Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn của dịch chiết lá đại bi (blumea balsamifera) trên chuột nhắt trắng

101 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM, KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT LÁ ĐẠI BI (Blumea balsamifera) TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Nguyễn Thị Nghi Trung∗, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Tình hình và mục ñích nghiên cứu: Đại bi là một thảo dược ñã ñược dân gian sử dụng ñể ñiều trị hiệu quả một số bệnh lý viêm. Cho ñến nay, tài liệu nghiên cứu về Đại bi vẫn còn khá khiêm tốn, vai trò kháng viêm của Đại bi vẫn chỉ là kinh nghiệm. Đề tài của chúng tôi thực hiện nhằm tìm hiểu tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn của Đại bi trên chuột nhắt trắng. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm bệnh - chứng, lựa chọn ngẫu nhiên, thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Y học Cổ Truyền, Đại học Y Dược TP. HCM từ 6/2009 ñến 12/2009 Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết Đại bi (2:1)/ ethanol 90% và ethanol 70% ,70 chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, mua tại viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh Phương tiện ñánh giá: Tỷ lệ ức chế u hạt, mức ñộ nhiễm S. pneumoniae, mức ñộ viêm niêm mạc xoang mũi của chuột nhiễm S. pneumoniae. Sử dụng phép kiểm t-Student và Anova ñể thống kê số liệu thực nghiệm. Kết quả chính: Dịch chiết Đại bi (uống, 40g/kg) có tác dụng ức chế 20,87% u hạt tươi (p<0,05), ức chế 28,93% u hạt khô (p<0,05), giảm mức ñộ viêm niêm mạc xoang mũi chuột gây bởi S. pneumoniae. Ở liều uống 40g/kg làm giảm 6/10 số chuột nhiễm khuẩn và ở liều nhỏ mũi 10µL/chuột (1,177 mg/kg) giảm 10/10 số chuột nhiễm khuẩn trên mô hình viêm xoang mũi do S. pneumoniae. Kết luận: Dịch chiết Đại bi (40g/kg) có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm trên chuột nhắt trắng gây u hạt và viêm xoang mũi thực nghiệm Từ khóa: Đại bi, kháng viêm, kháng khuẩn, chuột nhắt ABSTRACT STUDIES ON ANTIINFLAMATORY AND ANTIBACTERIAL ACTIVITIESOF BLUMEA BALSAMIFERA EXTRACT IN MURINE MODELS Nguyen Thi Nghi Trung, Nguyen Phuong Dung Background and aims :Although Blumea balsamifera has been widely used in pathological inflamation. So far, research about anti-inflamatory effect of Blumea balsamifera is unclearly. Our study was designed to evaluate anti-inflamatory effect of Blumea balsamifera on mice. Study design and Setting: An experimental study was carried out on swiss albino mice were given Blumea balsamifera extract (2:1)/ ethanol 90% và ethanol 70%. Outcome measures: The percentage of granuloma inhibition, infection levels of S. pneumoniae, the level of inflammatory sinus nasal mucosa of mice caused by S. pneumonia are outcome measurements. Results:Inhibitory effect of Blumea balsamifera extract (40g/kg, per oral) on fresh granulomas is 20.87% (p <0.05) and on dry granulomas is 28.93% (p <0.05). It reduces the f inflammatory phenomenon of sinusitis- induced S. pneumoniae in mice . The oral dose 40g/kg reduce 6/10 of infected mice and in nasal dose10µL/mice (1.177 mg / kg) reduced 10/10 of infected mice caused by S. pneumoniae. Conclusions:The extracts of Blumea balsamifera (40g/kg) have antibacterial and