Nghiên cứu nồng độ AMH ở các trường hợp vô sinh có hội chứng buồng trứng đa nang

TẠ P C H Í PH Ụ SẢ N - 14(03), 135 - 139, 2016 135 Tậ p 14 , s ố 03 Th án g 07 -2 01 6 Lê Viết Thắng, Lê Minh Tâm Trường Đại học Y Dược Huế NGHIÊN CỨU NỒNG ĐỘ AMH Ở CÁC TRƯỜNG HỢP VÔ SINH CÓ HỘI CHỨNG BUỒNG TRỨNG ĐA NANG Tác giả liên hệ (Corresponding author): Lê Viết Thắng, email: drthangleviet@gmail.com Ngày nhận bài (received): 10/06/2016 Ngày phản biện đánh giá bài báo (revised): 24/06/2016 Ngày bài báo được chấp nhận đăng (accepted): 30/06/2016 Tóm tắt Mục tiêu: Khảo sát nồng độ AMH ở các trường hợp vô sinh có hội chứng buồng trứng đa nang và tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ AMH cũng như giá trị của nó trong chẩn đoán hội chứng này. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng. Kết quả: Qua nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy nồng độ trung bình các Hormon ở nhóm bệnh nhân có HCBTĐN lần lượt là LH = 10.53 ± 7.12 mIU/ml, trong đó LH>10 mIU/ml chiếm 44.9%; FSH = 05.91 ± 1.57mIU/ ml; Estradiol = 42.02 ± 26.70 pg/ml; Testosterone = 0.33 ± 0.21ng/ml; Prolactin = 393.51 ± 233.97uIU/ml; AMH = 14.07 ± 6.17 ng/ml, Tỉ số LH/ FSH = 1.82 ± 1.17, trong đó tỉ số LH/FSH ≥ 1.5 chiếm 65.9%. (p<0.001). Nồng độ AMH huyết thanh có mối tương quan thuận với nồng độ LH (r =0.353, p<0.001), nồng độTestosteron (r=0.434, p<0.001) và tỉ số LH/ FSH (r=0.348, p<0.001). Điểm cắt nồng độ AMH huyết thanh chúng tôi chọn trong nghiên cứu này để chẩn đoán HCBTĐN là 6,51 ng/ml (Se = 88.6%; Sp = 89,2% ) với AUC = 0.958; 95% CI : 0.937 – 0.980. Kết luận: Phụ nữ có HCBTĐN có những biến đổi về nội tiết với tăng nồng độ hormon LH, testosteron, tỉ số LH/FSH, đặc biệt có sự tăng rõ rệt nồng độ AMH. AMH có thể là một xét nghiệm hữu ích để chẩn đoán HCBTĐN trong tương lai. Abstract RESEARCH THE SERUM LEVEL OF AMH IN CASES OF INFERTILITY WITH POLYCYSTIC OVARY SYNDROME Objective: Elevated serum level of Anti-Mullerian Hormone, relationship between serum level of Anti-Mullerian Hormone and other elements in infertility patients with Polycystic Ovary Syndrome (PCOS). Role of serum level of Anti-Mullerian Hormone to predict the diagnosis of PCOS. Methods: Cross-sectional study controlled. Results: Through this study, we found that the average concentration of hormones in patients with PCOS respectively are: LH = 10.53 ± 7.12 LÊ VIẾT THẮNG, LÊ MINH TÂM 136 Tậ p 14 , s ố 03 Th án g 07 -2 01 6 P H Ụ K H O A – N Ộ I TI ẾT , V Ô S IN H mIU/ml, in which LH> 10 mIU/ml accounted for 44.9%; FSH = 05.91 ± 1.57mIU/ml; Estradiol = 42.02 ± 26.70 pg/ml; Testosterone = 0.33 ± 0.21ng / ml; Prolactin = 393.51 ± 233.97uIU /ml; AMH = 14.07 ± 6.17 ng/ml, ratio LH/FSH = 1.82 ± 1.17, which ratio LH/FSH ≥ 1.5 occupied 65.9%, (p<0.001). Serum AMH concentration has positive correlation with levels of LH (r = 0353, p<0.001), Testosteron concentration (r = 0434, p<0.001) and the ratio LH/FSH (r = 0348, p <0.001). Cut point of serum AMH concentration we choose in this study to diagnose PCOS is 6.51 ng/ml (Se = 88.6%, Sp = 89.2%) with AUC = 0958; 95% CI: 0937-0980. Conclusion: Women with PCOS have endocrine changes with increasing levels of hormone such as: LH, testosterone, ratio LH/FSH, especially increasing significantly in the concentration of AMH. AMH may be a useful test to diagnose PCOS in future. 