Nghiên cứu kiểu gen cyp1a1 tại vị trí đa hình RS4646903 và mối liên quan với nồng độ Dioxin máu ở người phơi nhiễm chất độc hóa học/Dioxin

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 102 NGHIÊN CỨU KIỂU GEN CYP1A1 TẠI VỊ TRÍ ĐA HÌNH rs4646903 VÀ MỐI LIÊN QUAN VỚI NỒNG ĐỘ DIOXIN MÁU Ở NGƯỜI PHƠI NHIỄM CHẤT ĐỘC HÓA HỌC/DIOXIN Đào Hồng Dương1; Nguyễn Hoàng Thanh2; Nguyễn Bá Vượng2 TÓM TẮT Mục tiêu: nghiên cứu phân bố kiểu gen CYP1A1 tại vị trí đa hình rs4646903 và đánh giá mối liên quan với nồng độ dioxin máu ở nạn nhân phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích 100 nạn nhân phơi nhiễm chất da cam/dioxin tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 17 từ tháng 01 - 2014 đến 12 - 2016. Phân tích nồng độ dioxin và 17 chất đồng loại trong máu theo phương pháp sắc ký khí khối phổ độ phân giải cao (GC/HR-MS), xác định đa hình gen CYP1A1 tại vị trí rs4646903 bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Kết quả và kết luận: tỷ lệ kiểu gen A/A, A/G, G/G, T/G lần lượt là 29%, 45%, 24%, 2%; tỷ lệ alen A 51,5%, alen G 47,5%, alen T 1%. Có sự khác biệt về nồng độ dioxin, tổng đương lượng độc polychlorinated dibenzo-p-dioxinsvà polychlorinated dibenzofurans giữa các kiểu gen CYP1A1 rs4646903, trong đó bệnh nhân có kiểu gen chứa alen A có nồng độ độ 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin và đương lượng độc cao hơn kiểu gen chứa alen G và T. Tổng đương lượng độc polychlorinated dibenzo-p-dioxins; 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin; 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-furanscó giá trị xác định alen A với diện tích dưới đường cong > 0,6. Trong đó, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-furanscó diện tích dưới đường cong lớn nhất = 0,833; điểm cắt tại vị trí 1,17ppt có chỉ số Youden J cao nhất (độ nhạy 89,2%; độ đặc hiệu 76,9%). * Từ khóa: CYP1A1; Dioxin. ĐẶT VẤN ĐỀ Dioxin là nhóm hóa chất độc hại nhất mà con người từng biết đến. Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ vượt bậc của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã làm sáng tỏ nhiều vấn đề về cơ chế tác động ở mức phân tử của dioxin đối với cấu trúc và chức năng của các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa dioxin như gen CYP1A1 [5, 6, 7]. CYP1A1 là gen mã hóa cho CYP1A1, enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa các hydrocarbon thơm dạng vòng, trong đó có dioxin. Những biến đổi trong cấu trúc của gen CYP1A1 gây ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của enzym, từ đó gây rối loạn quá trình chuyển hóa các phối tử như dioxin [9]. Phân tích gen CYP1A1tại vị trí đa hình rs4646903 trên đối tượng phơi nhiễm dioxin cho thấy khác biệt rõ rệt về nồng độ dioxin và các chất độc đồng loại cũng như tổng đương lượng độc giữa các kiểu gen của CYP1A1 tại một số vị trí đa hình [6, 10]. 1. Học viện Quân y 2. Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corressponding): Đào Hồng Dương Ngày nhận bài: 07/01/2020; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 04/02/2020 Ngày bài báo được đăng: 10/02/2020 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 103 Ở Việt Nam, lượng dioxin lớn nhất trên thế giới và tạp chất lẫn trong các hóa chất diệt cỏ chủ yếu là chất da cam đã được không quân Hoa Kỳ rải xuống chiến trường miền Nam trong thời kỳ chiến tranh (1961 - 1972). Ảnh hưởng nghiêm trọng của dioxin đối với sức khỏe nạn nhân phơi nhiễm qua nhiều thế hệ đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu với các mức độ khác nhau [1]. Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về các gen chuyển hóa dioxin như CYP1A1 trên quần thể nạn nhân phơi nhiễm chất độc màu da cam/dioxin ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành: Nghiên cứu kiểu gen CYP1A1 tại vị trí đa hình rs4646903 và mối liên quan với nồng độ dioxin máu ở người phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. - 100 người phơi nhiễm với chất da cam/dioxin, sinh sống quanh sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa được thu dung về Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 17 từ tháng 01 - 2014 đến 12 - 2016. * Tiêu chuẩn lựa chọn: - Đang sinh sống tại địa bàn điểm nóng của ô nhiễm dioxin quanh sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. - Thời gian sống và cư trú tại địa bàn ≥ 5 năm. - Xét nghiệm nồng độ 2,3,7,8- tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) ≥ 2ppt. 2. Phương pháp nghiên cứu. - Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang có phân tích. - Phân tích dioxin trong máu: phân tích 17 đồng loại nhóm polychlorinated dibenzo- p-dioxins (PCDD) và polychlorinated dibenzofurans (PCDF) trên hệ thống máy Sắc ký khí ghép nối khối phổ phân giải cao (High - Resolution Gas Chromatography/High Resolution Mass Spectrometry - HRGC/HRMS) theo phương pháp 1613 của Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US EPA) tại Trung tâm Eurofins (Đức) [4]. Định lượng 7 đồng loại 2,3,7,8-PCDD và 10 đồng loại PCDF. Tổng đương lượng độc của 7 đồng loại PCDD, 10 đồng loại PCDF và của tổng số 17 đồng loại được tính bằng cách cộng gộp nồng độ từng đồng loại nhân với hệ số đương lượng độc của từng chất theo thống nhất của WHO (2005). Giá trị của đồng loại thấp hơn ngưỡng phát hiện của máy được gán bằng một nửa giá trị của ngưỡng phát hiện khi tính tổng đương lượng độc [8]. - Phân tích đa hình gen CYP1A1 tại vị trí rs4646903: tách chiết và tinh sạch ADN từ máu ngoại vi bằng DNA blood mini kit. Nhân gen PCR trên hệ thống Real-time PCR 7500 (Hãng Applied Biosystem, Mỹ) với cặp mồi đặc hiệu thiết kế bằng phần mềm thiết kế primer-primer chuyên dụng (Vector NTI 11.5) và kiểm tra trên ngân hàng gen (Genebank). Giải trình tự gen CYP1A1 tại vị trí rs4646903 theo nguyên lý Sanger trên hệ thống CEQ 8800 Sequencer (Hãng Beckman Coulter, Mỹ) để đối chiếu kết quả Real-time PCR. Thực hiện phân tích gen CYP1A1 tại Khoa Sinh học Phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 104 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1. Nồng độ dioxin trong máu ở nạn nhân phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin. Bảng 1: Kết quả phân tích dioxin trong máu ở nạn nhân phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin. Nồng độ (ppt) Min - max Trung vị (25 - 75%) 2,3,7,8-TCDD 3,32 - 858,33 38,56 (30,41 - 51,35) 2,3,7,8-TCDF 0,12 - 177,35 2,38 (2,02 - 2,88) Tổng đương lượng độc PCDD 6,94 - 981,3 55,44 (46,48 - 67,59) Tổng đương lượng độc PCDF 3,2 - 229,29 11,15 (10,64 - 13,13) Tổng đương lượng độc WHO-PCDD/F 11,4 - 1.080 62,70 (54,40 - 75,80) (TCDF: Tetrachlorodibenzofuran) Kết quả phân tích cho thấy, tất cả đối tượng trong nhóm nghiên cứu đều có nồng độ 2,3,7,8-TCDD và các đồng loại trong máu cao. Tổng đương lượng độc của các đối tượng đều vượt cao hơn mức tiêu