Nghiên cứu mô hình 2d-Qsar trên các chất ức chế bơm nor-a của Staphylococcus Aureus

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 329 NGHIÊN CỨU MÔ HÌNH 2D-QSAR TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ BƠM NOR-A CỦA STAPHYLOCOCCUS AUREUS Thái Khắc Minh*, Phan Thiện Vy*, Ngô Triều Dủ*, Huỳnh Nghĩa Tín* TÓM TẮT Mở đầu : Đề kháng kháng sinh đang là vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng hiện nay. Một trong những cơ chế đề kháng kháng sinh quan trọng là vi khuẩn tạo ra bơm đề kháng đẩy kháng sinh ra ngoài và đây là nguyên nhân của đề kháng đa kháng sinh. Cơ chế đã được khám phá ở Staphylococcus aureus (SA) đề kháng quinolon và berberin thông qua bơm NorA. Hiện tại, nhiều nhóm cấu trúc đã được nghiên cứu và chứng minh khả năng ức chế bơm NorA của SA. Mục tiêu : Nghiên cứu này nhằm mục đích xây dựng các mô hình QSAR từ cơ sở dữ liệu thu thập được và áp dụng trong sàng lọc trên ngân hàng dữ liệu, định hướng thiết kế để tìm ra những chất có khả năng ức chế NorA góp phần đẩy lùi sự đề kháng kháng sinh. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu : Mô hình 2D-QSAR được xây dựng dựa trên thuật toán bình phương tối thiểu từng phần PLS MOE) trên cơ sở dữ liệu gồm 47 chất có giá trị IC50. Mô hình 2D-QSAR sau khi xây dựng được ứng dụng để dự đoán giá trị IC50 của 182 dẫn chất flavonoid. Kết quả và bàn luận : Theo hướng thiết kế thuốc dựa vào ligand, nghiên cứu xây dựng được 3 mô hình 2D- QSAR trên 3 thông số mô tả có tên rings, SlogP và logS. Các giá trị đánh giá mô hình cho thấy cả 3 mô hình đều có khả năng dự đoán đúng và sai số giữa giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm <0,5. Kết quả ứng dụng mô hình 2D-QSAR trên 182 dẫn chất flavonoid cho thấy các chất được dự đoán có tác dụng tốt trên bơm Nor-A đều thuộc 2 nhóm cấu trúc 2-hydroxychalcon và flavon. Kết luận: Mô hình QSAR I có khả năng dự đoán tốt nhất trong các mô hình xây dựng được. Các flavonoid có giá trị hoạt tính dự đoán cao đều thuộc 2 nhóm cấu trúc chính là 2-hydroxychalcon và 3-benzoyl-7-hydroxy flavon. Từ khóa: 2D-QSAR, chất ức chế bơm, Nor-A, Staphylococcus aureus, đề kháng kháng sinh ABSTRACT 2D-QSAR STUDIES ON STAPHYLOCCOCUS AUREUS NOR-A EFFLUX PUMP INHIBITORS Thai Khac-Minh, Phan Thien Vy, Ngo Trieu Du, Huynh Nghia Tin * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 329 - 335 Background : Bacterial resistance to important antibacterial agents represents a crucial and worldwide health care problem. Over-expression of efflux pumps is an important mechanism by which bacteria evade effects of multiple substrate antimicrobial agents. This mechanism has been discovered in quinolone and berberine resistant Staphylococcus aureus (SA) via NorA pump. Several classes of compounds have been studied and demonstrated the SA NorA inhibition activity. Objectives : The aim of this study was to develop QSAR models from collected dataset and to apply the QSAR model to design the new NorA efflux pump inhibitors for reversing the bacterial resistance to antibiotics. Materials and methods : 2D-QSAR