1. Đặt vấn đề Hội chứng buồng trứng đa nang (HCBTĐN) là rối loạn nội tiết và chuyển hóa phổ biến nhất ở phụ nữ, ảnh hưởng khoảng 5 - 10% cộng đồng đã được Stein và Leventhal mô tả từ những năm 1935. Mặc dù cho đến nay những vấn đề liên quan đến buồng trứng đa nang đã dần dần được hiểu biết một cách đầy đủ nhưng hội chứng buồng trứng đa nang vẫn là một vấn đề được quan tâm, đặc biệt trong lĩnh vực hiếm muộn vì tần suất phổ biến, biểu hiện lâm sàng đa dạng cũng như những khó khăn trong điều trị - phụ thuộc vào đáp ứng buồng trứng của từng cá nhân. Anti - Mullerian Hormone (AMH) là một glycoprotein chuỗi đôi và là thành viên của gia đình TGF-b (transforming growth factor b) và được chế tiết từ các tế bào hạt của nang noãn nhỏ đang phát triển, kể từ khi nang noãn nguyên thủy được chiêu mộ và đạt đỉnh cao ở các nang tiền hốc và có hốc nhỏ [3, 5]. Nồng độ AMH khá ổn định trong suốt chu kỳ kinh nguyệt. Vai trò của AMH được quan tâm rất nhiều không chỉ trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản mà còn liên quan đến chức năng buồng trứng ở trẻ em, dậy thì và phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ. Trong thực hành lâm sàng, AMH được đề nghị dùng để đánh giá dự trữ buồng trứng, dự đoán đáp ứng với kích thích buồng trứng, nguy cơ quá kích buồng trứng do can thiệp y khoa, AMH còn được xem là đại diện cho phương pháp siêu âm đếm nang noãn thứ cấp (Antral follicle count - AFC) trong chẩn đoán HCBTĐN [3]. Theo Lie Fong S. (2011) nồng độ AMH huyết thanh ở phụ nữ hội chứng buồng trứng đa nang cao gấp 2-4 lần so với phụ nữ bình thường [10]. Sự gia tăng này phản ánh sự tăng số lượng các nang thứ cấp nhỏ là nang sản xuất AMH cao nhất. Do sự liên quan chặt chẽ về mặt sinh bệnh học, nồng độ AMH huyết thanh là mối quan tâm đặc biệt của các nhà lâm sàng đối với những bệnh nhân có HCBTĐN. Hiện nay tuy giá trị ngưỡng của AMH vẫn chưa được thống nhất và còn thay đổi tùy theo phòng xét nghiệm trong vấn đề chẩn đoán HCBTĐN cũng như có thể dùng nó như là một tiêu chuẩn chẩn đoán HCBTĐN hay không, nhưng rõ ràng là nồng độ AMH huyết thanh ở những trường hợp này cao đáng kể, vì vậy đây là một xét nghiệm có tiềm năng được ứng dụng rộng rãi trong tương lai. Ngoài giá trị chẩn đoán, AMH có thể dùng để xác định phác đồ điều trị, đặc biệt trong kích thích buồng trứng ở những phụ nữ vô sinh do HCBTĐN không phóng noãn. Ở Việt Nam hiện nay, vấn đề này vẫn còn mới mẻ, chưa có nhiều nghiên cứu về nồng độ AMH huyết thanh cũng như vai trò chẩn đoán và điều trị của nó trong HCBTĐN. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nồng độ AMH ở các trường hợp vô sinh có hội chứng buồng trứng đa nang” với mục tiêu: (1) khảo sát nồng độ AMH ở các trường hợp vô sinh có hội chứng buồng trứng đa nang và (2) tìm hiểu một số yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ AMH cũng như giá trị của nó trong chẩn đoán hội chứng này. TẠ P C H Í PH Ụ SẢ N - 14(03), 135 - 139, 2016 137 Tậ p 14 , s ố 03 Th án g 07 -2 01 6 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu Gồm 334 phụ nữ trong độ tuổi sinh sản được được chia làm 2 nhóm, nhóm bệnh gồm 167 phụ nữ được chẩn đoán HCBTĐN theo tiêu chuẩn Rotterdam Consencus 2003 (có 2 hoặc 3 tiêu chuẩn nêu dưới đây) và nhóm chứng gồm 167 phụ nữ không có HCBTĐN : - Tiêu chuẩn 1 kinh thưa hoặc vô kinh. Kinh thưa được biểu hiện vòng kinh kéo dài trên 35 ngày, thường có rối loạn phóng noãn. Vô kinh được biểu hiện không có kinh trên 6 tháng, thường không có phóng noãn. - Tiêu chuẩn 2 cường androgen. Cường androgen được biểu hiện như về lâm sàng có biểu hiện rậm lông, mụn trứng cá, béo phì; về cận lâm sàng biểu hiện tăng testosterone toàn phần, tự do, giảm SHBG, tăng chỉ số androgen tự do (Testosterone x100/SHBG). - Tiêu chuẩn 3 chẩn đoán trên siêu âm. Buồng trứng có > 12 nang kích thước từ 2 đến 9mm và / hoặc tăng thể tích buồng trứng > 10 cm3, không cần xét đến sự phân bố nang hoặc mật độ mô buồng trứng; Thể hiện ít nhất ở một buồng trứng; Siêu âm thực hiện vào ngày 2-5 của chu kỳ (ngày 3 của chu kỳ nhân tạo); Thể tích buồng trứng được tính bằng 0,523 x (dài x rộng x cao) cm3. Bệnh nhân đồng ý tham gia vào mẫu nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ : - Một số tình trạng cường androgen do các nguyên nhân khác: tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, hội chứng cushing, tăng prolactin máu, khối u sản xuất androgen. - Bệnh nhân vô kinh sau dùng thuốc tránh thai nội tiết phối hợp, bệnh lý tuyến giáp. - Bệnh nhân có tiền sử phẫu thuật trên buồng trứng trước đó. - Bệnh nhân bị suy buồng trứng sớm nguyên phát hoặc thứ phát. - Bị các bệnh lý gan, thận, đái tháo đường. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng 2.2.2. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nội tiết Sinh sản và Vô sinh Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế (HUECREI). 2.2.3. Các bước tiến hành: Khi bệnh nhân đến khám chúng tôi khai thác và nghi nhận các đặc điểm về: - Tiền sử: sản khoa, phụ khoa, nội-ngoại khoa - Khám lâm sàng: đánh giá BMI, các đặc điểm rậm lông. - Xét nghiệm cận lâm sàng + Xét nghiệm nội tiết cơ bản đầu chu kỳ (ngày 2-3 chu kỳ kinh): Các hormon LH, FSH, estradiol và testosterone được định lượng theo kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang ECLIA (Electro Cleimie Luminescence Immuno Assay) bằng máy Cobas 6000. + Xét nghiệm nồng độ AMH huyết thanh: AMH được định lượng theo Elisa assay ( Beckman Coulter, Mỹ) trên máy Human reader single, kết quả được tính theo đơn vị ng/ml. + Siêu âm đường âm đạo: đánh giá số lượng, kích thước các nang noãn và thể tích buồng trứng. 2.2.4. Xử lý số liệu: Phần mềm thống kê SPSS 16.0. 