Nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactobacillus sporogenes

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Trần Hạnh Triết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Nguyễn Ngọc Hải Trần Hạnh Triết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 3 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng  TS Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  Phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh  Phòng phân tích hóa lý – Trung tâm phân tích thí nghiệm, Trƣờng đại học Nông Lâm  Những anh chị lớp Thú y K26; các bạn lớp Chăn nuôi K27 đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp cùng thời gian với tôi tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh  Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập  Ba mẹ đã luôn động viên, chăm lo cho con trong suốt thời gian thực hiện đề tài 4 TÓM TẮT TRẦN HẠNH TRIẾT, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes”. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là các chủng vi khuẩn L. sporogenes phân lập từ chế phẩm (Thorne Research, USA). Bƣớc đầu, chúng tôi tìm hiểu về đặc điểm hình thái vi/đại thể và sinh hóa của vi khuẩn. Sau đó, tiếp tục khảo sát những đặc tính khác: khả năng sinh acid lactic trong môi trƣờng 10% sữa đặc có đƣờng; khả năng hình thành bào tử trong hai loại môi trƣờng nuôi cấy MRSA và GYE, hai điều kiện nhiệt độ - thời gian 370C/6 ngày và 370C/2 ngày chuyển sang 500C/2 giờ và 700C/2 giờ. Những khảo sát về mặt sinh trƣởng và phát triển tạo cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm từ bào tử vi khuẩn L. sporogenes sau này. Những kết quả đạt đƣợc: 1. Đã phân lập đƣợc vi khuẩn L. sporogenes 2. Vi khuẩn L. sporogenes có khả năng sản sinh acid lactic nhƣng hàm lƣợng không cao (0,144 – 0,342 g/100 ml môi trƣờng sữa) 3. Môi trƣờng nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử (370C/6 ngày và 370C/2 ngày → 500C/2 giờ → 700C/2 giờ) ảnh hƣởng không có ý nghĩa lên sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes khảo sát 5 MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .............................................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................................... v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................................... viii Danh sách các bảng ............................................................................................................... ix Danh sách các hình................................................................................................................ ix Danh sách các sơ đồ ............................................................................................................... x 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................. 1 1.2. Mục đích .................................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu ...................................................................................................................... 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................................. 2 2.1. Tổng quan về probiotic ............................................................................................. 2 2.1.1. Định nghĩa về probiotic ................................................................................... 2 2.1.2. Các chức năng sinh học của probiotic ............................................................. 2 2.1.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme ................................... 2 2.1.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B ......................................................... 2 2.1.2.3. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột .............................................. 3 2.1.2.4. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất .................................. 3 2.1.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch ............................................................ 4 2.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi ........................ 4 2.1.3.1. Trong nƣớc .......................................................................................... 4 2.1.3.2. Thế giới ............................................................................................... 5 2.2. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes ................................................................... 5 2.2.1. Lịch sử phát hiện ............................................................................................ 5 6 2.2.2. Đặc điểm phân loại ........................................................................................ 5 2.2.3. Đặc điểm phân bố .......................................................................................... 6 2.2.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa ............................................................. 6 2.2.4.1. Tế bào sinh dƣỡng ............................................................................. 6 2.2.4.2. Bào tử ................................................................................................ 8 2.2.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác .......................................................................................... 9 2.2.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất .......................................................... 10 2.2.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu ................................................. 13 2.2.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic ................................................................................... 15 2.2.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes ........................................ 