KẾT LUẬN
Carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn được
chiết tách bằng phương pháp tán siêu âm đầu
dò có hiệu quả tốt nhất trong việc phá vỡ
màng tế bào với hệ dung môi thích hợp là
chloroform-methanol (2:1, tt/tt), hiệu suất chiết
đạt khoảng 95%.
Carotenoid được định lượng bằng phương
pháp HPLC sử dụng cột pha đảo C18 với hệ
dung môi phân tích là acetonitril- methanoldichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung
amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích
là 12 phút. Qui trình đã được thẩm định đáp
ứng các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính
đặc hiệu, độ đúng, độ lập lại của một phương
pháp phân tích dựa trên HPLC. Áp dụng qui
trình đã thẩm định xác định hàm lượng
carotenoid của một số nguyên liệu vi khuẩn của
phòng thí nghiệm và chế phẩm chứa carotenoid
đang lưu hành: trong đó các sản phẩm
carotenoid trong nước chưa đạt hàm lượng
carotenoid ghi trên nhãn, các chế phẩm ngoại
nhập có hàm lượng carotenoid đạt thông số ghi
trên nhãn.
6 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 09/02/2022 | Lượt xem: 47 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xây dựng qui trình định lượng Carotenoid trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
Chuyên Đề Dược Học 182
XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CAROTENOID
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG
Võ Xuân Hoài*, Phan Thanh Dũng*, Trần Cát Đông*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm giàu carotenoid đang lưu hành như: carotenoid
từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), tảo và gần đây là từ vi khuẩn, tuy nhiên trong nước chưa có quy trình định
lượng cụ thể cho các chế phẩm này.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu quy trình chiết tách
carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng
phương pháp HPLC với hệ thống Knauer Smarline 2500 system.
Kết quả và bàn luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy, phá vỡ tế bào bằng tán trong bể siêu âm và chiết
carotenoid với chloroform - methanol (2:1) cho hiệu quả chiết tách carotenoid từ vi khuẩn cao nhất (94,82%).
Hàm lượng carotenoid từ vi khuẩn và các chế phẩm được xác định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ
nhạy cao, trên cột RP C18 ở nhiệt độ phòng, hệ dung môi pha động là acetonitril- methanol - dichloromethal
(70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với tốc độ dòng 1ml /phút, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát
hiện tại 450 nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với các thông số sắc ký có RSD < 2%. Phương pháp
được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích hợp với tỷ lệ phục hồi của carotenoid từ chế phẩm đạt 99,83%.
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công trình định lượng bằng kỹ thuật HPLC để kiểm tra hàm lượng
carotenoid trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường. Qui trình được thẩm định và áp dụng thành công
trên một số sinh khối vi khuẩn giàu carotenoid và chế phẩm chứa carotenoid trong nước và ngoại nhập.
Từ khóa: HPLC, carotenoid, betacaroten, thực phẩm chức năng,
ABSTRACT
ESTABLISHMENT OF A METHOD FOR CAROTENOIDS QUANTIFICATION
IN SOME COMMERCIAL PRODUCTS USING HPLC METHOD
Vo Xuan Hoai, Phan Thanh Dung, Tran Cat Dong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 182 - 187
Introduction: Nowadays, there are many rich carotenoid products on the market. Carotenoids in these
products come from plants: carrot, gac fruit (Momordica cochinchinensis), tomato, seaweed and recently from
bacteria. Although they are popularly used but the suitable quantity method is not yet available for these products
in Vietnam.
Materials and methods: In this work, we studied methods for extraction of carotenoid from bacteria and
developed the carotenoid quantitative method for products containing carotenoid based on HPLC with Knauer
Smarline 2500 system.
Results and disscussions: The result show that, cells breaking process by using ultrasonic bath and extract
carotenoid with chloroform/methanol (2:1) are the most effective with performance about 94,82%. The content of
carotenoids from bacteria and other products were determined by HPLC method, that is rapid and high sensitivity
with RP C18, at room temperature. The mobile phase is acetonitrile – methanol - dichloromethal (70:20:10, v/v/v)
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: DS. Phan Thanh Dũng ĐT: 0983957158 Email: dungpharm@yahoo.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 183
supplemented with ammonium acetate 10 mM, with flow 1ml/minute, inject volume 20 μl, UV detector at 450
nm. The HPLC method is highly suitable with RSD of chromatography parameters were less than 2%. The
method was validated for the acceptable accuracy and precision with the recovery rate is 99.83%.