models were developed by Partial Least Squares algorithm in MOE from dataset containing of 47 compounds with Nor-A IC50 values. Then, these models were applied for predicting ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Thái Khắc Minh ĐT: 0909680385 Email: thaikhacminh@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 330 IC50 values of 182 new flavonoides. Results and Discussion: In term of ligand-based design, three 2D-QSAR models were created from three descriptors namely rings, SlogP, and logS. Validation results showed that three models were showed the predictive powers with the residuals between predicted values and experimental values were smaller 0.5. 2D-QSAR model was applied on 182 flavonoide derivatives and the results showed that the substances having good activities belong to two chemical structure groups named 2-hydroxychalcone and flavone. Conclusion : QSAR model I was the best predictive model. The flavonoides with good Nor-A inhibitory activity belong to two structure groups: 2-hydroxychalcone and 3-benzoyl-7-hydroxy flavone. Key words : QSAR, inhibitors, Nor-A, Staphylococcus aureus, antibiotic resistance ĐẶT VẤN ĐỀ Đề kháng kháng sinh, một hệ quả của việc lạm dụng thuốc và biến đổi hoặc thu nhận gen đề kháng của vi sinh vật(18) đang là vấn đề nghiêm trọng đối với sức khỏe cộng đồng hiện nay, khiến cho phác đồ điều trị thông thường trở nên không hiệu quả. Nhiều chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus (SA) đã đề kháng với các kháng sinh thế hệ mới như vancomycin, daptomycin, linezolid(1) .Vi khuẩn đề kháng kháng sinh theo nhiều cách khác nhau, trong đó cơ chế bơm ngược đẩy thuốc ra ngoài được quan tâm đặc biệt do liên quan đến hiện tượng đa đề kháng ở vi khuẩn(1) .Bơm ngược NorA thuộc nhóm Major Facilitator Superfamily (MFS - Liên họ nhóm điều phối chính) đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra tính đề kháng quinolon, ethidium và berberin ở SA(2). Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều nhóm cấu trúc khác nhau như dẫn chất N- caffeoylphenalkylamid(9), dẫn chất benzothiazin(6,14), dẫn chất thiopyranopyridinylquinolon(11), fluoroquinolon(4), pyrazolo (4,3-c)(1,2) benzothiazin 5,5-dioxid(13), nhóm cấu trúc phenylpiperidin ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin (PSSRI)(3,7), polyacylat oligosaccharid(10), diterpen(16,17), các chất kháng khuẩn có nguồn gốc thực vật(5) và các cấu trúc khác(1) có khả năng ức chế bơm NorA của SA, làm tăng nồng độ và tác dụng của quinolon khi sử dụng kết hợp. Tuy nhiên cho đến nay, chỉ có một vài ví dụ của chất ức chế NorA được thiết kế hợp lý và rất ít mối quan hệ cấu trúc – tác dụng (SAR) của chất ức chế NorA được biết đến như nghiên cứu của các nhóm tác giả Zhang (2010); Brincat (2011) và Sabatini (2011)(13) Theo hướng thiết kế thuốc dựa vào ligand, nghiên cứu sẽ tiến hành xây dựng các mô hình QSAR về mối liên hệ giữa cấu trúc và tác động ức chế bơm ngược NorA trên cơ sở dữ liệu được thu thập. Những mô hình này có thể ứng dụng trong sàng lọc số lượng lớn các chất sẵn có trong