Nghiên cứu phân lập các hợp chất Alkaloid từ rễ trinh nữ hoàng cung crinum Latifolium L., Amaryllidaceae

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 162 NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TỪ RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG CRINUM LATIFOLIUM L., AMARYLLIDACEAE Lê Ngọc Tú*, Khổng Minh Thương*, Võ Thị Bạch Huệ*, Nguyễn Hồng Thiên Thanh*; Nguyễn Hữu Lạc Thủy* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cao chiết từ rễ của Crinum latifolium L. Amaryllidaceae được sử dụng làm thuốc phổ biến trong điều trị các bệnh như u xơ cổ tử cung, u phì đại lành tính tuyến tiền liệt ...(1). Y học hiện đại đã chứng minh tính kháng khối u của nhiều hợp chất có nguồn gốc từ c}y n|y, như lycorin, 1,2 - β epoxy Ambellin, Undulatin, 6-Hydroxy Crinamidin. Trong nghiên cứu này, hai hợp chất alcaloid tinh khiết Crinamidin (200 mg), Lycorine (2000 mg) được phân lập từ 20 g cao alkaloid toàn phần của rễ cây Trinh Nữ Hoàng cung. Các cấu trúc hóa học của chúng được làm sáng tỏ bằng cách sử dụng c{c phương ph{p phân tích quang phổ (IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR). Bằng c{ch n|y, Crinamidin, Lycorin đã được xác định. Đ}y l| thông b{o đầu tiên về việc phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký v| định danh Lycorin, Crinamidin từ rễ cây TNHC Crinum latifolium thu hái tại Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu về thành phần alkaloid trong rễ cây TNHC. Đối tượng: Cao toàn phần rễ TNHC ở Bình Định được chiết xuất bằng ethanol 70% tại bộ môn Hóa phân tích-Kiểm nghiệm, Khoa Dược TP.HCM năm 2014. Phương pháp nghiên cứu: 1. Rễ TNHC được rửa sạch, phơi khô, xay nhuyễn, ngấm kiệt với cồn 70%, cô thu hồi cồn thu được cao cồn toàn phần của rễ. 2. Xây dựng quy trình chiết alkaloid toàn phần từ cao cồn rễ TNHC. 3. Phân lập c{c ph}n đoạn alkaloid từ cao cồn rễ TNHC bằng phương ph{p sắc ký cột nhanh thu được 10 ph}n đoạn. C{c ph}n đoạn chọn lọc có khối lượng cao hoặc có nhiều alkaloid được tiến hành sắc ký cột cổ điển thu được các hợp chất alkaloid. Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất phân lập được bằng SKLM v| HPLC. 4. X{c định cấu trúc của các hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập được bằng c{c phương pháp phổ nghiệm như UV, IR, MS, NMR. Kết quả: Từ 900 g cao cồn rễ TNHC toàn phần, thu được 20 g cao alkaloid (hiệu suất 2,22%). Bằng các kỹ thuật sắc ký, đã ph}n lập được 6 alkaloid (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A, F8.A). Trong số này, 2 hợp chất alkaloid F5.A, F6.A.1 được tiếp tục khảo sát cấu trúc bằng c{c phương ph{p phổ nghiệm. Kết quả các hợp chất F5.A (200 mg) v| F6.A (2000 mg) được x{c định trình tự là crinamidin, lycorin với độ tinh khiết (HPLC) lần lượt là 99,95% và 100%. Kết luận: Từ cao alkaloid toàn phần rễ TNHC bằng kỹ thuật sắc ký đã ph}n lập được hai thành phần alkaloid (crinamidin, 200 mg và lycorin 2000 mg). Hai thành phần này có thể làm chất đ{nh dấu trong tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và các sản phẩm thuốc từ dược liệu. Từ khóa: Crinum latifolium L., Amaryllidaceae, alkaloid, sắc ký cột, crinamidin, lycorin *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Lê Ngọc Tú ĐT: 0903 741 927 Email: truongtyca@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 163 ABSTRACT ISOLATION OF ALKALOIDS FROM THE ROOTS OF CRINUM LATIFOLIUM L. Le Ngoc Tu, Khong Minh Thuong, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Hong Thien Thanh, Nguyen Huu Lac Thuy * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:162 – 168 Introduction: Extracts from roots of Crinum latifolium L. Amaryllidaceae are used as popular medicine in the treatment of of diseases such as cervical fibroma, prostate enlargement...