ®é 5ml/phót vµ ®­îc trén víi dßng dung m«i s¾c ký qua bé trén h×nh ch÷ T (T Union). L­îng dung m«i theo dßng s¾c ký lóc nµy lµ 0,5ml/phót gÊp 100 lÇn lóc tr­íc (5ml/phót), do ®ã cÇn thiÕt ph¶i dïng khÝ ®Ó bay h¬i dung m«i, chän Sheath gas=30; Auxilary gas=20. Sau mét thêi gian sÏ xuÊt hiÖn m¶nh khèi m/z 749, qu¸ tr×nh Tune tiÕp tôc ®­îc tiÕn hµnh t­¬ng tù nh­ ®· nªu ë trªn sau ®ã l­u l¹i file Tune víi tªn AZI Flow 0,5mlph.LCQ Tune. - TiÕn hµnh t­¬ng tù víi ROXI ghi l¹i file Tune víi tªn ROXI flow 0,5mlph.LCQ Tune. Nh­ vËy ngoµi c¸c th«ng sè ®­îc lùa trän tèi ­u tù ®éng cÇn thiÕt lËp mét sè th«ng sè sau: - MS chÕ ®é SIM: + Chän ion cã m/z tõ 748-750 (®Ó x¸c ®Þnh AZI), + Chän ion cã m/z tõ 836- 838 (®Ó x¸c ®Þnh ROXI). - Sheath Gas: 30 - Auxilary Gas: 20 3.3.3. X¸c ®Þnh ch­¬ng tr×nh s¾c ký. *Kh¶o s¸t cét s¾c ký: Pha dung dÞch chuÈn AZI 1mg/ml vµ dung dÞch chuÈn ROXI 10mg/ml trong pha ®éng, ch¹y LC-MS chÕ ®é SIM, pha ®éng acetonitril : amoni acetat 0,05M(5:5). (AZI) (ROXI) H×nh 3.13. S¾c ký ®å AZI vµ ROXI ch¹y cét Thermo C18(50x2,1mm; 5mm) (AZI) (ROXI) H×nh 3.14: S¾c ký ®å AZI vµ ROXI ch¹y cét Zorbax C18 SB (150x4,6; 5mm) Cét Thermo cho pic xÊu, kÐo ®u«i thêi gian l­u cña AZI vµ ROXI gÇn trïng nhau. Chóng t«i chän sö dung cét Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm) v× cho pic t­¬ng ®èi ®Ñp víi thêi gian l­u hîp lý. *Pha ®éng: Kh¶o s¸t hÖ pha ®éng acetonitril : amoni acetat 0,05M víi c¸c tû lÖ (9:1),(8:2), (7:3) ,(6:4) vµ (5:5). KÕt qu¶ kh¶o s¸t cho thÊy víi tû lÖ (6:4) cã kh¶ n¨ng t¸ch tèt nhÊt, cho 2 pic s¾c nÐt t¸ch rêi nhau, ch©n pic gän, c©n ®èi vµ cã thêi gian ph©n tÝch hîp lý. Kh¶o s¸t ch¹y pha ®éng theo chÕ ®é gradient nh­ sau: Pha ®éng kªnh A ( NH4CH3COO 50mM), kªnh B(MeCN) Ch¹y chÕ ®é Gradient b¾t ®Çu 40% B thay ®æi tuyÕn tÝnh tíi 90%B trong 1,5 phót. Sau ®ã duy tr× 90%B trong 0,5 phót råi trë l¹i tû lÖ ban ®Çu nh­ng kÕt qu¶ pic thu ®­îc kh«ng tèt b»ng ch¹y chÕ ®é ®¼ng dßng, pic bÞ kÐo ®u«i vµ rÊt tï. Do vËy, trong qu¸ tr×nh x©y d­ng ph­¬ng ph¸p, chóng t«i chän hÖ dung m«i nµy víi tû lÖ 6:4 vµ kh«ng sö dông chÕ ®é trén tù ®éng. - Tèc ®é dßng: qua kh¶o s¸t l­u l­îng dßng tõ 0,2 – 0,6ml/phót cho thÊy l­u l­îng dßng lµ 0,5 ml/phót lµ tèi ­u v× vÉn cã kh¶ n¨ng t¸ch riªng AZI vµ ROXI, l¹i cã thêi gian ph©n tÝch hîp lý. - NhiÖt ®é cét: nhiÖt ®é phßng - ThÓ tÝch tiªm: tiªm tù ®éng víi thÓ tÝch 25ml. - §iÒu kiÖn ph©n tÝch khèi phæ: theo c¸c th«ng sè ®· ®­îc thiÕt lËp ë trªn. H×nh 3.15: S¾c ký ®å AZI vµ ROXI ch¹y chÕ ®é ®¼ng dßng 0,5ml/phót hÖ dung m«i acetonitril : amoni acetat 0,05M(6:4) 3.3.4. KÕt qu¶ thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch. 3.3.4.1. §¸nh gi¸ tÝnh chän läc. ChuÈn bÞ mÉu: HT tr¾ng. HT tr¾ng cã thªm AZI. HT tr¾ng cã thªm ROXI. HT tr¾ng cã thªm AZI vµ ROXI. Xö lý mÉu theo s¬ ®å h×nh 3.1 vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch theo ®iÒu kiÖn s¾c ký ®· x¸c ®Þnh. KÕt qu¶ thu ®­îc tr×nh bµy ë h×nh 3.16. S¾c ký ®å mÉu HT tr¾ng S¾c ký ®å và phæ khèi mÉu HT cã AZI S¾c ký ®å vµ phæ khèi mÉu HT cã ROXI S¾c ký ®å mÉu HT cã AZI vµ ROXI H×nh 3.16. C¸c s¾c ký ®å ®¸nh gi¸ tÝnh chän läc cña ph­¬ng ph¸p. NhËn xÐt: Trªn s¾c ký ®å mÉu tr¾ng t¹i c¸c vÞ trÝ t­¬ng øng víi thêi gian l­u cña AZI vµ ROXI kh«ng xuÊt hiÖn pic l¹, c¸c pic AZI vµ ROXI c©n ®èi, s¾c nÐt, t¸ch riªng biÖt. Phæ khèi cña pic t¹i thêi ®iÓm 3,12 phót cã m/z=749,3 vµ t¹i thêi ®iÓm 6 phót cã m/z=837,08 trïng víi gi¸ trÞ m/z cña chÊt chuÈn AZI vµ ROXI khi tiÕn hµnh c¸c ®iÒu kiÖn ch¹y MS. Tõ c¸c kÕt qu¶ trªn, chóng ta thÊy ph­¬ng ph¸p cã tÝnh chän läc tèt. 3.3.4.2. §¸nh gi¸ tÝnh phï hîp cña hÖ thèng. ChuÈn bÞ mÉu chuÈn cã AZI nång ®é 1mg/ml vµ ROXI nång ®é 2mg/ml trong pha ®éng, ph©n tÝch theo ®iÒu kiÖn LC-MS ®· x¸c ®Þnh. TiÕn hµnh ph©n tÝch 6 lÇn liªn tiÕp, kÕt qu¶ c¸c th«ng sè: thêi gian l­u, diÖn tÝch pic, tû sè diÖn tÝch pic ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.4. B¶ng 3.4. KÕt qu¶ kh¶o s¸t tÝnh phï hîp cña hÖ thèng LC-MS LÇn tiªm Thêi gian l­u AZI (phót) DiÖn tÝch pic AZI (relative Abundance*s) Thêi gian l­u ROXI (phót) DiÖn tÝch pic ROXI (relative Abundance*s) Tû sè diÖn tÝch AZI/ROXI 1 3,24 83975382 5,97 55977799 1,50 2 3,25 97146667 5,97 60627152 1,60 3 3,26 106438830 5,95 63970613 1,66 4 3,27 108898880 5,94 67171078 1,62 5 3,25 100948268 5,93 65374934 1,54 6 3,24 108645034 5,93 69106856 1,57 TB 3,25 5,95 1,58 SD 0,01 0,02 0,06 RSD (%) 0,36 0,31 3,67 NhËn xÐt: ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c th«ng sè ph©n tÝch ®Òu nhá h¬n 4%, ®iÒu nµy chøng tá hÖ thèng s¾c ký cã tÝnh thÝch hîp chÊp nhËn ®­îc, cã thÓ øng dông ph©n tÝch mÉu ®Ó cho kÕt qu¶ tin cËy. 3.3.4.3. X¸c ®Þnh kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh. ChuÈn bÞ c¸c mÉu HT tr¾ng, thªm AZI vµ ROXI t¹o thµnh c¸c mÉu cã nång ®é AZI lÇn l­ît lµ 0,02mg/ml; 0,05mg/ml; 0,15mg/ml; 0,5mg/ml; 1,5mg/ml vµ 2mg/ml, nång ®é ROXI cè ®Þnh 2mg/ml. Xö lý mÉu theo quy tr×nh ®· x©y dùng nh­ trong s¬ ®å h×nh 3.1 vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch theo ®iÒu kiÖn s¾c ký ®· x¸c ®Þnh. KÕt qu¶ thu ®­îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.5 B¶ng 3.5. Sù phô thuéc gi÷a tû sè diÖn tÝch pic vµ nång ®é AZI trong HT MÉu 1 2 3 4 5 6 7 Nång ®é (mg/ml) 0,02 0,05 0,15 0,50 1,00 1,50 2,00 Tû sè diÖn tÝch (AZI/ROXI) 0,0367 0,0742 0,2387 0,5807 1,0956 1,6322 2,3405 Ph­¬ng tr×nh håi quy: Y= 1,1237 X + 0,019 HÖ sè t­¬ng quan: R2= 0,9966 Trong ®ã: X lµ nång ®é cña AZI trong HT (mg/ml) Y lµ tû sè gi÷a diÖn tÝch pic cña AZI vµ diÖn tÝch pic cña ROXI H×nh 3.17. §å thÞ biÓu diÔn sù phô thuéc gi÷a tû sè diÖn tÝch pic(AZI/ROXI) vµ nång ®é AZI trong HT NhËn xÐt: tõ c¸c kÕt qu¶ trong b¶ng 3.5. vµ h×nh 3.17 cho thÊy cã sù phô thuéc tuyÕn tÝnh