ngân hàng dữ liệu định hướng thiết kế nhằm tìm ra những chất có khả năng ức chế bơm NorA ứng dụng trong phối hợp điều trị vi khuẩn đề kháng như S. aureus kháng methicillin (MRSA). PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cơ sở dữ liệu Tổng cộng 47 hợp chất có hoạt tính ức chế bơm ngược NorA thuộc hơn 16 nhóm cấu trúc khác nhau được thu thập từ 11 bài báo khoa học(1,4,3,5,7,8,14,13,15,16) có cùng phương pháp xác định hoạt tính bằng phép đo quang thông qua hoạt động đào thải EtBr của bơm NorA. Do các IC50 có giá trị chênh lệch nhau nhiều nên được đổi thành pIC50 (pIC50 = –lgIC50) để phù hợp cho việc xây dựng phương trình tuyến tính quan hệ cấu trúc - tác dụng. Tập dữ liệu ban đầu được phân chia ngẫu nhiên thành tập xây dựng mô hình (38 chất) và tập ngoại (9 chất) bằng cách đánh số ngẫu nhiên cho các chất bằng hàm RAND trong MOE rồi sắp theo thứ tự tăng dần và lấy 20% đầu tiên làm tập đánh giá ngoại. Quy trình xây dựng mô hình 2D-QSAR Quy trình xây dựng mô hình QSAR được trình bày ở sơ đồ 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 331 Sơ đồ 1: Tóm tắt quy trình xây dựng mô hình 2D- QSAR KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thông số mô tả phân tử và lựa chọn thông số mô tả phân tử Mô hình được xây dựng trên tập xây dựng gồm 36 chất thuộc nhiều nhóm cấu trúc, đã loại 2 chất gây nhiễu là JNP-2006-406-16 và PC-2005- 63-22 vì cả 2 chất này đều gắn kết kém vào khoang trung tâm của NorA theo kết quả của một nghiên cứu trước đó của nhóm chúng tôi. Sau khi lọc, lựa chọn được 3 thông số mô tả là rings, SlogP và logS có ý nghĩa và tương quan như Bảng 1. Bảng 1: Các thông số mô tả xây dựng phương trình hồi quy và sự tương quan Thông số rings SlogP logS Ý nghĩa Mô hình I Mô hình II Mô hình III pIC50 = rings 1,0 Số vòng trong cấu trúc +0.1952 +0.12504 SlogP 0,25 1,0 Log của hệ số phân chia dầu/nước (bao hàm cả nguyên tử hydro) +0.2363 logS -0,52 -0,82 1,0 Log của độ tan trong nước có giá trị (-1,1) -0.23314 -0.18469 Hệ số chặn 3.00398 3.54321 3.33285 Mô hình 2D QSAR trên các chất ức chế bơm NorA Sau khi xây dựng các mô hình bằng cách tổ hợp các thông số, sơ bộ lựa chọn được 3 mô hình có giá trị RMSE <0,5 và R2 lớn hơn 0,5. Trong đó, mô hình I có phương trình hồi quy biểu diễn theo 2 thông số rings và SlogP, mô hình II có phương trình hồi quy biểu diễn theo 1 thông số logS và mô hình III có phương trình hồi quy biểu diễn theo 2 thông số rings và logS. Ba mô hình này có giá trị Q2 và R2pred của cả tập xây dựng và tập ngoại đều trong khoảng 0,46 – 0,84, RMSE trong khoảng 0,25 – 0,32, cho thấy cả 3 mô hình đều có khả năng dự đoán đúng trên 45% và sai số giữa giá trị dự đoán và giá trị thực nghiệm là chấp nhận được (< 0,5) theo cách đánh giá mô hình cổ điển.