3. Kết quả 3.1. Đặc điểm bệnh nhân Tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân có HCBTĐN là 30.23 ± 4.24. Có 75.40% trường hợp vô sinh nguyên phát, thời gian vô sinh > 3 năm chiếm 47.90% 3.2. Nồng độ nội tiết cơ bản Đặc điểm Bệnh Chứng Tuổi trung bình 30.23 ± 4.24 32.36 ± 5.23 Thời gian vô sinh trung bình < 3 năm ≥ 3năm 3.49 ± 2.55 52.10% 47.90% Loại vô sinh Nguyên phát Thứ phát 75.40% 24.60% Bảng 3.1. Đặc điểm bệnh nhân Đặc điểm Bệnh Chứng p LH (mIU/ml) LH > 10 10.53 ± 7.12 44.90 % 4.62 ± 1.90 2.00% 0.000 FSH (mIU/ml) 5.91 ± 1.57 7.55 ± 2.87 0.000 Estradiol (pg/ml) 42.02 ± 26.70 47.85 ± 32.23 0.363 Testosterone (ng/ml) 0.33 ± 0.21 0.18 ± 0.11 0.000 Prolactin (uIU/ml) 393.51 ± 233.97 369.42 ± 220.59 0.465 Tỉ số LH/FSH ≥ 3 2.5 - <3 2 - <2.5 1.5 - <2 1 - <1.5 <1 1.82 ± 1.17 14.40% 6.60% 4.80% 14.40% 25.70% 34.10% 0.65 ± 0.27 0% 0% 0% 01.00% 06.90% 92.20% 0.000 Bảng 3.2. Nồng độ nội tiết cơ bản I chiếm tỉ lệ đa số 75.40%, thời gian vô sinh trung bình là 3.49 ± 2.55 năm, kết quả này cũng khá phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác. Theo nhận định của một số tác giả, rối loạn phóng noãn là nguyên nhân hàng đầu của vô sinh nguyên phát, còn vô sinh thứ phát thường là do nguyên nhân từ vòi tử cung và tử cung. Về nồng độ nội tiết cơ bản đầu chu kỳ, trong nghiên cứu của chúng tôi có sự khác biệt có ý nghĩa thống của nồng độ LH, FSH, testosterone, tỉ số LH/FSH giữa nhóm có HCBTĐN và nhóm chứng (p<0.001), không có sự khác biệt về nồng độ Estradiol và Prolactin giữa nhóm bệnh và nhóm chứng. Kết quả của một số nghiên cứu khác như sau [4], [12]: Giá trị nồng độ AMH huyết thanh trung bình nhóm có HCBTĐN là 14.07 ± 6.17 còn của nhóm chứng là 3.98 ± 1.90 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0.001). Phân tích mối tương quan giữa nồng độ AMH với một số yếu tố như: nồng độ LH, FSH, Testosterone, Estradiol, tỉ số LH/FSH nhận thấy có mối tương quan thuận mức độ trung bình giữa nồng độ LH (r =0.353), testosteron (r=0.434), tỉ số LH/FSH (r=0.348) với nồng độ AMH ở nhóm có HCBTĐN với p<0.001, không có sự tương quan giữa nồng độ Estradiol, FSH với nồng độ AMH huyết thanh. Kết quả của một số nghiên cứu khác [4], [12], [13]. Về giá trị chẩn đoán HCBTĐN của AMH, thông qua phân tích đường cong ROC, trong nghiên cứu này chúng tôi chọn điểm cắt nồng độ AMH = 6.51 LÊ VIẾT THẮNG, LÊ MINH TÂM 138 Tậ p 14 , s ố 03 Th án g 07 -2 01 6 P H Ụ K H O A – N Ộ I TI ẾT , V Ô S IN H 3.3. Nồng độ AMH 3.4. Đánh giá một số yếu tố liên quan đến nồng độ AMH 3.5. Giá trị cut-off của AMH trong chẩn đoán HCBTĐN AUC: 0.958 95% CI : 0.937 – 0.980 Chúng tôi chọn điểm cắt của nồng độ AMH là 6,51 ng/ml (Se = 88.6%; Sp = 89,2% ). 4. Bàn luận Tuổi trung bình của nhóm bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi là 30.23 ± 4.24 tuổi, so sánh với các tác giả trong nước thì tuổi trung bình trong nghiên cứu chúng tôi khá tương đồng. Nghiên cứu của Phạm Chí Kông (2009) 30.5 ± 3.6, Trần Ngọc Hà (2010) 28.8 ± 4.6 [1], [2]. Một số nghiên khác trên thế giới: Pascal Pigny và cs 27.4 (21.3 – 33.1). Về phân loại vô sinh, trong nghiên cứu này vô sinh AMH (ng/ml) Bệnh Chứng p <5 6.60% 79.40% 0.000 5 - <10 31.10% 19.60% 10 - <15 12.60% 1.00% 15 - <20 23.40% 0% ≥ 20 23.60% 0% Trung bình 14.07 ± 6.17 3.98 ± 1.90 Bảng 3.3. Nồng độ AMH Tác giả Hormon HCBTĐN Chứng p Pascal Pigny và cs LH 8.0 (3.3 – 14.9) 3.7 (2.1 – 5.9) 0.000 FSH 5.6 (4.5 – 7.3) 5.8 (4.0 – 7.4) 0.35 