Mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu thực nghiệm trên chuột nhắt bằng phối hợp doxorubicin và cyclophosphamid

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 440 MÔ PHỎNG MÔ HÌNH GÂY SUY GIẢM BẠCH CẦU THỰC NGHIỆM TRÊN CHUỘT NHẮT BẰNG PHỐI HỢP DOXORUBICIN VÀ CYCLOPHOSPHAMID Lê Phan Thu Giang*, Hà Đức Cường**, Nguyễn Đăng Thoại**, Trần Mạnh Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: “Mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid và doxorubicin trên chuột nhắt” để làm công cụ sàng lọc và đánh giá khả năng khôi phục bạch cầu của các thuốc thử nghiệm, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu. Phương pháp: Suy giảm bạch cầu được tiến hành bằng cách tiêm phúc mạc cyclophosphamid và doxorubicin ở các liều lượng khác nhau. Sử dụng buồng đếm Neubauer và xét nghiệm công thức máu để xác định mô hình phù hợp. Kết quả: cyclophosphamid (150 mg/kg) kết hợp với doxorubicin (5 mg/kg) tiêm phúc mạc với liều duy nhất gây giảm bạch cầu mạnh nhất ở thời điểm 4 ngày sau đó. Tác động làm giảm số lượng các loại bạch cầu cũng thể hiện rõ rệt, nhất là trên bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu lympho. Tổng lượng bạch cầu có thể phục hồi tự nhiên trở về bình thường sau một đợt khảo sát (14 ngày sau khi tiêm cyclophosphamid và doxorubicin). Vì thế, mô hình chỉ có giá trị áp dụng vào ngày thứ 4. Kết luận: Mô hình này có thể được áp dụng làm công cụ sàng lọc các thuốc có tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu do thuốc hóa trị ung thư gây ra. Từ khóa: Cyclophosphamid, Doxorubicin, Suy giảm bạch cầu, Mô hình thực nghiệm ABTRACT DEVELOPMENT OF A MOUSE MODEL OF NEUTROPENIA INDUCED BY CYCLOPHOSPHAMID AND DOXORUBICIN Le Phan Thu Giang, Ha Duc Cuong, Nguyen Dang Thoai, Tran Manh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 440 - 445 Objective: A mouse model of neutropenia induced by cyclophosphamide and doxorubicin was developed to provide a tool for screening bone-marrow protecting agents. Methods: Neutropenia was induced by a single intraperitoneal injection of cyclophosphamid and doxorubicin. Neubauer cell counter and white blood cell count were applied to determine grade of neutropenia. Results: Cyclophosphamide (150 mg/kg, ip.) and doxorubicin (5 mg/kg, ip.) induced significant neutropenia after 4 days of injection. However, total white blood cell count returned to baseline 14 days thereafter, thus this model could be of value when evaluating at day 4. Conclusion: This mouse model can be applied for screening agents that exert protective effect on cyclophosphamid and doxorunicin-induced neutropenia. Key words: Cyclophosphamid, doxorubicin, Neutropenia, Mouse model * Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Công ty Cổ phần Dược Phẩm OPC Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Mạnh Hùng ĐT: 0937746596 Email: tranmanhhung@uphcm.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 441 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là bệnh ác tính với tỷ lệ tử vong cao. Hiện nay, với sự ra đời của nhiều thuốc mới, tác động đến đích, kèm theo sự kết hợp các phương pháp phẫu trị, xạ trị và đặc biệt là hóa trị đã góp phần rất lớn trong điều trị và cải thiện chất lượng cuộc sống bệnh nhân. Các thuốc hóa trị như doxorubicin, cyclophosphamid là một trong những nhóm thuốc chính sử dụng trong các phác đồ điều trị ung thư vú(1), u lympho Hodgkin và không Hodgkin, ung thư phổi(2) và một số loại ung thư thường gặp khác với hiệu quả đã được chứng minh, nhưng nhóm này gây nhiều tác dụng phụ trên hệ tạo máu, gây suy giảm bạch cầu, vì thế làm hạn chế liều sử dụng trên lâm sàng. Bạch cầu có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh. Giảm số lượng bạch cầu làm tăng nguy cơ mắc các bệnh nhiễm trùng cơ hội trong quá trình hóa trị ung thư và có thể gây tử vong cho người bệnh. Trước đây tình trạng giảm bạch cầu chỉ có thể khắc phục bằng cách giảm liều, trì hoãn hoặc ngưng hóa trị. Nhưng hiện nay khó khăn này đã được khắc phục bằng