(1). Modern medicine has demonstrated the anticancer properties of many compounds derived from this plant, such as lycorine, 1,2 β epoxy Ambelline, Undulatine, 6-Hydroxy Crinamidine. In this study, two alcaloid compounds Crinamidine (200 mg), Lycorine (2000 mg) were isolated from alkaloid total extract (20 g) of the roots. Their chemical structures were elucidated using spectroscopic analyses (IR, UV, 1H-NMR, 13C-NMR). By this means, Crinamidine, Lycorine were identified. This is the first announcement on the isolation of Lycorine and Crinamidine using chromatographic techniques and also this is the first time Lycorine and Crinamidine were isolated and identified from the roots of Crinum latifolium L.collected at Vietnam country. Objectives: Chemical components of alkaloids in roots of Crinum latifolium were studied. Materials: Total extract of Crinum latifolium roots in Binh Dinh province was extracted with 70% ethanol at the department of Analytical Chemistry and Drug Quality Control, Faculty of Pharmacy, HCMC in 2014. Methods: 1. Roots from Crinum latifolium were washed, dried, milled, percolated with 70% ethanol, then recovered solvent to get total alcohol roots extract. 2. Extraction process of total alkaloid from alcohol roots extract was built. 3. Isolation of alkaloids from alcohol roots extract by flash column chromatography to collect ten fractions. From selected fractions, pure compounds were isolated by column chromatography. The purity of these compounds was tested by TLC and HPLC. 4. The structure of these compounds was determined by spectroscopic methods such as UV, IR, MS, NMR. Results and discussions: From 900 g of total roots extract, 20 g total alkaloid extract was collected (yield point : 2.22%.). By chromatography methods, 6 alkaloids (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A, F8.A) were isolated. In which 2 alkaloids F5.A and F6.A were determined the struture by spectroscopic methods. The compound F5.A (200 mg) and F6.A (2000 mg) were crinamidine and lycorine respectively with the purity were 99,95% and 100% by HPLC. Conclusions: From the total alkaloid extract of the roots of Crinum latifolium L., by means of chromatographic techniques, two pure alkaloids (crinamidine, 200 mg and lycorine, 2000 mg) were isolated. They can be used as chemical markers for standardization of raw materials as well as products contained this medicinal plant as a component. Keywords: Crinum latifolium L. Amaryllidaceae, alkaloid, flash chromatography, crinamidine, lycorine ĐẶT VẤN ĐỀ Từ lâu, Trinh nữ ho|ng cung (TNHC) đã đƣợc biết đến là một cây thuốc có t{c dụng trong điều trị một số bệnh nhƣ phì đại tuyến tiền liệt; u xơ tử cung< Th|nh phần hoạt chất chính của dƣợc liệu n|y l| c{c alkaloid. Đã có kh{ nhiều nghiên cứu về th|nh phần hóa học của th}n h|nh, l{ v| hoa TNHC; nhƣng c{c nghiên cứu về th|nh phần hóa học - đặc biệt l| nhóm alkaloid - trong rễ TNHC hiện vẫn còn rất ít. Do vậy, đề t|i “Nghiên cứu phân lập hợp chất alkaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 164 Crinum latifolium L. Amaryllidaceae” đƣợc x}y dựng nhằm chiết xuất alkaloid toàn phần, phân lập các hợp chất alkaloid tinh khiết, x{c định cấu trúc c{c alkaloid ph}n lập đƣợc nhờ v|o c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm. NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Rễ TNHC thu h{i tại tỉnh Bình Định (tháng 3 năm 2014 v| th{ng 3 năm 2016) Phƣơng pháp nghiên cứu - Rễ TNHC đƣợc rửa sạch, phơi khô, xay và rây qua rây 500, ngấm kiệt với cồn 70%, cô thu hồi cồn thu đƣợc cao cồn toàn phần của rễ. - Xây dựng quy trình t{ch nhóm alkaloid toàn phần từ cao cồn rễ TNHC. - Bằng phƣơng ph{p sắc ký cột ch}n không (VLC), cao alkaloid toàn phần đƣợc t{ch th|nh c{c ph}n đoạn. C{c ph}n đoạn chọn lọc đƣợc tiếp tục sắc ký cột cổ điển và tinh chế để thu đƣợc các hợp chất alkaloid. Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất phân lập đƣợc bằng SKLM và HPLC. - X{c định cấu trúc của các alkaloid tinh khiết phân lập đƣợc bằng c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm nhƣ UV, IR, MS, NMR. KẾT QUẢ Chiết xuất các alkaloid từ cao cồn rễ TNHC - Nguyên liệu rễ TNHC (thu hái tại Bình Định, th{ng 3/2014) đƣợc rửa sạch, phơi khô, chiết ngấm kiệt với cồn 70%. Cô thu hồi dung môi thu đƣợc 900 g cao cồn rễ TNHC. Cao này đƣợc đóng gói trong bao PE kín, cho bao v|o hộp thủy tinh và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 oC. Đến th{ng 12 năm 2015, từ 900 g cao cồn rễ TNHC n|y, tiến h|nh chiết theo sơ đồ 1 thu đƣợc 20 g cao alkaloid to|n phần (gọi là cao I, hiệu suất 2,2%). - Song song, từ 10 g rễ TNHC (thu h{i tại Bình Định, th{ng 3/2016) đƣợc chiết bằng cồn 70% thu đƣợc cao cồn rễ TNHC. Sau đó, chiết tiếp theo sơ đồ 1 để thu đƣợc 270 