Conclusion: We have succesfully established an HPLC protocol for qualification of carotenoid in commercial
products. The protocol has been validated and applied to determining the carotenoid contents of several different
bacterial biomasses and some domestic and imported products.
Keywords: HPLC, carotenoid. Betacarotene, functional food
ĐẶT VẤN ĐỀ
Carotenoid là nhóm sắc tố terpenoid phổ
biến trong tự nhiên, nhất là trong các sinh vật
sống được dưới ánh nắng mặt trời bao gồm thực
vật, động vật, vi khuẩn, tảo, nấm(3). Kể từ khi
được phát hiện cho đến nay, carotenoid được
ứng dụng rộng rãi để làm phụ gia tạo màu cho
thực phẩm, bổ sung những chất dinh dưỡng,
giúp gia tăng giá trị thẩm mỹ cho cho ngành
thủy sản (7). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dịch
tễ học và kết quả thực nghiệm đã chứng minh
các carotenoid với vai trò là chất chống oxi hóa
đã mang lại lợi ích cho sức khỏe con người bằng
cách ngăn ngừa hay trì hoãn các bệnh mạn tính
như ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh
thể và một số bệnh khác. Do đó, carotenoid cũng
đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều
trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm(1).
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế
phẩm giàu carotenoid được lưu hành như:
carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua),
carotenoid từ tảo, carotenoid từ vi khuẩn
(3)tuy nhiên hàm lượng carotenoid trong các
chế phẩm này thường chỉ ghi chung chung,
không được xác định chính xác và không thể xác
định hoạt tính của các chế phẩm này. Do đó vấn
đề đặt ra là phải xây dựng một quy trình chiết
tách và xác định hàm lượng carotenoid trong chế
phẩm cũng như xác định các loại carotenoid có
trong chế phẩm để xác định hoạt tính của chế
phẩm. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Xây dựng qui trình định lượng carotenoid
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Bột sinh khối vi khuẩn Bacillus marisflavi
DD1.1, Bacillus indicus HU36, Bacillus infantis
AT14, độ ẩm 5%, mật độ tế bào 1010 CFU/g sinh
khối, được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Vi
sinh Công nghệ Dược – Khoa Dược – ĐH Y
Dược TP HCM, 41 Đinh Tiên Hoàng Q1.
Các chế phẩm chứa carotenoid trên thị
trường: Dầu gấc Vinaga (Số lô 4306, hạn sử
dụng 6/2013), dầu gấc Gấc Việt Nam (Số lô
4609, hạn sử dụng 6/2013), Super Antioxidant
của Holland & Barrett (Số lô 375324, hạn sử
dụng 1/2015), Mỹ, Beta-Carotene của Holland
& Barrett (Số lô 375221, hạn sử dụng 1/2015),
Mỹ, Tảo Spiruline của Teva S. Switzerland (Số
lô 4609, hạn sử dụng 9/2013).
Khảo sát phương pháp phá vỡ màng tế bào
vi khuẩn
Chúng tôi tiến hành khảo sát các phương
pháp phá vỡ màng tế báo vi khuẩn như nghiền
trong nitơ lỏng, tán siêu âm đầu dò, dùng bể
siêu âm và sử dụng lysozym với lượng sinh khối
khảo sát là 200 mg. dung môi chiết là cloroform
và methanol với tỷ lệ 1:2 (3,4,5).
Khảo sát dung môi chiết carotenoid từ bột
sinh khối vi khuẩn
Bảng 1: Tỉ lệ các dung môi chiết
Dung môi Cloroform Methanol Tỉ lệ
Thể tích (ml)
2,5 2,5 1:1
1,67 3,33 1:2
3,33 1,67 2:1
1,25 3,75 1:3
3,75 1,25 3:1
Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ dung môi
chiết carotenoid với nhiều tỉ lệ khác nhau, dựa
trên hai dung môi chính là methanol và
cloroform, nhằm tìm ra tỉ lệ dung môi chiết tối
ưu nhất. Chiết tách carotenoid theo quy trình đã
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
Chuyên Đề Dược Học 184
khảo sát ở trên với tỉ lệ hệ dung môi bổ sung
được thay đổi như Bảng 1.