anti-inflammatory effects on mice caused granulomas and experimental sinusitis. Key words: Blumea balsamifera, anti-inflammatory, antibacterial, mice ĐẶT VẤN ĐỀ Đại bi là một thảo dược ñã ñược sử dụng trong dân gian ñể ñiều trị một số bệnh lý viêm. Vị thuốc có vị cay ñắng, thành phần hóa học chủ yếu là tinh dầu và flavonoid. Cây Đại bi dễ trồng, thích hợp với khí hậu nước ta, lá có thể thu hái quanh năm, là nguồn nguyên liệu làm thuốc tương ñối dồi dào. Cho ñến nay, tài liệu chứng minh hiệu quả ñiều trị từ lá Đại bi còn khá khiêm tốn, chủ yếu vẫn là những kinh nghiệm dân gian truyền khẩu. Để góp phần nâng cao giá trị của dược liệu này, chúng tôi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu tác dụng kháng viêm của dịch chiết lá Đại bi trên chuột nhắt trắng”. ∗ ,** Khoa Y học cổ truyền- Đại học Y Dược Tp. HCM Điạ chỉ liên hệ: DS. Nguyễn Thị Nghi Trung ĐT: 0936943944 Email: kagome0909@yahoo.com 102 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Thuốc thử nghiệm: Dịch chiết lá Đại bi (2:1) ethanol 90% và 70% ñược thực hiện tại bộ môn Bào chế, khoa Y học cổ truyền Hóa chất: Canh cấy vi khuẩn S. pneumoniae TSB 24 giờ, chứa khoảng 1,2 x 109 CFU/ ml, thiopental injection BP 1g, lô F80730 (Đức), nước muối sinh lý NaCl 0,9%, thạch máu và thạch máu chứa gentamycin 1µg/ml (Công ty TNHH Nam khoa), formol 10 %, HNO3 5 %, bông, ethanol 90% và ethanol 70%. Súc vật: Chuột nhắt trắng ñực, chủng Swiss albino mua ở Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh, 4 – 5 tuần tuổi, trọng lượng 16-18g dùng ñể nghiên cứu tác dụng kháng viêm mũi xoang cấp do S. pneumoniae và chuột 6 – 8 tuần tuổi, trọng lượng 20 – 22 g dùng ñể nghiên cứu tác dụng kháng viêm mạn (mô hình gây u hạt). Trong suốt quá trình thử nghiệm, chuột ñược nuôi trong ñiều kiện ổn ñịnh về dinh dưỡng (thực phẩm viên, giá sống, nước uống tự do) Các thử nghiệm ñược tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Y Học Cổ Truyền, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mô hình gây viêm mũi xoang trên chuột (theo Kelly Bomer) [2], [3] Rửa mũi chuột bằng NaCl 0,9%. Trải dịch rửa mũi trên môi trường thạch máu. Ủ 370C trong 48 giờ và quan sát hệ vi khuẩn mọc ñược. Một ngày sau, nhỏ mũi chuột với 10µl dịch vi khuẩn S. pneumoniae. Chia ngẫu nhiên chuột làm 4 lô: • Lô chứng: uống nước cất 0,2 ml / 10g thể trọng. • Lô ñối chứng: cho chuột uống prednisolon (0,01mg/kg/ngày) ampicilin (1mg/ngày/con), thể tích 0,2 ml/10g thể trọng (am+pred) • Lô nghiên cứu 1: uống dịch chiết Đại bi, thể tích 0,2 ml dịch chiết 2:1/10 g thể trọng, tương ñương 40g dược liệu tươi/kg thể trọng. • Lô nghiên cứu 2: nhỏ mũi dịch chiết Đại bi, thể tích 10µL/chuột, tương ñương 1,177 mg dược liệu tươi/kg thể trọng. Mỗi ngày dùng thuốc 1 lần, liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 8, chuột ñược gây mê bằng thiopentan với liều truỵ hô hấp (120mg/kg). Sát trùng phần ngoài khoang miệng và ñầu, rửa mũi bằng NaCl 0,9%. Dịch rửa mũi ñược nhỏ giọt trực tiếp trên ñĩa thạch BA chứa gentamycin, cấy vạch 3 chiều và ủ ở 370 C trong 24 giờ. Đánh giá sự tồn tại của S. pneumoniae trong dịch mũi chuột qua sự hình thành khuẩn lạc và mật ñộ của chúng trên 3 chiều cấy với 4 cấp ñộ: Cấp ñộ 0 (không mọc); Cấp ñộ 1 (chỉ mọc ở 1 chiều - khóm ít); Cấp