18 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM............................................................ 19 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ............................................... 19 3.1.1. Thời gian ....................................................................................................... 19 3.1.2. Địa điểm ........................................................................................................ 19 3.2. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 19 3.2.1. Mẫu khảo sát ................................................................................................. 19 3.2.2 Môi trƣờng ..................................................................................................... 19 3.2.3. Hóa chất......................................................................................................... 19 3.2.4. Thiết bị – dụng cụ ......................................................................................... 19 3.3. Nội dung đề tài ......................................................................................................... 19 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................................. 20 3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài ............................................................ 20 3.4.2. Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 20 3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào .................................................. 21 3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa ........................................................... 22 3.4.3.Khả năng sinh acid lactic ................................................................................ 22 3.4.3.1. Định tính ............................................................................................ 22 3.4.3.2. Định lƣợng ......................................................................................... 23 7 3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử .................................................................................. 24 3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 27 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................................... 28 4.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes ........................................................... 28 4.1.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 28 4.1.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes ..................................................... 28 4.1.2.1. Quan sát khuẩn lạc ......................................................................... 28 4.1.2.2. Quan sát hình thái tế bào ................................................................ 29 4.1.2.3. Quan sát hình thái bào tử................................................................ 29 4.1.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes ...................................................... 29 4.2. Khả năng sinh acid lactic ......................................................................................... 31 4.2.1. Định tính ....................................................................................................... 31 4.2.2. Định lƣợng ................................................................................................. 32 4.3. Khảo sát khả năng hình thành bào tử ......................................................................... 34 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................................... 36 5.1. Kết luận..................................................................................................................... 36 5.2. Đề nghị ..................................................................................................................... 36 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 37 PHỤ LỤC 8 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ctv Cộng tác viên CV Coefficient of variation, hệ số biến thiên FDA Food & Drug Administration, cơ quan quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm của Mỹ GRAS Generally Recognise As Safe, chứng nhận an toàn cho sức khỏe MRSA De Man-Rogosa-Sharpe agar GYE Glucose Yeast Extract SD standard deviation, độ lệch chuẩn 9 DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus ........ 6 Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus ...................... 6 Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và Lactobacillus ..................................................................................................................... 7 Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với Bacillus .............................................................................................................................. 8 Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus .......................................... 11 Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus ...................... 12 Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus ............. 17 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn L. sporogenes . 24 Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes .......................................................... 28 Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc từ chế phẩm . 30 Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa .......... 31 Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất ............. 33 Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát ......... 34 DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử ........................................................................................ 8 Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic ............................................................................ 