gi÷a tû sè diÖn tÝch pic (AZI/ROXI) vµ nång ®é AZI trong HT. §­êng chuÈn håi quy cã d¹ng th¼ng vµ hÖ sè t­¬ng quan lín h¬n 0,99 chøng tá cã sù t­¬ng quan tuyÕn tÝnh chÆt gi÷a tû sè diÖn tÝch pic (AZI/ROXI) vµ nång ®é AZI trong HT ë kho¶ng nång ®é kh¶o s¸t. 3.3.4.4. X¸c ®Þnh LOD vµ LOQ TiÕn hµnh chiÕt, ph©n tÝch mÉu HT cã nång ®é 0,05mg/ml AZI, ph©n tÝch cho ®¸p øng cã tû sè S/N=75. Ph©n tÝch víi mÉu cã nång ®é 0,02mg/ml AZI cho ®¸p øng víi tû sè S/N=15, chØ sè gÇn víi 10 nªn x¸c ®Þnh LOQ kho¶ng 0,02mg/ml vµ LOD vµo kho¶ng 0,006 mg/ml. (A) (B) H×nh 3.18. S¾c ký ®å mÉu HT x¸c ®Þnh LOQ (A) cã nång ®é AZI 0,05 mg/ml; (B) cã nång ®é AZI 0,02mg/ml 3.3.4.5. §é ®óng ChuÈn bÞ c¸c mÉu AZI cã ROXI trong HT tr¾ng ë 3 nång ®é 0,05mg/ml; 0,5mg/ml vµ 1,5mg/ml; mçi nång ®é lµm 5 mÉu, xö lý mÉu theo s¬ ®å h×nh 3.1 vµ tiÕn hµnh ph©n tÝch theo ®iÒu kiÖn s¾c ký ®· x¸c lËp, råi so s¸nh gi¸ trÞ trung b×nh gi÷a c¸c lÇn ®Þnh l­îng cña mçi nång ®é víi gi¸ trÞ thùc cã trong mÉu. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ ®é ®óng ®­îc tr×nh bµy ë b¶ng 3.6. B¶ng 3.6. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®é ®óng cña ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch MÉu STT 0,05mg/ml 0,50mg/ml 1,50mg/ml Nång ®é ®o ®­îc (mg/ml) §é ®óng (%) Nång ®é ®o ®­îc (mg/ml) §é ®óng (%) Nång ®é ®o ®­îc (mg/ml) §é ®óng (%) 1 0,0502 100,48 0,5555 111,10 1,4357 95,71 2 0,0491 98,23 0,4999 99,98 1,5088 100,58 3 0,0477 95,46 0,4956 99,12 1,3059 87,06 4 0,0486 97,17 0,5693 113,87 1,3899 92,66 5 0,0515 103,09 0,4868 97,37 1,4131 94,21 TB 0,0494 98,89 0,5214 104,29 1,4107 94,05 NhËn xÐt: kÕt qu¶ kh¶o s¸t cho thÊy ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng cã ®é ®óng biÕn thiªn tõ 94,05% - 104,29%, chøng tá ph­¬ng ph¸p cã ®é ®óng cao. 3.3.4.6. §é chÝnh x¸c TiÕn hµnh t­¬ng tù nh­ phÇn x¸c ®Þnh ®é ®óng nh­ng kÕt qu¶ dùa trªn ®¸nh gi¸ ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña tû sè diÖn tÝch pic c¸c mÉu ë tõng nång ®é. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®é lÆp l¹i trong ngµy ®­îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.7. B¶ng 3.7. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh ®é lÆp l¹i trong ngµy cña phÐp ph©n tÝch STT Tû sè diÖn tÝch pÝc ë c¸c nång ®é 0,05mg/ml 0,50mg/ml 1,50mg/ml 1 0,0755 0,5555 1,6322 2 0,0742 0,4999 1,7144 3 0,0726 0,4956 1,4864 4 0,0736 0,5693 1,5809 5 0,0769 0,4868 1,6070 TB 0,0746 0,5214 1,6042 SD 0,0017 0,0380 0,0827 RSD (%) 2,24 7,29 5,16 NhËn xÐt: kÕt qu¶ tõ b¶ng 3.7 cho thÊy ph­¬ng ph¸p cã ®é lÆp l¹i trong ngµy ®¹t yªu cÇu (RSD t¹i 3 nång ®é ®Òu <15%). Trong ph©n tÝch dÞch sinh häc, víi gi¸ trÞ RSD dao ®éng tõ 2,24% - 7,29% th× ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc coi lµ cã ®é chÝnh x¸c trung b×nh (5 - 10%), [19]. 