(18) Ba mô hình đều có giá trị > 0,5 cho cả tập xây dựng và tập ngoại nên cũng đạt yêu cầu theo Roy và cộng sự(18) (có > 0,5 và tốt nhất khi có > 0,5; <0,2). Bảng 2: Các thông số đánh giá khả năng dự đoán tập xây dựng và tập ngoại của 3 mô hình Tập xây dựng n= 36 Mô hình RMSE Q2 I 0,26 0,55 0,61 0,31 0,46 0,3 II 0,29 0,46 0,52 0,18 0,34 0,34 III 0,27 0,51 0,59 0,3 0,44 0,29 Tập ngoại n=9 Mô hình RMSE R2pred I 0,25 0,84 0,71 0,51 0,61 0,2 II 0,32 0,78 0,51 0,2 0,36 0,31 III 0,28 0,82 0,62 0,45 0,53 0,18 Trong 3 mô hình, mô hình I có giá trị cao nhất cho cả tập xây dựng (0,46) và tập đánh giá ngoại (0,61 > 0,5), giá trị thấp cho cả tập xây dựng (0,30) và tập đánh giá ngoại (0,2) và được xem là mô hình có khả năng dự đoán tốt nhất trong các mô hình xây dựng được. Chuẩn bị cơ sở dữ liệu Vẽ cấu trúc, tối thiểu hóa E Lựa chọn thông số mô tả Lọc thô, QSAR-Contingency, PCA Tính thông số mô tả 184 thông số MOE 2D Xây dựng mô hình QSAR Đánh giá mô hình Dự đoán hoạt tính sinh học Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 332 Bảng 3: Các thông số đánh giá mô hình I pIC50 = + 0.1952 * rings + 0.2363 * SlogP + 3.00398 N RMSE R2/Q2 Tập xây dựng 36 0,26 0,61 0,61 0,31 0,46 0,30 Đánh giá chéo 36 0,28 0,55 Tập ngoại 9 0,25 0,84 0,71 0,51 0,61 0,2 Toàn tập 45 0,26 0,63 0,67 0,40 0,54 0,27 Giá trị dự đoán pIC50 của các flavonoid nằm trong khoảng 3,83 - 5,39, tương ứng với IC50 dự đoán trong khoảng 4,04 - 148,04 µM. Trong đó, các flavonoid có giá trị hoạt tính dự đoán cao đều thuộc 2 nhóm cấu trúc chính là 2’-hydroxy chalcon và flavon. Tập xây dựng Tập ngoại Hình 1: Đường thẳng tương quan pIC50 dự đoán và thực nghiệm của tập xây dựng và tập ngoại (A) A B Hình 2. Đồ thị phân bố tập ứng dụng và tập xây dựng biểu diễn theo rings và SlogP (A), theo PCA1 và PCA2 (B). chất xây dựng mô hình, flavonoid, flavonoid có giá trị hoạt tính dự đoán tốt Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 333 Theo kết quả dự đoán, hoạt tính ức chế bơm NorA của các dẫn chất chalcon tăng khi có thêm nhóm thế benzyloxy trên vị trí 4’ và 5’ trên vòng A; không có nhóm thế benzyloxy hay thay bằng nhóm thế khác như benzyl, methoxy trên vòng A làm giảm hoạt tính (Hình 3). Hình 3: Vai trò các nhóm thế trên khả năng ức chế bơm NorA của dẫn chất 2-hydroxychalcon từ hoạt tính dự đoán bằng mô hình I. Bảng 4: Cấu trúc, kết quả dự đoán hoạt tính của 4 dẫn chất 2-hydroxy chalcon và 14 dẫn chất flavon Cấu trúc Tên 4’ 5’ pIC50 dự đoán IC50 dự đoán (µM) BMC-2009-1650-13 OCH2-Ar OCH2-Ar 5,39 4,04 BMC-2009-1650-14 OCH2-Ar OCH3 4,80 15,87 BMC-2009-1650-9 OCH2-Ar 4,80 15,94 BMC-2009-1650-8 Ar 4,76 17,43 Cấu trúc Tên 5 6 7 8 3 3’ 4’ pIC50 dự đoán IC50 dự đoán (µM) F1 OH Cl OH Cl Cl OCH3 4,68 20,86 CBDD- 2012-1- 30 OH CF3 4,62 23,73 CBDD- 2012-1- 11 OH CF3 4,62 23,73 CBDD- 2012-1- 15 OH Cl Cl 4,62 24,01 Cấu trúc Tên 5 3” 4” 3’ 4’ pIC50 dự đoán IC50 dự đoán (µM) CBDD-2012-1-39 CF3 CF3 5,38 4,16 CBDD-2012-1-45 Cl Cl 5,37 4,30 CBDD-2012-1-40 F F F F 5,09 8,19 CBDD-2012-1-38 F F 4,92 11,92 CBDD-2012-1-42 OCH3 OCH3 4,86 13,70 CBDD-2012-1-41 OCH3 OCH3 4,81 15,62 CBDD-2012-1-44 OCH3 OCH3 4,81 15,62 CBDD-2012-1-43 NO2 NO2 4,76 17,27 CBDD-2012-1-46 OH OCH3 OCH3 4,74 18,09 CBDD-2012-1-47 OH NO2 NO2 4,70 20,01 Đối với các dẫn chất flavon, nhóm thế hydroxy ở vị trí 7 trên vòng A và nhóm thế benzoyl ở vị trí 3 trên vòng C đóng vai trò quyết định khả năng ức chế bơm NorA theo như giá trị