11 Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol ................................................ 14 Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE ................................. 38 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi .... 29 Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes ................... 31 Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes .................................... 32 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ 10 SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu ................................... 13 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes ........... 20 Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes .............................................. 20 Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa ............................ 21 Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa ......................................................... 22 Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner ................................................................ 23 Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes....... 25 11 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi Việt Nam hiện nay đang có những chuyển biến mới. Số lƣợng bầy đàn ngày càng tăng và tình hình bệnh trong chăn nuôi ngày càng có nhiều diễn biến phức tạp. Vì thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe cho thú nuôi là yêu cầu cấp thiết. Bên cạnh đó, nhà chăn nuôi còn nhắm tới hiệu quả kinh tế tối đa trong sản xuất với những chi phí tối thiểu. Đó cũng là mục tiêu của các nhà khoa học nhằm ứng dụng thành quả nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi. Hiện nay, bệnh đƣờng tiêu hóa đã và đang gây nhiều tổn thất về mặt kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này đang dần hạn chế do những tác dụng phụ. Liệu pháp thay thế cho kháng sinh là sử dụng probiotic (chế phẩm sinh học) ngày càng đƣợc chú trọng. Probiotic là một hỗn hợp các vi khuẩn sống có lợi hay các enzyme của chúng. Chúng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh, làm cân bằng lại hệ vi sinh vật đƣờng ruột, tổng hợp vitamin B, thúc đẩy sự tăng trƣởng của thú nuôi. Trong hỗn hợp probiotic, mỗi vi khuẩn có một đặc tính có lợi riêng. Trong đó, nhóm vi khuẩn Lactobacillus mà đặc biệt là Lactobacillus sporogenes với khả năng tạo bào tử sẽ cho phép kéo dài thời gian bảo quản và tế bào sinh dƣỡng sau khi phục hồi vẫn có hoạt tính ổn định. Nhờ vậy mà L. sporogenes ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất chế phẩm sinh học. 1.2. Mục đích Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic). 1.3. Yêu cầu Phân lập các chủng L. sporogenes từ các sản phẩm chế phẩm sinh học có sẵn. Đánh giá khả năng hình thành bào tử trong điều kiện nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy thay đổi. 12 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3. Tổng quan về probiotic 2.3.1. Định nghĩa về probiotic Thuật ngữ probiotic lần đầu tiên đƣợc đƣa ra bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô tả những yếu tố kích thích sinh trƣởng do vi sinh vật tạo ra [4]. Những nghiên cứu tiếp theo giúp hoàn thiện dần định nghĩa về probiotic. Cho đến nay, theo Havenaar (1992) thuật ngữ probiotic đƣợc hiểu là một loại hay hỗn hợp các vi sinh vật sống ảnh hƣởng có lợi đối với động vật và ngƣời bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong đƣờng ruột vật chủ [4]. Những vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic là những vi sinh vật sống trong tự nhiên bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men [2]. 2.3.2. Các chức năng sinh học của probiotic 2.3.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme Vi sinh vật đƣờng ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các chất dinh dƣỡng trong khẩu phần nhƣ: carbonhydrate, protein, lipid…thành những chất dễ hấp thu hơn nhờ hệ thống enzyme của chúng nhƣ: amylase, protease, cellulase… Nhóm này gồm những vi khuẩn: Bacillus subtilis, Ruminococcus, Cellulomonas, Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Lactobacillus,… Theo một số nghiên cứu của Nahashon, việc bổ sung Lactobacillus vào trong khẩu phần bắp, lúa mạch, đậu nành đã kích thích thèm ăn và tăng tích lũy mỡ, N, Ca, P, Cu và Mn cho gà đẻ [2]. Ngoài ra, việc bổ dung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hƣởng phần nào lên sức đề kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất. 2.3.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B6, B12 và vitamin K ở manh tràng và đại tràng. 13 Bản thân tế bào nấm men có chứa một lƣợng dinh dƣỡng rất cao bao gồm: protein, lipid, glucid, khoáng và nhiều vitamin nhất là vitamin nhóm B, cải thiện tăng trƣởng và sức đề kháng. 2.3.2.3. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất Theo Rami và Khetarpaul (1998), probiotic có khả năng sản xuất các chất có tác dụng trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E. coli, có thể làm giảm hoạt tính urease trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ NH3 trong phân gia súc, gia cầm [27]. Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và phân hủy một số chất có độc tính, tạo thành những dẫn xuất không độc. Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc đƣợc sinh ra trong quá trình tiêu hóa nhƣ: indol, skatol, phenol,… Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic không những giúp cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi trƣờng. 2.3.2.4. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa tốt thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể. Đặc tính quan trọng nhất của một đƣờng tiêu hóa khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Việc bổ sung probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật đƣờng ruột thông qua hoạt động cạnh tranh và đối kháng. Hoạt động cạnh tranh thể hiện ở các vị trí bám dính trên nhung mao ruột, các chất dinh dƣỡng và khối lƣợng các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu chứng minh probiotic ức chế sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh nhƣ E. coli, Salmonella typhimurium [7, 19, 29]. Việc ức chế khả năng bám dính của vi sinh vật gây bệnh giúp ngăn ngừa sự phát triển và gây bệnh của chúng. Nhóm vi khuẩn lactic là những vi sinh vật tiêu biểu cho hoạt động đối kháng của của probiotic. Chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh nhờ vào các sản phẩm do chúng tạo ra nhƣ: bacteriocin, acid hữu cơ, hydroperoxydase, lactocidin,… Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng. Các acid acetic và lactic làm giảm pH đƣờng ruột khiến môi trƣờng đƣờng ruột trở nên bất lợi cho sự tồn tại của vi sinh vật gây bệnh Gr (-). Một số bacteriocin thƣờng gặp nhƣ: mycobacillin, subtilin (do Bacillus subtilis sinh ra), nizin (do Lactococcus lactis sinh ra), penicillin (do nấm penicillium sinh ra),…L. 14 acidophillus tạo ra lactacin B có tác dụng ức chế các loài Lactobacillus khác và acidocin ức chế vi sinh vật gây bệnh [6, 34]. 2.3.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch Yếu tố đƣợc xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của vách tế bào vi khuẩn: peptidoglycan. Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất muramyl peptid có tác dụng kích hoạt đại thực bào [32]. Saarela và ctv (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tƣơng tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống lympho đƣờng ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột [28]. 2.3.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi 2.3.3.1. Trong nƣớc Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất các chế phẩm cung cấp vi sinh vật có lợi cho đƣờng ruột ở nƣớc ta không ngừng phát triển. Kết quả của các nghiên cứu tìm hiểu ảnh hƣởng của các chế phẩm này lên sức đề kháng, tỉ lệ tiêu tốn thức ăn, tỉ lệ chết, sức tăng trọng của gia súc, hiệu quả kinh tế… đƣợc ứng dụng trong chăn nuôi ngày càng rộng rãi. Các công trình nghiên cứu của Viện Thú Y quốc gia: Sữa chua và canh trùng B. subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của lợn con (Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hƣng, 1962) Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đƣờng ruột trên gia súc (Lê Thị Tài và ctv, 1968 – 1978) [3]. Chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii cải thiện tình hình bệnh phân trắng ở lợn con (Phan Thanh Phƣợng và ctv, 1979 – 1984) Các chế phẩm trên đều khẳng định kết quả phòng trị bệnh đƣờng ruột ở heo và tác dụng điều tiết kích thích sinh trƣởng của chế phẩm Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và ctv đã sản xuất và thử nghiệm chế phẩm Subcolac (Bacillus subtilis, Lactobacillus) làm giảm tỉ lệ tử vong , giảm tỉ lệ tái phát cho bệnh tiêu chảy so với dùng kháng sinh và heo con tăng trọng tốt (cao hơn đối chứng 0,9 kg/con). Phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y trƣờng Đại Học Nông Lâm đã sản xuất thành công chế phẩm Biolactyl, qua sử dụng đã cho hiệu quả tốt trong việc phòng bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi. 15 Viện Pasteur Nha Trang cũng đã sản xuất chế phẩm Biosubtyl (Bacillus subtilis) đã sử dụng có hiệu quả trong phòng và trị bệnh tiêu chảy trên ngƣời và gia súc. 2.3.3.2. Thế giới Trên thế giới, trong những thập niên gần đây, ngƣời ta hƣớng vào việc phân lập và chọn các chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao đƣa vào đƣờng ruột, nâng cao sức chống đỡ đối với mầm bệnh, phòng trị bệnh đƣờng ruột cho ngƣời, động vật nuôi, nhất là trẻ sơ sinh, ngƣời già và thú non. Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều nƣớc khác trên thế giới đã sản xuất những chế phẩm hỗn hợp nhiều loại enzyme, kết hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng trị bệnh, nâng cao khả năng tiêu hoá của ngƣời và vật nuôi nhƣ: Biozim, Rozim F - 3C, Lactopure, NatureFlora,… 2.4. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes 2.4.1. Lịch sử phát hiện L. sporogenes lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1933 bởi L.M. Horowitz- Wlassowa và N.W. Nowotelnow. Vào thời gian đó, vi khuẩn đƣợc phân loại và mô tả nhƣ sau: tế bào hình que, Gram (+), tạo bào tử, sản xuất acid lactic, hiếu khí hay kị khí tùy ý, phản ứng catalase (+) (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1974). Vi khuẩn còn có tên là Bacillus coagulans [8]. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, đặc biệt là nghiên cứu dựa trên sự tƣơng đồng về DNA đã khẳng định L. sporogenes gần gũi với Lactobacillus hơn Bacillus. Năm 1967, L. sporogenes đƣợc xếp lại vào giống Lactobacillus. 2.4.2. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn L. sporogenes có đặc điểm phân loại nhƣ sau: Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Tộc: Lactobacilleae Loài: Lactobacillus sporogenes 2.4.3. Đặc điểm phân bố Vi khuẩn L. sporogenes có mặt trong các sản phẩm đồ hộp. Chúng phân bố tƣơng đối rộng rãi trong tự nhiên. 2.4.