Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRỊNH MINH ANH NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. VĂN THỊ HẠNH ĐẶNG TRỊNH MINH ANH TS. NGUYỄN NGỌC HẢI KHÓA: 2002 – 2006 CN. LÊ PHÚC CHIẾN Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  RESEARCHING SPECIFIC PROTEIN OF RED TAIL VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) AND PACIFIC WHITE SHRIMP (Penaeus vannamei) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Ph.D. VAN THI HANH DANG TRINH MINH ANH Ph.D. NGUYEN NGOC HAI TERM: 2002 - 2006 BSc. LE PHUC CHIEN HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. TS. Văn Thị Hạnh đã hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã truyền đạt kiến thức và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. CN. Đỗ Thị Tuyến thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học - Viện Sinh Học Nhiệt Đới. Anh Lê Phúc Chiến, chị Phạm Thị Hạnh thuộc phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật - Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã nhiệt tình giúp đỡ, và hướng dẫn trong quá trình thực tập. Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên. Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 28 và các bạn cùng phòng đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian thực tập. Tp Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 08 năm 2006. Đặng Trịnh Minh Anh v TÓM TẮT ĐẶNG TRỊNH MINH ANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “NGHIÊN CỨU ĐẶC TRƢNG PROTEIN CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỎ ĐUÔI Ở TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei)” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Văn Thị Hạnh  TS. Nguyễn Ngọc Hải  CN. Lê Phúc Chiến Khoá luận được thực hiện tại Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới là 1 phần của đề tài “Nghiên cứu hội trứng Taura ở tôm thẻ chân trắng và mối liên quan với tác nhân gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm càng xanh”. Nguồn virus ban đầu đã được phòng thí nghiệm phân lập và nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Nội dung của khoá luận là: Xác định đặc trưng protein của Red - Tail Virus (RTV) bằng kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot. Sau đó kiểm tra khả năng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng của RTV được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Bước tiếp theo là tiến hành thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của virus bằng phương pháp sắc ký lọc gel để phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo. Những kết quả thu được: 1. Sử dụng RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ chân trắng được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 gây nhiễm trở lại cho tôm sú và tôm thẻ thành công. 2. Xác định được các protein của RTV thu từ tôm sú và tôm thẻ được nuôi cấy trong tế bào côn trùng Sf9 bằng kỹ thuật điện di gel Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide (SDS-PAGE) và điện di miễn dịch (Western Blot) vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iv Tóm tắt .......................................................................................................................... . v Mục lục ......................................................................................................................... .vi Danh mục các chữ viết tắt .......................................................................................... ...ix Danh mục các hình ....................................................................................................... .x Danh mục các bảng....................................................................................................... .xi PHẦN 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... ..1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... ..3 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ........................................................................... ..3 2.1.1 Hiện trạng chung ............................................................................................. ..3 2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới ........................................................................ ..4 2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam ........................................................................... ..4 2.2.1 Hiện trạng chung ............................................................................................. ..4 2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam ....................................................................... ..5 2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) .............................................. ..6 2.3.1 Lịch sử và phân bố hội chứng Taura ............................................................ ..6 2.3.2 Phân loại và tên gọi ...................................................................................... ..7 2.3.2.1 Tên gọi .................................................................................................. ..7 2.3.2.2 Vị trí phân loại ...................................................................................... ..7 2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV ........................................................ ..7 2.3.4 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm ......................................................... ..8 2.3.5 Vật chủ .......................................................................................................... ..9 2.3.6 Sự đa dạng di truyền và sự xuất hiện các chủng TSV mới ........................... 10 2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV ............................................................... 10 2.3.6.2 Sự xuất hiện các chủng TSV mới .......................................................... 10 vii 2.3.7 Khả năng lây truyền của virus Taura ............................................................ 