Estradiol 32 (20 – 47) 30 (20 – 52) 0.36 Testosterone 0.53 (0.25 – 0.83) 0.3 (0.17 – 0.45) 0.000 Christine L. Cook và cs LH 15.2 ± 1.2 5.1 ± 0.7 0.000 FSH 3.4 ± 0.2 3.2 ± 0.4 NS Estradiol 75.7 ± 5.7 42.9 ± 3.3 0.000 Testosterone 1.6 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.000 Tác giả AMH HCBTĐN Chứng r p r p Pascal Pigny và cs FSH -0.313 0.018 -0.311 0.037 Testosteron 0.454 0.0004 0.163 0.288 Estradiol -0.083 0.54 0.072 0.64 Athanasia Piouka và cs LH 0.374 <0.001 và cs 0.444 <0.001 Christine L. Cook và cs Estradiol -0.596 0.05 Không có mối tương quan giữa nồng độ AMH và nồng độ các hormon LH, FSH, Testosterone ở cả 2 nhóm có HCBTĐN và không có HCBTĐN AMH Bệnh Chứng r p r p LH 0.353 0.000 0.171 0.86 FSH -0.100 0.202 0.084 0.403 Tỉ số LH/FSH 0.348 0.000 0.157 0.114 Testosterone 0.434 0.000 -0.050 0.168 Estradiol -0.109 0.438 -0.070 0.944 Bảng 3.4. Đánh giá một số yếu tố liên quan đến nồng độ AMH ng/ml (Se = 88.6%; Sp = 89,2%)v để chẩn đoán HCBTĐN với AUC = 0.958; 95% CI : 0.937 – 0.980. Kết quả nghiên cứu của các tác giả khác [6-9], [11], [14], [15]. 5. Kết luận Qua nghiên cứu nồng độ AMH, nội tiết sinh sản ở các trường hợp vô sinh có hội chứng buồng trứng TẠ P C H Í PH Ụ SẢ N - 14(03), 135 - 139, 2016 139 Tậ p 14 , s ố 03 Th án g 07 -2 01 6 Tác giả Năm Cut-off AMH (ng/ml) Se % Sp% AUC Homburg 2013 6.72 60.0 98.2 0.81 Woo 2012 7.82 75.9 86.8 0.868 Lin 2012 7.3 76 70 0.774 Dewailly 2011 4.9 92 97 0.973 Li HWR 2011 5.88 79 96 0.913 Li L 2010 8 61.7 70 0.664 Yi-Hui Lin 2009 7.3 70 76 0.774 Pigny 2006 8.4 67 92 0.851 đa nang, nồng độ LH trung bình là 10.53 ± 7.12 mIU/ml, trong đó LH>10 mIU/ml chiếm 44.9%; nồng độ FSH trung bình là 05.91 ± 1.57mIU/ml; nồng độ Estradiol trung bình là 42.02 ± 26.70 pg/ml; nồng độ Testosterone trung bình là 00.33 ± 0.21ng/ml; nồng độ Prolactin trung bình là 393.51 ± 233.97 mIU/ml; tỷ số LH/FSH trung bình là 1.82 ± 1.17, trong đó tỉ số LH/FSH ≥ 1.5 = 65.9%. Nồng độ AMH trung bình là 14.07 ± 6.17 ng/ml; Nồng độ AMH huyết thanh có mối tương quan thuận với nồng độ LH (r =0.353), nồng độ Testosterone (r=0.434) và tỉ số LH/FSH (r=0.348). Điểm cắt nồng độ AMH huyết thanh chúng tôi chọn trong nghiên cứu này để chẩn đoán HCBTĐN là 6,51 ng/ml (Se = 88.6%; Sp = 89,2% ) với AUC = 0.958; 95% CI : 0.937 – 0.980. Tài liệu tham khảo 1. Trần Thị Ngọc Hà (2010), “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đánh giá kết quả điều trị vô sinh ở phụ nữ do hội chứng buồng trứng đa nang”, Luận văn Tiến sĩ Y học, Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế. 2. Phạm Chí Kông, Phan Thị Kim Cúc (2009), “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của hội chứng buồng trứng đa nang ở các bệnh nhân hiếm muộn tại khoa phụ sản Bệnh viện Đà Nẵng”, Tạp Chí Phụ sản, Tập 7 (số 3), Tr. 10-13. 3. Lê Minh Tâm (2014), “Chỉ báo dự trữ buồng trứng Anti-Mullerian Hormone - Từ lý thuyết đến thực hành”, Tạp chí Phụ sản, Tập 12 (03), Tr 10-19. 4. Christine L . Cook M.D, Yong Siow Ph.D, Amy G. Brenner M.D, and, Mary E. Fallat M.D (2002), “Relationship between serum mullerian-inhibiting substance and other reproductive hormones in untreated women with polycystic ovary syndrome and normal women”. Fertility and Sterility, Vol. 77, No. 1, pp143-146. 