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 16 2.4.4.1. Tế bào sinh dƣỡng Hình thái Vì có quan hệ với hai giống Bacillus và Lactobacillus nên hình thái của L. sporogenes có những nét tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt với Bacillus (xem Bảng 2.1 và 2.2) Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus [35] Điểm tƣơng đồng Chi tiết Hình dạng khuẩn lạc -Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm -Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, lấp lánh, không tạo sắc tố. Hình dạng tế bào -Hình que thon, dài -Kích thƣớc: 0,3 - 0,8 µm 3,0 - 5,0 µm -Tròn ở đầu tận cùng Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus [35] Điểm khác biệt Chi tiết Hình dạng khuẩn lạc -Khuẩn lạc Bacillus có bề mặt nhăn. Hình dạng tế bào -Bacillus luôn có dạng hình que thẳng, trong khi Lactobacillus còn có dạng hình que uốn cong. -Bào tử của Bacillus ở giữa thân còn bào tử của L. sporogenes có ở một đầu tế bào. Các đặc điểm sinh trƣởng phát triển và sinh hóa Tƣơng tự nhƣ hình thái, những điểm tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt Bacillus về mặt sinh trƣởng phát triển và sinh hóa của L. sporogenes đƣợc trình bày ở Bảng 2.3 và 2.4 17 Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và Lactobacillus [35] Điểm tƣơng đồng Chi tiết Môi trƣờng nuôi cấy -Khó nuôi cấy, cần những chất hữu cơ phức tạp để phát triển nhƣ: carbonhydrate (để lên men), peptone, chiết thịt, chiết nấm men. -Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp: MRSA có bổ sung nƣớc ép cà chua a. pH tối ƣu 5,5 - 6,8 Nhiệt độ tối ƣu 30 - 450C Một số phản ứng sinh hóa -Không thủy phân tinh bột, casein. -Không hóa lỏng gelatine -Indole (-) -Không sinh gas hay H2S -Không có menaquinones Khả năng lên men đƣờng -Sản xuất acid khi lên men các loại đƣờng: lactose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, maltose, sucrose và trehalose. -Sản xuất acid lactic khi lên men: glucose, fructose, sucrose, trehalose và lactose. Một số đặc điểm khác -Gram (+) -Hiếu khí hay kị khí tùy ý Lƣu ý: (a) L. sporogenes cũng phát triển tốt trong môi trƣờng GYE (glucose yeast extract agar). Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với Bacillus [35] Điểm khác biệt Chi tiết Môi trƣờng nuôi cấy Dễ nuôi cấy hơn Lactobacillus 18 Một số phản ứng sinh hóa Lactobacillus cho phản ứng oxidase (-) và nitrate (-) trong khi Bacillus luôn cho hai phản ứng này (+) Khả năng lên men đƣờng Bacillus không lên men đƣợc lactose 2.4.4.2. Bào tử Hình thái Lớp vỏ bào tử có cấu tạo là một phức hệ peptidoglycan - acid dipicolinic - calcium. Bào tử hình ellip, nằm ở một đầu của tế bào sinh dƣỡng, có kích thƣớc 0,9 - 1,21,0 - 1,7 µm . Cấu tạo chi tiết của bào tử L. sporogenes đƣợc mô tả theo Hình 2.1. Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử. Gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng ngoài (outer coat), màng trong (inner coat), lớp vỏ dƣới màng trong (cortex), màng vỏ của vách tế bào mầm (cortical membrane of the germ cell wall), tế bào chất sát nhập vào tế bào mẹ (incorporated mother cell cytoplasm), nguyên sinh chất (core/protoplast), vật chất nhân (nuclear material) [15, 39]. Khi gặp phải điều kiện bất lợi nhƣ nhiệt độ, pH, môi trƣờng dinh dƣỡng không phù hợp,… L. sporogenes từ dạng tế bào sinh dƣỡng tạo thành bào tử. Đặc tính o In vitro 19 Bào tử L. sporogenes bền với nhiệt và những điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt khác. Chúng vẫn sống ngay cả sau khi đã xử lý ở 100oC trong 20 phút trong dung dịch đệm phosphate ở pH 7. Bào tử nảy chồi trong dịch canh chứa malt ngay cả khi có HCl pha loãng (pH 4,6 – 5,6), dịch NaOH (pH 7,6 – 9,6), dịch muối (nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nƣớc cất. Bào tử chịu đƣợc kháng sinh 2 – 8 lần so với tế bào dinh dƣỡng [12]. o In vivo Khi qua đƣờng miệng, bào tử đƣợc hoạt hóa và hồi sinh trong môi trƣờng acid của dạ dày - ruột với pH thấp nhờ hoạt động đánh khuấy hóa học của dạ dày và môi trƣờng nƣớc trong dạ dày. Các lớp màng (coat) hút nƣớc và trƣơng phồng lên. Sự gia tăng hàm lƣợng nƣớc làm tăng tỉ lệ trao đổi chất của vi khuẩn trong bào tử, chồi hình thành và ló ra ngoài lớp màng của bào tử. Tại tá tràng, bào tử không còn nữa, các tế bào nảy chồi chuyển thành tế bào sinh dƣỡng. Chúng nhân lên rất nhanh trong ruột non. Thông thƣờng, sự nảy chồi diễn ra khoảng 4 giờ sau khi bào tử đi vào qua đƣờng miệng. Tế bào sinh dƣỡng nhân đôi sau mỗi 30 phút. Các tế bào này cố định trên bộ máy tiêu hóa và tiếp tục hoạt động trao đổi chất, sản xuất acid lactic và bacteriocin. Điều này tạo một môi trƣờng bất lợi cho vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột [13]. 2.4.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác Vi khuẩn L. sporogenes là một loài thuộc giống Lactobacillus nên mang nhiều đặc tính và chức năng sinh học của Lactobacillus. Những đặc tính và chức năng này đều có ý nghĩa trong ứng dụng sản xuất probiotic. 2.4.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất Quá trình trao đổi chất của Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong khả năng chữa bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus trong môi trƣờng sữa đã thể hiện rõ ràng những hoạt tính đáng chú ý sau: Phân giải protein Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các polypeptide mạch ngắn. 20 Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối tƣợng: trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non. Phân giải lipid Nhờ có enzyme lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng triglyceride thành các acid béo và glycerol. Điều này cũng có ý nghĩa về mặt dinh dƣỡng đối với ngƣời và vật nuôi. Có những nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng (preclinical) cho rằng Lactobacillus phân giải đƣợc cholesterol trong lipid huyết thanh (serum lipids) [25, 26] và muối mật [14]. Cả hai khả năng này đều có ý nghĩa về mặt lâm sàng. Phân giải đƣờng lactose Lactobacillus mang enzyme beta - galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase (LDH) có tác dụng chuyển hoá đƣờng lactose thành acid lactic. Đây là một acid hữu cơ có những đặc tính sinh học đặc biệt. o Vai trò của acid lactic [5] Về mặt sinh lý học, acid lactic có những ƣu điểm sau:  Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa protein sữa thông qua sự đông vón  Tăng cƣờng hoạt tính Ca, P, Fe  Kích thích sự tiết dịch vị  Tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dạ dày  Là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng Lactobacillus làm probiotic. Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) acid lactic (xem Hình 2.3). Ở ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong đƣờng ruột. 21 D(-) acid lactic L(+) acid lactic Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic. L (+) acid lactic: đƣợc chuyển hóa hoàn toàn và nhanh chóng trong quá trình tổng hợp glycogen. D (-) acid lactic: đƣợc chuyển hóa ít hơn và phần không chuyển hóa sẽ đƣợc bài tiết dƣới dạng urine. Sự hiện diện của acid không đƣợc chuyển hóa trong ống tiêu hóa sẽ gây tình trạng nhiễm acid trong trao đổi chất (metabolic acidosis) ở trẻ sơ sinh. Một số loài Lactobacillus, tiêu biểu là L. acidophilus có sản xuất D (-) acid lactic nên lợi ích về mặt lâm sàng là không chắc chắn mặc dù đã sớm đƣợc sử dụng trong nhiều liệu pháp. Vì vậy, xu hƣớng mới trong sản xuất probiotic là tìm những nguồn vi sinh vật có khả năng tạo ra L (+) acid lactic sẽ an toàn hơn cho sức khỏe. Đại diện tiêu biểu thỏa mãn yêu cầu này là Lactobacillus sporogenes. Ngoài ra, acid lactic còn làm hạ pH đƣờng ruột còn 4 – 5. Do đó, sự phát triển của vi sinh vật gây thối và E. coli (thích nghi ở pH 6 – 7) bị ức chế. Sản xuất bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn Bacteriocin là protein hay hợp chất protein do vi khuẩn sản xuất có hoạt tính diệt khuẩn trực tiếp [23, 31]. Cơ chất này giúp vi khuẩn Lactobacillus thể hiện hoạt tính ức chế đối với các vi sinh vật gây thối trong hệ tiêu hóa. Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus Tên bacteriocin Loài sản xuất Acidolin L. acidophilus Acidophilin L. acidophilus Lactacin B L. acidophilus 22 Lactacin F L. acidophilus Bulgarin L. bulgaricus Plantaricin SIK-83 L. plantarum Plantaricin A L. plantarum Lactolin L. plantarum Plantaricin B L. plantarum Lactolin 27 L. helveticus Helveticin J L. helveticus Reuterin L. reuteri Lactobrevin L. brevis Lactobacillin L. brevis Vi khuẩn Lactobacillus còn có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối nhờ vào những sản phẩm trao đổi chất khác nhƣ: H2O2, CO2 và diacetyl. Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus [33] Sản phẩm trao đổi chất Tác dụng 1.Carbon dioxide Ức chế sự khử nhóm carboxyl? Làm giảm tính thấm của màng tế bào? 2. Diacetyl Tƣơng tác với các protein gắn kết arginine 3. Hydrogen peroxide / Lactoperoxidase Oxi hóa những protein cơ bản 2.4.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu Các sản phẩm lên men từ sữa đã đƣợc dùng để chữa bệnh trong nhiều nền y học thời xa xƣa ở Trung Cận Đông. Tuy nhiên giá trị về mặt dinh dƣỡng và trị liệu của các vi khuẩn lactic vẫn còn đang đƣợc tranh cãi. Mặc dù vậy, một số nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng đã cho thấy ích lợi của Lactobacillus (xem Sơ đồ 2.1). 23 Các lợi ích về mặt dinh dƣỡng Nghiên cứu trên chuột cho thấy tốc độ phát triển và lƣợng ăn vào tăng lên khi cho ăn sữa chua chứa Lactobacillus [10]. Vài loài Lactobacillus có khả năng tự tổng hợp vitamin B. Hàm lƣợng các loại vitamin nhóm B và K trong sữa chua thƣờng cao hơn trong sữa tƣơi. Ngoài ra, tính chất sinh học tự nhiên của Cu, Fe, Ca, Zn, Mg và P cũng tăng lên khi dùng sữa chua làm thức ăn cho chuột [16]. Các lợi ích về mặt trị liệu Các chế phẩm chứa Lactobacillus đều cho thấy hiệu quả trong chữa trị vô số những rối loạn và viêm nhiễm bao gồm: viêm ruột kết, táo bón, tiêu chảy, đầy hơi, bệnh hepatic encephalopathy, ung bƣớu, lƣợng cholesterol trong máu cao, đau đầu và viêm Lactobacillus Trị liệu Dinh dƣỡng Phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột Giải độc tố Cải thiện tình trạng không dùng đƣợc lactose Tăng cƣờng miễn dịch Loại bỏ carcinogen trong sản phẩm cuối Ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh trong thực phẩm Sản xuất vitamin nhóm B, K. Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa các chất trong thực phẩm và tăng cƣờng những hoạt tính sinh học tự nhiên của chất dinh dƣỡng Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu [35] 24 âm đạo không điển hình, cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose (lactose intolerance). Khẩu phần chứa Lactobacillus có tác dụng làm hạ cholesterol trong máu. Cơ chế tác động của Lactobacillus lên quá trình hình thành cholesterol có thể đƣợc biểu diễn nhƣ Hình 2.5. Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol [35] Ngoài ra, có nghiên cứu còn cho rằng Lactobacillus làm giảm lƣợng cholesterol gắn cholesterol vào khoang ruột [17]. Lactobacillus tạo ra enzyme beta – galactosidase (lactase), có tác dụng thủy phân lactose thành acid lactic [21]. Vì vậy, Lactobacillus giúp cải thiện tình trạng không sử dụng đƣợc lactose ở những ngƣời thiếu enzyme lactase. Vi khuẩn Lactobacillus sản xuất acid lactic và các cơ chất khác tạo một môi trƣờng bất lợi cho sinh vật gây thối phát triển trong đƣờng tiêu hóa. Do đó, lƣợng urase trong ruột giảm và kéo theo lƣợng NH3 trong máu. Hơn nữa, pH thấp do acid lactic tạo ra gây trở ngại cho NH3 hấp thu từ ruột vào mô và thúc đẩy việc bài tiết NH3 từ máu vào ruột [24]. Những vi khuẩn gây thối rữa ở ruột kết tạo các enzyme beta-glucuronidase, azoreductase và nitroreductase chuyển hóa procarcinogen thành carcinogen, chất có vai trò trong việc hình thành và phát triển khối u. Bằng cách ức chế cạnh tranh và tạo môi Chất béo trong khẩu phần Nhũ hóa Hấp thụ Tổng hợp cholesterol Muối mật Lactobacillus ức chế enzyme khử hydroxymethyl glutarate CoA, enzyme này hạn chế tốc độ tổng hợp cholesterol Lactobacillus kết hợp với muối mật để ngăn cản muối mật đi vào vòng tuần hoàn máu. 25 trƣờng acid không thuận lợi, Lactobacillus đã kìm hãm sự trao đổi chất của vi khuẩn trong ruột kết. Có lẽ điều này làm giảm sự hình thành carcinogen ở ruột già [18]. Nhờ vào khả năng sản xuất acid lactic và bacteriocin trong đƣờng ruột, Lactobacillus cải thiện tình trạng tiêu chảy. Acid lactic cũng giúp tăng cƣờng nhu động ruột nên chữa đƣợc chứng táo bón. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy các loài Lactobacillus có thể thúc đẩy khả năng sản xuất anfa-interferon, tính tự vệ của tế bào và hoạt tính của enzyme 2 – 5 A - synthase. Viện Pasteur ở Tokyo đã ghi nhận đƣợc lƣợng interferon tăng 65% ở những ngƣời tham gia thí nghiệm sau 2 tuần tiêu thụ chế phẩm chứa Lactobacillus [22]. Lactobacillus duy trì pH âm đạo ở khoảng 4 – 4,5 nhờ vào hoạt động lên men glycogen thành acid lactic. Đây là môi trƣờng không thích hợp cho mầm bệnh phát triển nhƣ Trichomonas vaginalis (protozoa kí sinh) và Candida albicans (nấm men),… [30] Khi dùng Lactobacillus kèm theo kháng sinh sẽ giúp ngăn ngừa các triệu chứng trên. Lactobacillus thông qua các hoạt động trao đổi chất của mình: tạo acid lactic, bacteriocin để cố định trong đƣờng ruột, âm đạo hay miệng và tạo môi trƣờng không phù hợp cho mầm bệnh phát triển. Lactobacillus có hiệu quả trong phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng ruột và giúp hình thành hệ vi sinh vật dạ cỏ. Nhờ vào sự giảm nồng độ NH3 và hạn chế vi sinh vật gây thối nhiễm vào đƣờng ruột, Lactobacillus có hiệu quả kích thích tăng trƣởng ở thú nuôi [11]. 2.4.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic Ngoài những chức năng sinh học kể trên, L. sporogenes còn vƣợt trội hơn các vi khuẩn khác làm probiotic nhờ đáp ứng những yêu cầu của một loại probiotic lý tƣởng nhƣ: Có nguồn gốc tự nhiên và thích hợp với cơ thể ngƣời và vật nuôi Không mang độc tính hay bất kỳ một tác dụng phụ nào cho ngƣời và vật nuôi Có khả năng gắn vào tế bào biểu mô ruột và cố định trên trên đƣờng tiêu hóa để ngăn ngừa và chống mầm bệnh xâm nhập 26 Kháng đƣợc acid và mật, vẫn sống sau khi di chuyển từ dạ dày xuống ruột non Lên men và tạo ra L (+) acid lactic, đƣợc chuyển hóa hoàn toàn trong quá trình trao đổi chất nên không gây tình trạng nhiễm acid nhƣ D (-) acid lactic. Tỉ lệ sống cao sau khi trải qua quy trình sản xuất (thu hoạch, sấy khô,…) Tính ổn định cao ở nhiệt độ phòng khi trộn hay không trộn với những thành phần khác Có tác dụng cải thiện sức khỏe vật chủ Ngoài ra, L. sporogenes còn là loài Bacillus duy nhất dùng làm probiotic mang chứng nhận an toàn cho sức khỏe GRAS (Generally Recognise As Safe) do FDA (Food & Drug Administration) cấp. Vì những lý do kể trên giúp L. sporogenes ngày càng đƣợc ƣa chuộng hơn Lactobacillus quen thuộc khác. Điển hình nhất trong số này là L. acidophillus. Đây là loài vi khuẩn rất thông dụng và phổ biến có mặt trong sữa chua, các loại thực phẩm lên men khác và thuốc trị rối loạn tiêu hóa,… và đƣợc con ngƣời tin dùng từ rất lâu. Những đặc điểm vƣợt trội của L. sporogenes so với L. acidophilus đƣợc thể hiện qua Bảng 2.7. Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus Lactobacillus sporogenes Lactobacillus acidophilus Bào tử vẫn sống sau khi đã xử lý 100 oC/20 phút trong môi trƣờng đệm Tất cả tế bào sinh dƣỡng đều bị tiêu diệt sau khi thanh trùng Pasteur. 27 phosphate. Không yêu cầu phải có vitamin để sinh trƣởng và phát triển. Yêu cầu phải có vitamin cho sự sinh trƣởng. Khi gặp điều kiện bất lợi, tế bào sinh dƣỡng tạo thành bào tử chống chịu tốt với những điều kiện bất lợi: nhiệt độ, pH thấp trong đƣờng tiêu hóa, dịch mật, sấy khô, đông lạnh, bức xạ, hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh. Vi khuẩn không tạo bào tử. Tế bào sinh dƣỡng rất nhạy cảm với nhiệt độ. Lên men đồng hình tạo ra L (+) acid lactic dễ dàng chuyển hóa trong cơ thể [13]. Sản xuất D (-) acid lactic có thể gây chứng nhiễm acid vào quá trình trao đổi chất (tài liệu 159, International Dairy Federeration, 1983) Khả năng tái sinh tốt và tính ổn định của bào tử nên vẫn đạt đƣợc hiệu quả chữa trị dù chỉ dùng một liều nhỏ. Khả năng tái sinh và tính ổn định của tế bào kém nên phải uống một lƣợng lớn. Có hạn dùng đến 3 năm khi trữ ở nhiệt độ phòng Bảo quản ở nhiệt độ 4-10oC để giữ hoạt tính tế bào Tuy nhiên, L. sporogenes có một khuyết điểm duy nhất đó là thời gian tồn tại trong ống tiêu hóa chỉ trong 6 – 7 ngày. Cuối cùng, bào tử theo phân thải ra ngoài. Hiện nay, cơ chế và nguyên nhân của vấn đề này còn đang đƣợc nghiên cứu. 2.4.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes 28 Từ khi đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1933 đến nay, L. sporogenes đã trải qua nhiều nghiên cứu. Những khảo sát về độc tính, khả năng làm giảm cholesterol, trị viêm âm đạo không điển hình, trị rối loạn tiêu hóa,… đã chứng minh dần những đặc tính có lợi và vƣợt trội của vi khuẩn này. Các sản phẩm probiotic chứa L. sporogenes đƣợc sản xuất ngày một nhiều hơn nhƣ: Lactospore®, Sporlac®, SANVITA,…của Sabinsa Corporation, Lactopure của Pharmed Medicare, NaturaFlora® & NaturaFlora Kids Formula-Chewable® của Natura Health,… [35, 36, 37, 38] Một nghiên cứu của Tae-Han Kim và ctv (đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc) đã thành công khi dùng N – methyl – N’ – nitro – N – nitrosoguanidine (NTG) gây đột biến kháng rifampicin cho L. sporogenes [20]. Điều mở ra hƣớng kết hợp L. sporogenes với loại kháng sinh này dùng làm thuốc mà không gây bất hoạt sự phát triển của L. sporogenes. 29 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ 2/2005 đến 8/2005 3.1.2. Địa điểm Tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi thú y, trƣờng Đại học Nông Lâm, TPHCM 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học (Thorne Research, USA) 3.2.2 Môi trƣờng Môi trƣờng phân lập và giữ giống: GYE (Glucose Yeast Extract) thạch đĩa và thạch nghiêng Môi trƣờng thử sinh hóa: GYE thạch nghiêng và lỏng, NB (Nutrient broth) bán lỏng, các môi trƣờng đƣờng Môi trƣờng khảo sát bào tử: GYE và MRSA thạch đĩa. Môi trƣờng bảo quản: bột đậu nành sấy khô và glycerol 3.2.3. Hóa chất Thuốc nhuộm Gram NaCl 9%0 ; NaOH 0,1N; H2O2 30%; FeCl3 1N; phenol 1% 3.2.4. Thiết bị – dụng cụ Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp autoclave, bếp nấu, giá đỡ ống nghiệm... Dụng cụ: kính hiển vi, ống nghiệm, đĩa petri... 