12 2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa.................................. 12 2.4 Các phương pháp và kỹ thuật chuẩn đoán virus Taura .......................................... 13 2.4.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng ................................................... 13 2.4.2 Phương pháp mô học ..................................................................................... 14 2.4.3 Phương pháp cảm nhiễm sinh học ................................................................ 14 2.4.4 Phương pháp miễn dịch ................................................................................. 14 2.4.5 Phương pháp chuẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) ............................ 14 2.4.6 Phương pháp RT-PCR ............................................................................... 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................. 16 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 16 3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu ................................................................... 16 3.2.1 Hóa chất ......................................................................................................... 16 3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel .................................................. 16 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE .......................................... 16 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel ............................................................ 16 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting .................................. 16 3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot ...................................................... 17 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................... 17 3.2.3 Vật liệu .......................................................................................................... 18 3.2.3.1 Kháng thể ................................................................................................ 18 3.2.3.1 Mẫu........................................................................................................... 18 3.3 Phương pháp ......................................................................................................... 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE ............................................................................. 18 3.3.1 Phương pháp SDS–PAGE ....................................................................................... 18 3.3.1.1 Nguyên tắc............................................................................................... 18 3.3.1.2 Phương pháp tiến hành ........................................................................... 20 3.3.2 Phương pháp Western Blot ........................................................................ 21 viii 3.3.2.1 Nguyên tắc............................................................................................... 21 3.3.2.2 Phương pháp tiến hành ............................................................................ 23 3.3.3 Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ (Penaeus vannamei) bằng RTV được nhân lên trong tế bào Sf9 ................................................. 26 3.3.4 Phương pháp Dot Blot ................................................................................... 27 3.3.4.1 Nguyên tắc............................................................................................... 27 3.3.4.2 Phương pháp tiến hành .............................................................................. 27 3.3.5 Phương pháp sắc ký ................................................................................... 28 3.3.5.1 Nguyên tắc ............................................................................................. 28 3.3.5.2. Phương pháp tiến hành ............................................................................ 29 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 30 4.1 Kết quả SDS – PAGE ...................................................................................... 30 4.2 Kết quả Western Blot ...................................................................................... 32 4.3 Kết quả thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm ................................................... 34 4.4 Kết quả Dot Blot chỉ thị virus .......................................................................... 37 4.5 Kết quả sắc ký lọc gel ...................................................................................... 40 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 42 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 42 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 42 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 43 PHỤ LỤC 1 ................................................................................................................. 47 PHỤ LỤC 2 ................................................................................................................. 48 PHỤ LỤC 3 ................................................................................................................. 50 PHỤ LỤC 4 ................................................................................................................. 52 ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 1. APS Ammmonium persulphate 2. bp: Base pair 3. DNA: Deoxyribonucleic acid 4. DAB: 3,3’- Diaminobenzidinetetrahydrochloride 5. LOS: Lymphoid Organ Syndrome 6. IHHNV: Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus 7. MBV: Monodon Baculovirus 8. Kb: Kilo base 9. KDa: Kilo Dalton 10. PAb: Polyclonal Antibody 11. PBS: Phosphate Buffered Saline 12. PCR: Polymerase Chain Reaction 13. PL: Post larvae 14. RNA: Ribonucleic acid 15. RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction 16. RTV: Red - Tail Virus 17. ORF: Open Reading Frame 18. OIE: Office International Des Epizooties (Tổ chức dịch tễ thế giới) 19. SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis 20. Sf9: Sepodoptera frugiperda 21. SPF: Specific Pathogen Free (Sạch bệnh) 22. TCT: Tôm thẻ chân trắng 23. TEMED: N, N, N’, N’ – tetramethylethylenediamine 24. TTBS: Tween tris buffer saline 25. TSV: Taura Syndrome Virus 26. YHV Yellow Head Virus 27. WSSV: White Spot Syndrome Virus x DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Sự phân bố của TSV trên thế giới ................................................................ ..6 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của TSV ................................................................... ..8 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV ....................................................................................... ..9 Hình 2.4: cây phát sinh loài của 40 phân lập TSV dựa vào trình tự aa của VP2 ......... 10 Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) của 6 chủng TSV ................. 11 Hình 3.1: Các bước thực hiện Western Blot................................................................. 21 Hình 3.2: Cách lắp ráp gel và màng nitrocellulose ...................................................... 22 Hình 3.3: Sơ đồ hệ thống chẩn đoán miễn dịch ......................................................... 28 Hình 4.1: Kết quả SDS – PAGE ................................................................................... 30 Hình 4.2: Kết quả Western Blot ................................................................................... 32 Hình 4.3: Tôm thẻ không gây nhiễm và tôm thẻ gây nhiễm ........................................ 34 Hình 4.4: Tôm thẻ chết do gây nhiễm thực nghiệm với RTV ...................................... 35 Hình 4.5: Ảnh chụp hiển vi tôm sú đối chứng nuôi trong phòng thí nghiệm (x40) ..... 36 Hình 4.6: Ảnh chụp hiển vi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV . 36 Hình 4.7: Ảnh chụp hiển vi phần đuôi tôm sú nhiễm thực nghiệm với dịch tế bào nhiễm RTV ................................................................................................................... 36 Hình 4.8: Tôm sú giống gây nhiễm nhiễm thực nghiệm với RTV ............................. 37 Hình 4.9: Chỉ thị mức độ bệnh theo phương pháp Dot Blot ........................................ 37 Hình 4.10: Kết quả kiểm tra tôm thẻ trước khi gây nhiễm ........................................... 38 Hình 4.11: Kết quả kiểm tra tôm sú giống trước khi gây nhiễm .................................. 38 Hình 4.12: Kết quả kiểm tra tôm thẻ sau khi gây nhiễm .............................................. 38 Hình 4.13: Kết quả kiểm tra tôm sú giống sau khi gây nhiễm ..................................... 39 Hình 4.14: Kết quả dịch tế bào (DTB) Sf9 ................................................................... 40 Hình 4.15: Kết quả DTB nhiễm virus từ tôm sú Long An bị bệnh RTV (RT-PmLA).40 Hình 4.16: Kết quả DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng bị bệnh RTV (RTV-PvM) . ...................................................................................................................................... 41 xi DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Sản lượng tôm tôm thế giới năm 2002-2003 ............................................... ..3 Bảng 2.2: Sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam qua các năm ............................................. ..5 Bảng 2.3: Các phương pháp chuẩn đoán TSV ............................................................ 13 Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng .......................................................................................... 18 Bảng 4.1: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi SDS-PAGE và trọng lượng của các protein đã được công bố ........................................................................ 31 Bảng 4.2: So sánh trọng lượng các protein của RTV sau khi Western Bloting và trọng lượng của các protein đã được công bố ........................................................................ 33 Bảng 4.3: Số tôm thẻ sống sót sau ba tuần gây nhiễm ................................................. 34 Bảng 4.4: Số tôm sú sống sót sau hai tuần gây nhiễm ................................................. 35 1 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU Nuôi tôm đang là thế mạnh của ngành thủy sản nước ta. Từ năm 1995 nghề nuôi tôm nước ta phát triển mạnh mẽ cả về diện tích, hình thức nuôi, năng suất, sản lượng và hiệu quả kinh tế. Cụ thể là năm 2004 diện tích tôm nuôi đạt hơn 460.000ha, tổng sản lượng đạt 350.000 tấn và là nguồn cung cấp nguyên liệu quan trọng cho chế biến xuất khẩu thủy sản. Nghề nuôi tôm đã thực sự trở thành một trong những nghề sản xuất hàng hóa lớn của Việt Nam. Tuy nhiên cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm, dịch bệnh do virus gây ra cũng liên tục lan rộng và gây thiệt hại nặng nề về kinh tế. Trong khi đó, những nghiên cứu về virus tôm còn rất hạn chế. Vì vậy, việc nghiên cứu tác nhân virus gây bệnh nhằm đề xuất giải pháp hạn chế tác nhân này là một yêu cầu cấp bách hiện nay. Bên cạnh đó, việc khai thác tiềm năng và phát triển thêm các chủng loại tôm nuôi khác để đa dạng hóa các sản phẩm tôm thương mại, tận dụng tối đa điều kiện tự nhiên và nhân lực ở các vùng ven biển cũng là vấn đề hiện đang rất được nhà nước quan tâm. Năm 2001 Việt Nam bắt đầu du nhập tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) từ Đài Loan và Hawaii vào nuôi thử nghiệm ở một số vùng. Tôm thẻ chân trắng có những ưu thế so với tôm sú như chủ động về nguồn giống, thời gian nuôi ngắn hơn nhưng năng suất tương đương tôm sú, chịu được độ mặn cao và có thể nuôi được trong cả nước mặn, ngọt và lợ… Tuy nhiên việc nhập nuôi loài tôm này gắn liền với việc đưa virus hội chứng Taura (Taura Syndrome Virus – TSV) vào Việt Nam. Để tránh không xảy ra dịch bệnh như đã có đối với các nước từng du nhập tôm thẻ chân trắng (TCT) thì