mg cao alkaloid toàn phần (gọi là cao II, hiệu suất 2,7%). Sơ bộ so s{nh th|nh phần alkaloid có trong cao I (chiết từ cao cồn rễ, 2014, đƣợc bảo quản trong c{c điều kiện đã ghi) v| trong cao II (chiết từ rễ vừa thu hái, 2016). Qui trình t{ch cao alkaloid từ cao cồn của rễ TNHC Cao c n Cao khô ch acid ch acid L p CHCl3 Cao alkaloid toàn phần Cô thu h i c n + HCl 1%; c o i ch EtOAcL c v i EtOAc Chi t v i CHCl3Ki m h a ® pH 9-10 Cô thu h i CHCl3 Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết cao alkaloid toàn phần từ cao cồn của rễ TNHC - So s{nh sơ bộ th|nh phần hóa học của cao I v| cao II bằng kỹ thuật SKLM Nhận xét: Th|nh phần c{c vết của cao I v| cao II có Rf tƣơng đƣơng nhau. Th|nh phần alkaloid của cao I v| cao II thì tƣơng đƣơng nhau. Do vậy, cao I đƣợc sử dụng để tiếp tục nghiên cứu hóa học (Hình 1). Tách các phân đoạn alkaloid bằng phƣơng pháp VLC Tách cao alkaloid toàn phần I bằng sắc ký cột ch}n không (VLC), thu đƣợc 10 ph}n đoạn có độ phân cực tăng dần (gọi tên lần lƣợt là F1, F2... F10). C{c ph}n đoạn n|y đƣợc kiểm tra bằng SKLM. Ph}n đoạn F2, F4, F5, F6, F7, F8 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 165 đƣợc chọn để tách tiếp vì có khối lƣợng đủ lớn v| tƣơng đối ít tạp. (hình 2) Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff Hệ dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : 1 : 0,05) Hình 1: Sắc ký đồ so sánh các alkaloid từ cao I (vết 1) và cao II (vết 2) Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff Hệ dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : 1 : 0,05) Hình 2: Sắc ký đồ kiểm tra c{c ph}n đoạn qua cột VLC. T: Vết chấm cao alkaloid toàn phần (cao I). F1 ® F10: vết chấm của c{c ph}n đoạn F1 ® F10. Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Nhúng TT Dragendorff Hệ dung môi khai triển CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : 1 : 0,05) Hình 3: Sắc ký đồ các hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập được từ cao I T: vết chấm cao alkaloid toàn phần (cao I). F2A ® F8A: vết chấm của các alkaloid tinh khiết ph}n lập được. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 166 Phân lập và tinh chế các hợp chất alkaloid Ph}n đoạn F5 v| F6 có nhiều tủa. Lọc riêng biệt c{c tủa n|y, sau đó kết tinh lại nhiều lần bằng cách hòa tan ấm trong dung môi thích hợp; lọc loại tạp và kết tinh ở nhiệt độ phòng. Từ ph}n đoạn F5 đã thu đƣợc 200 mg alkaloid (gọi tên là F5.A; kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC: 99,95%). Từ ph}n đoạn F6 đã thu đƣợc 2000 mg alkaloid (gọi tên là F6.A; kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC: 99,99%). Hai alkaloid n|y đƣợc tiếp tục khảo s{t để x{c định cấu trúc. Các alkaloid tinh khiết từ c{c ph}n đoạn khác có khối lƣợng ít đƣợc lƣu dƣới tên F2.A, F4.A, F7.A, F8.A. (Hình 3) Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc Hợp chất F5.A - SKLM: với hệ dung môi CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : 1 : 0,05); trên bản mỏng silica gel F254 (Merck), hợp chất F5.A cho một vết có hình dạng, m|u sắc v| gi{ trị Rf tƣơng đƣơng với chất đối chiếu crinamidin. - Phổ UV/MeOH: có 3 đỉnh hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 210, 281 và 373 nm. - Phổ MS: Phổ khối của F5.A cho mảnh tín hiệu có m/z = 318,1235 [M+H]+ phù hợp với phân tử khối của crinamidin (C17H19NO5= 317). - Phổ NMR: Hợp chất F5.A đƣợc đo phổ NMR (CDCl3, m{y 500 MHz) v| so s{nh với c{c dữ liệu phổ tƣơng ứng của Crinamidin (CDCl3, m{y 500 MHz) trong TLTK(2). Kết quả cho thấy c{c dữ liệu phổ NMR của F5.A thì ho|n to|n phù hợp với Crinamidin (xem Bảng 1). Bảng 1: So s{nh dữ liệu phổ NMR (CDCl3, 125/500 MHz) của F5.A v| Crinamidin(2) ị tr phân p được Crinamidin (2) C, ppm H, ppm, mult., (J, Hz) C, ppm H, ppm, mult. 1 53,8 3,76 d (3,0) 53,8 3,76 d 2 56,5 3,27 t (2,5) 56,4 3,27 m 3 65,2 4,47 d (2,5) 65,5 4,46 m 4 29,7 1,59 m (2H) 29,7 1,59 m (2H) 4a 61,0 3,17 m 61 3,24 m 6 58,5 4,18 d (17,5); 3,70 d (17,5) 58,6 3,71 d; 4,24 d 6a 117,5  117,6  7 141,1  141,1  8 133,4  133,4  9 148,2  148,1  10 96,5 6,63 s 96,4 6,62 s 10a 138,7  138,7  10b 41,7  41,6  11 39,1 2,02 m; 2,39 dt (11,5; 6,0) 39,2 không rõ 12 52,6 2,79 m; 3,17 m 52,5 không rõ -CH2O- 100,7 5,87 dd (6,5; 1,5; 2H) 100,7 5,87 s OCH3 59,1 3,97 s 59,1 3,97 s Nhận xét: Hợp chất alkaloid F5.A phân lập đƣợc từ rễ TNHC chính l| Crinamidin. 