3.3. Nội dung đề tài Phân lập các chủng L. sporogenes từ các chế phẩm có sẵn Khảo sát khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc Khảo sát các điều kiện hình thành bào tử ở vi khuẩn L. sporogenes 30 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes 3.4.2. Phân lập vi khuẩn Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes Lấy mẫu Phân lập Khảo sát Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn Đặc điểm sinh hóa Xác định khả năng tạo acid lactic Khảo sát hình thái khuẩn lạc Khả năng tạo bào tử Nhuộm Gram (trực khuẩ n, Gram (+) ), sinh bào tử ở mộ t đầ u. Kiểm tra phản ứng sinh hóa Đánh giá Môi trƣờng GYE, 37 oC/48 giờ Môi trƣờng GYE để giữ giống ở nhiệt độ phòng Mẫu 31 3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40]  Hình thái khuẩn lạc Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40] Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, màu vàng trùng với màu môi trƣờng xung quanh. Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm.  Hình thái tế bào Tế bào đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.1). Vi khuẩn L. sporogenes có hình que, bắt màu Gram (+), không tạo chuỗi. Bào tử nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc tế bào: 0,4 – 0,8 µm  2,5 – 4,5 µm.  Hình thái bào tử Bào tử đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.2). Bào tử L. sporogenes có hình bầu dục, bắt màu hồng, nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc bào tử: 0,9 – 1,2 µm  1 – 1,7 µm. Mẫu chế phẩm Pha loãng trong 9 ml NaCl 9%0 đến nồng độ 10 -8 Giữ 3 ống nồng độ pha loãng 10-6, 10 -7 , 10 -8 ở 1000C/10 phút Cấy trang trên đĩa GYE Quan sát khuẩn lạc đặc trƣng Giữ giống trên GYE thạch nghiêng Ủ 370C/48 giờ 32 3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa [35] Để định danh L. sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những phản ứng sinh hóa đặc trƣng (xem phụ lục 6.1 – 6.3). Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa [35] 3.4.3. Khả năng sinh acid lactic 3.4.3.1. Định tính  Nguyên tắc Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phát hiện khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes bằng phản ứng với thuốc thử Uffelman  Tiến hành Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào 10 ml canh GYE. Ủ 370C/48 giờ. Ly tâm ống canh khuẩn ở tốc độ 3000 vòng/10 phút. Thu dịch nổi vào bình chiết, thêm 2,5 ml H2SO4 10%, 25 ml diethyl ether và lắc đều. Thu lấy tầng ether và cho bốc hơi thật kỹ trong bồn nƣớc nóng (trong khoảng 60 - 1000C)cho đến khi còn lại một thể tích dung dịch ổn định. Hòa tan phần còn lại này trong 2,5 ml nƣớc cất. Thêm vào 2,5 ml thuốc thử Uffelman màu tím xanh. Đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): dung dịch không chuyển thành màu vàng Phản ứng (+): dung dịch chuyển thành màu vàng Giống Cấy tăng sinh trong GYE lỏng Ủ 370C/24 giờ Cấy sang các môi trƣờng thử sinh hóa Lên men đƣờng Di động Catalase 33 3.4.3.2. Định lƣợng  Nguyên tắc L. sporogenes lên men đƣờng tạo ra acid nên có cũng có khả năng làm đông vón sữa. Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi xác định và đánh giá lƣợng acid lactic (chiếm hơn 85% tổng lƣợng acid đƣợc tạo ra) do các chủng L. sporogenes trong chế phẩm Lactospore ® sản xuất thông qua giá trị độ chua Therner.  Tiến hành o Xác định độ chua 34 Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner Công thức tính độ chua (T) trong 100 ml dịch sữa lên men o Tính lƣợng acid lactic Công thức tính lƣợng acid lactic trong 100 ml dịch lên men dựa vào giá trị độ chua T = n.100/V T: độ chua n: VNaOH 0,1N sử dụng (ml) V: thể tích dịch sữa lên men chƣa pha loãng (ml) 4 ml GYE lỏng Hấp vô trùng Cấy vi khuẩn Ủ 370C/24 giờ Sữa đặc có đƣờng Pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ 1:10 Chiết 40 ml vào bình tam giác Ủ 370C/24 giờ Hút 10 ml dịch lên men + 90 ml nƣớc cất + 2-3 giọt phenolphtalein Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dịch lên men chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 5 phút Ghi nhận VNaOH 0,1N Tính giá trị độ chua (T) theo công thức 35 3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử  Nguyên tắc Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L .sporogenes chịu ảnh hƣởng lớn bởi những điều kiện môi trƣờng. Thí nghiệm sau đây đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm là 3 trong số các chủng giữ giống.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu 3 yếu tố Yếu tố 1: nhiệt độ nuôi cấy Yếu tố 2: môi trƣờng nuôi cấy Yếu tố 3: 3 chủng vi khuẩn L. sporogenes Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử L. sporogenes Yếu tố 3 Yếu tố 1 Yếu tố 2 37 0C/6 ngày [9] 37 0C/2 ngày  500C/2 giờ  700C/2 giờ MRSA GYE MRSA GYE Chủng 1 Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 2 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 Nghiệm thức 7 Nghiệm thức 8 3 Nghiệm thức 9 Nghiệm thức 10 Nghiệm thức 11 Nghiệm thức 12 Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần A = 0,009.n.100/V = 0,009.T A: khối lƣợng acid lactic (g) n : VNaOH 0,1N chuẩn độ (ml) 0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N sang số gam acid lactic V : thể tích dịch sữa lên men chƣa lên men (ml) 36  Quy trình khảo sát Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes [9, 40] Chọn 3 chủng Cấy tăng sinh trên GYE lỏng Ủ 370C/24 giờ Hút 1ml sinh khối và cấy lên 2 môi trƣờng thạch đĩa MRSA GYE Ủ 370C/6 ngày Ủ 370C/6 ngày Ủ 370C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 50 0C/2 giờ và 70 0C/2 giờ Ủ 370C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 50 0C/2 giờ và 70 0C/2 giờ Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) So sánh số lƣợng bào tử và đánh giá khả năng hình thành