những thông tin đầy đủ về bệnh hội chứng Taura và khả năng lây lan TSV từ tôm này sang các loài tôm bản địa khác, đặc biệt đối với tôm sú, cũng là vấn đề rất được quan tâm. Năm 2000 Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới thu được mẫu tôm sú ở Long An nghi nhiễm TSV, với biểu hiện lâm sàng là đỏ đuôi quạt và đỏ 2 đốt thân cuối. Tôm còn sống nhưng vận động và tiêu thụ thức ăn kém. Các mẫu tương tự sau đó đã thu được ở Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh. Năm 2003 phòng thí nghiệm cũng thu được mẫu tôm TCT với biểu hiện lâm sàng tương tự. Tất cả các mẫu tôm này đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR và cho kết quả âm tính WSSV 2 2 (White Spot Syndrome Virus), IHHNV (Infectious Hypodermal and Haematopoietic Necrosis Virus), MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Virus). Các kết quả nghiên cứu về đặc trưng sinh hóa, sinh học phân tử, cấu trúc hiển vi điện tử ở phòng thí nghiệm khẳng định tác nhân gây bệnh chính là virus. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” là cần thiết và cấp bách nhằm xác định mối liên hệ giữa tác nhân gây bệnh đỏ đuôi đặc biệt này và virus hội chứng Taura ở tôm thẻ chân trắng để có biện pháp phòng ngừa kịp thời. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đặc trưng protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi ở tôm sú và tôm TCT. Yêu cầu thực hiện của đề tài Đề tài thực hiện gồm 3 nội dung như sau: Nội dung 1: Xác định các protein của virus gây hội chứng đỏ đuôi. Nội dung 2: Kiểm tra khả năng gây nhiễm thực nghiệm của virus gây hội chứng đỏ đuôi được nhân trong tế bào côn trùng Sf9 trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng. Nội dung 3: Thăm dò khả năng phân tách các thành phần protein của virus bằng phương pháp sắc ký lọc gel. 3 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 2.1.1 Hiện trạng chung Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên thế giới. Vào những năm cuối thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có những bước phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm được xây dựng ở gần 40 nước, đưa sản lượng tôm nuôi từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với tổng sản lượng tôm (Latscha, 1989). So với năm 1984, sản lượng tôm nuôi năm 1990 tăng 368% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992). Năm 2003, sản lượng tôm nuôi trên thế giới gia tăng nhanh chóng. Đứng đầu là Trung Quốc với 400.000 tấn, kế đến là Thái Lan 350.000 tấn so với năm 2002, Việt Nam xếp thứ 3 với 200.000 tấn. Trong đó các nước Đông Bán Cầu chiếm 70% tổng sản lượng tôm nuôi, còn lại là các nước Tây Bán Cầu. Bảng 2.1: Sản lượng tôm thế giới năm 2002 – 2003 Quốc gia Năm 2002 Năm 2003 Trung Quốc 280.000 400.000 Thái Lan 250.000 350.000 Việt Nam 150.000 200.000 Indonesia 102.000 168.000 Ấn Độ 125.000 160.000 Malaysia 20.000 32.000 Trung và Nam châu Mỹ 93.000 320.000 Các quốc gia khác 225.000 270.000 Tổng cộng 1.245.800 1.900.000 Nguồn: Thông tin hội thảo kỹ thuật nuôi tôm sú (2005) 4 4 2.1.2 Thiệt hại do TSV trên thế giới Virus hội chứng Taura (TSV) gây nên những tổn thất nghiêm trọng về doanh thu trên khắp cả vùng Châu Mỹ - Latinh vào những năm 1990. Người ta đã từng cho rằng TSV gây ra những tổn thất trực tiếp (do tỉ lệ tôm chết cao) vào khoảng 1 – 1,3 tỉ USD trong 3 năm đầu tiên tại Châu Mỹ - Latinh. Tuy vậy, những tổn thất gián tiếp do hàng hóa bị mất, chi phí cho tôm giống tăng và những hạn chế trong thương mại của khu vực tăng lên rất nhiều (Brock et al., 1997; Hernandez – Rodriguez et al., 2001). Sau khi TSV được phát hiện ở Ecuador năm 1992 đã làm cho sản lượng tôm nước nay sụt giảm 30% từ 100.000 tấn xuống còn 70.000 tấn. Ecuador mất khoảng 400 triệu USD/năm. Cũng kể từ khi phát hiện được TSV, dịch bệnh do virus này lan nhanh chóng khắp các nước ở vùng Châu Mỹ - Latinh và Bắc Mỹ (Ecuador, Brazil, Columbia, Peru, Panama...). Và dần dần virus hội chứng Taura cũng đã lây lan sang các nước Châu Á khi tôm TCT được du nhập và nuôi nhiều như ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan. Năm 1999/2000 TSV được phát hiện ở TCT tại Trung Quốc và Đài Loan (Tu et al., 1999; Yu và Song, 2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm 1999, dẫn đến 700.000 trường hợp và 200.000 tôm chết vào năm 2000 và dẫn đến 500.000 trường hợp và 50.000 tôm chết vào năm 2001. Gần đây, năm 2003 đã phát TSV hiện ở Thái Lan (Timothy Flegel, per.com), nhưng không được thông báo chính thức với OIE (Office International Des Epizooties). Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây dịch lớn tại Châu Mỹ (Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm của Venezuela sụt giảm khoảng 90%. 2.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam 2.2.1 Hiện trạng chung Việt Nam bước vào thị trường tôm thế giới chậm so với nhiều nước láng giềng Châu Á. Tuy nhiên, nhờ những điều kiện thời tiết thuận lợi, chính sách mở cửa của nền kinh tế, sự phát triển của thị trường tôm toàn cầu và tình trạng tôm nhiễm bệnh lây lan ở các nước khác đã tạo nên một bước tiến khá ngoạn mục cho Việt Nam vào thị trường thế giới. Việc nuôi tôm tiếp tục phát triển nhanh chóng trên khắp Việt Nam. Sản xuất tăng từ dưới 200 tấn (năm 1976) lên hơn 100.000 tấn (năm 2000) và 158.755 tấn (năm 5 5 2001). Năm 2001, 446.208 ha được dành cho nuôi tôm, tăng lên 97% so với năm 2000 với năng suất bình quân đạt 0,36 tấn /ha (Nguyễn Văn Thanh, 2003). Ngành thủy sản Việt Nam xuất khẩu 1,76 tỷ USD năm 2001, gấp đôi kim ngạch năm 1998, đứng hàng thứ ba về thu nhập xuất khẩu, và các trang trại hải sản chiếm diện tích tới hơn một triệu ha, tăng 74% so với năm 1998. Thu nhập ngoại tệ từ nuôi trồng thủy sản tăng lên hàng năm, và chỉ riêng tôm đã mang lại ước tính 500 triệu USD (Nguyễn Văn Thanh, 2003). Vào năm 2002, sản lượng tôm là 150.000 tấn. Năm 2003, sản lượng cho hơn 200.000 tấn. Năm 2004, sản lượng tôm ở Việt Nam đã đạt 350.000 tấn. Đến nay hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam đã có mặt ở 80 nước và lãnh thổ, trong đó