3.4. X¸c ®Þnh hiÖu suÊt chiÕt. ChuÈn bÞ c¸c mÉu AZI trong HT tr¾ng ë 3 nång ®é kh¶o s¸t, mçi nång ®é lµm 3 mÉu, song song tiÕn hµnh s¾c ký c¸c mÉu chuÈn pha trong pha ®éng ë 3 nång ®é t­¬ng øng. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh hiÖu suÊt chiÕt AZI ®­îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.8. B¶ng 3.8. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh hiÖu suÊt chiÕt Nång ®é STT 0,05mg/ml 0,5mg/ml 1,5mg/ml DiÖn tÝch pic AZI Trong HT DiÖn tÝch pic AZI Trong P§ HiÖu suÊt (%) DiÖn tÝch pic AZI Trong HT DiÖn tÝch pic AZI Trong P§ HiÖu suÊt (%) DiÖn tÝch pic AZI Trong HT DiÖn tÝch pic AZI Trong P§ HiÖu suÊt (%) 1 2731470 3047678 26468816 25995430 65566638 73791647 2 2605301 2936448 23350781 21805271 79792243 82674135 3 2744469 2800785 21812699 26001376 85689724 83012457 TB 2693747 2928304 91,99 23877432 24600692 97,06 77016202 79826080 96,48 NhËn xÐt: kÕt qu¶ thùc nghiÖm cho thÊy ph­¬ng ph¸p cho hiÖu suÊt chiÕt cao ë c¶ 3 nång ®é (tõ 91,99% - 97,06%), do ®ã ph­¬ng ph¸p xö lý mÉu ®· x©y dùng thÝch hîp ®Ó cã thÓ chiÕt t¸ch AZI tõ HT ng­êi. 3.5. §Þnh l­îng th¨m dß AZI trong HT ng­êi t×nh nguyÖn. TiÕn hµnh lÊy m¸u ®Þnh l­îng AZI trong HT 2 ng­êi t×nh nguyÖn uèng chÕ phÈm cã chøa AZI ( viªn nÐn Zithromax liÒu 500 mg) sau b÷a ¨n 2 giê. Mçi ng­êi ®­îc lÊy m¸u ë 2 thêi ®iÓm, sau uèng thuèc 1giê vµ 1,75 giê. C¸c mÉu m¸u ®­îc ®¸nh sè vµ m· hãa theo thêi gian lÊy m¸u. LÊy m¸u tÜnh m¹ch c¸nh tay vµo èng nghiÖm cã chøa EDTA, ly t©m lÊy HT . Mçi mÉu lÊy 0,5ml thªm 100ml IS xö lý mÉu theo s¬ ®å h×nh 3.1 vµ tiÕn hµnh s¾c ký theo ®iÒu kiÖn ®· x¸c ®Þnh. KÕt qu¶ ph©n tÝch ®­îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.9. B¶ng 3.9.KÕt qu¶ ®Þnh l­îng th¨m dß AZI trong HT ng­êi t×nh nguyÖn NTN Nång ®é AZI trong HT (μg/ml) Sau uèng thuèc 1 giê Sau uèng thuèc 1,75 giê 1 0,048 0,195 2 0,052 0,211 (T1) (T2) S¾c ký ®å mÉu sau 1giê uèng thuèc (T1) (T2) S¾c ký ®å mÉu sau 1,75 giê uèng thuèc H×nh 3.19. C¸c s¾c ký ®å ®Þnh l­îng AZI trong HT 2 ng­êi t×nh nguyÖn T1 vµ T2 Ch­¬ng 4: Bµn luËn. 4.1. VÒ x©y dùng vµ thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng AZI. 4.1.1. VÒ x©y dùng vµ thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng AZI trong dung dÞch b»ng HPLC víi dertecter huúnh quang. *VÒ X©y dùng ph­¬ng ph¸p: ThiÕt lËp ®­îc c¸c ®iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký, kh¶o s¸t mét sè ®iÒu kiÖn t¹o dÉn xuÊt huúnh quang nh­: nhiÖt ®é, thêi gian. *VÒ thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p: Qu¸ tr×nh thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ®· ®­îc nªu chi tiÕt t¹i môc 3.2.3 víi kÕt qu¶ nh­ sau: - Ph­¬ng ph¸p cã tÝnh chän läc tèt. - HÖ thèng cã tÝnh phï hîp cao do cã ®é lÖch chuÈn t­¬ng ®èi cña c¸c th«ng sè ph©n tÝch ®Òu nhá h¬n 3% khi tiÕn hµnh s¾c ký 6 lÇn liªn tiÕp trªn cïng mét mÉu chuÈn. - Kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh: 0,5mg/ml- 10mm/ml. Cã sù