14 12 11 10b 10a 10 9 8 7 6a 6 5 4a 4 3 2 1 N O O O OMe OH 13 (F5.A) = Crinamidin Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 167 N O O OH HO 1 2 3 4 4a 5 6 6a 7 8 9 10 10a 10b 11 12 13 (F6.A) = Lycorin Hợp chất F6.A - SKLM: với hệ dung môi CHCl3 – MeOH – NH4OH (5 : 1 : 0,05); trên bản mỏng silica gel F254 (Merck), hợp chất F6.A cho một vết có hình dạng, m|u sắc v| gi{ trị Rf tƣơng đƣơng với chất đối chiếu lycorin. - Phổ UV/MeOH: F6.A cho 3 đỉnh hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 203, 238 và 288 nm. - Phổ IR/KBr, ν (cm-1): 3333 (-OH); 3100- 3000 (CHarom); 1500 (C=Carom); 1037 (-OCH2O). - Phổ MS: Phổ khối của F5.A cho mảnh tín hiệu có m/z = 288,1246 [M+H]+ phù hợp với công thức của lycorin (C16H17NO4= 287). - Phổ NMR: Hợp chất F6.A đƣợc đo phổ NMR (DMSO-d6, m{y 500 MHz) v| so s{nh với c{c dữ liệu phổ tƣơng ứng của Lycorin (DMSO- d6, m{y 500 MHz) trong TLTK(4). Kết quả cho thấy c{c dữ liệu phổ NMR của F5.A thì ho|n to|n phù hợp với Lycorin (xem Bảng 2). Bảng 2: So s{nh dữ liệu phổ NMR (DMSO-d6, 125/500 MHz) của F6.A v| Lycorin(4) ị tr phân p được Lycorin (4) C, mult. H, ppm, mult., (J, Hz) C, ppm H, ppm, mult. 1 70,2 d 4,27 br s 70,16 d 4,29 s 2 71,7 d 3,97 br s 71,68 d 3,99 s 3 118,4 d 5,36 br s 118,41 d 5,38 s 4 141,7 s  141,68 s  4a 60,7 d 2,60 d (10,5) 60,74 d 2,63 d 6 56,7 t 4,01 d (14,0); 3,32 d (14,0) 56,65 t 4,02 d; 3,34 d 6a 129,6 s  129,70 s  7 107,0 d 6,67 s 106,94 d 6,69 s 8 145,2 s  145,48 s  9 145,6 s  145,59 s  10 105,0 d 6,80 s 104,99 d 6,82 s 10a 129,7 s  129,60 s  10b 40,2 d 2,49 m 40,15 d 2,52 m 11 28,1 t 2,46 m (2H) 28,07 t 2,46 m (2H) 12 53,3 t 3,21 t (7,5); 2,22 q (8,5) 53,24 t 3,21 t; 2,22 q 13 100,5 t 5,95 d (1,0); 5,94 d (1,0) 100,07 t 5,96 s; 5,95 s Nhận xét: hợp chất alkaloid F6.A phân lập đƣợc từ rễ TNHC chính l| Lycorin BÀN LUẬN Các phương pháp s c ký đã sử dụng như s c ký l p m ng (TLC), s c ký cột nhanh (VLC) k t hợp v i các phương pháp phổ nghiệm đã dẫn đ n k t quả đ t yêu cầu là phân lập và đ nh danh được một số alcaloid từ rễ Trinh nữ hoàng cung. Sự lựa ch n phương pháp s c ký sẽ tùy vào mục tiêu của giai đo n là đ nh tính, kiểm tra tinh khi t hay thi t lập số lượng l n để xác đ nh cấu trúc. KẾT LUẬN Từ 900 g cao cồn toàn phần của rễ TNHC thu h{i tại Bình Định, đã t{ch riêng v| thu đƣợc 20 g cao alkaloid (hiệu suất 2,22%). Bằng các kỹ thuật sắc ký, đã ph}n lập đƣợc 6 hợp chất alkaloid (F2.A, F4.A, F5.A, F6.A, F7.A v| F8.A). Trong số này, 2 alkaloid F5.A (200 mg) v| F6.A (2000 mg) đƣợc tiếp tục khảo sát cấu trúc bằng c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 168 Kết quả cho thấy F5.A v| F6.A tuần tự l| crinamidin v| lycorin với độ tinh khiết (HPLC) lần lƣợt là 99,95% và 100%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Eman S et al. (2015), "HPTLC and GC/MS study of Amaryllidaceae alkaloids of two Narcissus species", Chemistry & Biodiversity, 12, pp. 1184-1199. 2. Kobayashi S, Tokumoro T, Taisa Z, Kihara M, Imakura Y, Shingu T (1984). Alkaloid constituents of Crinum latifolium and C. bulbispermum, Chem. Pharm. Bull., 32(8), pp. 3015- 3022. 3. Nguyễn Hữu Lạc Thủy (2014), "Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)", Luận án Tiến sĩ Dƣợc học, Đại học Y Dƣợc Tp. HCM. 4. Nguyễn Ngọc Quỳnh, Nguyễn Hữu Phúc, Trần Hùng (2011), Nghiên cứu ph}n lập lycorin từ N{ng hoa trắng (Crinum asiaticum Roxb.) l|m chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm. Y Học Tp. Hồ Chí Minh, 15, Phụ bản của Số 1, tr. 602-605. 5. Nguyen THY, Vo TBH, Jose B, Nguyen HLT, Mohamad A, Agnes C (2013), "Extracts of Crinum latifolium inhibit the cell viability of mouse lymphoma cell line EL4 and induce activation of anti-tumour activity of macrophages in vitro", Journal of Ethnopharmacology, 149, pp. 75-83. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 169 ĐỊNH LƢỢNG HỢP CHẤT PHENOL TRONG RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP FOLIN CIOCALTEU Lê Ngọc Tú*, Hồ Lê Trúc Linh*, Võ Thị Bạch Huệ*, Nguyễn Hồng Thiên Thanh* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) từ l}u đã được sử dụng trong y học dân gian Việt Nam. Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của loài cây này tập trung chủ yếu vào nhóm alkaloid. Từ những năm 2000, đã có nhiều nghiên cứu về thành phần các hợp chất phenol. Tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu hướng tới các bộ phận như l{, củ, hoa mà rất ít nghiên cứu trên rễ của loài cây này. Mục tiêu nghiên cứu: Định lượng hợp chất phenol trong rễ Trinh nữ hoàng cung bằng phương ph{p Folin Ciocalteu. Đối tượng: Rễ TNHC thu hoạch vào tháng 3/2016 tại Bình Định và tp. Hồ Chí Minh. Cao cồn (Cao E) rễ TNHC được chiết từ năm 2014, tại Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dược, Đại học Y Dược tp. Hồ Chí Minh. Chất chuẩn: acid gallic (98%) được cung cấp bởi Sigma Aldrich. Phương pháp nghiên cứu: Chiết cao phenol toàn phần từ cao cồn rễ TNHC bằng phương ph{p chiết phân bố lỏng – lỏng, lắc phân bố với dung môi ethyl acetat. Phân tách cao phenol toàn phần bằng sắc kí cột chân không với c{c dung môi có độ phân cực tăng dần để thu được c{c ph}n đoạn có thành phần đơn giản hơn. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng hợp chất phenol trong dịch chiết nước từ rễ TNHC bằng phương ph{p Folin Ciocalteu với chuẩn acid gallic. Kết quả: Từ 900 gam cao cồn rễ TNHC, bằng phương ph{p chiết phân bố lỏng – lỏng, thu được 20 g cao phenol toàn phần. Sau đó ph}n t{ch bằng sắc kí cột ch}n không, thu được 10 ph}n đoạn (F1 → 10). Qui trình định lượng hợp chất phenol bằng phương ph{p Folin Ciocalteu với máy quang phổ UV-vis tại bước sóng 760 nm (tiến hành song song với mẫu trắng). Lượng hợp chất phenol toàn phần/1 g khối lượng mẫu khô theo chuẩn acid gallic. Qui trình đã được thẩm định: độ đặc hiệu, tính tuyến tính (ŷ = 12,774x + 0,0937, R2 = 0,9968, khoảng tuyến tính 0,01 – 0,08 mg/ml), độ lặp lại (RSD = 2,87%) v| độ đúng (RSD = 2,10%). Kết quả áp dụng qui trình định lượng đã x}y dựng và thẩm định v|o x{c định h|m lượng hợp chất phenol của một số mẫu thử (% hợp chất phenol toàn phần/1 g khối lượng mẫu khô theo chuẩn acid gallic): rễ TNHC thu hoạch tại Bình Định và tại tp. Hồ Chí Minh lần lượt l| 2,45; 2,96; c{c ph}n đoạn F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 lần lượt là 13,41; 29,66; 17,90; 211,83; 177,15; 69,07; 80,54; 55,90; 38,39; 20,12. Ph}n đoạn F4và F5 chứa h|m lượng hợp chất phenol toàn phần cao. Kết luận: • X}y dựng và thẩm định qui trình định lượng hợp chất phenol bằng phương ph{p Folin Ciocalteu. • X{c định qui trình chiết hợp chất phenol từ cao cồn rễ TNHC v| cũng ph}n lập được một hợp chất tinh khiết L-1. • Áp dụng qui trình định lượng đã x}y dựng và thẩm định v|o định lượng hợp chất phenol trong rễ TNHC thu hoạch tại Bình Định và tp. Hồ Chí Minh cũng như trong c{c ph}n đoạn (F1 → 10) từ cao cồn rễ TNHC. Từ khóa: Trinh nữ hoàng cung, Folin Ciocalteu, Crinum latifolium *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Lê Ngọc Tú ĐT: 0903 741 927 Email: truongtyca@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 170 ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF PHENOLIC COMPOUNDS IN THE CRINUM LATIFOLIUM L. AMARYLLIDACEAE ROOTS BY FOLIN CIOCALTEU METHOD Ho Le Truc Linh, Le Ngoc Tu, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Hong Thien Thanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:169 - 175 Background: Crinum latifolium L. Amaryllidaceae has been used in Vietnamese folk medicine. Most studies have referred to alkaloids. Since the 2000s there have been many studies on phenolic compounds in this plant species. However, these studies have focused on leaves, bulbs, flowers, while a few studies have researched on the roots. Objectives: To contribute to study more completely, we carried out “Quantitative determination of phenolic compounds in the Crinum latifolium L. Amaryllidaceae roots by Folin Ciocalteu method". Materials: The Crinum latifolium L. roots were collected in March, 2016 in Binh Dinh province and in Ho Chi Minh City. Ethanolic extract (extract E) from the Crinum latifolium L. roots was extracted in 2014 at Department of analytical chemistry and drug quality control, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City. Reference standard: acid gallic (purity 98%) provided by Sigma Aldrich. Methods: Use the liquid-liquid extraction method with ethyl acetate to obtain extracts of total phenolic compounds from the ethanolic extract of