dẫn đầu là thị trường Nhật, kế đến là Mỹ (đây cũng là hai thị trường có sự gia tăng mạnh về giá trị xuất khẩu so với năm 2003), EU, Trung Quốc, Hồng Kông… (Chalor Limsuwan, Nguyễn Văn Hảo, 2005). Bảng 2.2: Sản lượng tôm nuôi ở Việt Nam qua các năm Năm Sản lượng (tấn) 1976 < 200 2000 > 100.000 2001 158.755 2002 186.600 2003 200.000 2004 350.000 Nguồn: Thông tin Khoa học Công nghệ - Kinh tế Thủy sản tháng 3/2005, 04/2005 2.2.2 Thiệt hại do TSV tại Việt Nam Năm 2003, bệnh hội chứng Taura đã bùng phát ở tôm TCT, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tại nhiều vùng nuôi như Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau. Trước nguy cơ đó, Cục quản lý chất lượng, an toàn vệ sinh và thú y thủy sản đã dừng làm thủ tục nhập khẩu tôm TCT giống từ Trung Quốc và Đài Loan. Bên cạnh đó, Bộ Thủy Sản cũng có chỉ thị không được tiến hành sản xuất giống tôm TCT tại các trại giống tôm sú và giống tôm khác, chỉ được phép nuôi loại tôm này tại các khu vực ao, 6 6 đầm nuôi tách biệt (VietNamNet 03/10/04). Sau thời gian nuôi thử tôm TCT, dịch bệnh đã xảy ra ở một số nơi trên địa bàn cả nước. Quảng Nam có 20 ha tôm bị bệnh có khả năng là bệnh Taura, Bình Định có 20 ha (chưa rõ nguyên nhân bệnh). Ở Quảng Ngãi sau vụ 1 và 2 thành công, vụ thứ ba tôm chết hàng loạt trên 80% diện tích nuôi (khoảng 20 ha) với triệu chứng mềm vỏ, thân. Một số khu vực nuôi tôm chân trắng khác ở phía Nam như Sóc Trăng, Đồng Nai, Bà Rịa Vũng tàu cũng xảy ra dịch bệnh trên diện rộng (VietNamNet 03/10/04). Khả năng lây lan TSV sang các loài tôm khác ở Việt Nam, đặc biệt đối với tôm sú chưa được thống kê và nghiên cứu đầy đủ. Nhóm các nhà nghiên cứu Viện Công Nghệ Sinh học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã khẳng định sự có mặt của TSV ở tôm TCT nuôi tại Quảng Ninh, Phú Yên, Bạc Liêu và từ sản phẩm tôm đông lạnh tại Hà Nội bằng kỹ thuật PCR. Các tác giả cũng khẳng định khả năng lây nhiễm thực nghiệm TSV từ tôm TCT sang tôm sú (Nguyễn Hoàng Uyên, 2005). 2.3 Giới thiệu hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) 2.3.1 Lịch sử và phân bố hội chứng Taura Hình 2.1: Sự phân bố của TSV trên thế giới Virus hội chứng Taura lần đầu tiên được xác định từ các đầm nuôi xung quanh sông Taura ở Ecuado vào năm 1992 và lan rộng nhanh chóng ra toàn bộ MEXICO (1995) HAWAII (1994) BRAZIL (1994) PERU (1993) ECUADOR COLOMBIA (1993) TEXAS (1994) THAILAN (2003) CHINA (1999) TAIWAII (1999) 7 7 Châu Mỹ - Latinh và Bắc Mỹ trong vòng 3 năm. TSV lan ra đầu tiên qua Ecuado và sang Peru (1993), Colombia (bờ biển Thái Bình Dương và Đại Tây Dương), Hondurat, Guatemala, Ensanvado. Nicaragoa, Hawaii, Florida và Brazil (1994), Mexico, Texas, nam Carolina và Belize (1995/1996) (Brook, 1997; Lighter và Redman, 1998) và dần dần là cả châu Á, bao gồm Trung Quốc và Đài Loan (từ năm 1999) (Flegel và Fegan, 2002a), và gần đây nhất là Thái Lan (2003) (Timothy Flegel, per.com). 2.3.2 Phân loại và tên gọi 2.3.2.1 Tên gọi Tên phổ biến thường gọi là virus gây bệnh hội chứng Taura (TSV). [Ngoài ra có một số tên gọi khác chỉ tác nhân gây bệnh hội chứng Taura như: hội chứng Taura (Taura Syndrome – TS); bệnh Hội chứng Taura (Taura Syndrome Disease – TSD); bệnh đỏ đuôi (Red Tail Disease – RTD) (Lightner, 1996)]. 2.3.2.2 Vị trí phân loại Ban đầu TSV được phân loại là Picornavirus, họ Picornaviridae (Bonami, Lighner 1997) dựa trên cơ sở hình thái học và cấu trúc của tác nhân này. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu về trình tự genome virus cho thấy nó giống với các thành viên của một loại virus gây bệnh côn trùng (giống Cricket paralysis – like viruses) (Mari, 2002) và thuộc họ Dicistrovidae, giống Cripavirus (Mayo, 2002). Năm 2004 TSV đã được đưa ra khỏi giống Cripavirus và không được được xếp vào họ Dicistrovidae (Mayo, 2004). Hiện nay TSV được coi là loại virus chưa được phân loại (Phụ lục 1). 2.3.3 Đặc điểm cấu trúc và genom của TSV TSV là loại virus ssRNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30 – 32 nm, không có vỏ envelope, mật độ bouyant trong CsCl 1,338 g/ml (Lightner, 1996). Được sao chép trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ. Genome của TSV (Hình 2.2) có kích thước khoảng 9 kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205 nucleotid, tạo chuỗi poly–A –3’, chứa hai khung đọc mở (Open Reading Frame - ORF) lớn:  ORF 1 chứa chuỗi mã hóa protein phi cấu trúc của các enzyme như helicase (H), protease (P) và polymerase RNA phụ thuộc RNA (RNA–dependent RNA polymerase–RdRp).  ORF 2 chứa các chuỗi mã hóa cho các protein cấu trúc của TSV, bao gồm ba protein capsid chính VP1, VP2, VP3 tương ứng với các protein 55, 40 và 8 8 24 kDa. Ngoài ra còn có polypeptide phụ: 58 kDa. Đoạn gen VP2 mã hóa protein capsid 40 kDa là đoạn gen đặc hiệu có thể sử dụng để nhận dạng các chủng TSV (Bonami,1997; Mari, 1998; Mari, 2002). Vùng gen mã hóa protein phi cấu trúc Vùng gen mã hóa protein cấu trúc Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc bộ gen của TSV (Mari, 2002) 2.3.4. Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm Hội chứng Taura được biết là bệnh của tôm TCT ở giai đoạn còn nhỏ, xảy ra trong khoảng 14 – 40 ngày sau khi thả. Tôm bị hội chứng Taura thường là loại tôm giống nhỏ, khoảng 0,05 – 5 g. Tôm lớn hơn cũng có thể bị ảnh hưởng, đặc biệt nếu chúng không được tiếp xúc với virus cho tới khi trở thành tôm non hay trưởng thành. Quá trình diễn biến của bệnh hội chứng Taura xuất hiện chủ yếu trong giai đoạn của một chu kỳ lột xác. Bệnh tiến triển theo hai giai đoạn (pha): pha tiền cấp tính (peracute) và pha hồi phục (hay mãn tính – chronic):  Pha tiền cấp tính (hay cấp tính) thường có biểu hiện: Thường thấy tôm chết hoặc hấp hối trong lưới hoặc nằm dưới đáy bể. Tôm thường yếu và mất phương hướng khi di chuyển. Biểu hiện sự lan tỏa vùng sắc tố đỏ làm cho toàn thân tôm có màu đỏ nhạt, quạt đuôi và chân bò có màu đỏ rõ rệt và thường chết trong khi lột xác. Biểu mô ở phần phụ mỏng (cạnh của chân bò hay quạt đuôi) thấy có dấu hiệu hoại tử biểu mô tập trung. Vỏ mềm, ruột trống rỗng và thường ở giai đoạn muộn của chu kỳ lột xác. Là điểm nhạy cảm trong quá trình phát sinh bệnh hội chứng Taura (Lightner, 1995).  