t­¬ng quan chÆt gi÷a tû sè diÖn tÝch pic (AZI/CLA). - LOQ lµ 0,5 mg/ml kh«ng phï hîp ®Ó tiÕn hµnh x©y dùng quy tr×nh ®Þnh l­îng AZI trong HT, v× ®Ó ®Þnh l­¬ng AZI trong HT ®ßi hái ph­¬ng ph¸p cã LOQ thÊp h¬n (ng/ml). Víi giíi h¹n ®Þnh l­îng vµ kho¶ng tuyÕn tÝnh trªn th× ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong c¸c chÕ phÈm. 4.1.2. VÒ x©y dùng vµ thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng AZI trong HT b»ng LC-MS. *VÒ X©y dùng ph­¬ng ph¸p: - Ph­¬ng ph¸p xö lý mÉu: ®Ó t¹o ®iÒu kiÖn tèi ­u cho ®Þnh l­îng AZI trong HT ng­êi (cã nång ®é thÊp, nÒn mÉu phøc t¹p) ®¹t kÕt qu¶ tèt, quy tr×nh xö lý mÉu ph¶i cã kh¶ n¨ng lo¹i t¹p tèt vµ hiÖu suÊt chiÕt cao. Chóng t«i lùa chän ph­¬ng ph¸p chiÕt láng - láng ®Ó t¸ch AZI trong HT nh»m gi¶m chi phÝ cho qu¸ tr×nh ph©n tÝch, ngoµi ra chiÕt láng - láng còng kh«ng ®ßi hái c¸c trang thiÕt bÞ ®Æc biÖt, qu¸ tr×nh tiÕn hµnh ®¬n gi¶n, dÔ triÓn khai. ChiÕt láng - láng sö dông dung m«i h÷u c¬ cßn cã kh¶ n¨ng lµm giµu mÉu do qu¸ tr×nh bay h¬i dung m«i (c« ®Æc mÉu). Tuy nhiªn, trong qu¸ tr×nh bay h¬i dung m«i, ®Ó tr¸nh AZI cã thÓ bÞ ph©n hñy bëi nhiÖt ®é, nªn khi bay h¬i dung m«i kh«ng ®Ó nhiÖt ®é cao ( nhá h¬n 50oC). - Ph­¬ng ph¸p LC-MS ®Þnh l­îng AZI trong HT: ph­¬ng ph¸p LC-MS ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong dÞch sinh häc ®· ®­îc nghiªn cøu vµ c«ng bè trong mét sè tµi liÖu[12],[13]. Dùa vµo c¸c tµi liÖu ®· c«ng bè, kÕt hîp víi c¸c ®iÒu kiÖn kh¸ch quan phï hîp chóng t«i tiÕn hµnh kh¶o s¸t c¸c ®iÒu kiÖn s¾c ký. KÕt qu¶ ®¸nh gi¸ th«ng qua x¸c ®Þnh tÝnh chän läc, tÝnh phï hîp cña hÖ thèng, kho¶ng nång ®é ®¸p tuyÕn tÝnh, hµm ®¸p øng, tÝnh ®óng, ®é chÝnh x¸c, hiÖu suÊt chiÕt. Qua c¸c kÕt qu¶ thu ®­îc, chóng t«i nhËn thÊy ch­¬ng tr×nh ®­îc x©y dông vµ ®· sö dông trong ®Ò tµi lµ phï hîp ®Ó ph©n tÝch ®Þnh l­îng AZI trong HT ng­êi. Pic AZI cã thêi gian l­u ng¾n (kho¶ng 3 phót), t¸ch riªng biÖt khái pic cña néi chuÈn (kho¶ng 6 phót), pic c©n ®èi, gän, víi thêi gian s¾c ký phï hîp (8,5 phót). * VÒ thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng. Sau khi x©y dùng xong mét quy tr×nh ph©n tÝch, ®Ó ®¶m b¶o cã thÓ ¸p dông quy tr×nh vµo ph©n tÝch trong thùc tÕ mét c¸ch chÝnh x¸c, cÇn thÈm ®Þnh l¹i ph­¬ng ph¸p víi ®Çy ®ñ c¸c chØ tiªu nh­: tÝnh chän läc, kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh, giíi h¹n ®Þnh l­îng, ®é ®óng, ®é chÝnh x¸c, ®é æn ®Þnh cña mÉu ph©n tÝch. Qu¸ tr×nh thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng ®· ®­îc nªu chi tiÕt t¹i môc 3.3.4 víi kÕt qu¶ nh­ sau: *Ph­¬ng ph¸p cã tÝnh chon läc cao. LC-MS lµ mét trong nh÷ng thiÕt bÞ ph©n tÝch cã tÝnh chän läc vµ ®é nh¹y cao nhÊt hiÖn nay. X©y dông ph­¬ng ph¸p b»ng LC-MS ®¶m b¶o tèt ®­îc tÝnh chän läc vµ ®é nh¹y nh­ng h¹n chÕ lµ thiÕt bÞ ch­a ®­îc trang bÞ réng r·i t¹i c¸c trung t©m kiÓm nghiÖm, hiÖn t¹i chØ cã t¹i c¸c trung