Crinum latifolium L. roots. Then vacuum liquid chromatography to separate the extract of total phenolic into the simple fractions that contain less compositions. Folin Ciocalteu method with gallic acid standard was used to build and validate the procedure to determine phenolic compounds in aqueous extract of dry C. latifolium roots. Results: The procedure for determination of phenolics by Folin Ciocalteu method is carried out with the UV-Vis spectrophotometer at 760 nm (in parallel with the blank). The total phenolic content is expressed as gallic acid equivalent (GAE). This procedure has been validated: specificity, linearity (ŷ = 12.774x + 0.0937, R2 = 0.9968, the range of linearity is 0.01 - 0.08 mg/ml), repeatability (RSD = 2.87%) and accuracy (RSD = 2.10%). From 900 g of the extract E by liquid-liquid extraction, we had 20 g of condensed extract of total phenolic. After the fractionation by vacuum liquid chromatography, it gave 10 fractions (F1 → 10). The results of application of validated procedure to determine total phenolic content (% g gallic acid equivalent/ g dry weight of sample): C. latifolium roots collected in Binh Dinh province and in Ho Chi Minh City: 2.45; 2.96; F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 respectively: 13.41; 29.66; 17.90; 211.83; 177.15; 69.07; 80.54; 55.90; 38.39; 20.12. F4 and F5 have the highest content of phenolic compounds. Conclusion: The procedure to extract the phenolics from ethanolic extract of C. latifolium roots was determined and a pure compound L-1 was also isolated. The procedure for quantitative determination of phenolics by Folin Ciocalteu method was built and validated. The total phenolic content in C. latifolium roots in Binh Dinh province, in Ho Chi Minh City and in fractions (F1 → 10) from the extract of total phenolics of C. latifolium roots were determined. Keywords: Crinum latifolium L. Amaryllidaceae, Folin Ciocalteu, Crinum latifolium ĐẶT VẤN ĐỀ Từ l}u con ngƣời đã biết sử dụng những cây cỏ trong thiên nhiên để chữa bệnh và truyền thống đó đã đƣợc duy trì trong thời gian d|i, đặc biệt khi nƣớc ta sở hữu một hệ động - thực vật phong phú, đa dạng. Trong đó Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 171 cây Trinh nữ hoàng cung- Crinum latifolium L. Amaryllidaceae, đƣợc sử dụng từ lâu trong điều trị các bệnh nhƣ u xơ buồng trứng, u nang cổ tử cung, phì đại tuyến tiền liệt,< t{c dụng kháng khối u luôn đƣợc chú ý nhiều nhất. Phần lớn các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của Trinh nữ hoàng cung đều đề cập đến thành phần alcaloid. Từ những năm 2000 mới có nhiều nghiên cứu về thành phần hợp chất phenol của loài c}y n|y, tuy nhiên, đa phần đều tập trung vào các bộ phận lá, thân củ và hoa, rất ít nghiên cứu trên rễ. Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “Định lƣợng hợp chất phenol trong rễ Trinh nữ hoàng cung bằng phƣơng pháp Folin Ciocalteu” với những mục tiêu cụ thể nhƣ sau: xây dựng và thẩm định qui trình định lƣợng hợp chất phenol toàn phần trong rễ TNHC bằng phƣơng ph{p Folin Ciocalteu; {p dụng qui trình đã thẩm định v|o định lƣợng một số mẫu rễ TNHC; x{c định qui trình chiết xuất hợp chất phenol từ rễ TNHC. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Rễ TNHC thu hoạch vào tháng 3/2016 tại Bình Định và TP. Hồ Chí Minh. Cao cồn (Cao E) rễ TNHC đƣợc chiết từ năm 2014, tại Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm, Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc tp. Hồ Chí Minh. Hóa chất và thuốc thử Chuẩn acid gallic, độ tinh khiết 98% cung cấp bởi Sigma Aldrich. Thuốc thử Folin Ciocalteu (Merck) Natri bicarbonat (Trung Quốc) Các dung môi: methanol, ethyl acetat (Việt Nam), cloroform, n-hexan, ethanol, aceton (Trung Quốc). Trang thiết bị Máy quang phổ UV-vis Shimadzu UV 2550 (Nhật) Bản mỏng Silicagel G (Merck) C}n ph}n tích Sartorius (Đức) Bể siêu }m Elma (Đức) PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Xây dựng qui trình định lƣợng hợp chất phenol toàn phần từ rễ Trinh nữ hoàng cung bằng phƣơng pháp Folin Ciocalteu Nguyên tắc Sự khử tungstat/molybdat (thành phần TT FC) bởi hợp chất phenol trong môi trƣờng kiềm, tạo sản phẩm có màu, đo độ hấp thu ở bƣớc sóng cực đại của sản phẩm thu đƣợc, mật độ quang tỉ lệ với lƣợng