việc sử dụng các yếu tố kích thích tạo bạch cầu như: G-CSF (filgrastim/pegfilgrastim, lenograstim); GM-CSF (molgramostim, sargramostim). Bên cạnh đó, các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu như tam thất, phụ tử, linh chi, trinh nữ hoàng cungv,v, cũng đang được nghiên cứu như là những chất hỗ trợ điều trị, giúp hạn chế tác dụng phụ trên hệ tạo máu của các thuốc hóa trị. Với mục đích xây dựng các mô hình dược lý phù hợp phục vụ cho nghiên cứu sàng lọc thuốc có tác động phòng ngừa độc tính trên tủy xương, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu trên chuột nhắt bằng phối hợp doxorubicin và cyclophosphamid”. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thú vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, giống đực, khỏe mạnh, không có biểu hiện bất thường, có trọng lượng khoảng 24 ± 2 gam, do Viện Vắc-xin và Sinh phẩm Y Tế Nha Trang cung cấp. Hàng ngày chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn và nước uống. Hóa chất và thuốc thử nghiệm - Endoxan® 200 mg (cyclophosphamid 200mg): Baxter Oncology GmbH – Germany - Doxorubin® 25 ml (doxorubicin 50 mg): Pharmachemie BV, Nederland - Neupogen® (filgrastim 30 MIU): F.Hopmann – La Roche Ltd, Thụy Sỹ Phương pháp thử nghiệm Thử nghiệm sơ khởi trên trên buồng đếm Neubauer Thử nghiệm này nhằm khảo sát liều lượng của doxorubicin và cyclophosphamid trên mức độ gây suy giảm tổng lượng bạch cầu để từ đó có thể xác định liều lượng và thời gian thích hợp để mô phỏng mô hình thực nghiệm. Cyclophosphamid và doxorubicin được tiêm phúc mạc, thể tích tiêm 0,1 ml/10 g vào buổi sáng. Hằng ngày chuột được lấy máu đuôi và xác định số lượng bạch cầu bằng buồng đếm Neubauer vào thời điểm trước khi tiêm và liên tục 14 ngày sau khi tiêm. Chuột được thử nghiệm ở các liều sau: - Cyclophosphamid 100 mg/kg + doxorubicin 5 mg/kg, ip, liều duy nhất, ngày 0. - Cyclophosphamid 150 mg/kg + doxorubicin 5 mg/kg, ip, liều duy nhất, ngày 0. Thử nghiệm xác định trên máy xét nghiệm huyết học Sau khi đã xác định được liều lượng và thời gian gây suy giảm bạch cầu của các thuốc doxorubicin và cyclophosphamid trong thử nghiệm sơ khởi, chúng tôi tiến hành thử nghiệm xác định để xây dựng mô hình. Các mẫu máu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 442 được xét nghiệm trên máy huyết học CELL- DYN 3200. Tổng lượng bạch cầu, số lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, hồng cầu, tiểu cầu đều được ghi nhận và đưa vào kết quả thực nghiệm. Phân tích kết quả và thống kê Số liệu được trình bày là giá trị trung bình ± Sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM). Việc thống kê được thực hiện trên phần mềm thống kê Minitab, sử dụng phép kiểm t- test để so sánh sự khác biệt giữa các lô với sự khác biệt có ý nghĩa khi giá trị p<0,05; p<0,01 hay p<0,001. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát tác động gây suy giảm bạch cầu của các lô thử nghiệm sơ khởi Trong thí nghiệm này mỗi lô gồm 6 chuột được lấy máu ở đuôi để xác định tổng lượng bạch cầu trước khi tiêm (ngày 0), sau đó tiêm cyclophosphamid và doxorubicin liều duy nhất (ngày 0). Tiến hành xác định tổng lượng bạch cầu bằng buồng đếm Neubauer vào thời điểm trước khi tiêm và liên tục 14 ngày sau khi tiêm. Kết quả thử nghiệm sơ khởi được trình bày ở hình 1. Hình 1. Tổng lượng bạch cầu xác định bằng buồng đếm Neubauer của các lô thử nghiệm sơ khởi. Đối với lô tiêm cyclophosphamid (100 mg/kg) kết hợp doxorubicin (5 mg/kg), thể trọng của chuột giảm nhẹ và hồi phục nhanh, chuột vẫn hoạt động bình thường. Bạch cầu chuột giảm thấp nhất vào ngày 4 (1333 ± 142/mm3), sau đó hồi phục dần dần đến ngày 7 và dao động quanh mức bình thường đến ngày 14 (Hình 1A). Đối với lô tiêm cyclophosphamid (150 mg/kg) kết hợp doxorubicin (5 mg/kg), thể trọng của chuột giảm mạnh. Tổng lượng bạch cầu giảm rõ rệt. Ở ngày 4, tổng lượng bạch cầu giảm xuống dưới 1000/mm3 (783 ± 120/mm3), sau đó hồi phục dần từ ngày 7 đến ngày 14 (Hình 1B). Qua quá trình khảo sát tác động gây suy giảm bạch cầu của