t©m kiÓm nghiÖm ®Çu ngµnh do ®ã triÓn khai øng dông c¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch trªn LC-MS trong ngµnh Y, D­îc cßn rÊt h¹n chÕ. * Kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh: 0,02μg/ml - 2μg/ml. HÖ sè t­¬ng quan lín h¬n 0,99 (R2 = 0,9966) lµ chÊp nhËn ®­îc cho ®Þnh l­îng trong dÞch sinh häc ë nång ®é thÊp. Kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh thu ®­îc phï hîp ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong HT ng­êi sö dông AZI (uèng 2 viªn Zithromax 250mg Cmax= 332,08 ± 90,12 ng/ml, Tmax= 2,82± 1,11 h [16].) * Giíi h¹n ®Þnh l­îng: LOQ= 0,02μg/ml Trong ®Ò tµi nµy, giíi h¹n ®Þnh l­îng ®­îc x¸c ®Þnh theo tû sè S/N. Giíi h¹n ®Þnh l­îng nµy lµ phï hîp ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong huyÕt t­¬ng phôc vô nghiªn cøu sinh kh¶ dông vµ t­¬ng ®­¬ng sinh häc * §é ®óng Ph­¬ng ph¸p nghiªn cøu cã ®é ®óng cao víi gi¸ trÞ biÕn thiªn tõ 94,05% - 104,29%, ®é lÖch n»m trong giíi h¹n cho phÐp (±15%). Nh­ vËy, theo tµi liÖu [19], ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng cña ®Ò tµi nghiªn cøu ®¹t tiªu chuÈn vÒ ®é ®óng cho ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch c¸c dÞch sinh häc vµ cã thÓ ¸p dông ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong HT ng­êi. * §é chÝnh x¸c: Trong ®Ò tµi chóng t«i tiÕn hµnh thÈm ®Þnh ®é chÝnh x¸c theo tiªu chÝ ®é lÆp l¹i trong ngµy vµ kÕt qu¶ cho thÊy ®èi víi ®é lÆp l¹i trong ngµy, c¸c gi¸ trÞ RSD biÕn thiªn tõ 2,24% - 7,29% (< 10%), vËy ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch ®­îc x©y dùng trong ®Ò tµi ®¹t tiªu chuÈn vÒ ®é chÝnh x¸c cho ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch c¸c dÞch sinh häc [19], vµ cã ®é chÝnh x¸c trung b×nh. * §é æn ®Þnh: Do ®iÒu kiÖn kh¸ch quan lµ kh«ng chñ ®éng ®­îc thêi gian còng nh­ lÞch tr×nh sö dông thiÕt bÞ (LC-MS) nªn chóng t«i ch­a thùc hiÖn ®¸nh gi¸ ®é æn ®Þnh cña AZI trong thêi gian ph©n tÝch vµ trong thêi gian b¶o qu¶n. 4.2. VÒ kÕt qu¶ ®Þnh l­îng th¨m dß AZI trong HT ng­êi t×nh nguyÖn. §Þnh l­îng th¨m dß trªn 2 ng­êi t×nh nguyÖn uèng viªn nÐn Zithromax liÒu 500mg sau b÷a ¨n 2 giê, ®o ®­îc nång ®é AZI trong HT t¹i thêi ®iÓm sau uèng thuèc 1 giê lµ: 0,048μg/ml vµ 0,052μg/ml; t¹i thêi ®iÓm sau uèng thuèc 1,75 giê lµ: 0,195μg/ml vµ 0,211μg/ml VËy chóng t«i kh¼ng ®Þnh ph­¬ng ph¸p ®· ®­îc x©y dùng ®Þnh l­îng ®­îc AZI trong HT. Cã thÓ dïng ph­¬ng ph¸p nµy ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong HT ng­êi dïng thuèc phôc vô c«ng t¸c ®iÒu trÞ, nghiªn cøu sinh kh¶ dông vµ t­¬ng ®­¬ng sinh häc. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ KÕt luËn: Tõ c¸c kÕt qu¶ thùc nghiÖm thu ®­îc, chóng t«i ®· ®¹t môc tiªu ®Ò ra lµ x©y dùng ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng azithromycin trong HT. Ph­¬ng ph¸p ®­îc x©y dùng trªn thiÕt bÞ LC-MS. Qua qu¸ tr×nh thùc hiÖn ®Ò tµi chóng t«i rót ra mét sè kÕt luËn sau: * Víi ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng AZI b»ng HPLC víi detector huúnh quang. Qu¸ tr×nh x©y dùng dõng l¹i ë giai ®o¹n kh¶o s¸t ®Þnh l­îng trong dung dÞch khi x¸c ®Þnh thÊy giíi h¹n ®Þnh l­îng kh«ng phï hîp cho ®Þnh l­îng AZI trong HT. §· x©y dùng ®­îc ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng AZI trong dung dÞch, cã thÓ ¸p dông ph­¬ng ph¸p nµy ®Ó ®Þnh l­¬ng AZI trong chÕ phÈm. Ph­¬ng ph¸p ®­îc tãm t¾t nh­ sau: - Dïng CLA lµm chuÈn néi. - DÉn xuÊt hãa tr­íc cét b»ng FMOC-Cl . + KiÒm hãa b»ng ®Öm borat 0,1M pH=7,4. + NhiÖt ®é ph¶n øng: 500C + Thêi gian 40 phót. - §iÒu kiÖn s¾c ký: + Cét: C18 (150 mm x 4,6 mm x 5mm). + NhiÖt ®é cét: 400C. + Pha ®éng: Acetonitril: §Öm phosphat 0,1M pH 7,7 (76:24). + L­u l­îng dßng: 1,5ml/phót. + Tiªm mÉu: 50ml + Detector huúnh quang : b­íc sãng kÝch thÝch: 270nm. B­íc sãng ph¸t x¹ : 317nm. *Víi ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng AZI trong HT b»ng LC-MS - Dïng ROXI lµm chuÈn néi - §· thiÕt lËp ®­îc mét quy tr×nh chiÕt AZI tõ HT b»ng ph­¬ng ph¸p chiÕt láng - láng, sö dông dung m«i chiÕt lµ diethyl ether sau khi kiÒm hãa b»ng dung dÞch Na2CO3 0,05M vµ c« bay h¬i dung m«i ë nhiÖt ®é 45oC. - §· x¸c ®Þnh ®­îc ch­¬ng tr×nh LC-MS ®Ó ®Þnh l­îng AZI trong HT nh­ sau: + Cét Zorbax C18 SB (150 x4,6; 5mm). + Pha ®éng: acetonitril : amoni acetat 0,05M (6 : 4) + Tèc ®é dßng: 0,5ml/phót +ThÓ tÝch tiªm mÉu: 25μl. + MS chÕ ®é SIM: Chän ion cã m/z tõ 748-750 ®Ó x¸c ®Þnh pic cña AZI, ion cã m/z tõ 836- 838 ®Ó x¸c ®Þnh pic cña ROXI. + KhÝ Sheath Gas: 30 + Auxilary Gas: 20 * ThÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch: §· tiÕn hµnh thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p mét c¸ch t­¬ng ®èi ®Çy ®ñ, bao gåm c¸c chØ tiªu: tÝnh chän läc, sù phï hîp cña hÖ thèng, kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh, giíi h¹n ®Þnh l­îng d­íi, ®é ®óng, ®é chÝnh x¸c. KÕt qu¶ cho thÊy c¸c chØ tiªu trªn ®Òu ®¹t yªu cÇu. * VÒ ®Þnh l­îng th¨m dß AZI trong HT ng­êi t×nh nguyÖn: KÕt qu¶ thu ®­îc cho phÐp kh¼ng ®Þnh ph­¬ng ph¸p x©y dùng b»ng LC – MS ®Þnh l­îng ®­îc AZI trong HT ng­êi sö dông chÕ phÈm cã chøa AZI. KiÕn nghÞ: - Ph­¬ng ph¸p cÇn tiÕp tôc hoµn thiÖn phÇn thÈm ®Þnh ph­¬ng ph¸p (x¸c ®Þnh ®é æn ®Þnh) ®Ó ®¶m b¶o kh¶ n¨ng øng dông cao trong thùc tÕ. - øng dông ®Ó nghiªn cøu sinh kh¶ dông vµ t­¬ng ®­¬ng sinh häc c¸c chÕ phÈm AZI trong n­íc s¶n xuÊt. Tµi liÖu tham kh¶o TiÕng ViÖt. 1. TrÇn Tö An, TrÇn TÝch, NguyÔn V¨n TuyÒn, ... (2003), §¸nh gi¸ t­¬ng ®­¬ng sinh häc viªn nang cephalexin s¶n xuÊt trong n­íc, T¹p chÝ d­îc häc 10/2003, tr. 15 - 19. 2. TrÇn Tö An, Th¸i NguyÔn Hïng Thu (2006), Hãa ph©n tÝch, tËp 2, Trung t©m th«ng tin – th­ viÖn tr­êng ®¹i häc D­îc Hµ Néi, tr 107-124, tr 173-210. 