Nghiên cứu chế tạo test thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn tả

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 18 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TEST THỬ NHANH PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ VI KHUẨN TẢ Phạm Đức Minh*; Hoàng Văn Lương* TãM T¾T Mục tiêu: chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn tả (VKT). Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: sử dụng kháng thể đơn dòng kháng độc tố CTX của VKT. Que thử dựa trên nguyên lý phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể xảy ra trên màng mỏng. Có đối chiếu với kỹ thuật ELISA trên mẫu nhiễm CTX. Kết quả: que thử có khả năng phát hiện được độc tố CTX ở nồng độ 50 ng/ml và có độ đặc hiệu 100%. Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố CTX trên mẫu thử, que thử có độ nhạy lần lượt là 95% và 53% so với kỹ thuật ELISA. Que thử nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả năng áp dụng cao trong thực tiễn y học và cộng đồng. Kết luận: Học viện Quân y đã bước đầu chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện độc tố CTX của VKT. Que thử nhanh có giá thành thấp, dễ sử dụng, khả năng áp dụng cao. * Từ khóa: Vibrio cholerae; Độc tố tả; Que thử nhanh. Studying Development of Rapid Test to Detect Vibrio Cholerae Toxin Summary Objective: Production of test strips for rapid detection of Cholera toxin. Subjects and methods: The study used monoclonal antibodies against CTX toxin of Vibrio cholerae. The strips based on the principle of antigen-antibody immune response occur on thin films. The result will be compared to ELISA in samples infected with CTX. Results: The strips have the ability to detect CTX toxin at concentrations of 50 ng/mL and a specificity of 100%. At the concentration of 50 ng/mL and 25 ng/mL of CTX toxin in the sample, the test strip has a sensitivity of 95% and 53%, respectively, compared to ELISA. The strips are low cost, easy to use, and have high applicability in medicine practice and community. Conclusion: Military Medical University has initial successfully made the rapid test strips to detect CTX toxin of Vibrio cholerae. The strips are low cost, easy to use, and have high applicability in medicine practice and community. * Key words: Vibrio cholerae; CTX; Rapid test. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn tả là một trong những mầm bệnh nguy hiểm, do nó có thể sinh ra độc tố gây dịch tiêu chảy cấp [1, 7]. Độc tố VKT còn có nguy cơ sử dụng trực tiếp như là một vũ khí sinh học nguy hiểm [4]. Hiện tại Việt Nam đã có vắcxin phòng bệnh tả, nhưng hiệu quả chỉ đạt từ 66 - 90% [6] và chưa phổ biến. Chẩn đoán nhanh và * Häc viÖn Qu©n y Người phản hồi (Corresponding): Ph¹m §øc Minh (drminh103@yahoo.com) Ngày nhận bài: 15/01/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 22/01/2015 Ngày bài báo được đăng: 26/01/2015 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 19 chính xác mẫu có chứa độc tố CTX của VKT sẽ giúp ích cho quá trình phát hiện, điều trị và dự phòng ngộ độc do độc tố của VKT [3, 4]. Hiện nay, que thử nhanh đã và đang chiếm ưu thế trong ứng dụng y học và các lĩnh vực liên quan [3]. Que thử nhanh được Singer J M và Plotz C M (1956) [8] nghiên cứu và phát triển, cho đến nay đã cải tiến nhiểu. Với ưu điểm giá thành thấp, dễ áp dụng, độ chính xác cao, que thử nhanh đang là mục tiêu của nhiều phòng thí nghiệm cũng như các công ty sản xuất sản phẩm liên quan đến sinh học phân tử. Học viện Quân y đang quản lý một dây chuyền sản xuất que thử nhanh. Hệ thống này được nhập từ Công ty Arista (Hoa Kỳ), có khả năng hoạt động tự động hoàn toàn hoặc bán tự động. Hiện tại có một số phương pháp thường dùng để phát hiện VKT và độc tố trong thực phẩm, bao gồm nuôi cấy, phương pháp ELISA, phương pháp khuếch đại gen (PCR), que thử nhanh... [1, 3, 4]. Trong đó, que thử có ưu thế trong sàng lọc và được ưu tiên sử dụng. Xuất phát từ những yêu cầu đó, đề tài này thực hiện nhằm: Chế tạo que thử nhanh phát hiện độc tố CTX của VKT. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn các nhóm vi khuẩn sau: - Độc tố chuẩn: CTX code G-117 Lot # P5351 (Enza Life Sciences). - Độc tố đối chứng: độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) của vi khuẩn E. coli; độc tố ruột SEB (Staphylococcal enterotoxin B) của vi khuẩn Staphylococcus aureus. 2. Vật liệu nghiên cứu. * Dụng cụ, thiết bị: Dụng cụ và thiết bị chuyên dụng của Khoa Vi sinh vật và Trung tâm nghiên cứu Y Dược học - Học viện Quân y. Hệ thống sản xuất que thử nhanh của Hãng Arista (Hoa Kỳ). * Kháng thể: Bảng 1: Các kháng thể sử dụng trong nghiên cứu. TÊN KHÁNG THỂ VẬT CHỦ TYPE: ISOTOPE KÝ HIỆU (Catalog #) HÃNG SẢN XUẤT MAb to Cholera Toxin Monoclonal Antibody to Cholera Toxin beta subunit Chuột MAb-IgG1 C01593M Meridian MAb to Cholera Toxin Monoclonal Antibody to Cholera Toxin beta subunit Chuột MAb-IgG1 C01594M Meridian Anti Mouse IgG Dê IgG ABCAM- 0500 ABCAM Có 3 kháng thể được gắn lên màng: kháng thể phát hiện (KT1), kháng thể bắt giữ (KT2) và kháng thể kiểm tra (KT3). Kháng thể phát hiện (Detection Antibody) là C01594M, sẽ được gắn với hạt vàng, sau đó gắn lên màng chứa cộng hợp (Conjugate pad). Kháng thể bắt giữ (Capture antibody) là C01593M, sẽ được gắn lên màng NC ở vị trí test line. Kháng thể kiểm tra là ABCAM-0500, sẽ gắn lên màng NC ở vị trí vạch đối chứng (control line). TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 20 * Màng gắn trên que thử: Mỗi thanh test được cấu tạo bởi 5 bộ phận chính: màng hút mẫu (Sample pad); màng chứa chất cộng hợp màu (Conjugate pad); màng nitrocellulose (Nitrocellulose membrance); màng hút trên (Absorbent pad) và đế nhựa giữ (Plastic adhesive backing card) của que thử, đặt mua của Công ty Ahlstrom, P.O. Box 329, Salmisaarenaukio 1, FI-00180 Helsinki (Phần Lan) và của Công ty Advanced Microdevices (mdi), 20-21 Industrial Area, Ambala Cantt 133 006 (Ấn Độ). * Dung môi xử lý màng: Các màng đều có chức năng riêng biệt và để tối ưu hóa hoạt động của que thử, loại màng đều cần phải xử lý trước khi gắn lên test. Mỗi dung môi sẽ đặc hiệu cho một loại màng nhất định và làm tăng hoạt tính của màng sau xử lý. 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Phương pháp chế tạo que thử nhanh: - Thiết kế: chế tạo que thử nhanh dựa theo quy trình của Công ty Arista (Hoa Kỳ). Trước tiên, xử lý loại màng bằng các dung môi thích hợp, để khô. Tiếp theo, phun kháng thể lên màng, cuối cùng lắp ghép và giữ chặt các bộ phận trên một đế nhựa. Quá trình tiến hành ở điều kiện nhiệt độ khoảng 25oC, độ ẩm tương đối < 40%. Sau khi hoàn thành, cất giữ sản phẩm trong gói hàn nhiệt kín, có vật liệu chống ẩm bảo quản. 1: Màng hút mẫu 2: Màng chứa chất cộng hợp màu (chứa KT1). 3: Màng phát hiện đầu tiên 4: Màng Nitrocellulose 5(a): Vạch phát hiện mẫu (chứa KT2) 5(b): Vạch đối chứng (Chứa KT3) 6: Màng hút trên 7: Đế nhựa giữ Hình 1: Sơ đồ cấu tạo của test phát hiện nhanh. - Nguyên lý hoạt động của que thử: kháng thể phát hiện (KT1) sẽ gắn với kháng nguyên đặc hiệu và gặp kháng thể bắt giữ (KT2). Nếu phản ứng miễn dịch đặc hiệu xảy ra sẽ cho kết quả vạch dương tính. Tất cả các phức hợp đi tiếp gặp kháng thể kiểm tra (KT3) sẽ làm xuất hiện màu tại vạch đối chứng. - Tối ưu hóa: công đoạn tối ưu hóa sẽ cho công thức phối hợp tối ưu giữa nồng độ kháng thể cũng như các hóa chất khác trên que nhúng, phải đảm bảo nguyên tắc “sử dụng hàm lượng tối thiểu các chất để tạo được thiết bị có tính năng tối ưu”. * Phương pháp thử nghiệm que nhúng với mẫu thử: Que nhúng sẽ được đối chiếu với kỹ thuật ELISA trong thử nghiệm với mẫu TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 21 độc tố để xác định độ nhạy và độ đặc hiệu. Đánh giá độ nhạy của que thử qua khả năng phát hiện mẫu CTX ở các nồng độ pha loãng khác nhau từ 5 - 200 ng/ml. Kiểm chứng độ đặc hiệu với độc tố không chịu nhiệt LT của vi khuẩn E. coli và độc tố ruột SEB của vi khuẩn S. aureus. * Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Nghiên cứu thực hiện tại Labo Vi sinh và các Mầm bệnh sinh học, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự. Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Quân y 103 từ 10 - 2012 đến 6 - 2014. * Xử lý số liệu: số liệu được quản lý và phân tích bằng phần mềm Epi.info 7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Chế tạo và tối ƣu hóa que nhúng. * Nồng độ kháng thể trên màng que thử: Hình 2: Que thử có hàm lượng KT1: 0,25 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. Hình 3: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 23 Hình 4: Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 1 µg/card; KT3: 0,25 µg/card. (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) Que thử có hàm lượng KT1: 0,5 µg/card; KT2: 0,5 µg/card; KT3: 0,25 µg/card đã cho tín hiệu có thể nhận biết được. * Khả năng phát hiện của que thử trên mẫu độc tố chuẩn: Hình 5: Thử que nhúng với độc tố CTX ở nồng độ 50 ng/ml. Hình 6: Thử que nhúng với độc tố CTX ở nồng độ 100 ng/ml. (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) Que thử cho kết quả dương tính (2 vạch) rõ nét khi mẫu CTX ở nồng độ 50 ng/ml (hình 5). TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 24 2. Tính đặc hiệu của que thử. Hình 7: Thử que nhúng với độc tố SEB nồng độ 100 ng/ml của vi khuẩn Staphycoccocus aureus. Hình 8: Thử que nhúng với độc tố LT nồng độ 100 ng/ml của vi khuẩn Escherichia coli. (Vị trí KT3: vạch chứng; Vị trí KT2: vạch test) Que thử cho kết quả âm tính (tín hiệu tại vạch chứng KT3) với độc tố SEB của vi khuẩn Staphylococcus aureus, độc tố LT của vi khuẩn Escherichia coli đều cho kết quả âm tính. 3. So sánh que thử với kỹ thuật ELISA trong phát hiện độc tố CTX. Bảng 2: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhiễm CTX nồng độ 50 ng/ml. K Õ t q u ¶ ELISA T æ n g (+) (-) Que thử nhanh (+) 38 0 38 (-) 2 0 2 Tổng 40 0 40 Độ nhạy [95%CI] = 0.95 [0.82 - 0.99] TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 25 Bảng 3: Kết quả thử nghiệm que thử nhanh và ELISA trên mẫu thực phẩm nhiễm CTX nồng độ 25 ng/ml. K Õ t q u ¶ ELISA T æn g (+) (-) Que thử nhanh (+) 21 0 21 (-) 19 0 19 Tổng 40 0 40 Độ nhạy [95%CI] = 0.53 [0.36 - 0.68] Ở nồng độ 50 ng/ml và 25 ng/ml của độc tố CTX trên mẫu thử, que thử có độ nhạy lần lượt là 95% và 53% so với kỹ thuật ELISA. BÀN LUẬN 1. Quy trình chế tạo que thử nhanh. Nghiên cứu sử dụng kết quả từ một khảo sát trước đó trên 04 kháng thể đơn dòng phát hiện độc tố CTX cho thấy những kháng thể có khả năng phát hiện kháng nguyên khác nhau, xếp theo thứ tự tăng dần của độ nhạy lần lượt là kháng thể C01238M, C01592M, C01593M, C01594M [2]. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử dụng phương pháp Western blot để kiểm tra sự phát hiện chính xác tiểu phần B độc tố CTX của VKT gây bệnh bằng kháng thể đơn dòng, cho thấy các kháng thể đều phát hiện ra độc tố CTX tiểu phần B, đây là phần quan trọng nhất quyết định hoạt tính của độc tố. Trong đó, kháng thể C01594M có khả năng phát hiện chính xác độc tố của vi khuẩn V. cholerae với độ nhạy cao nhất (5 ng/ml). Dựa trên các kết quả đó, quá trình sàng lọc và lựa chọn sẽ cho cặp kháng thể tối ưu để sử dụng trên que thử. Kết quả khảo nghiệm cho thấy, khi nồng độ kháng thể tại màng cộng hợp và màng NC < 0,5 µg/card, tín hiệu tại que thử không có hoặc yếu. Tín hiệu rõ khi hàm lượng kháng thể > 0,5 µg/card và rất rõ khi > 1 µg/card. Trong sản xuất que thử, cần quan tâm đến giá thành sản phẩm, nên sử dụng lượng nguyên liệu tối thiểu để đưa ra được sản phẩm đạt yêu cầu. Chính vì những lý do này nên công thức phối hợp tối ưu về hàm lượng kháng thể tại màng cộng hợp (KT1-kháng thể phát hiện), vạch kiểm tra (KT2-kháng thể bắt giữ), vạch đối chứng (KT3) lần lượt là: 0,5; 0,5; 0,25 