Pha mãn tính (hay hồi phục) thường có biểu hiện: 9 9 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm TSV Hình 1 – tôm nhiễm TSV thân biến màu hồng và đuôi quạt bị đỏ Hình 2 – đuôi bị tổn thương, vỏ kitin bị ăn mòn Hình 3 – ruột quăn không đầy thức ăn Hình 4 – trên thân xuất hiện những vệt sắc tố lạ Biểu hiện kiểu tổn thương của bệnh do vi khuẩn gây ra như có nhiều điểm bị đen hóa. Có thể có hoặc không có biểu hiện mềm vỏ hoặc lan tỏa sắc tố đỏ, vận động và tiêu thụ thức ăn bình thường. Tôm sống sót qua quá trình lột xác bước vào giai đoạn mãn tính hay hồi phục bệnh và có biểu hiện tổn thương vỏ bị đen (melanin hóa). Tôm bị nhiễm bệnh có thể trải qua bước tiền cấp tính khác của hội chứng Taura ở giai đoạn lột xác tiếp sau, hoặc chúng có thể lột xác bình thường và hồi phục mặc dù vẫn mang TSV (Lightner, 1996). TSV có thể gây chết từ 80 – 90%.Tuy nhiên tỷ lệ sống sót trong quần thể tôm bị bệnh có thể đạt tới 60% hay cao hơn. 2.3.5. Vật chủ Theo Lightner dải vật chủ đối với TSV chưa được biết đầy đủ nhưng đã tìm thấy sự hiện diện mầm bệnh Taura (TSV) ở các vật chủ sau (Lightner, 1996b): Nhiễm tự nhiên: Tôm thẻ chân trắng (P. vannamei), tôm xanh Nam Mỹ (P. stylirostris) 10 10 Nhiễm thực nghiệm: Tôm nương Trung Quốc (P. chinensis), tôm trắng Nam Mỹ (P. schmitti), tôm he Nhật Bản (P. japonicus), tôm trắng Bắc Mỹ (P. setiferus), tôm nâu Bắc Mỹ (P. aztecus) và tôm sú (P. monodon) Cho đến nay thì đã phát hiện thêm 2 loài tôm bị nhiễm TSV trong tự nhiên là Penaeus monodon và Metapenaeus ensis (Yun–Shiang Chang et al., 2004). 2.3.6 Sự đa dạng di truyền và sự xuất hiện các chủng TSV mới 2.3.6.1 Sự đa dạng di truyền của TSV Hình 2.4: Mối quan hệ phát sinh loài của 40 phân lập TSV dựa vào trình tự acid amin của VP2 Đến năm 2004 đã phát hiện có khoảng 40 phân lập TSV. Dựa vào sự thay đổi trình tự acid amin trên VP2 người ta chia chúng thành 3 nhóm khác nhau: Americas, Belize và SE Asia (Hình 2.4). 2.3.6.2. Sự xuất hiện các chủng TSV mới Vào vụ tôm 1999 – 2000, TSV gây ra tỷ lệ chết cao ở tôm giống Penaeus stylirostris ở Mexico. Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR và lai Insitu dương 11 11 tính nhưng lại cho kết quả âm tính với hóa mô miễn dịch. Bởi vì giống tôm này trước đó được xem là kháng TSV. Nên chủng TSV này đã được nghiên cứu xem có phải có một chủng TSV mới đã xuất hiện ở Mexico không (Hasson, 2002). Các dữ liệu về hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) và sinh học phân tử giả thiết rằng có sự tồn tại ít nhất hai giống TSV. Một trong hai giống này có lẽ được tiến hóa do sự tiếp xúc với một vật chủ penaeid mới, P. stylirostris (Refugio, 2002). Theo Yun–Shiang Chang et al., thì sự thích ứng với môi trường mới và những đột biến nhanh chóng ở TSV đã tạo ra 1 số chủng TSV nhạy cảm với vật chủ mới như P. monodon và M. ensis ở Đài Loan. Sự thay đổi của các acid amin (Hình 2.5) tại vị trí 201, 408, 413, 560, 696, 713, 720, 729 và 785 giữ vai trò như dấu hiệu di truyền của TSV ở Đài loan, đặc biệt là biến đổi tại 201F và 560H (Robles–Sikisaka, 2002). Sự thay đổi vật chủ từ L. vannamei sang P. monodon và M. ensis là do sự biến đổi các acid amin xảy ra ở các vị trí 97 (ED), 598(VI), 710 (AV), 768 (ED) và 803 (LF) ở nhánh Tw2KPmTSV và Tw2KMeTSV của Đài Loan (Hình 2.5). P. monodon và M. ensis là 2 vật chủ mới của 2 phân lập TSV khác nhau cả về kiểu di truyền và kiểu hình. (Yun–Shiang Chang et al., 2004). Hình 2.5: Cây phát sinh loài theo đoạn ORF2 (1011aa) của 6 chủng TSV. Vị trí của 32 acid amin thay đổi so với chủng HI94TSV 12 12 2.3.7 Khả năng lây truyền của virus Taura Cơ chế lây lan của TSV vẫn chưa được xác định chắc chắn, mặc dù những giả thuyết ban đầu tập trung vào sự lây lan từ đầm nuôi này sang đầm nuôi kia thông qua tôm giống và tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh (Lighter, 1995 và 1996; Garza et al., 1997). Những dữ liệu ít ỏi đã cho thấy TSV được du nhập vào Côlômbia và Brazil thông qua việc nhập tôm bố mẹ bị nhiễm bệnh từ Hawaii (Brock et al., 1997). Những con tôm bố mẹ đó đã không được kiểm tra TSV vì người ta vẫn chưa biết rằng hội chứng Taura là do virus gây nên. Những trường hợp như vậy đã một lần nữa minh chứng cho những vấn đề có liên quan tới việc di chuyển động vật qua biên giới, cho dù là những động vật được cho là sạch bệnh (Specific Pathogen Free – SPF). Nghiên cứu gần đây cho thấy việc truyền bệnh về mặt cơ học thông qua các vật chủ trung gian là chim và côn trùng cũng là một đường lây bệnh không kém phần và thậm chí còn nghiêm trọng hơn. Đôi khi, người ta còn tìm thấy TSV trong các xét nghiệm sinh học mô của Trichocorixa reticulata, một loài côn trùng phổ biến khắp thế giới sống ở của sông, và những phần có chứa virus của loài côn trùng này đã được chứng minh là gây ra sự lây nhiễm ở các con tôm chân trắng SPF trong các điều kiện thí nghiệm (Lighter, 1995). Các dạng lây lan và việc TCT chết ở Texas cũng cho thấy việc TCT ăn các côn trùng bị nhiễm bệnh có thể là một cơ chế lây lan bệnh TSV (Thompson et al., 1997). TSV có thể lây lan qua chim mòng biển (Larus atricilla) do những con chim này ăn tôm bị bệnh tại những đầm nuôi khác (Lighter, 1995 và 1996; Garza et al., 1997). Những kết quả thí nghiệm cho thấy những con tôm khỏe mạnh có thể bị nhiễm thông qua việc tiêm các yếu tố đươc tách từ tế bào tôm bị nhiễm bệnh hoặc trực tiếp ăn những con tôm bệnh (Brock et al., 1995; Hasson et al., 1995). Người ta thấy virus hội chứng Taura vẫn có thể lây lan sau một số chu kỳ làm đông lạnh. Điều này cho cho thấy khả năng truyền bệnh thông qua tôm đông lạnh đã nhiễm bệnh (Lighter, 1995; Brock et al., 1997). Tuy vậy, với những quy trình và biện pháp kiểm soát diệt khuẩn phù hợp, đường lây bệnh này hiện đang được coi là có tỷ lệ rủi ro thấp (Flegel và Fegan, 2000; Flegel, 2003). 