3. NguyÔn ThÞ KiÒu Anh, Tõ Minh Koãng, Vò ThÞ Thanh Loan (2002), §Þnh l­îng ketoprofen trong huyÕt t­¬ng b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao, T¹p chÝ d­îc häc 8/ 2002, tr. 20 - 22. 4. Bé Y tÕ - Héi ®ång D­îc ®iÓn viÖt nam (2002), D­îc th­ quèc gia ViÖt Nam, Nhµ xuÊt b¶n y häc, tr. 166-168. 5. Tµo Duy CÇn, Hoµng Trung Quang (2005), Tra cøu biÖt d­îc míi vµ d¹ng thuèc th­êng dïng, tËp 1, Nhµ xuÊt b¶n Y häc, tr. 128-131. 6. TrÇn §øc HËu (2004), Hãa d­îc tËp 2, Trung t©m th«ng tin – th­ viÖn tr­êng ®¹i häc D­îc Hµ Néi, tr. 238-239. 7. TrÞnh V¨n Quú, Phïng ThÞ Vinh, T¹ M¹nh Hïng (2004), KÕt qu¶ triÓn khai m« h×nh ®¸nh gi¸ t­¬ng ®­¬ng sinh häc in vivo t¹i ViÖn KiÓm nghiÖm - Bé Y tÕ, T¹p chÝ kiÓm nghiÖm thuèc 1/2004, tr. 13 - 17. 8. NguyÔn §×nh TriÖu (2005), C¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch vËt lý vµ hãa lý, tËp 2, Nhµ xuÊt b¶n khoa häc vµ kü thuËt, tr. 41-60. TiÕng Anh 9. Robert E.Ardray (2003), Liquid chromatography – Mass Spectrometry: An introduction, University of Huddersfield. 10. Bahrami, S. Mirzaeei, A. Kiani, Journal of Chromatography B, 820 (2005), pp. 277-281. 11. C. Blandizzi, T. Malizia, G. Gherardi, F. Costa, S. Marchi, C. Marveggio, G. Natale, S. Senesi, M. Bellini, G. Maltinti, M. Campa, M. Del Tacca, Journal of Microbial Chemotherapy, 42 (1998), pp. 75-82. 12. L. Chen, F. Qin, Y. Ma, F. Li, Journal of Chromatography B, in press (2007). 13. L.M. Chiu, A.M. Menhinick, P.W. Johnson, G.W. Amsden, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 50 (2002), pp. 1075-1079. 14. J.E. Conte, J. Golden, S. Duncan, E. McKenna, E. Lin, E. Zurlinden, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 40 (1996), pp. 1617-1622. 15. F. Kees , S. Spangler, M. Wellenhofer, Journal of Chromatography A, 812 (1998), pp. 287–293. 16. N.M. Najib, N. Idkaidek, I.E. Ghanem, I. Admour, S.M. Alam, Q. Zaman, R. Dham, Biopharmaceutics and Disposition, 22 (2001), pp. 15-21. 17. J. Niopas, A.C. Daftsios, Biomedica Chromatography, 15 (2001), pp. 507-508. 18. K.M. Olsen, G.S. San Pedro, L.P. Gann, P.P. Gubbins, D.M. Halinski, G.D. Campbell, Antimicrobial Agents Chemotherapy, 40 (1996), pp. 2582-2585. 19. C. M. Riley, T. W. Rosanske (1996), Development and Validation of Analytical Method, Vol. 3. 20. R.A. Shawabkeh, M.F. Tutunji, Sensors, 2 (2002), pp. 436-446. 21. Gary Siuzdak (1994), The emergence of mass spectrometry in biochemical research, Proceeding of the national Academy of science of the United States of America, vol.1, No 21, pp. 11290-11297. Phô lôc C¸c s¾c ký ®å kh¶o s¸t tÝnh phï hîp cña hÖ thèng C¸c s¾c ký ®å kh¶o s¸t kho¶ng nång ®é tuyÕn tÝnh cña AZI trong huyÕt t­¬ng S¾c ký ®å vµ phæ khèi AZI 0,02mg/ml S¾c ký ®å vµ phæ khèi AZI 0,05mg/ml S¾c ký ®å vµ phæ khèi AZI 0,15mg/ml S¾c ký ®å vµ phæ khèi AZI 0,5mg/ml S¾c ký ®å vµ phæ khèi AZI 1mg/ml S¾c ký ®å vµ phæ khèi AZI 1,5mg/ml