ñộ 2 (mọc ở chiều 1 và 2 - khóm vừa); Cấp ñộ 3(mọc trên cả 3 chiều - khóm nhiều) Cắt lấy phần ñầu chuột khi tim còn ñập và ngâm trong dung dịch cố ñịnh mẫu formol 10% trong 1 ngày. Lọc bỏ da cơ, mắt, hàm dưới và lưỡi, phần còn lại cho vào HNO3 5%, ngâm qua ñêm. Dùng dao lam cắt phần trước mũi và não thành 3 phần sao cho phần xoang mũi từ trước tới sau dài khoảng 8mm, mẫu ñược gửi khoa Giải phẫu bệnh –Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Nghiên cứu tác dụng ức chế tạo u hạt thực nghiệm bằng amian (theo Ducrot, Julou - 1963) [1] Cắt amian thành từng ñoạn ngắn, trọng lượng 20 ± 1 mg, vê tròn, sấy khô. Cạo sạch lông vùng lưng chuột, dùng ñầu kéo bấm 1 lỗ nhỏ trên ñể tách da lưng ra khỏi lớp cơ, cấy amian. Khâu bằng chỉ ñể nối liền vết mổ. Chia ngẫu nhiên chuột thành 3 lô, mỗi lô 10 chuột: • Lô chứng (C): mỗi chuột uống nước cất 0,2 ml/10 g thể trọng • Lô ñối chứng (As): mỗi chuột uống aspirin liều 240 mg/kg thể trọng, thể tích 0,2ml/10g thể trọng • Lô nghiên cứu (Đại bi): mỗi chuột uống dịch chiết 0,2 ml/10 g thể trọng, tương ñương 40 g dược liệu tươi/kg thể trọng. Tác dụng ức chế u hạt ñược biểu thị bằng tỷ lệ % giảm trọng lượng trung bình các u hạt ở lô dùng thuốc so với lô chứng. Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm 103 Dùng chương trình MS-Excel trên máy tính ñể tính các giá trị: Giá trị trung bình của mẫu; ñộ lệch chuẩn; khoảng tin cậy của giá trị trung bình; so sánh giá trị trung bình dữ liệu tương ứng từng cặp (Paired Two Sample for Means) và so sánh giá trị trung bình với phương sai khác nhau (n<30). KẾT QUẢ Tác dụng kháng S. pneumoniae của dịch chiết lá Đại bi khi sử dụng ñường uống - Ở lô chứng (nhỏ mũi S. pneumoniae, uống nước cất), vi khuẩn mọc trên cả 10 mẫu thạch (30% chuột nhiễm cấp ñộ 1, 30% chuột nhiễm cấp ñộ 2, 40% chuột nhiễm cấp ñộ 3). - Ở lô uống ampicilin và prednisolon, hiện tượng nhiễm S. pneumoniae giảm cả về số lượng chuột (3/10 chuột) và mức ñộ nhiễm (chỉ có 3 chuột nhiễm cấp ñộ 1) so với lô chứng. Kết quả thực nghiệm này cũng tương ñương với công bố trước ñây của tác giả khác [3] - Ở lô chuột uống dịch chiết lá Đại bi, hiện tượng nhiễm S. pneumoniae giảm cả về số lượng chuột (4/10 chuột) và mức ñộ nhiễm (2 chuột nhiễm cấp ñộ 1) so với lô chứng. Mặc dù tỷ lệ chuột còn nhiễm S. pneumoniae cao hơn lô ñối chứng (amp + pred), nhưng ñã thể hiện hiệu quả kháng khuẩn rõ rệt trên chuột nhắt nghiên cứu. Biểu ñồ 1. Mức ñộ nhiễm S. pneumoniae theo các cấp ñộ sau 8 ngày uống thuốc của các lô nghiên cứu Tác dụng kháng S. pneumoniae của dịch chiết lá Đại bi khi sử dụng ñường nhỏ mũi - Ở lô chứng (nhỏ mũi S. pneumoniae, uống nước cất), vi khuẩn mọc trên cả 10 mẫu thạch (3 chuột nhiễm cấp ñộ 1, 3 chuột nhiễm cấp ñộ 2, 4 chuột nhiễm cấp ñộ 3). Kết quả này tương ñồng với công trình ñã công bố trước ñây. - Ở lô chuột nhỏ mũi dịch chiết lá Đại bi, hiện tượng nhiễm S. pneumoniae giảm cả về số lượng chuột (0/10 chuột) và mức ñộ nhiễm (0) so với lô chứng. Cho thấy, ñường dùng nhỏ mũi có hiệu quả kháng khuẩn rõ rệt khi dùng liều thấp (10µL/chuột, 1,177 mg/kg thể trọng) hơn nhiều lần so với liều uống. Biểu ñồ 2. Mức ñộ nhiễm S. pneumoniae sau 8 ngày nhỏ mũi ở các lô nghiên cứu Tác dụng kháng viêm của dịch chiết lá Đại bi trên chuột nhiễm S. pneumoniae