chuẩn cho phép trên thế giới. Trong đó, 1 người có hàm lượng dioxin trong máu cao nhất với nồng độ 2,3,7,8-TCDD là 853,33 ppt và tổng đương lượng độc PCDD/F là 1.080 ppt. Theo Nguyễn Hoàng Thanh (2010), khi khảo sát ở người phơi nhiễm tại các vùng nóng Đà Nẵng và Biên Hòa đều phát hiện có 2,3,7,8-TCDD trong máu và tổng đương lượng độc PCDD/F (WHO) dao động từ 13 - 39 ppt [2]. Lính không quân Mỹ tham gia phun rải chất da cam trong chiến dịch Ranch Hand (1962 - 1971) có CDD trong huyết thanh từ 10 - 521 ppt [3]. Tổng đương lượng độc trong nghiên cứu của chúng tôi trên 100 người ở Đà Nẵng và Biên Hòa từ 3,9 - 722 ppt. 2. Phân bố kiểu gen CYP1A1 tại vị trí đa hình rs4646903 ở nạn nhân phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin (theo định luật cân bằng Hardy - Weinberg). Bảng 2: Kết quả phân tích kiểu gen CYP1A1 rs4646903 ở nạn nhân phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin. Kiểu gen Alen A/A 29% Alen A 51,5% A/G 45% Alen G 47,5% G/G 24% Alen T 1% T/G 2% χ 2 = 0,615; p = 0,893 Tỷ lệ người mang alen G trong nghiên cứu này cao hơn nghiên cứu 1.000 Genomes Project Phase 3 trên 99 người Kinh khỏe mạnh sống tại TP. Hồ Chí Minh (alen G là 43,4% và alen A là 56,6%, không có người mang alen T) [11, 12]. Kobayashi S và CS (2013) nghiên cứu 421 phụ nữ mang thai phơi nhiễm dioxin ở Sapporo, Hokkaido, Nhật Bản nhận thấy tỷ lệ alen lặn của đa hình CYP1A1 MspI rs4646903 là 34,4% và chỉ phát hiện 2 loại alen tại vị trí đa hình này [10]. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 105 3. Mối liên quan của kiểu gen CYP1A1 rs4646903 và nồng độ dioxin trong máu của ở nạn nhân phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin. Bảng 3: Nồng độ 2,3,7,8-TCDD (ppt). Kiểu gen n Min - max Trung vị (25 - 75%) A/A 29 4,92 - 858,33 61,28 (36,21 - 213,92) A/G 45 3,69 - 203,51 44,4 (34,35 - 59,14) G/G 24 3,32 - 621,71 12,03 (5,99 - 24,02) T/G 2 34,09 - 34,3 34,2 (34,09 - 34,3) pmedian test < 0,05 Chứa alen A (1) 74 3,69 - 858,33 48,37 (37,08 - 60,23) Không chứa alen A (2) 26 3,32 - 621,71 14,7 (6,35 - 28,16) p(1-2) < 0,05 Chứa alen G (3) 71 3,32 - 621,71 34,3 (21,63 - 47) Không chứa alen G (4) 29 4,92 - 858,33 61,28 (36,21 - 213,92) p(3-4) < 0,001 Không có sự tương đồng về nồng độ 2,3,7,8-TCDD giữa các kiểu gen của CYP1A1 rs4646903 (p < 0,05), có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về nồng độ 2,3,7,8-TCDD giữa các kiểu gen chứa alen A/không chứa alen A và chứa alen G/không chứa alen G của CYP1A1 rs4646903 (p < 0,05). Bảng 4: Tổng đương lượng độc PCDD (ppt). Không có sự tương đồng về tổng đương lượng độc PCDD giữa các kiểu gen của CYP1A1 rs4646903 (p < 0,05). Tổng đương lượng độc PCDD giữa các kiểu gen chứa Kiểu gen n Min - max Trung vị (25 - 75%) A/A 29 10,05 - 981,3 86,9 (56,46 - 270,79) A/G 45 14,35 - 226,33 56,11 (48,09 - 80,66) G/G 24 6,94 - 731,62 22,08 (14,81 - 36,43) T/G 2 48,32 - 50,79 49,56 (48,32 - 50,79) pmedian test < 0,001 Chứa alen A (1) 74 10,05 - 981,3 62,59 (53,74 - 81,61) Không chứa alen A (2) 26 6,94 - 731,62 23,7 (17,22 - 42,38) p(1-2) < 0,05 Chứa alen G (3) 29 10,05 - 981,3 86,9 (56,46 - 270,79) Không chứa alen G (4) 71 6,94 - 731,62 48,32 (33,86 - 57,29) p(3-4) < 0,05 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 106 alen A/không chứa alen A và chứa alen G/không chứa alen G của CYP1A1 rs4646903 khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Bảng 5: Tổng đương lượng độc PCDF (ppt). Kiểu gen n Min - max Trung vị (25 - 75%) A/A 29 10,05 - 981,3 86,9 (56,46 - 270,79) A/G 45 14,35 - 226,33 56,11 (48,09 - 80,66) G/G 24 6,94 - 731,62 22,08 (14,81 - 36,43) T/G 2 48,32 - 50,79 49,56 (48,32 - 50,79) pmedian test < 0,001 Chứa alen A (1) 74 3,61 - 229,29 11,45 (10,68 - 13,25) Không chứa alen A (2) 26 3,2 - 76,6 10,74 (9,1 - 14,58) p(1-2) = 0,427 Chứa alen G (3) 71 3,2 - 76,6 10,73 (10,35 - 11,47) Không chứa alen G (4) 29 6,3 - 229,29 13,43 (11,62 - 18,31) p(3-4) < 0,05 Không có sự tương đồng về tổng đương lượng độc PCDF giữa các kiểu gen của CYP1A1 rs4646903 (p < 0,05). Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tổng đương lượng độc PCDF giữa các kiểu gen chứa alen G/không chứa alen G của CYP1A1 rs4646903 (p < 0,05) và không có sự khác biệt giữa các kiểu gen chứa alen A/không chứa alen A (p > 0,05). Kết quả phân tích cho thấy, nồng độ dioxin và đương lượng độc cao hơn ở người có kiểu gen chứa alen A so với người chứa alen G, T. Kết quả của chúng tôi tương tự với nghiên cứu của Tsuchida và CS (2003) ở 28 đàn ông khỏe mạnh Nhật Bản tuổi từ 50 - 59 có dioxin trong máu. Khi phân tích riêng biệt những người có kiểu gen CYP1A1 MspI A (gen chứa alen thuần chủng) có nồng độ PCDD, PCDF và co - PCB trong máu tăng hơn so với người có kiểu gen B (gen chứa alen lặn), trong đó tổng nồng độ của các non - ortho - PCB ở kiểu gen A cao hơn có ý nghĩa thống kê so với kiểu gen B [6]. Trong nghiên cứu của Kobayashi S và CS (2013) ở 421 phụ nữ Nhật Bản mang thai, tổng đương lượng độc PCDD và PCDF của kiểu gen chứa alen thuần chủng (TT + TC) tại vị trí đa hình rs4646903 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với tổng đương lượng độc của kiểu hình chỉ chứa alen lặn (CC). Đồng thời, về nồng độ của từng chất, có sự khác biệt về nồng độ 2,3,4,7,8-pentachlorinated dibenzofuran (PeCDF) giữa kiểu gen TT với CC, kiểu hình chứa gen trội TT + TC với kiểu hình chỉ chứa gen lặn CC (p lần lượt là 0,049 và 0,028) [10]. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 107 Bảng 6: Phân tích tương quan giữa kiểu gen CYP1A1 rs4646903 và nồng độ dioxin. CYP1A1 rs4646903 (A/T/G) Biến số n r p Tổng đương lượng độc PCDD 100 -0,345 0,000 Tổng đương lượng độc PCDF 100 -0,199 0,048 2,3,7,8-TCDD 100 -0,332 0,001 2,3,7,8-TCDF 100 -0,241 0,016 Các biến số nghiên cứu đều tương quan có ý nghĩa với phân bố kiểu gen (p < 0,05). Biểu đồ 1: Đường cong ROC trong đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu với phân bố alen A. Dựa vào đường cong ROC có thể thấy tổng đương lượng độc PCDDs; 2,3,7,8- TCDD; 2,3,7,8-TCDF có giá trị xác định alen A với diện tích dưới đường cong > 0,6. Trong đó, 2,3,7,8-TCDF có diện tích dưới đường cong lớn nhất = 0,833; điểm cắt tại vị trí 1,17ppt có chỉ số Youden J cao nhất (độ nhạy 89,2%; độ đặc hiệu 76,9%); 2,3,7,8- TCDD có diện tích dưới đường cong nhỏ nhất = 0,743; điểm cắt tại vị trí 34,3 ppt có chỉ số Youden J cao nhất (độ nhạy 67,6%; độ đặc hiệu 76,9%), tổng đương lượng độc PCDDs có diện tích dưới đường cong = 0,756; điểm cắt tại vị trí 37,39 ppt có chỉ số Youden J cao nhất (độ nhạy 73%; độ đặc hiệu 69,2%). T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 108 KẾT LUẬN Nghiên cứu 100 nạn nhân phơi nhiễm chất độc hóa học/dioxin sinh sống tại các điểm nóng dioxin ở Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi nhận thấy: - Tất cả nạn nhân đều có