2.3.8 Một số đặc tính của virus Taura với các yếu tố lý hóa - Bị mất hoạt tính trong tế bào ở 100oC trong vòng 10 phút - Các chất oxi hoá, SDS (sodium dodecyl sulfate), lipid hòa tan có thể làm mất hoạt tính của TSV (theo OIE) 13 13 2.4 Các phƣơng pháp và kỹ thuật chẩn đoán virus Taura. Tổ chức dịch tễ quốc tế (Office International Des Epizooties – OIE) đã liệt kê một số phương pháp để chuẩn đoán TSV. Bảng 2.3: Các phương pháp chuẩn đoán TSV Phương pháp Đối tượng Giả thiết Khẳng định Ấu trùng Tôm post Tôm non Trưởng thành Dấu hiệu lâm sàng - - - - ++ - Kính hiển vi - - - - ++ - Biểu hiệu bệnh lý - +++ +++ +++ +++ +++ Cảm nhiễm sinh học - - - - ++ ++ Kính hiển vi điện tử - - - - + + Chẩn đoán miễn dịch - - - - +++ +++ Chẩn đoán bằng mẫu dò - +++ +++ +++ +++ +++ RT – PCR - +++ +++ +++ +++ +++ Dấu (-) phương pháp không có sẵn hiện nay hoặc có nhưng chưa được thí nghiệm. Dấu (+) phương pháp có ứng dụng trong vài trường hợp, nhưng sự chính xác hoặc ứng dụng còn hạn chế. Dấu (++) phương pháp chuẩn với tính nhạy cảm và sự đặc biệt chẩn đoán tốt. Dấu (+++) phương pháp được khuyến cáo là đã sẵn sàng và chính xác. Trong 8 phương pháp liệt kê bởi OIE chỉ có 3 phương pháp được khuyến cáo đã sẵn sàng và có thể áp dụng được ngay (phương pháp mô bệnh học, lai DNA dot blot và (RT – PCR). Phương pháp mô bệnh học có thể nhận biết được bệnh nhưng không có giá trị chẩn đoán sớm, phương pháp chẩn đoán bằng chỉ thị gen (lai DNA, RT – PCR) có thể phát hiện rất sớm mầm bệnh TSV trước khi có biểu hiện bệnh lý. Hiện nay kỹ thuật PCR đã dùng để phát hiện nhiều loại virus (WSSV, IHHNV, YHV...), do đó sử dụng RT – PCR xác định TSV có nhiều thuận lợi khi triển khai rộng trong sản xuất. 2.4.1. Chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng Ở thời kì phát bệnh tôm có màu đỏ nhợt nhạt, toàn bộ vỏ thân và ở đuôi có màu đỏ rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo những dấu hiệu tiêu biểu mỏng vỏ, xoang 14 14 tiêu hóa rỗng, tôm thường chết nhiều trong thời gian lột xác. Trong thời kì ủ bệnh xuất hiện những bất thường ở sắc tố của biểu bì, những đốm sắc tố này là những haemocyte do những thương tổn trong biểu bì biểu mô. Tôm có thể có hoặc không bị vỏ mềm và có vết đỏ, có thể ăn bình thường. Mặc dù chỉ xuất hiện một ít ngày dịch bệnh, nhưng dấu hiệu trong thời kì ủ bệnh có thể giúp cho việc nhận biết sự lây nhiễm TSV. 2.4.2. Phƣơng pháp mô học Chẩn đoán TSV trong thời kì phát bệnh tùy thuộc vào sự biểu hiện của mô khi nhuộm haematoxylin và Eosin, những điểm nhuộm màu ở vùng necrosis trong biểu mô bì biểu bì của bề mặt toàn thân, tất cả các phần phụ mang, xoang tiêu hoá. Trong thời kì ủ bệnh. Những tổn thương biểu bì thời kì phát bệnh tiêu biểu biến đi và được thay thế bởi những haemocytes ở tại cùng vị trí đó. Số lượng nhiều haemocytes có thể trở thành các sắc tố là những vệt đen, đó là đặc điểm của thời kì ủ bệnh. Những tổn thương như vậy có thể làm mòn biểu bì, và dễ bị Vibrio spp xâm nhập. Trong thời kì ủ bệnh của TS không có những dấu hiệu chính của nhiễm bệnh, và về tế bào học dấu hiệu duy nhất của nhiễm bệnh là sự có mặt LOS (Lymphoid Organ Syndrome). Đó là những sự tích tụ những tế bào hình cầu ở trung tâm các ống lymphoi bình thường. 2.4.3 Phƣơng pháp cảm nhiễm sinh học Sự nhiễm TSV có thể được xác định bằng cách cho ăn trực tiếp những mảnh thức ăn nhiễm virus. Hoặc tiêm truyền trực tiếp dịch chiết từ tôm đang mắc bệnh vào đối tượng thí nghiệm. Những dấu hiệu bệnh lý hoặc dấu hiệu điển hình về tế bào học sẽ xuất hiện sau 3 – 8 ngày (Lighter, 1996). 2.4.4 Phƣơng pháp miễn dịch Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (MAs) để xác định TSV ở những mẫu huyết và dịch tế bào đồng thể từ tôm. MAs còn có thể áp dụng để kiểm tra những mẫu mô đông lạnh, hoặc đã cố định. Hiện trên thị trường có sản phẩm của DiagXotics (Wilton, CT, USA). 2.4.5 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng mẫu dò gen (gene probe) Nguyên lý của phương pháp là sử dụng một đoạn oligonucleotide (thiết kế trên trình tự gene đặc hiệu của TSV) gắn với một chất chỉ thị và gọi là mẫu dò (probe). Chất chỉ thị có thể là enzyme, đồng vị hoặc chất phát huỳnh quang… Sau đó lai probe với DNA – RNA của virus. Những probe này được tổng hợp trong phòng thí nghiệm 15 15 hoặc từ những nguồn thương mại. Phương pháp này có độ chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những phương pháp chẩn đoán truyền thống, tế bào học cổ điển. 2.4.6 Phƣơng pháp RT-PCR Phương pháp RT – PCR phát hiện virus Taura ở TCT được nhóm tác giả đại học Arizona thực hiện lần đầu tiên vào năm 1998 (Nunan L.M., et al., 1998). Tác giả sử dụng cặp mồi thiết kế tại vị trí 9195 và 9992 trên trình tự gen TSV khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 231bp bằng phản ứng RT – PCR 16 16 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu A. Thời gian thực hiện đề tài: 3/2006 – 7/2006. B. Địa điểm thực hiện: Phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới (1– Mạc Đĩnh Chi – Q.1 – Thành phố Hồ Chí Minh). 3.2 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ và vật liệu 3.2.1 Hóa chất 3.2.1.1 Các hoá chất để thực hiện sắc ký lọc gel  Bio Gel – P100  Đệm photphat 3.2.1.2 Các dung dịch gốc để thực hiện SDS-PAGE  Monomere solution (30,8% T; 2%Cbis)  4X Running Gel Buffer (1,5 M Tris HCl; pH 8,8)  4X Stacking Gel Buffer (0,5 M Tris HCl; pH 6,8)  SDS 10%  Ammonium Persulfate 10%  2X Treatment Buffer (0,125 M Tris HCl; 4% SDS; 20% v/v Glycerol; 0,2 M DTT; 0,02% Bromophenol Blue; pH 6,8)  Tank Buffer (0,025 M Tris HCl; 0,1% SDS; 0,192 M Glycine; pH 8,3)  Thang protein chuẩn Low Range (19,8 – 108,5 kDa) (Bio–rad) 3.2.1.3 Các dung dịch gốc để nhuộm gel  Dung dịch nhuộm (0,025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7% acetic acid)  Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid)  Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol, 7% acetic acid) 3.2.1.4 Các dung dịch gốc để thực hiện Western Blotting  Towbin transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%MeOH, 0,1%SDS) 17 17 - Các dung dịch để phát hiện bằng miễn dịch  Phosphate buffer saline (PBS): 10mM sodium phosphate; 0,9% NaCl  