Nhận xét: - Ở lô chứng (nhỏ mũi S. pneumoniae, uống nước cất), 3/6 mẫu mô có hiện tượng viêm vừa (hình 3.2), 3/6 mẫu có hiện tượng viêm nặng (hình 3.3), không có mẫu mô nào bình thường hoặc viêm mức ñộ nhẹ. Kết quả này chứng minh khả năng gây viêm xoang mạn của S. pneumoniae trên chuột nhắt. - Ở lô uống am+pred, hiện tượng viêm niêm mạc xoang mũi giảm hẳn: 2/3 mẫu mô ở trạng thái bình thường, 1/3 mẫu mô bị viêm nhẹ, không có mẫu mô viêm vừa và viêm nặng. Kết quả thực nghiệm cho thấy ampicilin kết hợp prednison có hiệu quả giảm viêm niêm mạc xoang mạn trên chuột nhiễm S. pneumoniae, phù hợp với những công bố trước ñây của các tác giả khác [3]. 104 - Ở lô chuột uống dịch chiết lá Đại bi, hiện tượng viêm cũng giảm rõ: 3/5 mô bình thường, 2/5 mô viêm nhẹ (hình 3.1), không có mô viêm vừa và viêm nặng. Chứng tỏ hiệu quả kháng viêm của dịch chiết lá Đại bi khi sử dụng ñường uống (40 g/kg) trên chuột nhắt viêm xoang mũi mạn tính do S. pneumoniae. Biểu ñồ 3. Mức ñộ viêm niêm mạc mũi xoang sau 8 ngày dùng thuốc ở các lô thuốc nghiên cứu Tác dụng kháng viêm của dịch chiết lá Đại bi trên chuột gây u hạt thực nghiệm Nhận xét: - Ở lô chuột uống aspirin (240 mg/kg), tỷ lệ ức chế u hạt là 12,6 %. Trọng lượng u hạt tươi giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P= 0,0445 (P<0,05)) - Ở lô chuột uống dịch chiết lá Đại bi (40 g/kg), tỷ lệ ức chế u hạt là 20,87 %. Trọng lượng u hạt tươi giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P = 0,0447 (P<0,05) Biểu ñồ 4. Trọng lượng u hạt tươi (mg) sau 6 ngày dùng thuốc của các lô nghiên cứu Nhận xét: - Ở lô chuột uống aspirin (240 mg/kg), tỷ lệ ức chế u hạt là 29,08 %. Trọng lượng u hạt khô giảm không ý nghĩa thống kê so với lô chứng P = 0,0025 (P<0,05) - Ở lô chuột uống dịch chiết lá Đại bi (40 g/kg), tỷ lệ ức chế u hạt là 28,93 %. Trọng lượng u hạt khô giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng P = 0,0046 (P<0,05). Biểu ñồ 5. Trọng lượng u hạt khô (mg) sau 6 ngày dùng thuốc của các lô nghiên cứu KẾT LUẬN Từ những kết quả thu ñược từ thực nghiệm, chúng tôi có một số kết luận sau: 105 Dịch chiết lá Đại bi (40 g dược liệu tươi/kg thể trọng, uống) có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm trên chuột nhắt trắng viêm mũi xoang gây bởi S. Pneumonaniae. Dịch chiết lá Đại bi thể hiện tác dụng kháng khuẩn khi dùng ñường nhỏ mũi (10 µL/chuột - 1,177 mg dược liệu tươi/kg thể trọng) trên chuột nhắt trắng viêm mũi xoang gây bởi S. pneumoniae sau dùng thuốc 8 ngày. Khi sử dụng liều uống 40 g dược liệu tươi/kg thể trọng liên tục trong 5 ngày, dịch chiết lá Đại bi có tác dụng ức chế 20,87% u hạt tươi và 28,93% u hạt khô trên chuột nhắt trắng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y Tế. Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 142 – 143, tr. 355 – 368. 2. Bomer, K., Brichta, A., Baroody, F., Boonlayangoor, S., Li, X., Naclerio, R. M. (1998), "A mouse model of acute bacterial rhinosinusitis". Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 124(11), pp. 1227-1232. 3. Đỗ Thị Hồng Tươi, Nguyễn Thị Ngọc Tuyết, Nguyễn Sào Trung, Nguyễn Văn Thanh, Trần Thu Hoa (2005), "Khả năng sử dụng Bacillus subtilis ñiều trị viêm mũi xoang trên mô hình chuột". Y Học TP. Hồ Chí Minh, Tập 9(Số 4), tr. 215 - 218.