Phương pháp chiết carotenoid từ chế phẩm
Đối với các chế phẩm có chứa carotenoid
(carotenoid được chiết ở dạng bột hoặc dầu)
chiết theo quy trình sau: cân 1/3 lượng dầu
(bột) trong 1 viên chế phẩm vào ống Falcon 50
ml. Thêm vào 10 ml NaOH 1 N pha trong
methanol, lắc rung mạnh trong 1 phút. Thêm
10 ml aceton, lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ
phòng trong 15 phút. Thêm 10 ml n-hexan, lắc
rung cho đều. Thêm 10 ml nước khử khoáng,
lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ phòng trong
10 phút. Ly tâm 9600 vòng /10 phút ở 4oC. Thu
lớp n-hexan. Lớp n-hexan sau đó loại nước
bằng Na2SO4. Dịch chiết với n-hexan được bay
hơi đến cắn. Hòa lại cắn vào 1 ml cloroform và
4 ml dung môi pha động(2,1).
Xây dựng quy trình định lượng carotenoid
bằng phương pháp HPLC và thẩm định
quy trình định lượng
Chúng tôi tiến hành thăm dò hệ dung môi
pha động để tách tốt nhất các loại carotenoid có
trong dịch chiết. Dựa vào tính chất carotenoid là
chất kém phân cực nên chọn hệ dung môi pha
động kém phân cực. Các hệ dung môi pha động
khảo sát gồm có: acetonitril-methanol,
acetonitril-methanol-dicloromethan là các hệ
dung môi thường sử dụng để phân tích
carotenoid với đầu dò UV, bước sóng phát hiện
450 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút trên hệ thống
Knauer Smarline 2500 system. Các mẫu chuẩn
được chọn gồm các loại carotenoid thông dụng
thuộc 2 nhóm xanthophyl và carotenoid:
astaxanthin, canthaxanthin, lutein, lycopen và β-
caroten để tiến hành quá trình thăm dò hệ dung
môi để chọn hệ pha động tối ưu(1,3,5).
Sau khi xây dựng quy trình định lượng
chúng tôi tiến hành hẩm định quy trình định
lượng và ứng dụng qui trình đã thẩm định để
định lượng trên một số chế phẩm đang lưu hành
trên thị trường(1-Error! Reference source not found.).
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát các phương pháp chiết, tách
carotenoid
Qua kết quả thực nghiệm nhận thấy,
phương pháp phá vỡ màng tế bào trong bể
siêu âm và chiết bằng hỗn hợp cloroform -
methanol tỉ lệ 2:1 cho hiệu quả cao nhất với tỷ
lệ hồi phục 94,82%.
Xây dựng quy trình định lượng carotenoid
bằng phương pháp HPLC
Dựa vào tính chất phân cực của carotenoid
(nhóm caroten không phân cực và nhóm
xanthophyl phân cực) để thăm dò hệ dung môi
phân tích bằng phương pháp HPLC. Tiến hành
thăm dò hệ dung môi pha động gồm acetonitril -
methanol, acetonitril – methanol - dicloromethan
với các tỉ lệ khác nhau để tách tốt nhất hỗn hợp 5
chất chuẩn gồm: astaxanthin, canthaxanthin,
zeaxanthin, lycopen và β- caroten. Kết quả khảo
sát cho thấy hệ dung môi phân tích carotenoid
tốt nhất là acetonitril – methanol - dicloromethan
(70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM
với thời gian phân tích là 12 phút (Hình 1-G).
Dung môi pha động isocratic bổ sung
amonium acetat 10 mM với A. ACN -MeOH
(50:50,tt/tt), B. ACN -MeOH (60:40,tt.tt), C. ACN
-MeOH (70:30,tt/tt), D. ACN - MeOH (80:20,tt/tt),
E. ACN - MeOH (90:10,tt/tt), F. ACN –MeOH -
DCM (70:25:5, tt/tt/tt), G. ACN –MeOH -DCM
(70:20:10, tt/tt/tt), H. ACN –MeOH -DCM
(70:15:15, tt/tt/tt).