hợp chất phenol (phƣơng ph{p quang phổ). Nguyên liệu rễ TNHC thu hoạch tại tp. Hồ Chí Minh (3/2016). Dung dịch chuẩn acid gallic (dung dịch A) Cân chính xác 20 mg acid gallic vào một bình định mức 20 mL, hòa tan v| điền đủ thể tích bằng nƣớc cất 2 lần. Pha loãng 10 lần để đƣợc dung dịch acid gallic 0,1 mg/mL. Dung dịch mẫu thử (dung dịch T) chiết từ rễ TNHC Cân chính xác khoảng 1 g bột rễ khô của TNHC vào một bình nón 100 mL, thêm 25 mL nƣớc cất 2 lần, siêu âm 15 phút ở nhiệt độ 40 ± 5 ºC. Lọc qua bông, thu lấy dịch lọc vào một bình định mức 100 mL. Lặp lại 3 lần c{c bƣớc trên. Rửa bã với 15 mL nƣớc cất 2 lần, bổ sung nƣớc cất 2 lần vừa đủ 100 mL. Lọc qua giấy lọc, bỏ 10-20 mL dịch lọc đầu. Phần dịch còn lại đƣợc sử dụng để định lƣợng (dung dịch T). Thể tích thêm vào (mL) Chuẩn Thử Trắng Dung dịch A x 0 0 Dung dịch T 0 y 0 TT FC 1 1 1 Dung dịch Na2CO3 20% 4 4 4 Nước cất 2 lần vđ 10 Xây dựng qui trình Tìm bƣớc sóng hấp thu cực đại của phức tạo bởi hợp chất phenol và TT FC. Khảo sát các Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 172 yếu tố ảnh hƣởng kết quả định lƣợng: tỉ lệ TT FC, dung dịch Na2CO3 20%, dung dịch thử, độ bền phức theo thời gian. Thẩm định qui trình phân tích Độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng. Áp dụng qui trình định lƣợng hợp chất phenol từ rễ TNHC Bột dƣợc liệu đƣợc làm ẩm với ethanol 96% trong 12 giờ và chiết ngấm kiệt với ethanol 96% trong 24 giờ, rút dịch chiết cồn và cô thu hồi dung môi để đƣợc cao đặc. Hòa tan cao đặc với HCl 1%, siêu âm 15 phút, lọc (lặp lại 3 lần). Dịch nƣớc acid đƣợc lắc nhiều lần với ethyl acetat. Dịch chiết ethyl acetat đƣợc cô thu hồi dung môi để đƣợc cao đặc-cao hợp chất phenol toàn phần. Áp dụng qui trình trên với cao E sau đó so sánh thành phần với cao hợp chất phenol toàn phần chiết từ rễ TNHC (thu hoạch ở Bình Định, tháng 3/2016). Phân tách các hợp chất trong cao hợp chất phenol toàn phần bằng sắc kí cột chân không với c{c dung môi có độ phân cực tăng dần. Áp dụng qui trình định lƣợng đã x}y dựng và thẩm định v|o x{c định h|m lƣợng hợp chất phenol trong rễ TNHC (thu hoạch ở Bình Định và tp. Hồ Chí Minh, tháng 3/2016) v| c{c ph}n đoạn thu đƣợc. KẾT QUẢ Xây dựng Qui trình định lƣợng hợp chất phenol từ rễ TNHC bằng phƣơng pháp Folin ciocalteu Thăm dò tỉ lệ thuốc thử Folin Ciocaleu (TT FC) và dung dịch Na2CO3 20% Các tỉ lệ 1:1; 1:2; 1:3 đều cho dung dịch trong suốt màu vàng, tỉ lệ 1:4 cho dung dịch trong suốt, không màu. Chọn tỉ lệ 1:4 để khảo sát. Xác định bước sóng hấp thu cực đại của dịch chiết lá TNHC (dịch T) và dung dịch chuẩn A với TT FC Dung dịch T với TT FC có 1 cực đại hấp thu tại λmax = 760 nm và dung dịch chuẩn A với TT FC có 1 cực đại hấp thu tại λmax = 761 nm. Nhƣ vậy, sử dụng bƣớc sóng 760 nm để tiến h|nh định lƣợng hợp chất phenol toàn phần trong rễ TNHC. Khảo sát sự ổn định độ hấp thu của dd chuẩn A với thuốc thử FC RSD = 0,69% <2%, độ hấp thu theo thời gian không có sự thay đổi đ{ng kể. Bảng1: Khảo sát thời gian ổn định dung dịch mẫu chuẩn trước khi đo Thời gian (phút) 0’ ’ 10’ 1 ’ 20’ 2 ’ 30’ 3 ’ A760 0,6989 0,7029 0,6995 0,6974 0,6952 0,7011 0,6973 0,6935 Khảo sát sự ổn định độ hấp thu của phức (dịch T + TT FC) theo thời gian Hình 1: Khảo sát thời gian ổn định của dung dịch mẫu thử trước khi đo Khoảng thời gian để ổn định dung dịch phức (mẫu chuẩn và mẫu thử) trƣớc khi đo l| 20 phút. Thăm dò thể tích dịch chiết rễ TNHC (dịch T) Bảng 2: Thăm dò thể tích dịch chiết rễ TNHC (dịch T) Bình Dịch T (mL) TT FC (mL) Dd Na2CO3 20% (mL) Nước cất 2 lần vđ (mL) A760 1 0,1 1 4 10 0,0793 2 0,3 1 4 10 0,1409 3 0,5 1 4 10 0,2127 4 0,7 1 4 10 0,3027 5 1,2 1 4 10 0,4978 6 1,5 1 4 10 0,5963 7 1,8 1 4 10 0,7194 8 2,0 1 4 10 0,7881 Chọn nồng độ dịch T là 0,5 mg/mL vì độ hấp thu nằm ở giữa thang đo v| dễ d|ng để thực hiện khảo s{t độ đúng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 173 Thẩm định qui trình định lƣợng hợp chất phenol Độ đặc hiệu Mẫu trắng không có đỉnh hấp thu tại 760 nm, cả mẫu chuẩn và thử đều có hấp thu tại 760 nm. Nhƣ vậy qui trình phân tích đạt độ đặc hiệu. (a) (b) (c) Hình 2: Phổ UV của mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c) Tính tuyến tính Đối với chuẩn Có sự liên quan tuyến tính giữa độ hấp thu và nồng độ của chuẩn A với đƣờng tuyến