Tween PBS (TPBS)  Tris buffer saline (TBS): 100mM Tris/HCl ; 0,9% NaCl  Blocking buffer: Tween tris buffer saline (TTBS); TTBS có 5% skim milk - Các dung dịch cho hệ thống sinh màu  Peroxidase assay buffer  DAB  CoCl2  Hydrogen peroxidase 30% 3.2.1.5 Các dung dịch để thực hiện Dot Blot - Đệm rửa (A1): 10 mM Na2 H PO4; pH 7,2; 150 mM NaCl - Đệm rửa (A2): 0,05% Tween 20 trong dung dịch A 1 - Dung dịch Bloking (B): 1% casein trong dung dịch A 2 - Dung dịch cơ chất và thuốc nhuộm (DAB): DAB 0,01 % /0,03% H 2O2 3.2.2 Thiết bị, dụng cụ  Bếp nhiệt khuấy từ IKAMAG  Bộ điện di nhỏ I Mudid  Bộ điện di SDS–PAGE và chuyển thẩm Power Pac Universal TM (Bio–rad)  Cân thường, cân phân tích  Máy sắc ký lọc gel (Bio–rad)  Máy lai HB–1000. Hybridize  Máy vortex VELP  Máy ly tâm thường Biofuge 13 (Heraus), máy ly tâm lạnh 4oC (Bio–rad)  Tủ lạnh –20oC, 4oC  Thiết bị hút chân không  Tủ ấm 37oC  Máy lắc  Cốc becher, ống đong, ống nghiệm, pipet, các loại micropipet, tube eppendoft, tip các loại, kẹp, kéo… 18 18 3.2.3 Vật liệu 3.2.3.1 Kháng thể - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV, MBV, YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1). - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vât – Viện Sinh Học Nhiệt Đới) (K1). - Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấu enzyme Peroxidase (K2) (A 9046 – SIGMA) 3.2.3.1 Mẫu Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV–Pm) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9. Virus gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV-Pv) được nhân lên trong tế bào côn trùng Sf9 Dịch nuôi cấy tế bào côn trùng Sf9. Bảng 3.1: Các mẫu sử dụng Kí hiệu Nơi thu Nguồn RTV-PmLA Long An Tôm sú RTV-PmLA (SLT) Long An Tôm sú RTV-PmCG Cần Giờ Tôm sú RTV-Pv M Chợ HCM Tôm TCT DTB Sf9 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Phƣơng pháp SDS–PAGE 3.3.1.1 Nguyên tắc SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS–PAGE) là phương pháp điện di protein đứng để phân tách được các thành phần protein theo trong lượng phân tử. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này là: Gel polyacrylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acrylamide (polyacrylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị (khác với lưới gel agarose là sự liên kết các sợi polymer phân tử đường bằng các cầu nối không đồng hoá 19 19 trị). Gel polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và biacrylamide. Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học. o Có hai tác nhân hóa học cần thiết đó là ammonium persulfate làm vai trò chất peroxide khởi động (initiator peroxide), và quaternary amine, N.N.N’.N’- tetramethylethylenediamine (TEMED) làm chất xúc tác. o Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động, và TEMED làm tác nhân xúc tác. Sự hình thành polyacrylamide để tạo lưới gel là một quá trình có sinh nhiệt. Do vậy, cần phải tối ưu hàm lượng tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình hoàn tất không nhanh quá, mà trong vòng 20 đến 60 phút là vừa. Nhờ Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) hoạt động như một chất tẩy mà làm biến tính được protein bằng cách bọc quanh phân tử protein, vì vậy đã tạo thành một lớp bọc điện tích âm chung quanh phân tử protein. Phân tử protein lúc này trở thành dạng que và mang điện tích âm nhiều hay ít tùy thuộc vào chiều dài (hay trọng lượng phân tử) của nó. Đây là động lực chính để các protein được phân giải theo trọng lượng phân tử của chúng khi điện di trong gel. Có hai hệ thống điện di: Hệ thống đệm liên tục và hệ thống đệm không liên tục. Hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần so với hệ thống đệm liên tục. Hiện nay, SDS–PAGE thường dùng hệ thống đệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (Laemmli, 1970), biến thể từ hệ thống của Ornstein (1964) và Davis (1964). Trong hệ thống này, gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp. Lớp ở trên có kích thước lưới gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp stacking gel. Lớp ở dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được gọi là running gel. Hai lớp gel này được pha với hai dung dịch đệm khác nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH. Dung dịch điện di cũng được pha bằng một dung dịch đệm khác, gọi là tank buffer. Trong hệ thống đệm không liên tục này, khi bắt đầu điện di, các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp stacking gel. Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion), và lớp mỏng protein này được di chuyển dần đến để tiếp cận lớp running gel. 20 20 Chính nhờ vậy mà các thành phần protein được phân giải rất tốt khi di chuyển trong running gel. 3.3.1.2 Phƣơng pháp tiến hành A. Đổ gel, chuẩn bị buồng điện di 1. Lắp ráp các khuôn đổ gel theo đúng sự hướng dẫn của nhà cung cấp. 2. Pha dung dịch running gel 12,5%. 3. Trong khi đợi running gel trùng hợp pha dung dịch stacking gel 4% acrylamide. Khi running gel trùng hợp hoàn toàn, cho tiếp vào khuôn stacking gel cho đến khi gần đầy khuôn. Cắm lược vào, để yên 30 – 60 phút. 4. Sau khi stacking gel đã trùng hợp hoàn toàn, rút lược nhẹ nhàng ra khỏi gel, tránh làm lệch gel giữa các răng lược. Rửa sạch các giếng gel bằng tank buffer. Ráp khuôn gel vào buồng điện di. Đổ đầy tank buffer vào hai máng trên và dưới của buồng điện di. Chuẩn bị điện di. B. Chuẩn bị mẫu để điện di 1. Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật – Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 2. Trong một tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein với một thể tích (V) 2X Treatment buffer. Đặt vào nồi đun cách thủy đang sôi để trong 2 phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong đá bào cho đến khi thực hiện thí nghiệm. 3. Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng gel. Luôn luôn để một giếng chứa thang protein chuẩn. C. Thực hiện điện di a) Đậy nắp máng điện di. Nối hai điện cực vào bộ cấp điện. b) Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100 mA. c) Quan sát sự di chuyển của vạch m