lượng dioxin và đương lượng độc trong máucao, trong đó người có hàm lượng dioxin cao nhất với nồng độ 2,3,7,8-TCDD là 853,33ppt và tổng đương lượng độc PCDD/F là 1.080 ppt. - Phân bố kiểu gen CYP1A1 rs4646903: tỷ lệ người mang alen A 51,5%, alen G 47,5% và alen T 1%. Kiểu gen A/G chiếm tỷ lệ cao nhất (45%), kiểu gen T/G chiếm tỷ lệ thấp nhất (2%), kiểu gen A/A 29% và kiểu gen G/G 24%. - Có sự khác biệt về nồng độ dioxin, tổng đương lượng độc PCDD và PCDF giữa các kiểu gen của CYP1A1 rs4646903. Bệnh nhân có kiểu gen chứa alen A có nồng độ dioxin và đương lượng độc cao hơn kiểu gen chứa alen G, T. - Có mối tương quan giữa nồng độ dioxin với phân bố các kiểu gen. Tổng đương lượng độc PCDDs; 2,3,7,8-TCDD; 2,3,7,8-TCDF có giá trị xác định alen A với diện tích dưới đường cong > 0,6. Trong đó 2,3,7,8-TCDF có diện tích dưới đường cong lớn nhất = 0,833; điểm cắt tại vị trí 1,17 ppt có chỉ số Youden J cao nhất (độ nhạy 89,2%; độ đặc hiệu 76,9%). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Tài nguyên và Môi trường. Tác hại của dioxin đối với con người Việt Nam. Nhà xuất bản Y học. 2008. 2. Nguyễn Hoàng Thanh. Thu dung, chẩn đoán và điều trị nạn nhân chất độ hóa học/dioxin. Dự án cấp Bộ Quốc phòng. 2010. 3. Institute of Medicine Committee to review the health effects in Vietnam veterans of exposure to herbicides. Veterans and Agent Orange: Update 2012. National Academies Press (US). Washington, D.C. 2012. 4. The United States Environmental Protection Agency's Office of Science and Technology. Method 1613: Tetra- through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMS. Washington, D.C. 1994. 5. Kishi R, Kobayashi S, Ikeno T et al. Ten years of progress in the Hokkaido birth cohort study on environment and children's health: Cohort profile. Environ Health Prev Med. 2013, 18 (6), pp.429-450. 6. Tsuchiya Y, Nakai S, Nakamura K et al. Effects of dietary habits and CYP1A1 polymorphisms on blood dioxin concentrations in Japanese men. Chemosphere. 2003, 52 (1), pp.213-219. 7. Chen H.L, Su H.J, Wang Y.J et al. Interactive effects between CYP1A1 genotypes and environmental polychlorinated dibenzo-p- dioxins and dibenzofurans exposures on liver function profile. J Toxicol Environ Health A. 2006, 69 (3-4), pp.269-281. 8. Van den Berg Martin, Birnbaum Linda S, Denison Michael et al. The 2005 World Health Organization re-evaluation of human and mammalian toxic equivalency factors for dioxins and dioxin-like compounds. Toxicological sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 2006, 93 (2), pp.223-241. 9. Mescher M, Haarmann-Stemmann T. Modulation of CYP1A1 metabolism: From adverse health effects to chemoprevention T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 1-2020 109 and therapeutic options. Pharmacol Ther. 2018, 187, pp.71-87. 10. Kobayashi S, Sata F, Sasaki S et al. Genetic association of aromatic hydrocarbon receptor (AHR) and cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 (CYP1A1) polymorphisms with dioxin blood concentrations among pregnant Japanese women. Toxicol Lett. 2013, 219 (3), pp.269-278. 11. Sudmant Peter H, Rausch Tobias, Gardner Eugene J et al. An integrated map of structural variation in 2,504 human genomes. Nature. 2015, 526 (7571), pp.75-81. 12. Auton Adam, Abecasis Gonçalo R, Altshuler David M et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 2015, 526 (7571), pp.68-74.