tính ŷ = 12,774x + 0,0937; R2 = 0,9968, khoảng tuyến tính là 0,01-0,07 mg/mL. Đối với thử Trong khoảng nồng độ khảo sát 0,1-2,0 mg/mL của dung dịch T thì độ hấp thu có sự tuyến tính với nồng độ dịch T với phƣơng trình hồi qui tuyến tính: ŷ = 0.379x + 0.334 v| R2 = 0.9993. Độ lặp lại Bảng 3: Kết quả khảo s{t độ lặp lại Số mẫu Khối ượng mẫu (g) A760 Hàm ượng hợp chất phenol toàn phần (%) Kết quả Lần cân 1 1,0148 0,2931 0,4712 XTB = 0,4609% SD = 0,0132 RSD = 2,87% < 5,3% µ = 0,4609 ± 0,0139% Lần cân 2 1,0068 0,2964 0,4803 Lần cân 3 1,0100 0,2824 0,4561 Lần cân 4 1,0151 0,2814 0,4522 Lần cân 5 1,0037 0,2843 0,4621 Lần cân 6 1,0047 0,2760 0,4437 Độ đúng Bảng 4: Kết quả khảo s{t độ đúng Mức chuẩn cho vào Lượng thêm vào (mg) Lượng tìm thấy (mg) Tỉ lệ phục hồi (%) 80% 0,0169 0,0147 87,15 0,0169 0,0146 86,22 0,0169 0,0146 86,26 100% 0,0212 0,0185 87,18 0,0212 0,0181 85,47 0,0212 0,0183 86,34 120% 0,0255 0,0217 81,26 0,0255 0,0221 86,61 0,0255 0,0220 86,40 Trung bình 85,88 SD 1,81 RSD 2,10% Áp dụng qui trình định lƣợng hợp chất phenol từ rễ TNHC Từ 10 g bột rễ khô TNHC thu đƣợc khoảng 1 g cao đặc phenol toàn phần (cao R1). Từ 900 g cao E thu đƣợc khoảng 60 mL cao phenol toàn phần (màu nâu sẫm) (cao E1), khối lƣợng cắn khô là khoảng 20 g. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 174 Hình 3: Sắc kí đồ kiểm tra, so sánh thành phần cao R, E, R1 và E1. Hệ dung môi: CHCl3 : MeOH : HCOOH (5 : 1 : 0.05). R: Cao cồn rễ TNHC (thu hái tháng 3/2016 tại Bình Định). E: Cao E (Cao cồn rễ TNHC thu hái tại bình Định, chiết năm 2014). R2: Cao phenol chiết từ cao R. E2: Cao phenol chiết từ cao E Thành phần cao R và E, R1 và E1 hầu nhƣ giống nhau, có 1 vài vết kh{c nhau nhƣng điều này có thể đƣợc giải thích bởi sự khác nhau thời điểm thu hoạch rễ,... Nhƣ vậy có thể sử dụng cao E để tiếp tục nghiên cứu thành phần hợp chất phenol. Sử dụng khoảng 5 g cao E khai triển qua sắc kí cột ch}n không, thu đƣợc 106 ph}n đoạn nhỏ, sau khi kiểm tra bằng SKLM các phân đoạn có sắc kí đồ giống nhau đƣợc gộp lại, kết quả thu đƣợc 10 ph}n đoạn có thành phần đơn giản hơn ban đầu (F1 → 10) Kết quả áp dụng qui trình định lƣợng đã xây dựng và thẩm định v|o x{c định hàm lƣợng hợp chất phenol của một số mẫu thử (% hợp chất phenol toàn phần/1 g khối lƣợng mẫu khô theo chuẩn acid gallic): rễ TNHC thu hoạch tại Bình Định và tại TP. Hồ Chí Minh lần lƣợt l| 2,45; 2,96; c{c ph}n đoạn F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 lần lƣợt là 13,41; 29,66; 17,90; 211,83; 177,15; 69,07; 80,54; 55,90; 38,39; 20,12. Ph}n đoạn F4và F5 chứa hàm lƣợng hợp chất phenol toàn phần cao. BÀN LUẬN Qui trình đ nh lượng hợp chất phenol từ rễ TNHC bằng phương pháp Folin ciocalteu đã được xây dựng và thẩm đ nh quy trình. Các phương pháp s c ký đã sử dụng như s c ký l p m ng (TLC), s c ký cột chân không (VLC) dẫn đ n k t quả đ t yêu cầu là xây dựng được quy trình đ nh lượng phenol từ rễ Trinh nữ hoàng cung. Sự lựa ch n phương pháp sẽ tùy vào mục tiêu của giai đo n xây dựng quy trình đ nh lượng. KẾT LUẬN Đề tài nghiên cứu đã x}y dựng đƣợc qui trình định lƣợng hợp chất phenol bằng phƣơng pháp Folin Ciocalteu. Ứng dụng qui trình vào xác định hợp chất phenol trong mẫu rễ TNHC thu hoạch ở Bình Định, tp. Hồ Chí Minh cũng nhƣ trong c{c ph}n đoạn thu đƣợc từ cao phenol toàn phần qua sắc kí cột chân không. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn Dƣợc liệu (2015), Phương ph{p nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dƣợc Tp. HCM, Tp. HCM, tr. 79-84, 89-91. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 175 2. Prior RL, Wu X, and Schaich K (2005), "Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements", [3]. J Agric Food Chem, 53 (10), pp. 4290-4302. 3. Blainski A, Lopes GC, and Mello de JC (2013), "Application and analysis of the folin ciocalteu method for the determination of the total phenolic content from Limonium brasiliense L", Molecules, 18 (6), pp. 6852-6865. 4. Vernon LS, Rudolf O, and Lamuela-Raventós MR (1999), Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent, in Methods in Enzymology, Academic Press, pp. 152-178 5. Ludwig H (2007), Validation and qualification in analytical laboratories, second edition, pp. 144-146. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018