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 185
L
y
co
p
en
β
-c
ar
o
te
n
L
y
co
p
en
β
-c
ar
o
te
n
A
st
ax
an
th
in
C
an
th
ax
an
th
in
Z
ea
x
an
th
in
L
y
co
p
en
β
-c
ar
o
te
n
A
st
ax
an
th
in
C
an
th
ax
an
th
in
Z
ea
x
an
th
in
L
y
co
p
en
β
-c
ar
o
te
n
A
st
ax
an
th
in
C
an
th
ax
an
th
in
Z
ea
x
an
th
in
L
y
co
p
en
β
-c
ar
o
te
n
A
st
ax
an
th
in
C
an
th
a
x
an
th
in
Z
ea
x
an
th
in
L
y
co
p
en
Β
-c
ar
o
te
n
A
st
a
x
an
th
in
C
an
th
ax
an
th
in
Z
ea
x
an
th
in
L
y
co
p
en
Β
-c
ar
o
te
n
A
st
a
x
an
th
in
C
an
th
ax
an
th
in
Z
ea
x
an
th
in
L
y
co
p
en
Β
-c
a
ro
te
n
A B
D
F
H
G
E
C
Hình 1: Thăm dò hệ dung môi
Thẩm định quy trình phân tích
Tính phù hợp hệ thống
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6)
Loại carotenoid n=6 Rt S (N) As Rs
Astaxanthin
RSD %
0,193 1,973 0,355 1,808 1,726
Canthaxanthin 0,196 1,273 0,852 1,908 1,913
Zeaxanthin 0,318 1,996 1,188 1,989 1,163
Lycopen 0,230 1,786 1,881 1,954 1,779
β-caroten 0,193 1,839 4,276 1,914 1,910
Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc
ký chọn lựa là phù hợp cho việc phân tích định
lượng carotenoid với RSD của thời gian lưu,
diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết của cột sắc ký
đều nằm trong giới hạn RSD ≤ 2%. Các thông số
như hệ số đối xứng nằm trong giới hạn từ 0,8≤
As ≤1,5 và độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5. Như
vậy phương pháp phân tích carotenoid đạt được
tính phù hợp hệ thống.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014
Chuyên Đề Dược Học 186
A
b
so
rb
an
ce
(
m
A
U
)
Time (min)
A
st
ax
an
th
in
C
an
th
ax
an
th
in
Z
ea
x
an
th
in
L
y
co
p
en
Β
-c
ar
o
te
n
Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống
Điều kiện HPLC: Pha động
acetonitril:Methanol:dicloromethan (70:20:10,
tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM, cột
RP- C18 (250 mm, 5 µm), phát hiện UV 450
nm, ở nhiệt độ phòng.
Bảng 3: Kết quả thẩm định phương pháp định lượng
Carotenoid
Canthaxanthin β-caroten
Độ chính xác (n=6) RSD% = 4,26 RSD% = 1,93
Độ đúng (Tỉ lệ hồi
phục, n=9)
98,53% 99,83%
Khoảng tuyến tính Ŷ = 363,86 x – 55,953
R2 = 0,9953
Ŷ = 240,5 x +
37,616
R2 = 0,9981
Giới hạn định lượng 0,026 µg/ml 0,049 µg/ml
Qui trình định lượng carotenoid đã thẩm
định
Phá vỡ màng tế bào bằng tán trong bể siêu
âm. Chiết carotenoid với hệ dung môi
chloroform - methanol với tỉ lệ 2:1. Tiến hành
phân tích HPLC với hệ thống Knauer theo các
điều kiện: Dung môi pha động: acetonitril –
methanol - dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ
sung amonium acetat 10 mM. Cột sắc ký:
Europher RP C18 (250 mm, 4,6 mm, 5 µm). phát
hiện UV 450 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. nhiệt
độ phòng, Thể tích bơm mẫu: 20 µl.
