Nghiên cứu tác dụng theo hướng tăng cường miễn dịch thực nghiệm của các công thức phối hợp từ dược liệu

111 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG THEO HƯỚNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH THỰC NGHIỆM CỦA CÁC CÔNG THỨC PHỐI HỢP TỪ DƯỢC LIỆU Lê Minh Triết∗, Nguyễn Thị Thu Hương*, Dương Thị Mộng Ngọc*, Trần Công Luận*, Lã Văn Kính∗∗ TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu tác dụng theo hướng kích thích miễn dịch của các công thức phối hợp từ các dược liệu Bọ mắm, Dây cóc, Xuyên tâm liên, Hoàng liên ô rô và Gừng trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide nhằm mục ñích ứng dụng các dược liệu trên trong việc ñiều trị các bệnh viêm nhiễm. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tác dụng của 4 công thức phối hợp từ các cao dược liệu trên chuột bình thường và chuột bị gây suy giảm miễn dịch bởi chất ức chế miễn dịch cyclophosphamide (150 mg/kg, tiêm phúc mô). Công thức phối hợp 1 (Hoàng liên ô rô, Bọ mắm, Gừng); công thức phối hợp 2 (Hoàng liên ô rô, Xuyên tâm liên, Gừng); công thức phối hợp 3 (Xuyên tâm liên, Dây cóc, Gừng) và công thức phối hợp 4 (Bọ mắm, Dây cóc, Gừng). Kết quả ñánh giá dựa trên chỉ số thực bào trong máu sau 5 phút theo phương pháp khảo sát ñộ thanh thải carbon (carbon clearance test). Kết quả: Trên chuột bình thường chỉ có công thức phối hợp 3 làm tăng chỉ số thực bào trong khi ñó trên chuột bị gây suy giảm miễn dịch thì cả 4 công thức phối hợp ñều có tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào bị gây suy giảm bởi cyclophosphamide. Kết luận: Các công thức phối hợp của các cao chiết từ các dược liệu Bọ mắm, Dây cóc, Hoàng liên ô rô và Gừng có tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào, tăng cường miễn dịch không ñặc hiệu. Từ khóa: Bọ mắm, Dây cóc, Xuyên tâm liên, Hoàng liên ô rô, Gừng, cyclophosphamide, chỉ số thực bào, ñộ thanh thải carbon, tăng cường miễn dịch SUMMARY EXPERIMENTAL STUDY ON IMMUNOSTIMULATING EFFECTOF MEDICINAL PLANT FORMULAE Le Minh Triet, Nguyen Thi Thu Huong, Duong Thi Mong Ngoc, Tran Cong Luan, La Van Kinh Objectives: Study on immunostimulating effects of formulae from Pouzolzia zeylanica, Tinospora crispa, Andrographis paniculata, Mahonia nepalensis and Zingiber officinale was performed in healthy mice and cyclophosphamide-induced immunosuppressive mice. Methods: Materials used in the study including Formula 1 (Mahonia nepalensis, Pouzolzia zeylanica and Zingiber officinale), Formula 2 (Mahonia nepalensis, Andrographis paniculata and Zingiber officinale), Formula 3 (Tinospora crispa, Andrographis paniculata and Zingiber officinale) and Formula 4 (Pouzolzia zeylanica, Tinospora crispa and Zingiber officinale). Cyclophosphamide (single dose of 150 mg/kg, intraperitoneal injection) was used to induce immunosuppressive model in mice. The observation parameter was blood phagocytic index of carbon clearance test. Results: In healthy mice, only Formula 3 increased phagocytic index whereas all