dự đoán từ mô hình I (Hình 4A.). Trong đó, các chất CBDD-2012-1-39, CBDD-2012-1-45, CBDD- 2012-1-40 và CBDD-2012-1-38 đều có halogen (CF3/F/Cl) trên vòng B và vòng benzoyl ở vị trí 3 trên vòng C, là 4 chất có giá trị hoạt tính dự đoán tốt nhất. Căn cứ vào giá trị dự đoán từ mô hình QSAR, hoạt tính ức chế bơm NorA của các dẫn chất flavon, đặc biệt là các dẫn chất 3-benzoyl-7- Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 334 hydroxy flavon, tăng khi có thêm nhóm thế halogeno (CF3/F/Cl) trên các vị trí khác nhau của cả vòng B và vòng benzoyl. Ngược lại, sự vắng mặt của nhóm thế halogen hay thay bằng các nhóm thế khác như methoxy, nitro trên vòng B và vòng benzoyl làm giảm hoạt tính ức chế bơm NorA (Hình 4B.). A B Hình 4: Vai trò các nhóm thế về khả năng ức chế bơm NorA trên khung flavon (A) và khung 3-benzoyl-7- hydroxy flavon (B) từ hoạt tính dự đoán bằng mô hình I KẾT LUẬN Từ 47 chất thuộc 16 nhóm cấu trúc với cùng một phương pháp thử nghiệm hoạt tính ức chế bơm NorA, ba mô hình 2D-QSAR trên bơm ngược NorA đã được xây dựng với khả năng dự đoán đúng trên 45%, sai số dự đoán là chấp nhận được và đều đạt yêu cầu theo Ojha và cộng sự.(15) Trong 3 mô hình, mô hình I có khả năng dự đoán tốt nhất ( cao nhất, thấp thứ nhì) cho cả tập xây dựng và tập đánh giá ngoại. Ứng dụng mô hình I dự đoán hoạt tính ức chế bơm ngược NorA trên 182 dẫn chất flavonoid, kết quả cho thấy các flavonoid có hoạt tính dự đoán cao đều thuộc 2 nhóm cấu trúc chính là 2’-hydroxy chalcon và flavon. Đối với các dẫn chất chalcon, hoạt tính ức chế bơm NorA tăng khi có thêm nhóm thế benzyloxy trên vị trí 4’ và 5’ trên vòng A. Trong khi ở các dẫn chất flavon, nhóm thế hydroxy ở vị trí 7 trên vòng A và nhóm thế benzoyl ở vị trí 3 trên vòng C đóng vai trò quyết định khả năng ức chế bơm NorA, cũng như vai trò tăng hoạt của nhóm thế halogeno (CF3/F/Cl) trên các vị trí khác nhau của cả vòng B và vòng benzoyl. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brincat JP, Carosati E, Sabatini S, Manfroni G, Fravolini A, L.Raygada J, Patel D, W.Kaatz G, and Cruciani G (2011), "Discovery of Novel Inhibitors of the NorA Multidrug Transporter of Staphylococcus aureus", Journal of Medicinal Chemistry, 54, 354-65. 2. Dupree T (2005), Pharmacophore develoment and validation for inhibitors of the bacterial NorA efflux pump, Master of Science (research), University of Wollongong,Wollonging, Australia. 3. German N, Kaatzb GW, and Kernsa RJ (2008), "Synthesis and evaluation of PSSRI-based inhibitors of Staphylococcus aureus multidrug efflux pumps", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 18, 1368-73. 4. German N, Wei P, Kaatz GW, and Kerns RJ (2008), "Synthesis and evaluation of fluoroquinolone derivatives as substrate-based inhibitors of bacterial efflux pumps", European Journal of Medicinal Chemistry, 43, 2453-63. 5. Gibbons S (2005), "Plants as a source of bacterial resistance modulators and anti-infective agents", Phytochemistry Reviews, 4, 63-78. 