Ứng dụng quy trình định lượng trên chế
phẩm
Bảng 4: Kiểm tra hàm lượng carotenoid của sinh khối
vi khuẩn
Chủng vi
khuẩn
RT
(phút)
Nhóm
carotenoid
Hàm lượng
carotenoid trung
bình (µg/g)
RSD
Bacillus
indicus
4,133 Chưa xác định
48,32 ± 0,14 2,92
4,833 Chưa xác định
Bacillus
infantis
3,833 Astaxanthin
78,23 ± 0,18 1,34
Bacillus
marisflavi
2,631 Chưa xác định
40,36 ± 0,21 4,14
4,582 Canthaxanthin
Bảng 5: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong dầu
gấc
Sản phẩm
Hàm lượng β-
caroten Trên nhãn
(mg %)
Hàm lượng β-
caroten định
lượng (mg%)
RSD
Gac Việt Nam 100 42,08 ± 0,52 1,24
Dầu gấc PV Không ghi trên nhãn 10,16 ± 0,13 1,30
Vinaga 150 126,34 ± 2,46 1,94
Bảng 6: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong các chế phẩm ngoại nhập
Sản phẩm
Nhóm
carotenoid
Hàm lượng
trên nhãn (mg/viên)
Hàm lượng định lượng
(mg/viên)
RSD
% hàm
lượng
Betacarotene β-caroten 15 14,58 ± 0,22 1,48 97,23
Super Antioxidant β-caroten 15 14,70 ± 0,31 2,13 98,01
Beta- carotene β-caroten 15 14,52 ± 0,25 1,89 95,30
Lycopene Lycopen 10 9,53 ± 0,18 1,75 96,79
Tảo Spiruline
Zeaxanthin 2 1,89 ± 0,04 1,98 94,63
β-caroten 2,4 2,29 ± 0,4 1,44 95,42
Tổng carotenoid 8 7,63 ± 0,09 1,12 95,33
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Dược Học 187
KẾT LUẬN
Carotenoid từ bột sinh khối vi khuẩn được
chiết tách bằng phương pháp tán siêu âm đầu
dò có hiệu quả tốt nhất trong việc phá vỡ
màng tế bào với hệ dung môi thích hợp là
chloroform-methanol (2:1, tt/tt), hiệu suất chiết
đạt khoảng 95%.
Carotenoid được định lượng bằng phương
pháp HPLC sử dụng cột pha đảo C18 với hệ
dung môi phân tích là acetonitril- methanol-
dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung
amonium acetat 10 mM với thời gian phân tích
là 12 phút. Qui trình đã được thẩm định đáp
ứng các yêu cầu về tính phù hợp hệ thống, tính
đặc hiệu, độ đúng, độ lập lại của một phương
pháp phân tích dựa trên HPLC. Áp dụng qui
trình đã thẩm định xác định hàm lượng
carotenoid của một số nguyên liệu vi khuẩn của
phòng thí nghiệm và chế phẩm chứa carotenoid
đang lưu hành: trong đó các sản phẩm
carotenoid trong nước chưa đạt hàm lượng
carotenoid ghi trên nhãn, các chế phẩm ngoại
nhập có hàm lượng carotenoid đạt thông số ghi
trên nhãn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Asean guideline for for validation of analytical procedures.
2008. p. 1-17.
2. Barua AB. (2001) Improved normal-phase and reversed-phase
gradient high-performance liquid chromatography
procedures for the analysis of retinoids and carotenoids in
human serum, plant and animal tissues. J Chromatogr A,.
936(1-2):71-82.
3. Bùi Minh Giao Long, Vũ Thanh Thảo and Trần Cát Đông.
(2010) Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh carotenoid từ biển và các
hô tôm ở Việt Nam. Y học TP. Hồ Chí Minh, 2010,14 (1):1-5.
Duc Le H, Fraser PD, Tam NK, et al. (2006) Carotenoids
present in halotolerant Bacillus spore formers. FEMS
Microbiol Lett, 255(2):215-24.
4. Johnson EA and Schroeder WA. (1996) Microbial carotenoids.
Adv Biochem Eng Biotechnol, 1996. 53:119-78.
5. Khaneja R., Perez-Fons L, Fakhry S, et al. (2010) Carotenoids
found in Bacillus. Journal of Applied Microbiology, 2010.
108(6):1889-1902.(9)
6. Lowe, G. M., R. F. Bilton, I. G. Davies, et al. (1999) Carotenoid
composition and antioxidant potential in subfractions of
human low-density lipoprotein. Ann Clin Biochem, 1999.
36:323-32.
7. Trần Hùng. (2006) Chuyên đề: Các chất chống oxi hóa trong
tự nhiên. Nxb Đại học Y Dược Tp. HCM.
8. Võ Thị Ngọc Mỹ. (2010) Nghiên cứu quy trình thu nhận và
định lượng carotenoid từ một số chủng Bacillus sp. 2010, Đại
học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM.
Ngày nhận bài báo: 10.12.2012
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20.03.2013
Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- xay_dung_qui_trinh_dinh_luong_carotenoid_trong_mot_so_che_ph.pdf