four formulae increased phagocytic index in cyclophosphamide-induced immunosuppressive mice. Conclusion: Formulae of Pouzolzia zeylanica, Tinospora crispa, Andrographis paniculata, Mahonia nepalensis and Zingiber officinale increased phagocytic index and stimulated non-specific immune function. Key words: Pouzolzia zeylanica, Tinospora crispa, Andrographis paniculata, Mahonia nepalensis and Zingiber officinale, cyclophosphamide, phagocytic index, carbon clearance test, immunostimulating, immune enhancement. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Bọ mắm (cây thuốc Giòi, tên khoa học là Pouzolzia zeylanica L. Benn., họ Gai-Urticaceae) ñược sử dụng theo kinh nghiệm dân gian trong ñiều trị các bệnh lý viêm nhiễm như: viêm họng, viêm ruột, lỵ, ñinh nhọt, viêm da, viêm vú, nhiễm trùng tiết niệu, vết thương bầm dập, ho lâu ngày, lao, bệnh về phổi...[5]. Dây cóc (dây Ký ninh, tên khoa học là Tinospora crispa L. Miers, họ Tiết dê-Menispermaceae) ñược dùng chữa sốt rét, cảm ∗ Trung tâm sâm và Dược liệu Tp. HCM – Viện Dược liệu ∗∗ Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam Địa chỉ liên hệ: PGS.TS. Lã Văn Kính ĐT: 38291746 Email: lakinh@hcmgmail.com 112 cúm, phát ban, ho, làm thuốc bổ ñắng giúp tiêu hóa, tiêu mụn nhọt, lở loét, ñắp vết thương, trị ghẻ [5]. Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm.f. Nees, thuộc họ Ô rô Acanthaceae) ñược dùng rất phổ biến trong y học cổ truyền Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Việt Nam...như là một cây thuốc quý với nhiều tác dụng dược lý ñã ñược khoa học chứng minh như: kháng khuẩn, thanh nhiệt, giải ñộc, giảm ñau... [5]. Tác dụng tăng cường hệ miễn dịch của Xuyên tâm liên cũng ñã ñược chứng minh [3],[4]. Hoàng liên ô rô (tên khoa học là Mahonia nepalensis DC., họ Hoàng liên gai-Berberidaceae) ñược sử dụng trong dân gian ñể chữa kiết lỵ, tiêu chảy, viêm ruột, ăn không tiêu, viêm gan vàng da, viêm da dị ứng, mẩn ngứa, mụn nhọt [5]. Theo kinh nghiệm cổ truyền Gừng (tên khoa học là Zingiber officinale Roscoe, họ Gừng-Zingiberaceae) ñược dùng làm chất bổ trợ cho nhiều thuốc bổ và kích thích, dùng làm thuốc chống ñộc, an thần, chống viêm, chữa ñau bụng, cảm lạnh, ho, sổ mũi, kích thích ăn ngon miệng và làm dễ tiêu [5]. Đề tài này nghiên cứu tác dụng theo hướng kích thích miễn dịch của các công thức phối hợp từ các dược liệu Bọ mắm, Dây cóc, Xuyên tâm liên, Hoàng liên ô rô và Gừng trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide nhằm mục ñích ứng dụng các dược liệu trên trong việc ñiều trị các bệnh viêm nhiễm. ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu nghiên cứu 4 công thức phối trộn từ cao cồn Bọ mắm (ñộ ẩm 19,7%, ñộ tro 9,7%), Dây cóc (ñộ ẩm 19,8%, ñộ tro 5,6%), Xuyên tâm liên (ñộ ẩm 15,3%, ñộ tro 11,97%), Hoàng liên ô rô (ñộ ẩm 19,18%, ñộ tro 4,92%) và Gừng (ñộ ẩm 15,03%, ñộ tro 12,11%), với các tỷ lệ phối chế khác nhau ñược cung cấp bởi Bộ môn Hóa-Chế phẩm thuộc Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM. Các công thức phối hợp và liều thử nghiệm ñược trình bày ở bảng 1. Bảng 1: Các công thức phối hợp và liều thử nghiệm Công thức Tỷ lệ (%) theo khối lượng Liều uống (g/kg thể trọng) Hoàng liên ô rô 8,2 Bọ mắm 51 Công thức phối hợp 1 Gừng 40,8 0,705 1,41 2,82 Hoàng liên ô rô 5,6 Xuyên tâm liên 59,6 Công thức phối hợp 2 Gừng 34,8 0,825 1,65 3,30 Dây cóc 41 Xuyên tâm liên 37,2 Công thức phối hợp 3 Gừng 21,8 0,615 1,23 2,46 Dây cóc 51,2 Bọ mắm 21,8 Công thức phối hợp 4 Gừng 27,2 0,295 0,59 1,18 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng ñực chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2 gam, ñược cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, Chuột ñược ñể ổn ñịnh một tuần trước khí thử nghiệm. Thể tích cho uống hoặc tiêm là 10 ml/kg thể trọng chuột. Phương pháp nghiên cứu [1], [2], [4] Bố trí thí nghiệm Chuột thí nghiệm ñược chia thành hai nhóm: nhóm chuột bình thường và nhóm chuột bị gây suy giảm miễn dịch (tiêm phúc mô 1 liều duy nhất Endoxan® hòa tan trong nước muối sinh lý liều tương ñương với cyclophosphamide 150 mg/kg thể trọng). Mỗi nhóm ñược chia thành các lô (10 con) ñể tiến hành ñiều trị bằng các công thức phối trộn từ các cao dược liệu với các liều khác nhau. Lô chứng âm (nước cất) và lô ñối chiếu dương (Zymosan) ñược tiến hành song song với các lô thử. Chỉ tiêu khảo sát: Xác ñịnh chỉ số thực bào bằng thực nghiệm thanh thải carbon (carbon clearance test) Nguyên tắc: xác ñịnh ñộ thanh thải vật lạ có kích thước lớn từ hệ tuần hoàn máu bởi hoạt ñộng thực bào. Tiến hành: Chuột thử nghiệm ñược cho uống nước cất hoặc các mẫu thử hàng ngày vào buổi sáng. Một giờ sau lần uống thứ 8, tiêm dung dịch mực víết máy Parker có ñộ ñậm ñặc ñã ñược ñịnh lượng là tương ứng với hàm lượng carbon là 751 mg/kg bằng ñường tiêm tĩnh mạch ñuôi. Sau ñó lấy 20 µl máu ở ñám rối tĩnh mạch hốc 113 mắt chuột bằng ống mao quản có chứa chất chống ñông EDTA ở các thời ñiểm 0 phút và 5 phút. Mẫu máu ñược pha trong 2 ml dung dịch có ñệm natri carbonat 0,1% và ño mật ñộ quang ở bước sóng 640 nm. Tính toán kết quả: Chỉ số thực bào ñược tính bằng công thức sau: K = lnOD1-lnOD2 T2-T1 K là hằng số biểu hiện sự thanh thải carbon OD1 và OD2 mật ñộ quang ño ở thời ñiểm T1 (0 phút) và T2 (5 phút) Đánh giá kết quả Các kết quả thu ñược trong các thử nghiệm ñược biểu thị bằng số trung bình M ± SEM (Standard Error of the Mean: sai số chuẩn của giá trị trung bình), xử lý số liệu thống kê dựa vào phép kiểm t-student và One-way ANOVA với ñộ tin cậy 95% (P<0,05). KẾT QUẢ Trên chuột bình thường Công thức phối hợp 1 (Hoàng liên ô rô, Bọ mắm, Gừng) ở 3 liều thử nghiệm 0,705; 1,41; 2,82 g/kg thể trọng chuột không thể hiện tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (Bảng 2). Công thức phối hợp 2 (Hoàng liên ô rô, Xuyên tâm liên, Gừng) ở 3 liều thử nghiệm 0,825; 1,65; 3,30 g/kg thể trọng chuột không thể hiện tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (Bảng 3). Công thức phối hợp 3 (Xuyên tâm liên, Dây cóc, Gừng) ở liều thử nghiệm 1,23 g/kg