cyclophosphamid phối hợp doxorubicin, chúng tôi nhận thấy: cyclophosphamid 100 mg/kg phối hợp doxorubicin 5 mg/kg tiêm phúc mạc liều duy nhất gây suy giảm bạch cầu ở mức trung bình trong khi đó liều cyclophosphamid 150 mg/kg phối hợp doxorubicin 5 mg/kg gây suy giảm bạch cầu ở mức độ nặng hơn. Do đó, chúng tôi quyết định lựa chọn liều này để tiếp tục lập lại thí nghiệm đánh giá cụ thể sự thay đổi từng loại bạch cầu trên máy xét nghiệm huyết học cũng như khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid phối hợp doxorubicin. Thử nghiệm xác định xây dựng mô hình suy giảm bạch cầu Từ kết quả thử nghiệm trên (hình 1B), chúng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 443 tôi đã xác định được liều lượng phối hợp thích hợp của cyclophosphamid và doxorubicin cũng như thời gian gây suy giảm bạch cầu thấp nhất (vào ngày thứ 4). Vì thế trong thử nghiệm xác định để xây dựng mô hình, các mẫu máu được lấy vào ngày thứ 4 sau khi tiêm các thuốc và được xét nghiệm công thức máu trên máy xét nghiệm huyết học. Thử nghiệm được tiến hành trên các lô sau: - Từ mô hình đã thiết kế, chúng tôi có được các lô thử nghiệm như sau: - Lô chứng: tiêm dung môi pha thuốc hóa trị (glucose 5%) - Lô gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid 150 mg/kg + doxorubicin 5 mg/kg thể trọng. - Lô gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid 150 mg/kg + doxorubicin 5 mg/kg + dự phòng bằng filgrastim 50 µg/kg thể trọng(4). Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm: tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân. Ngoài ra các chỉ số huyết học khác như bạch cầu ưa kiềm, bạch cầu ưa acid, hồng cầu và tiểu cầu cũng được ghi nhận. Đánh giá tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng 1 và 2. Bảng 1. Tổng lượng bạch cầu của các lô thử nghiệm. LÔ Tổng lượng bạch cầu (/mm3) Chứng (n = 10) 6851 ± 432 Cyclophosphamid 150 mg/kg + Doxorubicin 5 mg/kg (n = 11) 1114 ± 186 *** Cyclophosphamid 150 mg/kg + Doxorubicin 5 mg/kg + filgrastim 50 µg/kg (n = 11) 2111 ± 242 ## ***p<0,001: khác nhau có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. ##p<0,01: khác nhau có ý nghĩa thống kê so với lô tiêm cyclophosphamid 150 mg/kg và doxorubicin 5 mg/kg. Dựa vào kết quả thống kê về tổng lượng bạch cầu giữa các lô thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy: Đối với lô gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid và doxorubicin, kết quả cho thấy tổng lượng bạch cầu đã giảm đi rất nhiều. Sự suy giảm này khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) so với lô chứng. Cụ thể, tổng lượng bạch cầu giảm hơn 6 lần so với lô chứng, mức suy giảm này được xem là mức nặng. Khi sử dụng filgrastim, chúng tôi nhận thấy tổng lượng bạch cầu có cải thiện nhưng hiệu quả chưa cao. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) so với lô gây suy giảm bạch cầu. Từ kết quả đánh giá tác động gây suy giảm tổng lượng bạch cầu của mô hình cyclophosphamid kết hợp doxorubicin và đáp ứng của mô hình với filgrastim, chúng tôi tiếp tục đánh giá kết quả trên từng loại bạch cầu riêng biệt: bạch cầu đa nhân trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân. Bình thường lượng bạch cầu ưa acid và bạch cầu ưa kiềm rất thấp nên chúng tôi không đánh giá ở đây. Kết quả thực nghiệm về chỉ số số lượng các loại bạch cầu được trình bày trong bảng 2. Bảng 2. Số lượng các loại bạch cầu trung tính, lympho và đơn nhân của các lô thử nghiệm. Lô Bạch cầu trung tính Bạch cầu lympho Bạch cầu đơn nhân (/mm3) Lô chứng 904 ± 209 5865 ± 404 150 ± 19 Cyclophosphamid 150 mg/kg + doxorubicin 5 mg/kg 55 ± 9*** 848 ± 191*** 210 ± 107 Cyclophosphamid 150 mg/kg + doxorubicin 5 mg/kg + filgrastim 50µg/kg 279 ± 106 # 1281 ± 218 # 527 ± 107 # ***p<0,001: khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng. #p<0,05: khác biệt có ý nghĩa thống kê so lô tiêm cyclophosphamid 150 mg/kg và doxorubicin 5 mg/kg. Kết quả thực nghiệm cho thấy số lượng bạch cầu trung tính giảm rất mạnh sau khi sử dụng cyclophosphamid phối hợp