5. Grodahl ML, Nielsen ME, Dal Canto MB, Fadini R.et (2011), “Anti- Mulerian hormone remains higly expressed in human cumulus cell during the final stages of folliculogenesis”, Reprod Biomed Online (22), pp.389-398. 6. Woo HY, Kim KH, Rhee EJ, Park H, Lee MK (2012), “Differences of the association of anti-Mullerian hormone with clinical or biochemical characteristics between women with and without polycystic ovary syndrome.”. 2012, J Clin Endocrinol Metab, pp. 781 - 790. 7. Stamatina Iliodromiti Thomas W. Kelsey Richard A. Anderson and Scott M. Nelson (2013), “Can Anti-Müllerian Hormone Predict the Diagnosis of Polycystic Ovary Syndrome? A Systematic Review and Meta-Analysis of Extracted Data”, J Clin Endocrinol Metab, 98(8), pp.3332–3340. 8. Li HW, Anderson RA, Yeung WS, Ho PC, Ng EH (2011), “ Evaluation of serum antimullerian hormone and inhibin B concentrations the differential diagnosis of secondary oligoamenorhea. Feml Steril “, Fertil Steril, 96, pp.774-779. 9. Li L, Chen X, Mo Y, Chen Y, Yang D. Wenig M (2010), “Elevated serum anti-mullerian hormone in adolescent and young adult Chinese patients with polycystic ovary syndrome”. Wiener Klinische Wochenschrift, (122), pp. 519 - 524. 10. Lie Fong Schipper I S, de Jong FH, Themmen AP, Visser J Laven JS, (2011), “Serumanti-Mullerian hormone and inhibin B concentration are not useful predictorsofovarian response duringovulation induction treatment with recombinant follicle-stimulating hormone in women with polycystic ovary syndrome”, Fertil Steril 96, pp.459-463. 11. S. Jonard P. Pigny, Y. Robert, and D. Dewailly (2006), “Serum Anti- Mullerian Hormone as a Surrogate for Antral Follicle Count for Definition of the Polycystic Ovary Syndrome”, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 91(3), pp.941–945. 12. Pascal Pigny, Emilie Merlen, Yann Robert, Christine Cortet-Rudelli, Christine Decanter, Sophie Jonard, Didier Dewailly (2003), “Elevated Serum Level of Anti-Mullerian Hormone in Patients with Polycystic Ovary Syndrome: Relationship to the Ovarian Follicle Excess and to the Follicular Arrest”, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 88 ((12)), pp.5957–5962. 13. Athanasia Piouka Dimitrios Farmakiotis Ilias Katsikis Djuro Macut Spiros Gerou and Dimitrios Panidis (2009), “Anti-Mullerian hormone levels reflect severity of PCOS but are negatively influenced by obesity: relationship with increased luteinizing hormone levels”, AJP-Endocrinol Metab, 4 (vol 296), pp.238 - 243. 14. Homburg R Ray A Bhide P et al (2013), “ The relationship of serum antiMullerian hormone with polycystic ovarian morphology and polycystic ovary syndrome: a prospective cohort study”, Hum Reprod, 28(4), pp.1077–1083. 15. Yi-Hui Lin M.D, Wan-Chun Chiu Ph.D, Chien-Hua Wu Ph.D, Chii- Ruey Tzeng M.D, Chun-Sen Hsu M.D, and Ming-I Hsu M.D. (2011), “Anti- mullerian hormone and polycystic ovary syndrome”, Fertility and Sterility, Vol. 96, No. 1, , pp. 230 - 235.