µg/card. Trong tương lai, có thể nghiên cứu dùng kháng thể polyclonal thay thế cho monoclonal nhằm tăng ngưỡng phát hiện và giảm chi phí tạo kit. Độ ẩm khi phun kháng thể là một trong những yêu cầu rất quan trọng, nếu độ ẩm cao > 45% sẽ dẫn đến nhòe vạch phun, khả năng kháng thể bám dính vào màng không tốt, dẫn đến độ ổn định và độ bền của que thử không cao. 2. Khả năng phát hiện của que thử nhanh với độc tố CTX của VKT. Que thử nhanh sau khi tối ưu đã được thử với độc tố CTX ở các nồng độ khác nhau. Kết quả cho thấy tín hiệu của que thử có thể phát hiện được bằng mắt thường khi nồng độ độc tố trong mẫu thử là 50 ng/ml. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 25 Que thử nhanh cho kết quả trong vòng 5 - 10 phút. Chính vì vậy, trên thực tế que thử nhanh sẽ giúp ích trong công tác sàng lọc nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm độc tố trước khi tiến hành xét nghiệm sâu hơn, điều này sẽ làm giảm chi phí trong xét nghiệm chẩn đoán. Khi phương pháp này được áp dụng cùng với các phương pháp khác, đặc biệt là phương pháp khuếch đại gen định lượng và miễn dịch định lượng, các nhà khoa học đã có thể trả lời nhanh và chính xác về chủng loại vi khuẩn, số lượng mầm bệnh bị nhiễm trong thực phẩm và nồng độ độc tố có trong mẫu [4]. Để đánh giá tính đặc hiệu của que thử, đối tượng được chọn là độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin) của vi khuẩn E. coli và độc tố ruột SEB (Staphylococcal enterotoxin B) của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Trong đó, độc tố LT của E. coli có cấu trúc và cơ chế gây bệnh rất giống với độc tố CTX. Kết quả cho thấy que thử không có phản ứng chéo với 2 loại độc tố LT và SEB. So sánh khả năng phát hiện độc tố CTX với kỹ thuật ELISA trên mẫu nghiên cứu ở nồng độ khác nhau cho thấy que thử có độ tương đồng cao (95%) với ELISA ở nồng độ 50 ng/ml và thấp hơn (53%) ở nồng độ 25 ng/ml. Điều này có thể do ngưỡng phát hiện của ELISA (10 ng/ml) thấp hơn nhiều so với que thử nhanh (50 ng/ml) [2], nên khả năng phát hiện của ELISA nhạy hơn so với que thử nhanh, đặc biệt là những mẫu có nồng độ thấp. Trên thực tế, để chẩn đoán chính xác cần phối hợp một số kỹ thuật, trong đó que thử nhanh thường chỉ là nghiệm pháp sàng lọc [3, 4]. KẾT LUẬN Đã chế tạo thành công que thử nhanh phát hiện độc tố vi khuẩn Vibrio cholera. Que thử sử dụng kháng thể phát hiện là C01594M với khối lượng 0,5 µg/card, kháng thể bắt giữ là C01593M với khối lượng 0,5 µg/card và kháng thể kiểm tra là ABCAM-0500 với khối lượng 0,25 µg/card. Que thử có khả năng phát hiện được độc tố CTX ở nồng độ 50 ng/ml, có độ đặc hiệu tuyệt đối và độ nhạy 95% so với kỹ thuật ELISA. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phùng Đắc Cam. Vibrio cholerae và bệnh dịch tả. NXB Y học. 2003. 2. Phạm Đức Minh, Nguyễn Hùng Long, Hoàng Văn Lương. Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ELISA phát hiện độc tố VKT. Tạp chí Y học Việt Nam. 2014, tập 419, số 6 (1), tr.46-49. 3. Trần Linh Thước. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và môi trường. NXB Giáo dục. 2002. 4. CDC. Laboratory Methods for the Diagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera. 1999. 5. CDC. Agents for Bioterrorism. 2003. 6. Anh DD, Lopez AL, Tran HT, Cuong NV, Thiem VD, Ali M, Deen JL, von Seidlein L, Sack DA. Oral cholera vaccine development and use in Vietnam. PLoS Med. 2014, Sep 2, 11 (9). 7. Dalsgaard A, Forslund A, Tam NV, Vinh DX, Cam PD. Cholera in Vietnam: changes in genotypes and emergence of class I integrons containing aminoglycoside resistance gene cassettes in vibrio cholerae O1 strains isolated from 1979 to 1996. J Clin Microbiol. 1999, Mar, 37 (3), pp.734-941. 8. Singer J M & Plotz C M. The latex fixation test. Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis. American Journal of Medicine. 1956, 21, pp.888-992. TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 26