thể trọng chuột có tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (One-way ANOVA với F = 8,093; P < 0,001). Các liều khác 0,615 và 2,46 g/kg thể trọng chuột không thể hiện tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (Bảng 4). Công thức phối hợp 4 (Bọ mắm, Dây cóc, Gừng) ở 3 liều thử nghiệm 0,295; 0,59; 1,18 g/kg thể trọng chuột không thể hiện tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (Bảng 5). Trên chuột bị gây suy giảm miễn dịch Sau 8 ngày tiêm phúc mạc liều duy nhất cyclophosphamide (150 mg/kg), cyclophosphamide làm giảm chỉ số thực bào sau 5 phút ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường (Student t-test với t = 2,265; P = 0,033), chứng tỏ chuột bị suy giảm miễn dịch. Ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide, thuốc ñối chiếu dương Zymosan liều tiêm phúc mạc 0,050 g/kg thể trọng chuột và ñược sử dụng trong 8 ngày làm tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (Student t-test với T = 162; P < 0,001). Ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide, công thức phối hợp 1 (Hoàng liên ô rô, Bọ mắm, Gừng) liều 0,705 g/kg thể trọng chuột làm tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (One-way ANOVA với F = 10,683; P < 0,001) (Bảng 2) Ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide, công thức phối hợp 2 (Hoàng liên ô rô, Xuyên tâm liên, Gừng) liều 0,825 và 1,65 g/kg thể trọng chuột làm tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (One-way ANOVA với F = 13,063; P < 0,001) (Bảng 3). Ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide, công thức phối hợp 3 (Xuyên tâm liên, Dây cóc, Gừng) liều 0,615 và 1,23 g/kg thể trọng chuột làm tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (One-way ANOVA với F = 11,885; P < 0,001) (Bảng 4). Ở chuột bị gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide, công thức phối hợp 4 (Bọ mắm, Dây cóc, Gừng) liều 0,295 và 0,59 g/kg thể trọng chuột làm tăng chỉ số thực bào ñạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (One-way ANOVA với F = 13,603; P < 0,001) (Bảng 5). BÀN LUẬN Hoạt ñộng thực bào chủ yếu ñược thực hiện bởi các ñơn nhân thực bào (tế bào ñơn nhân trong máu, ñại thực bào ñã biệt hóa trong các tổ chức như tế bào Kupffer trong gan). Các ñơn nhân thực bào giữ vai trò trung tâm trong miễn dịch không ñặc hiệu, chúng có khả năng nuốt các vật lạ từ ngoài tế bào như vi khuẩn. Những chất kích thích hoạt ñộng thực bào hoạt hoạt ñộng của lưới nội mô sẽ giúp sự thanh thải nhanh ñược biểu hiện bằng sự gia tăng chỉ số thực bào. Các công thức phối hợp 1, 2, 3 và 4 thể hiện tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào, chứng tỏ các công thức này có khả năng hoạt hóa các ñơn nhân thực bào và làm gia tăng ñáp ứng miễn dịch không ñặc hiệu. 114 Bảng 2: Ảnh hưởng của công thức phối hợp 1 trên chỉ số thực bào Nhóm Lô Liều (g/kg) K Chứng - 0,207 ± 0,011 2,82 0,243 ± 0,043 1,41 0,270 ± 0,034 CY (-) Công thức phối hợp 1 0,705 0,239 ± 0,017 Chứng - 0,180 ± 0,006# 1,41 0,212 ± 0,011 Công thức phối hợp 1 0,705 0,256 ± 0,018* CY (+) Zymosan 0,050 0,310 ± 0,018* # P < 0,05 so với lô chứng bình thường CY(-); *P < 0,05 so sánh với lô chứng tương ứng. Bảng 3: Ảnh hưởng của công thức phối hợp 2 trên chỉ số thực bào Nhóm Lô Liều (g/kg) K Chứng - 0,207 ± 0,011 3,30 0,210 ± 0,012 1,65 0,209 ± 0,011 CY (-) Công thức phối hợp 2 0,825 0,196 ± 0,020 Chứng - 0,180 ± 0,006# 1,65 0,240 ± 0,019* Công thức phối hợp 2 0,825 0,273 ± 0,015* CY (+) Zymosan 0,050 0,310 ± 0,018* # P < 0,05 so với lô chứng bình thường CY(-); *P < 0,05 so sánh với lô chứng tương ứng. Bảng 4: Ảnh hưởng của công thức phối hợp 3 trên chỉ số thực bào Nhóm Lô Liều (g/kg) K Chứng - 0,207 ± 0,011 2,46 0,159 ± 0,025 1,23 0,276 ± 0,016* CY (-) Công thức phối hợp 3 0,615 0,229 ± 0,015 Chứng - 0,180 ± 0,006# 1,23 0,245 ± 0,017* Công thức phối hợp 3 0,615 0,247 ± 0,010* CY (+) Zymosan 0,050 0,310 ± 0,018* # P < 0,05 so với lô chứng bình thường CY(-); *P < 0,05 so sánh với lô chứng tương ứng. Bảng 5: Ảnh hưởng của công thức phối hợp 4 trên chỉ số thực bào Nhóm Lô Liều (g/kg) K Chứng - 0,207 ± 0,011 1,18 0,233 ± 0,018 0,59 0,201 ± 0,021 CY (-) Công thức phối hợp 4 0,295 0,248 ± 0,010 Chứng - 0,180 ± 0,006# 0,59 0,277 ± 0,022* Công thức phối hợp 4 0,295 0,303 ± 0,027* CY (+) Zymosan 0,050 0,310 ± 0,018* # P < 0,05 so với lô chứng bình thường CY(-); *P < 0,05 so sánh với lô chứng tương ứng. KẾT LUẬN Công thức phối hợp 1 liều 0,705 g/kg, công thức phối hợp 2 liều 1,65 g/kg và 0,825 g/kg, công thức phối hợp 3 liều 1,23 g/kg và 0,615 g/kg, công thức phối hợp 4 liều 0,59 g/kg và 0,295 g/kg thể hiện tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào, tăng cường miễn dịch không ñặc hiệu trên chuột bị suy giảm miễn dịch. Tuy nhiên chỉ có công thức 3 ở liều thử nghiệm 1,23 g/kg thể trọng chuột mới thể hiện tác dụng làm gia tăng chỉ số thực bào, tăng cường miễn dịch không ñặc hiệu trên chuột bình thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 1. Nguyễn Thị Thu Hương, Phạm Thị Mỹ Loan (2007), Tác dụng của Sâm Việt nam và Đinh lăng trên thực nghiệm suy giảm miễn dịch. Tạp chí Dược liệu, 12 (3+4), tr. 119-123. 2. Huong N.T.T., Matsumoto K., Nham N.T., Quang N.H., Duc N.M., Yamasaki K., Watanabe H. (1996), Effects of Vietnamese ginseng on the phagocytosis in vitro and in vivo. Phytomedicine, 4, pp. 341-346. 3. Kumar R.A., Sridevi K., Kumar N.V., Nanduri S., Rajagopal S. (2004), Anticancer and immunostimulatory compounds from Andrographis paniculata. J. Ethnopharmacol., 92(2-3), pp. 291- 295. 4. Lê Minh Triết, Dương Thị Công Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008), Tác dụng của Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata Burm.f.Nees, Acanthaceae) trên thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamide. Tạp chí Y học TP.HCM, tập12, phụ bản của số 4, tr. 142-147. 5. Viện Dược Liệu,(nhóm tác giả) (2004), Cây thuốc và ñộng vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Tập I và tập II, tr. 219, 649, 876, 956, 1138.