doxorubicin và khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) so với lô chứng. Filgrastim có thể hiện tác động phục hồi một phần lượng bạch cầu trung tính bị suy giảm. Tương tự, số lượng bạch cầu lympho ở lô sử Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 444 dụng cyclophosphamid và doxorubicin cũng suy giảm rõ rệt so với lô chứng (p < 0,001). Trong khi đó số lượng bạch cầu đơn nhân hầu như không thay đổi. Filgrastim có tác dụng phục hồi một phần số lượng bạch cầu lympho bị suy giảm và làm tăng số lượng bạch cầu đơn nhân so với lô gây suy giảm và cả lô chứng. Như vậy, qua kết quả thực nghiệm mà chúng tôi thu được, chúng tôi nhận thấy: cyclophosphamid phối hợp doxorubicin gây độc tính suy giảm bạch cầu: làm giảm tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho nhưng ít ảnh hưởng đến bạch cầu đơn nhân. Filgrastim thể hiện tác động hồi phục trên bạch cầu trung tính rõ nhất. Đánh giá các chỉ số về hồng cầu và tiểu cầu Song song với việc xác định tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu, chúng tôi cũng theo dõi số lượng hồng cầu, tiểu cầu. Kết quả được trình bày ở hình 2. Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy cyclophosphamid phối hợp doxorubicin gây suy giảm hồng cầu. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) so với lô chứng. Filgrastim không có tác động phục hồi sự suy giảm hồng cầu trên chuột thử nghiệm. So song với sự suy giảm số lượng hồng cầu, số lượng tiểu cầu cũng giảm đáng kể so với lô chứng (p < 0,01). Trên dòng tiểu cầu, filgrastim lại thể hiện tác động phòng ngừa độc tính của cyclophosphamid và doxorubicin trên chỉ số này. Hình 2. Tác động của Cyclophosphamid (Cyclo) và Doxorubicin (Doxo) trên hồng cầu, tiểu cầu và đáp ứng của filgrastim (Filg) trên các dòng tế bào này. BÀN LUẬN Các chỉ số biểu thị số lượng các loại tế bào máu thường có một khoảng dao động nhất định, nhưng trong thử nghiệm này, sự giảm mạnh tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, hồng cầu, tiểu cầu khi sử dụng cyclophosphamid phối hợp doxorubicin chứng tỏ đây là độc tính đặc thù của thuốc hóa trị. Mô hình gây suy giảm bạch cầu được xây dựng khá nhiều với các thuốc hóa trị ung thư như cyclophosphamid, doxorubicin, methotrexat, cytosin, arabinosid, etoposid, vincristin(3). Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn sự kết hợp cyclophosphamid với doxorubicin vì đây là một trong những phác đồ hay áp dụng trong điều trị ung thư vú, u lympho Hodgkin và không Hodgkin, ung thư phổi. Tuy nhiên, việc áp dụng mô hình của các tác giả đã công bố trước đây cần phải được Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 445 thẩm định lại do sự khác biệt về chỉ tiêu đánh giá, chủng thú vật thử nghiệm, điều kiện thí nghiệm và sự khác biệt khi phối hợp nhiều thuốc Mặt khác, hiện chưa tìm thấy mô hình được xây dựng dựa trên cả hai thuốc cyclophosphamid và doxorubicin. Kết quả cho thấy mô hình có sự suy giảm bạch cầu đạt ý nghĩa bệnh lý và có đáp ứng với filgrastim; vì thế có tính ứng dụng. KẾT LUẬN Mô hình này có thể được áp dụng làm công cụ sàng lọc các thuốc có tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu do thuốc hóa trị ung thư gây ra. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Jones SE1, Savin MA, Holmes FA, et al. (2006) Phase III Trial Comparing Doxorubicin Plus Cyclophosphamide With Docetaxel Plus Cyclophosphamide As Adjuvant Therapy for Operable Breast Cancer; Journal of Clinical Oncology, 24(34):5381-5387. 2. McEvoy GK (2003), Drug information, American Society of health – System Pharmacists, pp.1078-1084. 3. Schurig JE, Schlein A, Florczyk AP, Farwell AR, Bradner WT. (1986) Animal models for evaluating the myelosuppressive effects of cancer chemotherapeutic agents. Exp Hematol. Suppl 16:101-105. 4. Trần Mạnh Hùng, Nguyễn Thị Hương Hiền (2009), “ Mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu thực nghiệm bằng 5 FU và methorexat”, Tạp chí dược học, 402 (1): 25-31. Ngày nhận bài: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014