6. Kaatz GW, Moudgal VV, Seo SM, and Kristiansen JE (2003), "Phenothiazines and Thioxanthenes Inhibit Multidrug Efflux Pump Activity in Staphylococcus aureus", Antimicrob. Agents Chemother, 47 (2), 719-26. 7. Kaatz GW, Moudgal VV, Seo SM, Hansen JB, and Kristiansen JE (2003), "Phenylpiperidine selective serotonin reuptake inhibitors interfere with multi rug e flux pump activity in Staphylococcus aureus", International Journal of Antimicrobial Agents, 22, 254-61. 8. Law CJ, Maloney PC, and Wang DN (2008), "Ins and Outs of Major Facilitator Superfamily Antiporters", Annu Rev Microbiol, 62, 289-305. 9. Michalet S, Cartier G, David B, Mariotte AM, Dijoux- franca MG, Kaatz GW, Stavrid M, and Gibbonsd S (2007), "N-Caffeoylphenalkylamide derivatives as bacterial efflux Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 335 pump inhibitors", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17, 1755–58. 10. Pereda-Miranda R, Kaatz GW, and Gibbons S (2006), "Polyacylated Oligosaccharides from Medicinal Mexican Morning Glory Species as Antibacterials and Inhibitors of Multidrug Resistance in Staphylococcus aureus", J. Nat. Prod., 69, 406-09. 11. Pieroni M, Dimovska M, Brincat JP, Sabatini S, Carosati E, Massari S, Kaatz GW, and Fravolini A (2010), "From 6- Aminoquinolone Antibacterials to 6-Amino-7- thiopyranopyridinylquinolone Ethyl Esters as Inhibitors of Staphylococcus aureus Multidrug Efflux Pumps", J. Med. Chem., 53, 4466–80. 12. Roy K, Mitra I, Kar S, Ojha PK., Das RN, Kabir H (2012), Comparative Studies on Some Metrics for External Validation of QSPR Models. J. Chem. Inf. Model. 52, 396−408 13. Sabatini S, Gosetto F, Serritella S, Manfroni G, Tabarrini O, Iraci N, Brincat JP, Carosati E, Villarini M, Kaatz GW, and Cecchetti V (2012), "Pyrazolo(4,3- c)(1,2)benzothiazines 5,5-Dioxide: A Promising New Class of Staphylococcus aureus NorA Efflux Pump Inhibitors", Journal of Medicinal Chemistry, 55, 3568-72. 14. Sabatini S, Kaatz GW, Rossolini GM, Brandini D, and Fravolini A (2008), "From Phenothiazine to 3-Phenyl-1,4- benzothiazine Derivatives as Inhibitors of the Staphylococcus aureus NorA Multi rug E flux Pump" J. Med. Chem., 51, 4321-30. 15. Salas-Burgos A, Iserovich PE, Zuniga F, Vera JC, and Fischbarg J (2004), "Predicting the Three-Dimensional Structure of the Human Facilitative Glucose Transporter Glut1 by a Novel Evolutionary Homology Strategy: Insights on the Molecular Mechanism of Substrate Migration, and Binding Sites for Glucose and Inhibitory molecules", Biophysical Journal 87, 2990-99. 16. Smith ECJ, Williamson EM, Wareham N, Kaatz GW, and Gibbons S (2007), "Antibacterials and modulators of bacterial resistance from the immature cones of Chamaecyparis lawsoniana", Phytochemistry Reviews, 68, 210- 17. 17. Stavri M, Piddock LJV., and Gibbons S (2007), "Bacterial efflux pump inhibitors from natural sources", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 59, 1247-60. 18. WHO, www.who.int/mediacentre/factsheets/fs194/ en/index.html, ngày truy cập 10/7/2012 Ngày nhận bài báo: 11.12.2012 Ngày phản biện đánh giá báo cáo: 21.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014